一种提取环磷酸腺苷的方法及应用

摘要

本发明公开了一种提取环磷酸腺苷的方法及应用，属于生物活性物质提取技术领域。本发明所提供的方法是利用碱液调节发酵液的pH后离心分离获取上清液，浓缩上清液后进行第一次脱色，利用有机溶剂分级沉淀脱色液，再溶解所得沉淀后进行第二次脱色，微孔过滤后浓缩第二脱色液，加入有机溶剂沉淀浓缩后的第二脱色液，离心分离并真空干燥沉淀后获得成品。本发明所提供的方法可取代现有的离子交换和树脂层析工艺，可降低废水量82.5％，同时生产周期大大缩短，缩短36％的生产时间；所制备的环磷酸腺苷品质稳定，纯度可达97％以上，可广泛应用于医药、食品、饲料等领域。

权利要求

1.一种提取环磷酸腺苷的方法，其特征在于，调节发酵液的pH后离心分离获取上清液，浓缩上清液后进行第一次脱色，利用有机溶剂分级沉淀脱色液，再溶解所得沉淀后进行第二次脱色，微孔过滤后浓缩第二脱色液，加入有机溶剂沉淀浓缩后的第二脱色液，离心分离并真空干燥沉淀后获得成品。

2.权利要求1所述方法，其特征在于，步骤如下：

1)利用碱液调节发酵液的pH至8.0-8.5，离心分离后，收集上清液；

2)浓缩步骤1)所得上清液，并进行脱色处理，获得第一脱色液；

3)利用有机溶剂对步骤2)所得的第一脱色液进行分级沉淀，离心分离收集部分沉淀；

所述部分沉淀是有机溶剂浓度40％-50％的沉淀；

4)利用纯化水溶解步骤3)所得的部分沉淀，溶解后进行第二次脱色处理，微孔过滤后获取滤液；

5)浓缩步骤4)所得滤液，再加入有机溶剂进行沉淀处理，离心分离获取沉淀；

6)真空干燥步骤5)所得沉淀获得成品。

3.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤1)所述发酵液为节杆菌发酵液；所述碱液为钠或钾的氢氧化物或碳酸化合物溶液；所述离心，是在4500-5000rpm下离心5-6min。

4.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤2)所述浓缩，是减压浓缩，真空度为-0.065～-0.075MPa，浓缩温度为45-50℃，浓缩终浓度20-25g/L；所述脱色处理，使用糖用活性炭，在55-60℃条件下处理15-20min，活性炭添加量为浓缩液体积的1％。

5.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤3)所述分级沉淀，是使用无水乙醇或丙酮，通过流加的方式进行；所述收集部分沉淀，是收集有机溶剂浓度40％-50％的沉淀。

6.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤4)所述纯化水，是二级反渗透水，电导率≤2μS/cm，加水量为沉淀质量的5倍；所述第二次脱色处理，是用针剂活性炭在常温条件下脱色

15min，针剂活性炭的添加量为沉淀质量的6％。

7.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤5)所述浓缩，是在真空度-0.065～-

0.075MPa，温度45-50℃的条件下，将滤液的体积浓缩至原体积的1/3；所述沉淀处理，是加入无水乙醇或丙酮至溶剂体积浓度为70％。

8.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤6)所述真空干燥，干燥温度为45℃，干燥时间

10h。

9.权利要求2所述方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)利用氢氧化钠溶液调节节杆菌发酵液的pH至8.0-8.5，再将发酵液于5000rpm下离心

5min，获得上清液；

2)在真空度-0.065～-0.075MPa，浓缩温度45-50℃的条件下将步骤1)所得上清液浓缩至 浓度为20-25g/L，向浓缩液中加入浓缩液体积1％的糖用活性炭，在60℃下，脱色处理

15min，去除活性炭后，获得第一脱色液；

3)以流加的方式向步骤2)所得的第一脱色液中加入无水乙醇或丙酮进行分级沉淀处理，收集有机溶剂浓度40％-50％的沉淀；

4)向步骤3)所得的部分沉淀中加入5倍质量的电导率≤2μS/cm的二级反渗透水溶解沉淀，再加入沉淀质量6％的针剂活性炭，在室温下脱色处理15min并用微孔过滤获得滤液；

5)在真空度-0.065～-0.075MPa，温度45-50℃的条件下，将步骤4)所得滤液的体积浓缩至原体积的1/3，再加入无水乙醇或丙酮至溶剂体积浓度为70％，于8000rpm下离心

20min，获得沉淀；

6)在45℃条件下，真空干燥步骤5)所得沉淀10h。

10.权利要求1所述方法，用于从微生物发酵液中提取环磷酸腺苷。

说明书

一种提取环磷酸腺苷的方法及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种提取环磷酸腺苷的方法及应用，属于微生物发酵产物提取技术领域。

背景技术

[0002] 环磷腺苷为参与调节细胞功能的第二信使物质，其作用非常广泛，能使心肌收缩力增强，引起血压升高，心输出量增高。并能舒张平滑肌、扩张冠状动脉血管、改善肝功能、促进神经再生、抑制皮肤外层上皮细胞分裂及转化异常细胞的功能、促进呼吸链氧化酶的活性及改善心肌缺氧等。

[0003] 目前环磷酸腺苷的主要生产方法是化学合成法，存在着收率低、成本高，毒副作用大的缺点；为了克服这些缺点，开发一种生物方法制备环磷酸腺苷成为研究趋势，目前主要有红枣提取法和生物发酵法两种研究方向。而这两种方法相比，生物发酵法具有不受原材料限制，原材料廉价和易采购，规模容易放大，产品质量稳定，并且成本上有着极大优势，因此该法是最替代化学合成法最具潜力的一种方法。

[0004] 目前对发酵法生产环磷酸腺苷产物提取方面的工艺主要是离子交换和吸附层析，这种方法最大的缺点是废水量大，这也是所有树脂分离存在的共性问题，随着环保要求的提高，废水处理成本也开始上升，因此从经济和社会效益角度看，开发一种替代树脂分离的方法就显得相当必要。

发明内容

[0005] 为解决上述问题，本发明提供了一种从发酵液中提取环磷酸腺苷的方法，所采取的技术方案如下：

[0006] 本发明的目的在于提供一种从发酵液中提取环磷酸腺苷的方法，该方法是调节发酵液的pH后离心分离获取上清液，浓缩上清液后进行第一次脱色，利用有机溶剂分级沉淀脱色液，再溶解所得沉淀后进行第二次脱色，微孔过滤后浓缩第二脱色液，加入有机溶剂沉淀浓缩后的第二脱色液，离心分离并真空干燥沉淀后获得成品。

[0007] 所述方法的步骤如下：

[0008] 1)利用碱液调节发酵液的pH至8.0-8.5，离心后获取上清液；

[0009] 2)浓缩步骤1)所得上清液，并进行脱色处理，获得第一脱色液；

[0010] 3)利用有机溶剂对步骤2)所得的第一脱色液进行分级沉淀，离心分离收集部分沉淀；所述部分沉淀为有机溶剂浓度40％-50％的沉淀。

[0011] 4)利用纯化水溶解步骤3)所得的部分沉淀，溶解后进行第二次脱色处理，微孔过滤后获取滤液；

[0012] 5)浓缩步骤4)所得滤液，再加入有机溶剂进行沉淀处理，离心分获取沉淀；

[0013] 6)真空干燥步骤5)所得沉淀获得成品。

[0014] 步骤1)所述发酵液为节杆菌发酵液；所述碱液为钠或钾的氢氧化物或碳酸化合物溶液；所述离心，是在4500-5000rpm下离心5-6min。

[0015] 步骤2)所述浓缩，是减压浓缩，真空度为-0.065～-0.075MPa，浓缩温度为45-50℃，浓缩终浓度20-25g/L；所述脱色处理，使用糖用活性炭，在55-60℃条件下处理15-20min，活性炭添加量为浓缩液体积的1％。

[0016] 步骤3)所述分级沉淀，是使用无水乙醇或丙酮，通过流加的方式进行；所述收集部分沉淀，是收集有机溶剂浓度40％-50％的沉淀。

[0017] 步骤4)所述纯化水，是二级反渗透水，电导率≤2μS/cm，加水量为沉淀质量的5倍；所述第二次脱色处理，是用针剂活性炭在常温条件下脱色15min，针剂活性炭的添加量为沉淀质量的6％。

[0018] 步骤5)所述浓缩，是在真空度-0.065～-0.075MPa，温度45-50℃的条件下，将滤液的体积浓缩至原体积的1/3；所述沉淀处理，是加入无水乙醇或丙酮至溶剂体积浓度为70％。

[0019] 步骤6)所述真空干燥，干燥温度为45℃，干燥时间10h。

[0020] 所述方法的具体步骤如下：

[0021] 1)利用氢氧化钠溶液调节节杆菌发酵液的pH至8.0-8.5，再将发酵液于5000rpm下离心5min，获得上清液；

[0022] 2)在真空度-0.065～-0.075MPa，浓缩温度45-50℃的条件下将步骤1)所得上清液浓缩至浓度为25g/L，向浓缩液中加入浓缩液体积1％的糖用活性炭，在60℃下，脱色处理15min，去除活性炭后，获得第一脱色液；

[0023] 3)以流加的方式向步骤2)所得的第一脱色液中加入无水乙醇或丙酮进行分级沉淀处理，收集有机溶剂浓度40％-50％的沉淀；

[0024] 4)向步骤3)所得的部分沉淀中加入5倍质量的电导率≤2μS/cm的二级反渗透水溶解沉淀，再加入沉淀质量6％的针剂活性炭，在室温下脱色处理15min并有微孔过滤获得滤液；

[0025] 5)在真空度-0.065～-0.075MPa，温度45-50℃的条件下，将步骤4)所得滤液的体积浓缩至原体积的1/3，再加入无水乙醇或丙酮至溶剂体积浓度为70％，于8000rpm下离心20min，获得沉淀；

[0026] 6)在45℃条件下，真空干燥步骤5)所得沉淀10h。

[0027] 所述方法用于从微生物发酵液中提取环磷酸腺苷。

[0028] 本发明对发酵液的分离优选使用管式离心机；减压浓缩设备优选单效或多效减压蒸发器；有机溶剂沉淀分离优选防爆型布袋上卸料离心机，脱碳优选管式脱碳机。

[0029] 本发明有益效果：

[0030] 1、采取两次结晶沉淀的方法，取代离子交换和树脂层析工艺，降低废水量70％以上。

[0031] 2、采用管式离心机对中间产品进行分离，相比于传统的压滤机和膜过滤设备，分离效果好，生产连续性强，降低劳动强度，节约用水。

[0032] 3、生产周期大大缩短，由原来的72小时，缩短至48小时。

[0033] 4、产品品质稳定，纯度不低于95％，重金属含量符合企业质量标准。一次收率大于72％。

具体实施方式

[0034] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

[0035] 本发明所用方法、试剂以及仪器，未经特别说明，均为本技术领域中常规方法、试剂和仪器。

[0036] 实施例1 发酵液的制备

[0037] 本发明所用发酵液为节杆菌发酵液，其中，优选菌株Arthrobacter crystallopoietes，Arthrobacter oxidans，Arthrobacter CCTCC NO：M2013431，Arthrobacter sp.A302的发酵液。

[0038] 本实施例提供了一种上述菌株发酵液的制备方法。

[0039] 本实施例所用培养基具体组成如下：

[0040] 斜面培养基(g/L):葡萄糖10，蛋白胨10，酵母膏10，牛肉膏10，NaCl 3，琼脂20。pH 6.8。

[0041] 种子培养基(g/L):葡萄糖10，蛋白胨10，酵母膏10，牛肉膏10，NaCl 3。pH 6.8。

[0042] 发酵培养基(g/L):葡萄糖30，K2HPO4 15，KH2PO4 5，MgSO4 0.1，尿素10，生物素0.005，CoCl2 0.005，NaCl 0.4，次黄嘌呤5，pH 7.0。

[0043] 发酵条件如下：

[0044] 将-80℃冰箱保存菌种接种于斜面培养基活化，30℃培养48h。斜面培养基上的菌苔接种于种子培养基，30℃、280r/min摇床培养24h；将培养好的种子培养基以8％的接种量接入发酵培养基，30℃、280r/min摇床培养72h。以上种子培养基及发酵培养基均用500mL摇瓶，装液量为30mL。

[0045] 实施例2

[0046] 本实施例提供了一种采用离子交换和树脂层析法提取磷酸腺苷的方法，步骤如下：

[0047] 1)取实施例1所制备的发酵液1L，发酵单位3g/L，在5000rpm转速下离心5min，收集上清液，用浓盐酸调pH至2.0。

[0048] 2)离子交换分离所用树脂为001×7型阳离子交换树脂，树脂装柱体积200mL，用4％盐酸处理成氢型。上柱流速每小时0.3柱体积每小时，上柱结束后再用2倍床体积的纯化水压料，压料结束后用0.1N氢氧化钠洗脱，洗脱流速同上，收集洗脱液450mL。

[0049] 3)树脂层析层析树脂为大孔吸附树脂HP-20，树脂装柱体积300mL,将离交后收集洗脱液加入树脂中，上样流速0.3柱体积每小时，上样结束后采用3倍柱体积纯化水和5倍柱体积的20％甲醇溶液分步洗脱，收集甲醇溶液洗脱部分，洗脱流速同上。

[0050] 4)浓缩将洗脱液在减压蒸发器中浓缩，真空度-0.065～-0.075MPa，蒸发温度40-45℃,浓缩至发酵液体积的1/5。

[0051] 5)结晶往浓缩液加入无水乙醇至终浓浓度70％，搅拌结晶12小时[0052] 6)分离干燥结晶完成后利用离心机分离得到湿晶体，然后置于真空干燥箱中干燥，干燥温度40-45℃。

[0053] 实施例3

[0054] 1)取实施例1所制备的发酵液1L，发酵单位4g/L，在5000rpm转速下离心5min，收集上清液，用浓盐酸调pH至3.0。

[0055] 2)离子交换分离所用树脂为001×7型阳离子交换树脂，树脂装柱体积200mL，用4％盐酸处理成氢型。上柱流速每小时0.3柱体积每小时，上柱结束后再用2倍床体积的纯化水压料，压料结束后用0.1N氢氧化钠洗脱，洗脱流速同上，收集洗脱液450mL。

[0056] 3)树脂层析层析树脂为大孔吸附树脂HP-20，树脂装柱体积300mL,将离交后收集洗脱液加入树脂中，上样流速0.3柱体积每小时，上样结束后采用3倍柱体积纯化水和5倍柱体积的20％甲醇溶液分步洗脱，收集甲醇溶液洗脱部分，洗脱流速同上。

[0057] 4)浓缩将洗脱液在减压蒸发器中浓缩，真空度-0.065～-0.075MPa，蒸发温度40-45℃,浓缩至发酵液体积的1/5。

[0058] 5)结晶往浓缩液加入无水乙醇至终浓浓度70％，搅拌结晶12小时[0059] 6)分离干燥结晶完成后利用离心机分离得到湿晶体，然后置于真空干燥箱中干燥，干燥温度40-45℃。

[0060] 实施例4

[0061] 本实施例提供了一种从发酵液中提取环磷酸腺苷的方法，步骤如下：

[0062] 1)取实施例1所制备的发酵液1L，发酵单位4g/L利用氢氧化钠溶液调节发酵液的pH至8.0-8.5，再将发酵液于5000rpm下离心5min，获得上清液；

[0063] 2)在真空度-0.065～-0.075MPa，浓缩温度45-50℃的条件下将步骤1)所得上清液浓缩至浓度为25g/L，向浓缩液中加入浓缩液体积1％的糖用活性炭，在60℃下，脱色处理15min，去除活性炭后，获得第一脱色液；

[0064] 3)以流加的方式向步骤2)所得的第一脱色液中加入无水乙醇或丙酮进行分级沉淀处理，收集有机溶剂浓度40％-50％的沉淀；

[0065] 4)向步骤3)所得的部分沉淀中加入5倍质量的电导率≤2μS/cm的二级反渗透水溶解沉淀，再加入沉淀质量6％的针剂活性炭，在室温下脱色处理15min并有微孔过滤获得滤液；

[0066] 5)在真空度-0.065～-0.075MPa，温度45-50℃的条件下，将步骤4)所得滤液的体积浓缩至原体积的1/3，再加入无水乙醇或丙酮至溶剂体积浓度为70％，于8000rpm下离心10min，获得沉淀；

[0067] 6)在45℃条件下，真空干燥步骤5)所得沉淀10h。

[0068] 实施例5

[0069] 本实施例提供了一种从发酵液中提取环磷酸腺苷的方法，步骤如下：

[0070] 1)取实施例1所制备的发酵液1L，发酵单位4g/L利用氢氧化钠溶液调节发酵液的pH至8.0-8.5，再将发酵液于5000rpm下离心5min，获得上清液；

[0071] 2)在真空度-0.065～-0.075MPa，浓缩温度45-50℃的条件下将步骤1)所得上清液浓缩至浓度为25g/L，向浓缩液中加入浓缩液体积1％的糖用活性炭，在60℃下，脱色处理10min，去除活性炭后，获得第一脱色液；

[0072] 3)以流加的方式向步骤2)所得的第一脱色液中加入无水乙醇或丙酮进行分级沉淀处理，收集有机溶剂浓度40％-50％的沉淀；

[0073] 4)向步骤3)所得的部分沉淀中加入5倍质量的电导率≤2μS/cm的二级反渗透水溶解沉淀，再加入沉淀质量6％的针剂活性炭，在室温下脱色处理15min并有微孔过滤获得滤液；

[0074] 5)在真空度-0.065～-0.075MPa，温度45-50℃的条件下，将步骤4)所得滤液的体积浓缩至原体积的1/3，再加入无水乙醇或丙酮至溶剂体积浓度为70％，与于8000rpm下离心15min，获得沉淀；

[0075] 6)在45℃条件下，真空干燥步骤5)所得沉淀10h。

[0076] 实施例6

[0077] 本实施例提供了一种从发酵液中提取环磷酸腺苷的方法，步骤如下：

[0078] 1)取实施例1所制备的发酵液1L，发酵单位4g/L利用氢氧化钠溶液调节发酵液的pH至8.0-8.5，再将发酵液于4000rpm下离心5min，获得上清液；

[0079] 2)在真空度-0.065～-0.075MPa，浓缩温度45-50℃的条件下将步骤1)所得上清液浓缩至浓度为25g/L，向浓缩液中加入浓缩液体积1％的糖用活性炭，在50℃下，脱色处理15min，去除活性炭后，获得第一脱色液；

[0080] 3)以流加的方式向步骤2)所得的第一脱色液中加入无水乙醇或丙酮进行分级沉淀处理，收集有机溶剂浓度40％-50％的沉淀；

[0081] 4)向步骤3)所得的部分沉淀中加入5倍质量的电导率≤2μS/cm的二级反渗透水溶解沉淀，再加入沉淀质量6％的针剂活性炭，在室温下脱色处理15min并有微孔过滤获得滤液；

[0082] 5)在真空度-0.065～-0.075MPa，温度45-50℃的条件下，将步骤4)所得滤液的体积浓缩至原体积的1/3，再加入无水乙醇或丙酮至溶剂体积浓度为70％，与于8000rpm下离心15min，获得沉淀；

[0083] 6)在45℃条件下，真空干燥步骤5)所得沉淀10h。

[0084] 实施例7

[0085] 本实施例利用高效液相色谱法测定了实施例2-6所得样品的纯度，结果如表1所示；

[0086] 表1实施例2-6制备环磷酸腺苷的纯度及提取率

[0087]  实施例2 实施例3 实施例4 实施例5 实施例6
纯度 99 97 97 99 98
提取率 65％ 62 72％ 72.5 71％

[0088] 从表1可以看出，实施例4-6的方法所得产物的纯度与实施例2和3所用的离子交换和树脂层析法没有显著差别，但是产品的提取率却明显高于实施例2和3所用的离子交换和树脂层析法。说明本发明所提供的方法比离子交换和树脂层析法更加高效。

[0089] 表2是实施例2-6制备环磷酸腺苷所用的废水量和时间。

[0090] 表2实施例2-6制备环磷酸腺苷的废水用量及所用时间

[0091]  实施例2 实施例3 实施例4 实施例5 实施例6
废水量 10L 12L 2.5L 2.1L 2.3L
制备总时间 73 72 49 47 49

[0092] 从表2中可以看出，实施例4-6所用的废水量明显少于实施例2-3所用的废水量，同时，制备所用时间也明显缩短。与离子交换和树脂层析法相比，本发明所用方法可以节约75％-82.5％的用水，缩短31％-36％的时间。

[0093] 虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。