耐受重金属的好氧反硝化菌株及其应用

摘要

一种环境保护技术领域的耐受重金属的好氧反硝化菌株及其应用，该菌株为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)SNR‐3，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.7126，本发明能够耐受Cd2+、Cu2+等重金属，并能在上述重金属存在的条件下进行好氧反硝化作用，有效去除水体中的硝态氮和亚硝态氮，并吸附相应的重金属。该菌株培养条件粗放，操作方便简单，处理成本低，对重金属污染的含氮废水的高效净化具有重要意义。

权利要求

1.一种短小芽孢杆菌SNR-3，其特征在于，该短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.7126，保藏日期是2013年1月11日；所述的短小芽孢杆菌SNR-3经16S rDNA序列测得序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种根据权利要求1所述的短小芽孢杆菌SNR-3的应用，其特征在于，将其用于脱除污染水体中的硝态氮和亚硝态氮，具体为：将短小芽孢杆菌SNR-3扩大培养后，接种于含有Cd2+和/或Cu2+的含氮废水中，菌体在生长过程中通过好氧反硝化作用脱除水体中的硝态氮和亚硝态氮，同时利用生物吸附作用去除水体中的Cd2+、Cu2+重金属，并且被吸附的重金属全部位于胞内，从而达到去除重金属的目的。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征是，所述的扩大培养是指：将SNR-3菌株接种于含有碳源、氮源、无机盐和水的无菌发酵培养基中，在C/N比大于或等于5，初始pH为5.8~7.5、培养温度为25~37℃的环境下培养6~24小时。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征是，所述的无菌发酵培养基包含如下组分：碳源2~40 g/L，氮源0.1~20 g/L，无机盐0.01~20 g/L，其余为水，pH 6.0~7.5。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征是，所述的碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木糖、果糖、柠檬酸、甘油和糖蜜中的任意一种或几种的组合；氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、淀粉、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、(NH4)2SO4、KNO3和NH4NO3中的任意一种或几种的组合；无机盐为硫酸盐、磷酸盐或盐酸盐中的一种或多种。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征是，所述的接种是指：按照0.5~10%的比例投入到含氮废水中。

7.根据权利要求2所述的应用，其特征是，所述的含氮废水中硝态氮的初始浓度为10~

2000 mg/L、亚硝态氮初始浓度为1~350 mg/L。

8.根据权利要求2所述的应用，其特征是，所述的含氮废水中Cd2+的初始浓度为0.01~10 mg/L，Cu2+的初始浓度为0.01~30 mg/L。

说明书

耐受重金属的好氧反硝化菌株及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及的是一种环境保护技术领域的生物治理方法，具体是一种耐受重金属的好氧反硝化菌株及其应用。

背景技术

[0002] 地下水作为水资源的重要组成部分，在人类社会的发展过程中起着举足轻重的作用。近20年来，由于城市生活垃圾和工业“三废”等的不合理处置，农业生产中农药、化肥的大量使用，全国地下水污染状况日趋加重。根据2010年中国地质局的取样测试数据显示，我国东部主要平原地下水质量总体堪忧，地下水三氮污染普遍，呈面状污染特征，其超标率达到7.7～15.4％，淮河以北10多个省份约有3000万人饮用高硝酸盐水，海河流域受污染的地下水资源量占地下水总资源量的62％，农村约有3.6亿人喝不上符合标准的饮用水。重金属检出普遍呈点污染特征，多分布在城市周边及工矿企业周围的污灌区。这种多污染物共同存在的复合污染严重威胁到了饮水安全和人民身体健康。因此修复和治理三氮、重金属复合污染的地下水已迫在眉睫。

[0003] 现在大多数关于地下水污染的原位修复技术都是针对某一类污染物的。对于氮素污染的治理，生物脱氮是目前最为经济有效的治理技术。好氧反硝化细菌是一类能在有氧条件下发挥反销化作用的微生物，因而也能与硝化作用同步进行，并避免 对硝化反应的抑制，加速硝化反应进程。目前处理重金属废水的方法中生物吸附法是最有前途的方法之一。所谓生物吸附法就是利用某些生物体本身的化学结构及成分特性来吸附溶于水中的金属离子，再通过固液两相分离来去除水溶液中金属离子的方法。近年来有关生物吸附的报道中提及的都是非活性细胞的吸附作用，但死细胞的生物吸附难以实用化，而且对于某些种类的金属来说，死细胞难以有效吸附，而活体菌却可以实现特异性吸附，所以，人们开始重新关注活体微生物在重金属生物吸附中的利用。金属离子进入活细胞，一般要经过胞外结合与运输到胞内两个阶段。前者是一个快速过程，不需要消耗能量，称为被动吸附；后者进行得较为缓慢，依赖于能量及代谢系统的调控，称为主动吸收。虽然研究者们分别在生物脱氮和生物吸附领域都取得了较大的研究进展，但还缺乏有关同步修复地下水氮污染和重金属污染的生物修复技术研究。

[0004] 经过对现有技术的检索发现，中国专利文献号CN103937701A公开(公告)日2014.07.23，公开了一种短小芽孢杆菌shou002及其应用，其中的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)shou002于2013年11月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2013536，该短小芽孢杆菌shou002对水产病原菌具有良好的抑制作用，并且无致病性，安全可靠，能够有效的降解养殖水体中的有机物、氨氮和亚硝酸氮等污染物，优化养殖环境，促进水环境生态良性循环，可以用作饲料添加剂和水体生态环境改良剂应用到水产养殖中。但该技术并未涉及水体硝态氮的降解，且菌株本身不具有吸附重金属的能力，无法应用于重金属污染的含氮废水。

[0005] 李涵在《好氧反硝化细菌的脱氮机理及其絮凝特性的研究》(南京理工大学，环境工程，2013，硕士论文)中公开了两株好氧反硝化细菌，分别命名为ADB4A和ADB7。设置硝态氮进水浓度为268.8mg·L‐1，在160r/min，30℃的环境条件下培养2天后，菌株ADB4A和ADB7对硝态氮的降解率分别达到了83％和63％。经过16SrDNA序列测定，认为菌株ADB4A和ADB7分别为短小芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。为了更好地了解并利用好氧反硝化细菌，该文献从碳源、碳氮比、温度、转速、pH等因素着手，用单因素法探讨了好氧反硝化细菌生长的最佳环境条件以及环境对菌株的好氧反硝化作用的影响，均得到了最佳参数。但该技术在对水体硝态氮进行反硝化处理时，会导致水体中亚硝态氮和氨氮的积累，造成二次污染。

发明内容

[0006] 本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种耐受重金属的好氧反硝化菌株及其应用，该菌株能够耐受Cd2+、Cu2+等重金属，并能在上述重金属存在的条件下进行好氧反硝化作用，有效去除水体中的硝态氮和亚硝态氮，并吸附相应的重金属。该菌株培养条件粗放，操作方便简单，处理成本低，对重金属污染的含氮废水的高效净化具有重要意义。

[0007] 本发明是通过以下技术方案实现的：

[0008] 本发明涉及一种短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)SNR‐3，目前该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。保藏编号为CGMCC NO.7126，保藏日期是2013年1月11日。

[0009] 所述的短小芽孢杆菌SNR‐3具有下述性质：

[0010] 1、菌落形态学特征：在蛋白胨琼脂培养基上营养细胞为0.4～0.8×1.5～2.7μm大小的杆菌，37℃培养2～3天形成芽孢，芽孢为长圆形或圆柱状。在上述培养基中30℃培养8h菌体可以大量生长。菌落呈白色，边缘有褶皱，不透明，不闪光。

[0011] 2、生理与生化特性：培养温度：20～37℃，最适温度为30℃；在pH5.8～7.5范围内生长；革兰氏染色检测呈阳性；甲基红实验检测呈阳性；硝酸盐还原检测呈阳性；吲哚生产检测呈阳性；H2S生产检测呈阴性；脲酶生产检测呈阴性。

[0012] 所述的短小芽孢杆菌SNR‐3经16S rDNA序列测得，其16S rDNA大部分序列1414bp，如SEQ ID No.1所示，将该序列与GenBank中的基因序列进行同源性比较，发现其与短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)同源性达到99.9％。

[0013] 本发明涉及一种短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)SNR‐3的应用，将其用于脱除污染水体中的硝态氮和亚硝态氮，具体为：将短小芽孢杆菌SNR‐3扩大培养后，接种于含有Cd2+和/或Cu2+的含氮废水中，菌体在生长过程中通过好氧反硝化作用脱除水体中的硝态氮和亚硝态氮，同时利用生物吸附作用去除水体中的Cd2+、Cu2+重金属，并且被吸附的重金属全部位于胞内，从而达到去除重金属的目的。

[0014] 所述的扩大培养是指：将SNR‐3菌株接种于含有碳源、氮源、无机盐和水的无菌发酵培养基中，在C/N比大于或等于5，初始pH为5.8～7.5、培养温度为25～37℃的环境下培养6～24小时。

[0015] 所述的无菌发酵培养基包含如下组分：碳源2～40g/L，氮源0.1～20g/L，无机盐0.01～20g/L，其余为水，pH6.0～7.5，其中：所述的碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木糖、果糖、柠檬酸、甘油和糖蜜中的任意一种或几种的组合；氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、淀粉、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、(NH4)2SO4、KNO3和NH4NO3中的任意一种或几种的组合；无机盐为硫酸盐、磷酸盐、磷酸二氢盐和盐酸盐中的一种或多种。

[0016] 所述的接种是指：按照0.5～10％的比例投入到含氮废水中。

[0017] 所述的含氮废水中硝态氮的初始浓度为10～2000mg/L、亚硝态氮初始浓度为1～350mg/L。

[0018] 所述的含氮废水中Cd2+的初始浓度为0.01～10mg/L，Cu2+的初始浓度为0.01～30mg/L。

[0019] 技术效果

[0020] 与现有技术相比，本发明的技术效果包括：

[0021] 1)本发明筛选获得的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)能利用多种碳源和氮源进行生长繁殖，培养条件十分粗放，操作方便简单。

[0022] 2)本发明提供的菌株能够在好氧条件下进行完全的反硝化作用，即将硝态氮直接还原为氮气，实现彻底脱氮且不会对环境造成二次污染。

[0023] 3)本发明提供的菌株具有Cd2+、Cu2+重金属耐受性，能够通过菌体自身的生物吸附作用去除重金属离子，并且与好氧反硝化过程可以同步进行，适用于处理含氮废水或重金属污染的含氮废水，具有优异的环境效益和社会效益。

附图说明

[0024] 图1为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)SNR‐3的菌落形态照片。

[0025] 图2为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)SNR‐3的菌落显微镜照片(1000×)。

具体实施方式

[0026] 下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

[0027] 实施例1

[0028] 短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)SNR‐3的分离和纯化

[0029] 富集培养基1：酒石酸钾钠20g/L、柠檬酸三钠10g/L、乙酸钠10g/L、KNO32g/L、K2HPO40.5g/L、MgSO4·7H2O0.2g/L、微量元素溶液0.2％，pH7.5。微量元素溶液：EDTA-2Na57.1mg/L、ZnSO4·7H2O3.9mg/L、CaC12·2H2O7mg/L、MnCl2·4H2O5.1mg/L、FeSO4·
7H2O5.0mg/L、CuSO4·5H2O1.6mg/L、CoC121.6mg/L。

[0030] 富集培养基2：在富集培养基1的基础上加入100mg/L CuSO4·5H2O，50mg/L(CH3COO)2Cd·2H2O。

[0031] BTB培养基：KNO31.0g/L,C6H5Na3O2·2H2O1.0g/L,KH2PO41.0/Lg,FeS04·7H200.05g/L,CaCl20.2g/L,MgSO4·7H2O1.0g,1％的BTB1mL，琼脂20.0g/L，pH6.8。

[0032] 反硝化培养基：酒石酸钾钠20g/L、KNO32.5g/L、K2HPO40.5g/L、MgSO4·7H2O0.2g/L，琼脂20.0g/L，pH7.5。

[0033] 从崇明岛沿海滩涂地采集活性淤泥样品，分别取不同采样点的活性淤泥10g加入富集培养基1中，30℃、150r/min培养3d，以10％接种量接入新的富集培养基1中，继续按照上述方法进行培养，如此反复驯化4次，以富集好氧反硝化细菌。

[0034] 将上述富集菌液重新接入富集培养基2中，以相同的方法进行富集驯化培养，重复4次后，吸取lmL富集培养液至9mL无菌生理盐水中，得到10-1稀释度菌悬液，依次按10倍稀释法稀释至10-8。分别吸取各稀释度悬液0.lmL至BTB固体培养基均匀涂布，30℃倒置培养2～
3d，挑取有蓝色晕圈的单菌落，在反硝化固体培养基上连续传代培养6代，直至获得菌落形态稳定的纯培养。

[0035] 实施例2

[0036] 短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)SNR‐3对含氮污水的脱氮效果

[0037] 种子培养基：葡萄糖5g/L，牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，NaCl0.5g/L，利用NaOH溶液调pH6.5。

[0038] 发酵培养基：葡萄糖20g/L，酵母膏2g/L，蛋白胨5g/L，K2HPO4·3H2O2.5g/L，MgSO4·7H2O0.1g/L，利用NaOH溶液调pH7.0。

[0039] 将短小芽孢杆菌B.pumilus SNR‐3(CGMCC NO.7126)在种子培养基、30℃、200r/min的摇床条件下培养10h，将种子液按2％(v/v)的种子量接种于预装有3.5L灭菌后的发酵培养基的5L发酵罐中进行培养，培养条件：30℃，300r/min，通气量1.5L/min，发酵过程无需调节pH。发酵12h，菌体浓度达到300×108cfu/mL。

[0040] 将上述菌液按4％(v/v)的接种量分别接入含有硝态氮初始浓度300mg/L、亚硝态氮初始浓度100mg/L的污水中，其中：C/N比为15。在25℃、300r/min、通气量1.2L/min条件下培养5d，取培养液在8000rpm条件下离心10min，取上清检测硝态氮和亚硝态氮含量。

[0041] 表1 菌株对含氮污水的脱氮效果

[0042]

[0043] 实施例3

[0044] 短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)SNR‐3对Cu2+污染的含氮污水的修复效果[0045] 种子培养基：葡萄糖5g/L，牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，MgSO4·7H2O0.3g/L，利用NaOH溶液调pH6.5。

[0046] 发酵培养基：葡萄糖15g/L，蔗糖10g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏3g/L，K2HPO4·3H2O2.5g/L，MgSO4·7H2O0.1g/L，利用NaOH溶液调pH7.2。

[0047] 将短小芽孢杆菌B.pumilus SNR‐3(CGMCC NO.7126)在种子培养基、30℃、200r/min的摇床条件下培养10h，将种子液按2％(v/v)的种子量接种于预装有3.5L灭菌后的发酵培养基的5L发酵罐中进行培养，培养条件：35℃，300r/min，通气量2.0L/min，发酵过程无需调节pH。发酵8h，菌体浓度达到300×108cfu/mL。

[0048] 将上述菌液按6％(v/v)的接种量接入含有硝态氮初始浓度300mg/L、亚硝态氮初始浓度50mg/L、Cu2+初始浓度5mg/L的污水中，其中C/N比为20，在25℃、300r/min、通气量1.5L/min时培养5d，取培养液在8000rpm条件下离心10min，取上清检测硝态氮、亚硝态氮及
2+
Cu 含量。

[0049] 表2 菌株对Cu2+污染的含氮污水的修复效果

[0050]

[0051] 实施例4

[0052] 短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)SNR‐3对Cd2+污染的含氮污水的修复效果[0053] 种子培养基：蔗糖5g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，MgSO4·7H2O0.3g/L，利用NaOH溶液调pH6.8。

[0054] 发酵培养基：葡萄糖20g/L，甘油5g/L，蛋白胨5g/L，(NH4)2SO42g/L，K2HPO4·3H2O2.5g/L，MgSO4·7H2O0.1g/L，利用NaOH溶液调pH7.2。

[0055] 将短小芽孢杆菌B.pumilus SNR‐3(CGMCC NO.7126)在种子培养基、30℃、200r/min的摇床条件下培养10h，将种子液按4％(v/v)的种子量接种于预装有3.5L灭菌后的发酵培养基的5L发酵罐中进行培养，培养条件：35℃，400r/min，通气量1.5L/min，发酵过程无需调节pH。发酵8h，菌体浓度达到300×108cfu/mL。

[0056] 将上述菌液按6％(v/v)的接种量接入含有硝态氮初始浓度500mg/L、亚硝态氮初始浓度30mg/L、Cd2+初始浓度5mg/L的污水中，其中C/N比为20，在25℃、300r/min、通气量1.5L/min时培养5d，取培养液在8000rpm条件下离心10min，取上清检测硝态氮、亚硝态氮及
2+
Cu 含量。

[0057] 表3 菌株对Cd2+污染的含氮污水的修复效果

[0058]

[0059] 实施例5

[0060] 短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)SNR‐3对Cu2+、Cd2+污染的含氮污水的修复效果[0061] 种子培养基：葡萄糖5g/L，牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，MgSO4·7H2O0.3g/L，利用NaOH溶液调pH6.5。

[0062] 发酵培养基：葡萄糖20g/L，蔗糖10g/L，蛋白胨5g/L，(NH4)2SO43g/L，K2HPO4·3H2O2.5g/L，MgSO4·7H2O0.1g/L，利用NaOH溶液调pH7.2。

[0063] 将短小芽孢杆菌B.pumilus SNR‐3(CGMCC NO.7126)在种子培养基、30℃、200r/min的摇床条件下培养10h，将种子液按4％(v/v)的种子量接种于预装有3.5L灭菌后的发酵培养基的5L发酵罐中进行培养，培养条件：30℃，400r/min，通气量1.8L/min，发酵过程无需调节pH。发酵8h，菌体浓度达到300×108cfu/mL。

[0064] 将上述菌液按10％(v/v)的接种量接入含有硝态氮初始浓度600mg/L、亚硝态氮初2+ 2+
始浓度50mg/L、Cu 初始浓度10mg/L、Cd 初始浓度2mg/L的污水中，其中C/N比为25，在25℃、300r/min、通气量1.5L/min时培养5d，取培养液在8000rpm条件下离心10min，[0065] 取上清检测硝态氮、亚硝态氮、Cu2+、Cd2+的含量。

[0066] 表4 菌株对Cu2+、Cd2+污染的含氮污水的修复效果

[0067]

[0068]