基于共区域化触发链式杂交反应的适体传感器检测腺苷

摘要

本发明公开了一种基于共区域化触发链式杂交反应的适体传感器用于检测腺苷，由生物素化的适体链-1、适体链-2、发卡探针和链霉亲和素修饰的磁性纳米球组成，本发明的适体传感器用于检测腺苷，检测方法为：(1)链酶亲和素化修饰磁球的活化；(2)生物素化适体链-1的固定；(3)腺苷诱导的双适体的共区域化；(4)共区域化触发的链式杂交反应；(5)加入染料SYBR Green I和荧光检测；(6)计算：根据所测得的荧光值计算含有腺苷的待检测物中腺苷的浓度。本发明的适体传感器，通过共区域化诱导的链式杂交反应，降低了传统链式杂交反应的非特异性反应，具有检测灵敏度高、样品使用量小、无需酶放大等优势，可实现对低浓度腺苷的分析检测。

权利要求

1.一种基于共区域化触发链式杂交反应的适体传感器，其特征在于：由生物素化的适体链-1、适体链-2、发卡探针和链霉亲和素修饰的磁性纳米球组成，其中，所述生物素化的适体链-1的序列为：Bio-Apt-1：5’-biotin-TTTTTTTTTTTT GTG CAA GTA CCA TT TAG ACC ACC TGG GGG AGT AT-3’，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述适体链-2的序列为：

Apt-2：5’-ATA CTC CCC C AGGTGG TGT CTA GGA TTC GGC GTG-3’，如SEQ ID NO.2所示；

所述发卡探针由发卡探针H1和发卡探针H2组成，其中，发卡探针H1的核苷酸序列为：

5’-TGT CTA GGA TTC GGC GTG GGT TAA CAC GCC GAA TCC TAG ACA TGG TAC TTG CAC-3’，如SEQ ID NO.3所示；

发卡探针H2的核苷酸序列为：

5’-TTA ACC CAC GCC GAA TCC TAG ACA GTG CAA GTA CCA TGT CTA GGA TTC GGC GTG-3’，如SEQ ID NO.4所示。

2.根据权利要求1所述的基于共区域化触发链式杂交反应的适体传感器，其特征在于：所述链霉亲和素修饰的磁性纳米球，密度为1.343 g mL-1，直径为350 nm。

3.权利要求1所述的基于共区域化触发链式杂交反应的适体传感器在检测腺苷中的应用，所述应用用于非诊断目的。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述应用用于非诊断目的，应用步骤如下：（1）链霉亲和素化修饰磁球的活化：

①在离心管中加入200μL的TTL缓冲液和1μL链霉亲和素修饰的磁性纳米球，经充分震荡洗涤后，将离心管置于磁球分离架上静置7min，移除溶液部分；

②重复上述①的操作5次，最后得到1μL活化的链霉亲和素化修饰的磁性微球，待用；

（2）Bio-Apt-1的固定：向上述活化好的1μL活化的链霉亲和素化修饰的磁性微球中加入50μL的浓度为2.0×10–6molL-1的Bio-Apt-1，充分震荡混匀后，放于37℃恒温箱中孵育2 h；反应完后，放于磁球分离架上，静置7min，移除溶液部分；然后用Tris-HCl杂交缓冲液清洗两次，最后获得表面固定Bio-Apt-1的磁球；

（3）腺苷诱导的双适体的共区域化：向上述步骤（2）制备得到的表面固定Bio-Apt-1的磁球中加入40μL的浓度为1.0×10–6molL-1的Apt-2和10μL的含有腺苷的待检测物，充分震荡混匀后，放于37℃恒温箱中孵育2h；反应完后，放于磁球分离架上，静置7min，移除溶液部分；然后用Tris-HCl杂交缓冲液清洗两次，最后获得腺苷诱导共区域化的Bio-Apt-1/Apt-2复合物；

（4）共区域化触发的链式杂交反应：在上述腺苷诱导共区域化的Apt-1/Apt-2复合物中加入50μL的发卡探针H1、H2的混合物，充分震荡混匀后，放于37℃恒温箱中孵育3h；反应完后，放于磁球分离架上，静置7min，移除溶液部分；然后用PBS缓冲液清洗两次，最后获得表面固定有长的DNA双链的磁球；

（5）加入染料SYBR Green I和荧光检测：用PBS缓冲液将SYBR Green I稀释成浓度为

2.0× 10–6molL-1，然后加入到上述得到的表面固定有长的DNA双链的磁球中，室温静置10 min，然后进行荧光检测，得荧光值；

（6）计算：根据上述所测得的荧光值计算含有腺苷的待检测物中腺苷的浓度；

所述TTL缓冲液的组成为：由Tris-HCl、Tween 20、LiCl和水组成，其中，各组分的浓度为：100mmol L-1 Tris-HCl；0.1％ Tween 20；1 mol L-1 LiCl；pH 8.0；

所述Tris-HCl杂交缓冲液的组成为：由Tris-HCl、NaCl、MgCl2和水组成，其中，各组分的浓度为：10 mmol L-1Tris-HCl，pH7.4；300mmol L-1NaCl；1mmol L-1MgCl2。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述含有腺苷的待检测物为人的尿液，所述应用用于非诊断目的。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述发卡探针H1、H2的混合物中，发卡探针H1和H2的浓度相同，均为3.0×10–6molL-1，所述应用用于非诊断目的。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述发卡探针H1和H2在使用之前进行退火，退火的步骤是：在90℃加热5min，然后冷却到室温，所述应用用于非诊断目的。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述步骤（5）中，进行荧光检测时，荧光光度计的基本设置为：激发波长为477nm，扫描范围为500～600nm，激发狭缝宽度 2.5nm，发射狭缝宽度2.5nm，PMT电压700V，所述应用用于非诊断目的。

9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述步骤（6）中，利用下述线性方程计算得到腺苷的浓度：ΔF=14.55+1769.72×104 C，r =0.998；

其中，ΔF表示荧光净信号值，C表示腺苷的浓度，单位为molL-1；该线性方程的线性范围是1.0×10-6molL-1～1.2×10-4molL-1之间，所述应用用于非诊断目的。

说明书

基于共区域化触发链式杂交反应的适体传感器检测腺苷

技术领域

[0001] 本发明涉及构建一种基于共区域化触发链式杂交反应的腺苷适体传感器检测腺苷。

背景技术

[0002] 腺苷是一种重要的生物药物小分子，参与机体多种生命活动的调节，具有重要的生理和药理作用，如舒张血管、收缩平滑肌以及对神经系统和免疫系统的调节作用。此外，生物样本中腺苷的检测可用于疾病诊断、病程的监测以及癌症的早期诊断。因此对腺苷的定量检测，尤其是生物样本中腺苷的检测在临床研究、疾病的诊断和预防以及癌症的早期诊断等方面有重要的生物学意义。

[0003] 虽然大量的腺苷适体传感体系已成功实现了腺苷的分析检测，但是能够直接用于生物样本中腺苷检测的适体传感器却很少，这主要是以下两个原因造成的：1、生物样本中复杂体系的干扰，复杂的环境会对检测体系尤其含有蛋白酶的体系造成较大的影响；2、方-1法灵敏度不够，不能达到生物样本的检测标准，正常人尿液中腺苷的含量是2μmol L ～7μmol L-1。而生物样本中腺苷的检测在疾病的诊断和预防以及临床研究方面具有较高的临床应用意义，例如生理状态下腺苷含量的波动可用于心、脑生理功能的研究，尿液中腺苷含量的升高可用于肿瘤的早期诊断。因此，建立一个高灵敏度、高选择性，能实现生物样本中腺苷直接检测的传感体系是十分必要的。

[0004] 目前，为了实现高灵敏度的分析检测，多种信号放大技术如滚环扩增、外切酶辅助的信号扩增、核酸酶辅助的信号扩增以及基于聚合切刻酶等已被广泛用于腺苷的分析中。这些方法虽然能大大提高腺苷的检测灵敏度，但是均需酶的辅助作用。而蛋白酶和核酸酶的一些固有缺点(如易变性失活、高成本、需要特别的识别位点等)，大大限制了这些放大技术的广泛应用。近年来，粘性末端介导的链置换反应由于原理简单(碱基配对的基本原理)、无酶、反应快速和无需特别设计的优势而得以快速发展，基于发卡结构自组装的HCR和CHA反应是其中最为典型的两类方法。然而，非特异性反应的发生常常会造成较大的背景信号，影响方法的灵敏度，因此我们构建了一种基于共区域化触发的链式杂交反应的适体传感器，可以避免非特异性反应的发生，实现腺苷的高灵敏检测，同时实现生物样本中腺苷的直接分析检测。

发明内容

[0005] 针对现有腺苷分析技术不能实现生物样本中腺苷的直接检测的问题，本发明的目的是提供一种基于共区域化触发链式杂交反应的适体传感器，将该适体传感器用于腺苷的分析检测，具有灵敏度高、选择性强和重现性好等优点，并且可以直接用于人尿液中腺苷的含量测定，无需任何前处理过程。该适体传感器的工作原理是：首先，通过链酶亲和素和生物素之间的特异性作用，将生物素化的适体链-1(Bio-Apt-1)固定在磁球表面；然后加入腺苷和适体链-2(Apt-2)，通过腺苷的“粘合”作用，使得Bio-Apt-1和Apt-2结合在一起，从而使得Bio-Apt-1连接的粘性末端区域和Apt-2连接的链置换区域发生共区域化，形成完整的引物链，可以触发发卡结构H1和H2发生链式杂交反应(HCR)；反应完成后，加入内插染料SYBR Green I，产生荧光信号的输出。

[0006] 本发明是通过以下技术方案实现的：

[0007] 一种基于共区域化触发链式杂交反应的适体传感器，由生物素化的适体链-1、适体链-2、发卡探针和链霉亲和素修饰的磁性纳米球组成，其中，所述生物素化的适体链-1(Bio-Apt-1)为：

[0008] 5’-biotin-TTTTTTTTTTTT GTG CAA GTA CCA TT TAG ACC ACC TGG GGG AGT AT-3’(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)；

[0009] 所述适体链-2(Apt-2)的序列为：

[0010] Apt-2：5’-ATA CTC CCC C AGGTGG TGT CTA GGA TTC GGC GTG-3’，(如SEQ ID NO.2所示)；

[0011] (注：Apt-2中斜体加粗序列是与Apt-1杂交的碱基)；

[0012] 所述发卡探针由发卡探针H1和发卡探针H2组成，其中，发卡探针H1的核苷酸序列为：

[0013] 5’-TGT CTA GGA TTC GGC GTG GGT TAA CAC GCC GAA TCC TAG ACA TGG TAC TTG CAC-3’(如SEQ ID NO.3所示)；

[0014] 发卡探针H2的核苷酸序列为：

[0015] 5’-TTA ACC CAC GCC GAA TCC TAG ACA GTG CAA GTA CCA TGT CTA GGA TTC GGC GTG-3’(如SEQ ID NO.4所示)。

[0016] 所述链霉亲和素修饰的磁性纳米球(链酶亲和素化修饰的磁性微球)，下述简称磁球，为现有技术中已有的常规产品，本发明所用的磁球购自Bangs Laboratories，Carmel，IN，USA，1mL包装，密度为1.343g mL-1，直径为350nm。

[0017] 所述基于共区域化触发链式杂交反应的适体传感器，用于检测腺苷的过程如下：

[0018] (1)链酶亲和素化修饰磁球的活化：为了防止磁球的聚集，磁球储备液中含有大量的表面活性剂，在使用前，需要先将这些表面活性剂洗去，以活化磁球的功能，活化方式为：

[0019] ①在离心管中加入200μL的TTL缓冲液和1μL链霉亲和素修饰的磁性纳米球，经充分震荡洗涤后(震荡约5min)，将离心管置于磁球分离架上静置7min，移除溶液部分(用移液枪小心吸出溶液，弃去)；

[0020] ②重复上述①的操作5次，最后得到活化的链酶亲和素化修饰的磁性微球(1μL)，待用；

[0021] 所述TTL缓冲液的组成为：由Tris-HCl、Tween20、LiCl和水组成，其中，各组分的浓-1 -1度为：100mmol L Tris-HCl；0.1％Tween20；1mol L LiCl；pH8.0；

[0022] (2)生物素化适体链-1(Bio-Apt-1)的固定：向上述活化好的1μL活化的链酶亲和素化修饰的磁性微球中加入50μL的浓度为2.0×10–6mol L-1的Bio-Apt-1，充分震荡混匀后，放于37℃恒温箱中孵育2h；反应完后，放于磁球分离架上，静置7min，移除溶液部分(用移液枪小心吸出溶液，弃去)；然后用200μL的Tris-HCl杂交缓冲液清洗两次，最后获得表面固定生物素化Apt-1的磁球；

[0023] 所述Tris-HCl杂交缓冲液的组成为：由Tris-HCl、NaCl、MgCl2和水组成，其中，各组分的浓度为：10mmol L-1Tris-HCl，pH7.4；300mmol L-1NaCl；1mmol L-1MgCl2。

[0024] 本发明的基于共区域化触发链式杂交反应的适体传感器，可以用于腺苷的分析检测，具体应用时，应用方法如下：

[0025] (3)腺苷诱导的双适体的共区域化：向上述步骤(2)制备得到的表面固定生物素化Apt-1的磁球中加入40μL的浓度为1.0×10–6mol L-1的Apt-2和10μL的含有腺苷的待检测物，充分震荡混匀后，放于37℃恒温箱中孵育2h；反应完后，放于磁球分离架上，静置7min，移除溶液部分(用移液枪小心吸出溶液，弃去)；然后用200μL的Tris-HCl杂交缓冲液清洗两次，最后获得腺苷诱导共区域化的Apt-1/Apt-2复合物；

[0026] 进一步地，所述含有腺苷的待检测物为人的尿液；

[0027] (4)共区域化触发的链式杂交反应：在上述腺苷诱导共区域化的Apt-1/Apt-2复合物中加入50μL的发卡探针H1、H2的混合物(优选的，所述混合物中，发卡探针H1和H2的浓度–6 -1相同，均为3.0×10 mol L )。充分震荡混匀后，放于37℃恒温箱中孵育3h；反应完后，放于磁球分离架上，静置7min，移除溶液部分(用移液枪小心吸出溶液，弃去)；然后用200μL的PBS缓冲液清洗两次(以除去未反应的发卡探针)，最后获得表面固定有长的DNA双链的磁球；

[0028] 进一步地，发卡探针H1和H2在使用之前进行退火，目的是保证发卡的稳定性；退火的步骤是：在90℃加热5min，然后缓慢冷却到室温；

[0029] (5)加入染料SYBR Green I和荧光检测：用PBS缓冲液将SYBR Green I稀释成浓度为2.0×10–6mol L-1，然后加入到上述得到的表面固定有长的DNA双链的磁球中，室温静置10min，然后进行荧光检测，得荧光值；

[0030] 进一步地，所述荧光光度计的基本设置为：激发波长为477nm，扫描范围为500～600nm，激发狭缝宽度2.5nm，发射狭缝宽度2.5nm，PMT电压700V；

[0031] (6)计算：根据上述所测得的荧光值计算含有腺苷的待检测物中腺苷的浓度；

[0032] 进一步地，利用下述线性方程计算得到腺苷的浓度：

[0033] ΔF＝14.55+1769.72×104C，(r＝0.998)；

[0034] 其中，ΔF表示荧光净信号值，C表示腺苷的浓度，单位为mol L-1；该线性方程的线性范围是1.0×10-6mol L-1～1.2×10-4mol L-1之间。

[0035] 本发明的基于共区域化触发链式杂交反应的适体传感器的设计思路以及用于腺苷的检测的原理为：杂交链反应(HCR)是一组利用粘性末端介导的链迁移反应来实现信号放大的方法，整个反应是由碱基对形成是产生的自由能来驱动的。HCR反应是在等温、无酶的条件下进行的。与其它以酶为基础构建的放大方法相比，HCR更稳定，更价廉。但是，HCR反应中的非特异性反应是造成其背景信号的主要原因，也是限制其灵敏度的主要原因。因此，本发明将粘性末端区域与链迁移区域分开，利用目标物诱导两个区域发生共区域化，创造性的解决了传统HCR这种非特异性反应问题，构建了一种全新的、高灵敏的腺苷分析检测方法。

[0036] 共区域化的发生会催化发卡探针H1和H2进行自组装，形成一条长的双螺旋聚合物，SYBRGreen I是本设计中使用到的荧光信号标记分子，这种分子的特性是，在溶液中或是遇到单链DNA时几乎不发荧光，而当插入到双链DNA的股沟中之后，会产生明显增强的荧光信号，从而实现荧光检测。

[0037] 本发明具有如下有益效果：

[0038] (1)本发明的适体传感器具有检测灵敏度高、样品使用量小、无需酶放大等优势，可实现对低浓度腺苷的分析检测。

[0039] (2)通过共区域化诱导的链式杂交反应，降低了传统链式杂交反应的非特异性反应，提高了实验的灵敏度。

[0040] (3)通过磁性微球的分离作用，消除了复杂基质的干扰，可用于生物样本中腺苷的分析检测，无需任何前处理过程。

[0041] (4)本发明的适体传感器用于腺苷定量检测的检测方法具有较好的重现性和精密度，对腺苷具有良好的选择性，可实现在人尿样中对腺苷的检测。

附图说明

[0042] 图1：生物素化适体链-1(Bio-Apt-1)的固定示意简图。

[0043] 图2：腺苷诱导的共区域化示意简图。

[0044] 图3：共区域化触发的HCR反应示意简图。

[0045] 图4：插入SYBR Green I产生荧光示意简图。

[0046] 图5：腺苷诱导共区域化的适体传感器的工作原理示意图。

[0047] 图6：腺苷诱导共区域化的适体传感器的荧光图谱，其中，1：Bio-Apt-1+Apt-2；2：Bio-Apt-1+Apt-2+Adenosine；3：Bio-Apt-1+Apt-2+Adenosine+H1+H2。F:体系荧光强度；
Wavelength:扫描的体系发射波长；

[0048] 图7：腺苷浓度对体系荧光强度的影响示意图。

[0049] 图8：ΔF与腺苷浓度的线性关系示意图。

[0050] 图9：腺苷与其类似物的选择性实验结果示意图。

[0051] 图10：尿样中腺苷浓度对体系荧光强度的影响示意图(曲线)。

[0052] 图11：尿样中腺苷浓度对体系荧光强度的影响示意图(线性)。

[0053] 图12：尿样中的选择性考察示意图。

具体实施方式

[0054] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

[0055] 下述实施例中，未详尽描述的试剂、方法均为所属领域的常规试剂、方法。

[0056] 实施例1构建基于共区域化触发链式杂交反应的适体传感器，进行腺苷的检测[0057] (一)仪器和试剂

[0058] (1)仪器装置

[0059] 荧光分光光度计(F-2500型号，日本Hitachi)；电热恒稳培养箱(DNP-9052，上海精宏实验设备有限公司)；干式恒温器(K30，杭州奥盛仪器有限公司)；旋涡混合器(VDRTEX-5，海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；天平(H-101，上海康乐光电仪器有限公司)；电子天平(ME型号，梅特勒-托利多仪器有限公司)。

[0060] (2)试剂

[0061] 本实验所使用的核酸探针均由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成和提纯，如下所示：

[0062] 生物素化的适体链-1(Bio-Apt-1)为：

[0063] 5’-biotin-TTTTTTTTTTTT GTG CAA GTA CCA TT TAG ACC ACC TGG GGG AGT AT-3’(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)；

[0064] 适体链-2(Apt-2)序列为：

[0065] Apt-2：5’-ATA CTC CCC C AGGTGG TGT CTA GGA TTC GGC GTG-3’，(如SEQ ID NO.2所示)；

[0066] (注：Apt-2中斜体加粗序列是与Apt-1杂交的碱基)；

[0067] 发卡探针由发卡探针H1和发卡探针H2组成，其中，发卡探针H1的核苷酸序列为：

[0068] 5’-TGT CTA GGA TTC GGC GTG GGT TAA CAC GCC GAA TCC TAG ACA TGG TAC TTG CAC-3’(如SEQ ID NO.3所示)；

[0069] 发卡探针H2的核苷酸序列为：

[0070] 5’-TTA ACC CAC GCC GAA TCC TAG ACA GTG CAA GTA CCA TGT CTA GGA TTC GGC GTG-3’(如SEQ ID NO.4所示)。

[0071] DNA粉末先经高速离心(8000rpm，6min)，然后用适当体积的超纯水溶解混匀，配成浓度为100μM的储备液，最后分装成10μL的小体积置于-20℃保存备用。

[0072] 腺苷(Adenosine，≥ 99％)购于Sigma-Aldrich(上海，中国)。NMM(N-MethylMesoporphyrin IX)购于Frontier。40％丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺，过硫酰胺(APS)，四甲基乙二胺(TEMED)，溴化乙锭(EB)均购于上海生物工程有限公司(上海，中国)。6×上样缓冲液和DNA marker购于大连宝生物有限公司(大连，中国)。SYBR Green I购于百泰克生物技术有限公司(北京，中国)。人血清和人尿样均取自于山东大学校医院，肝癌病人尿样取自于山东省省立医院。

[0073] 试验中所有试剂均为分析纯，所用水均由Millipore Milli Q water(18.25MΩ.cm)制备。10×TAE/Mg(0.4mol L-1Tris，0.2mol L-1醋酸，2.0×10-2mol L-1EDTA-2Na，0.125mol L-1(CH3COO)2Mg.4H2O)。

[0074] TTL缓冲液：100mmol L-1Tris-HCl，0.1％Tween20，1mol L-1LiCl，pH8.0。

[0075] PBS缓冲液：0.15mol L-1的NaCl，7.6×10-3mol L-1的Na2HPO4，2.4×10-3mol L-1的NaH2PO4，pH＝7.4。

[0076] Tris-HCl杂交缓冲液：10mmol L-1Tris-HCl，pH7.4，300mmol L-1NaCl，1mmol L-1MgCl2。

[0077] 链霉亲和素修饰的磁性纳米球(简称磁球，1mL包装，密度为1.343g mL-1，直径为350nm，Bangs Laboratories，Carmel，IN，USA)。

[0078] 1mL的链酶亲和素化的磁球按照每份100μL的体积进行分装，放在-4℃冰箱保存备用。

[0079] (二)实验步骤

[0080] (1)链酶亲和素化修饰磁球的活化：为了防止磁球的聚集，磁球储备液中含有大量的表面活性剂，在使用前，需要先将这些表面活性剂洗去，以活化磁球的功能。活化方式为：

[0081] ①在离心管中加入200μL的TTL缓冲液和1μL链霉亲和素修饰的磁性纳米球，经充分震荡洗涤后(震荡5min)，将离心管置于磁球分离架上静置7min，移除溶液部分(用移液枪小心吸出溶液，弃去)；

[0082] ②重复上述①的操作5次，最后得到活化的链酶亲和素化修饰的磁性微球(1μL)，待用。

[0083] (2)生物素化适体链-1(Bio-Apt-1)的固定(示意简图如图1所示)：向上述活化好的1μL活化的链酶亲和素化修饰的磁性微球中加入50μL的浓度为2.0×10–6mol L-1的Bio-Apt-1，充分震荡混匀后，放于37℃恒温箱中孵育2h；反应完后，放于磁球分离架上，静置7min，移除溶液部分(用移液枪小心吸出溶液，弃去)；然后用200μL的Tris-HCl杂交缓冲液清洗两次，最后获得表面固定生物素化Apt-1的磁球。

[0084] (3)腺苷诱导的双适体的共区域化(示意简图如图2所示)：向上述步骤(2)制备得到的表面固定生物素化Apt-1的磁球中加入40μL的浓度为1.0×10–6mol L-1的Apt-2和10μL不同浓度的腺苷(浓度分别为：0，5.0×10–6mol L-1，1.0×10–5mol L-1，3.0×10–5mol L-1，5.0×10–5mol L-1，1.0×10–4mol L-1，1.2×10–4mol L-1，共7组)，充分震荡混匀后，放于37℃恒温箱中孵育2h；反应完后，放于磁球分离架上，静置7min，移除溶液部分(用移液枪小心吸出溶液，弃去)；然后用200μL的Tris-HCl杂交缓冲液清洗两次，最后获得腺苷诱导共区域化的Apt-1/Apt-2复合物；

[0085] (4)共区域化触发的链式杂交反应(HCR反应)(示意简图如图3所示)：在上述腺苷诱导共区域化的Apt-1/Apt-2复合物中加入发卡探针H1、H2的混合物(混合物中，发卡探针H1和H2的浓度相同，均为3.0×10–6mol L-1；)，总体积为50μL，充分震荡混匀后，放于37℃恒温箱中孵育3h；反应完后，放于磁球分离架上，静置7min，移除溶液部分(用移液枪小心吸出溶液，弃去)；然后用200μL的PBS缓冲液清洗两次(以除去未反应的发卡探针)，最后获得表面固定有长的DNA双链的磁球；

[0086] 发卡探针H1和H2在使用之前进行退火，目的是保证发卡的稳定性；退火的步骤是：在90℃加热5min，然后缓慢冷却到室温；

[0087] (5)加入染料SYBR Green I和荧光检测(示意简图如图4所示)：用PBS缓冲液将SYBRGreen I稀释成浓度为2.0×10–6mol L-1，然后加入到上述得到的表面固定有长的DNA双链的磁球中，室温静置10min，然后进行荧光检测，得荧光值；

[0088] 同时，设置两组对照，也加入染料SYBR Green I，进行荧光检测，一组对照为没有添加腺苷的Bio-Apt-1+Apt-2(即步骤3中，只添加Apt-2、不添加腺苷而得到的复合物，直接加入染料进行荧光检测)，另一组对照为Bio-Apt-1+Apt-2+Adenosine(即步骤3中的腺苷诱导共区域化的Apt-1/Apt-2复合物，直接加入染料进行荧光检测)；

[0089] 荧光光度计的基本设置为：激发波长为477nm，扫描范围为500～600nm，激发狭缝宽度2.5nm，发射狭缝宽度2.5nm，PMT电压700V。

[0090] (三)结果与讨论

[0091] (1)腺苷诱导共区域化的适体传感器的工作原理

[0092] 基于腺苷诱导共区域化触发HCR的适体传感器工作原理如图5所示：首先，通过链酶亲和素和生物素之间的特异性作用，将生物素化的适体链1(Apt-1)固定在磁球表面；然后加入腺苷和适体链2(Apt-2)，通过腺苷的“粘合”作用，使得Apt-1和Apt-2结合在一起，从而使得Apt-1连接的粘性末端区域和Apt-2连接的链置换区域发生共区域化，形成完整的引物链，可以进一步触发发卡结构H1和H2发生HCR反应；反应完后，加入内插染料SYBR GreenI，产生荧光信号。

[0093] (2)荧光实验验证

[0094] 图6的实验条件：CAdenosine＝1.0×10-4mol L-1，CApt-1＝2.0×10–6mol L-1，CApt-2＝1.0×10–6mol L-1，CH1＝3.0×10–6mol L-1，CH2＝3.0×10–6mol L-1，CSYBR Green I＝2.0×10–
6mol L-1，反应时间HCR2h，反应温度37℃。

[0095] 图6为体系的荧光光谱图，从图中可以看出，体系中没有腺苷时，Bio-Apt-1+Apt-2的荧光强度很低；加入腺苷后，Bio-Apt-1+Apt-2的荧光强度有所增加，说明腺苷可以诱导Apt-1和Apt-2发生共区域化，与电泳结果是一致的；在腺苷、Bio-Apt-1和Apt-2体系中加入H1和H2后，可以检测到很强的荧光信号，说明Apt-1和Apt-2的共区域化可以触发HCR反应，生成较长的DNA双链。该实验现象说明腺苷可以成功的诱导双适体发生共区域化，从而进一步触发HCR反应。

[0096] (3)系统条件优化

[0097] 为了获得较好的传感性能，对可能造成影响的实验条件进行了逐个优化，主要包括Apt-1的浓度、Apt-2的浓度、发卡H1和H2的浓度、HCR的反应时间和染料的浓度。最终选择的实验条件为：Apt-1的浓度为2.0×10–6mol L-1，Apt-2的浓度为1.0×10–6mol L-1，发卡H1、H2的浓度为3.0×10–6mol L-1，SYBR Green I的浓度为2.0×10–6mol L-1，HCR的反应时间为2h。

[0098] (4)腺苷的分析检测

[0099] 在最优实验条件(上述确定的)下，该体系对腺苷浓度的响应情况如图7所示，随着腺苷浓度的增加，体系的净荧光信号逐渐增大。所建立的适体传感系统的线性范围为1.0×10-6mol L-1～1.2×10–4mol L-1，线性回归方程为ΔF＝14.55+1769.72×104C(如图8所示)，相关系数r为0.998，方法对腺苷的检测限为2.0×10–7mol L-1。证明了本发明所构建的无酶、免标记和双重信号扩增的适体传感器可以成功用于腺苷的灵敏检测。

[0100] 图7的实验条件：CApt-1＝2.0×10–6mol L-1，CApt-2＝1.0×10–6mol L-1，CH1＝3.0×10–6mol L-1，CH2＝3.0×10–6mol L-1，CSYBR Green I＝2.0×10–6mol L-1，HCR反应时间2h，反应温度37℃。

[0101] 图8的实验条件：CApt-1＝2.0×10–6mol L-1，CApt-2＝1.0×10–6mol L-1，CH1＝3.0×10–6mol L-1，CH2＝3.0×10–6mol L-1，CSYBR Green I＝2.0×10–6mol L-1，HCR反应时间2h，温度
37℃。

[0102] (5)建立适体传感器的方法学验证

[0103] 为了验证基于发卡结构自组装的适体传感方法的精密度，本发明进行了日内实验和日间实验的相对标准偏差(RSD)的考察(N＝3)。最优实验条件下，选择1.0×10–5mol L-1、5.0×10–5mol L-1和1.0×10–4mol L-1三个浓度的三个样本进行实验。实验结果表明三个样本的RSD分别为1.7％、1.2％和0.7％，如表1所示。同样在上述三个浓度下，连续三次实验之间的RSD分别为3.9％、2.9％和1.9％(表2所示)，说明该适体传感方法具有良好的精密度。

[0104] 表1  日内精密度考察

[0105]

[0106] 表2  日间精密度考察

[0107]

[0108] 此外，为了考察该传感体系对腺苷检测的特异性识别作用，本发明对腺苷及其类似物进行了实验，结果如图9所示。在平行操作下，向反应体系中分别加入同样浓度的腺苷(A)、胞苷(C)、尿苷(U)及鸟苷(G)，观察到仅腺苷的加入能引起体系荧光信号明显的增强。此外，还将四种核苷混合加入到一个反应体系中，结果显示，腺苷类似物的存在并不干扰该体系对腺苷的测定，证明了该方法具有良好的选择性，能对腺苷和它的类似物进行有效的区分。

[0109] 图9的实验条件：CAdenosine/Cytidine/Uridine/Guanosine＝1.0×10-4mol L-1，CApt-1＝2.0×10–6mol L-1，CApt-2＝1.0×10–6mol L-1，CH1＝3.0×10–6mol L-1，CH2＝3.0×10–6mol L-1，CSYBR Green I＝2.0×10–6mol L-1，HCR反应时间2h，温度37℃。

[0110] 最后，为了考察方法在复杂生物基质中的分析性能，进行了人血清中不同浓度腺苷的回收率实验。由于该实验中应用了磁球的分离作用，因此可以避免生物样本对检测体系的影响，无需生物样本的前处理。实验结果如表3所示，腺苷在血清中的回收率在99.2％～104.7％之间，相对标准偏差在1.7％～3.2％，准确度和精密度均良好。

[0111] 表3  人血清中腺苷的样品回收率实验

[0112]

[0113] (6)生物样本中的分析应用

[0114] 尿液中腺苷的含量反映了腺嘌呤核苷酸的降解水平和细胞的异常增殖情况，它的定量检测对于癌症的早期诊断和病程的监控均具有很重要的意义。此外，在生理状态下直接检测腺苷波动在心、脑生理功能的研究中扮演重要的角色。因此，本发明进一步考察了该传感器对生物样本中腺苷的分析检测能力。

[0115] A.尿样中腺苷的校准曲线

[0116] 选取健康人尿液作为相对空白尿样，在空白尿样中加入不同浓度的腺苷标准液(浓度分别为：0，5.0×10–6mol L-1，1.0×10–5mol L-1，3.0×10–5mol L-1，5.0×10–5molL-1，–5 -1 –4 -1 –4 -17.5×10 mol L ，1.0×10 mol L ，1.2×10 mol L ，)，以测得荧光值(F)对加入腺苷浓度(C)做校准曲线，结果如图10、图11所示。由实验得知，该方法在尿样中的线性范围是1.0×10-6mol L-1～1.2×10-4mol L-1之间，线性方程是F＝217.2+1642.9×104C，(r＝0.997)。

[0117] 图10的实验条件：CApt-1＝2.0×10–6mol L-1，CApt-2＝1.0×10–6mol L-1，CH1＝3.0×–6 -1 –6 -1 –6 -110 mol L ，CH2＝3.0×10 mol L ，CSYBR Green I＝2.0×10 mol L ，HCR反应时间2h，反应温度37℃。

[0118] 图11的实验条件：CApt-1＝2.0×10–6mol L-1，CApt-2＝1.0×10–6mol L-1，CH1＝3.0×10–6mol L-1，CH2＝3.0×10–6mol L-1，CSYBR Green I＝2.0×10–6mol L-1，HCR反应时间2h，反应温度37℃。

[0119] B.尿样中的方法学验证

[0120] 为了证明本发明所建立方法适合于尿样腺苷的检测要求，对该适体传感器在尿液中的分析进行了方法学考察，主要包括精密度、选择性实验以及加样回收率实验。在最优实验条件下进行实验，结果证明该适体传感方法在尿液中具有良好的精密度，对腺苷具有很好的选择性识别作用，且准确可靠(如表4、表5、表6，图12所示)。

[0121] 表4  尿样中的日内精密度考察

[0122]

[0123] 表5尿样中的日间精密度考察

[0124]

[0125] 图12的实验条件：CAdenosine/Cytidine/Uridine/Guanosine＝1.0×10-4mol L-1，CApt-1＝2.0×10–6mol L-1，CApt-2＝1.0×10–6mol L-1，CH1＝3.0×10–6mol L-1，CH2＝3.0×10–6mol L-1，CSYBR Green I＝2.0×10–6mol L-1，HCR反应时间2h，温度37℃。

[0126] 表6  尿样中的回收率实验

[0127]

[0128] C.尿样中腺苷的检测

[0129] 用所建立的方法进行了尿液中腺苷含量的检测。选取人工尿液作为空白对照，用该校准曲线求得了所选取健康人尿液中腺苷的含量为4.8×10–6mol L-1，与文献报道人尿样正常腺苷浓度范围2.0×10–6mol L-1～7.0×10–6mol L-1相符，且用缓冲液中校准曲线计算所得该健康人尿样中腺苷浓度为4.9×10–6mol L-1，两种方法所得腺苷浓度相近，说明复杂生物基质并不影响该适体传感器的传感效能。最后，本发明进一步对癌症病人尿液中腺苷进行了检测。选取三个肝癌病人术前尿液进行检测，结果如表7所示。实验表明癌症病人尿样腺苷浓度约为正常腺苷浓度的5～10倍，明显高于正常人，与文献报道相符。

[0130] 表7  癌症病人尿液中的腺苷检测

[0131]

[0132] (7)结论

[0133] 基于目标物诱导共区域化触发的HCR，本发明构建了一个无酶、免标记和双重信号放大的新型腺苷适体传感器。该体系利用HCR和SYBR Green I产生双重放大的荧光信号，同时结合共区域化和磁球分离作用所实现的低背景，实现了腺苷无酶、免标记和高灵敏的检测。最重要的是，该方法可以消除复杂生物环境的干扰，实现生物样本中腺苷的直接检测，无需任何前处理。在最优实验条件下，该体系对腺苷的线性范围为1.0×10–6mol L-1～1.2–4 -1 4 -×10 mol L ，线性方程为ΔF＝14.55+1769.72×10 C(r＝0.998)，检测限为2.0×10
7molL-1。较Yu课题组酶辅助放大的腺苷适体传感器降低了60倍，较本课题组之前构建的无酶放大的腺苷适体传感器降低了约30倍。该方法无酶、免标记、设计简单、背景低，且能实现生物样本中腺苷的直接检测。此外，通过简单改变适体部分，该平台可用于其它目标物的分析检测，具有较高的通用性。