牛疙瘩皮肤病病毒Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒和检测方法

摘要

本发明公开了一种牛疙瘩皮肤病病毒Taqman—MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒和检测方法。本方法根据靶序列的1个区域设计2条引物和一条探针，该试剂盒包括2×Premix Ex TaqTM缓冲液、阳性对照、阴性对照和灭菌去离子水。本发明只需要两步法扩增法及简单的反应条件就可以快速、高效、特异性、高灵敏度地检测目的靶序列，且操作简便，不需要昂贵的仪器和试剂，对操作人员没有技术上的要求，检测成本低，检测时间短。

权利要求

1.牛疙瘩皮肤病病毒Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物及探针，其特征在于：包括牛疙瘩皮肤病病毒上游引物，其DNA序列为SEQ ID NO.1;牛疙瘩皮肤病病毒下游引物，其DNA序列为SEQ ID NO.2；

牛疙瘩皮肤病病毒MGB探针，其DNA序列为SEQ ID NO.3。

2.牛疙瘩皮肤病病毒Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用试剂盒，其特征在于：包括扩增反应液管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，其中：所述扩增反应液管，管内由以下反应液组成：

DNA序列为SEQ ID NO.1的10μmol/L的牛疙瘩皮肤病病毒上游引物1.0μL；

DNA序列为SEQ ID NO.2的10μmol/L的牛疙瘩皮肤病病毒下游引物1.0μL；

DNA序列为SEQ ID NO.3的10μmol/L的牛疙瘩皮肤病病毒MGB探针0.4μL；

2×Premix Ex Taq缓冲液 8μL；

灭菌去离子水 8.6μL；

合计19μL，为单次反应的用量；

所述阳性对照管，管内为牛疙瘩皮肤病病毒阳性重组质粒DNA，体积为20μL；

所述阴性对照管，管内为无牛疙瘩皮肤病病毒感染的牛组织基因组DNA，体积为20μL；

所述灭菌去离子水管 1mL～2mL。

3.根据权利要求2所述牛疙瘩皮肤病病毒Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用试剂盒，其特征在于：所述阳性重组质粒DNA由如下反应获得；

核苷酸序列为SEQ ID NO.4的PCR上游引物和核苷酸序列为SEQ ID NO.5的PCR下游引物按常规方法进行PCR扩增，将PCR扩增产物与pMD19-T载体进行连接反应获得所述阳性重组质粒DNA。

4.根据权利要求2所述牛疙瘩皮肤病病毒Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用试剂盒，其特征在于：所述DNA序列为SEQ ID NO.3的牛疙瘩皮肤病病毒MGB探针的5'端标记有报告基团VIC，3'端标记有非淬灭基团，同时还连接有MGB修饰基团。

5.利用权利要求2所述试剂盒进行牛疙瘩皮肤病病毒Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测的非疾病诊断目的的检测方法：包括如下步骤：

1）制备待检模板DNA：选用商品化的细胞培养液DNA提取试剂盒，提取待测样品中DNA，获得待检模板DNA；

2）扩增反应体系为：19μL扩增反应液；1μL待检模板DNA或阳性对照或阴性对照；反应体系的总体积为20μL;

3）牛疙瘩皮肤病病毒荧光定量PCR扩增：将步骤2）配制好的扩增反应体系进行PCR扩增，反应条件：预变性95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 34s 40个循环；在60℃ 34s进行荧光信号的采集；

4）结果判定：将扩增反应在35个循环以内且扩增曲线良好的反应直接判定为阳性，35个循环以后的可直接判定为阴性，同时阳性对照的扩增明显，阴性对照没有扩增。

说明书

牛疙瘩皮肤病病毒Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用

引物、试剂盒和检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及动物病毒分子生物学检验方法领域，具体涉及一种牛疙瘩皮肤病病毒Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒和检测方法。

背景技术

[0002] 牛疙瘩皮肤病（Lumpy skin disease,LSD）又称牛结节疹病或牛结节性皮肤病，是由牛疙瘩皮肤病病毒（Lumpy skin disease virus,LSDV）引起的一种牛的急性、亚急性传染病，各种牛均易感，被世界动物卫生组织（OIE）列为必须通报的动物疫病。该病的感染率为5%～85%，病死率为10%；其主要临床特征为病牛皮肤表面出现大量疙瘩样结节，体温升高至40℃以上，消瘦，产奶量聚减约50%。同时，还可致原发性和继发性肺炎，感染的患畜四肢因患滑膜炎和腱鞘炎而引起跛行，患病母畜流产，公畜暂时或永久不育，严重时导致死亡；皮张鞣制后具有凹陷或空洞而造成巨大的经济损失，对养牛业危害较大。

[0003] 该病于1929年在非洲的赞比亚地区首次发现，随后50年里LSD在非洲大陆广泛传播。1943年传播至波扎那 ，然后传入南非，引起800万头牛只发病，造成了重大的经济损失。1957年的肯尼亚出现该病并大流行。1971年苏丹出现此病后，LSDV跳过撒哈拉沙漠，1974年在乍得、尼日尔和尼日利亚被发现；1976年到达象牙海岸，接下来LSDV一直在非洲大陆周期性的爆发。1977年毛利塔尼亚、加纳、利比里亚均有该病的报道。1981～1986年,坦桑尼亚、肯尼亚、津巴布韦、索马里、喀麦隆均发生该病，死亡率在20%左右。1989年LSD在以色列爆发流行，同年以色列建立了非洲外第1个LSD实验室。2006年，埃及爆发LSD，从2006年1月7日到
4月9日294,576头牛感染该病，其中死亡771头。2006年9月4日，以色列农业部首席兽医官Moshe Chaimovitz博士宣布以色列发生LSD疫情，共有4000头牛发病。2007年莫桑比克发生LSD疫情，从1月6～17日，共有2856头牛发病。上述报道表明，在非洲之外的其他地区也有爆发LSD的危险性。如今，随着国际贸易的日益频繁，该病毒破击的范围也越来越大，对养殖业的危害也越来越严重。近年来，我国大量从国外引进种畜，而国内对该病毒还未见有相关研究，因此，为了防止该病毒通过从国外引进种畜或者进口肉制品而进入我国，在进境时加强对肉制品中牛疙瘩皮肤病病毒的检测显得尤为重要。

[0004] 荧光定量PCR技术是一种能够快速、准确的检测方法，且具有高灵敏度、高特异性、较高的稳定性。而TaqMan-MGB是一种新型的探针，3’端经特殊处理的高特异性探针，能检测模板结合区甚至1个碱基的突变基因，且本底荧光信号低，准确率高。本研究建立了针对TaqMan-MGB探针的优点，通过对牛疙瘩皮肤病病毒特异保守序列进行设计探针，建立了高度特异性、高灵敏度，并且稳定性好的检测方法。

[0005] TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团链接在探针的5，末端，淬灭基团则在3，端。当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3，端的淬灭基团接近而被淬灭。在进，行延伸反应时，聚合酶的5外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭基团分离，发射荧光。一分子的产物生成就会伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断的积累。因此，TaqMan探针检测的是积累荧光。目前，水解探针已被用于基因检测、病毒定量、癌细胞基因微突变检测、细胞因子基因定量等，其结果都具有高特异性与高敏感性。

[0006] TaqMan-MGB探针是近年来的一种新型探针，它的淬灭基团是一种非荧光的淬灭基团，本身不会发生荧光，这样就降低了PCR反应荧光本底信号的强度，进一步提高了其敏感性。

[0007] 中国发明专利（申请号为：200710030435.0、200710030437.X、200710132320.2、200710026389.7、200810052321.0、200810015001.8、200810093986.6、200910041358.8、
200910251055.9、200910090037.7、201010555073.9、201110339104.X等）分别公开了采用荧光定量PCR扩增技术检测病菌和动物疫病的方法。但是，目前尚无利用TaqMan-MGB探针荧光定量PCR扩增技术检测牛疙瘩皮肤病病毒的试剂盒及检测方法的报道。

发明内容

[0008] 为克服现有技术的不足，本发明的第一个目的是提供一种牛疙瘩皮肤病病毒TaqMa-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物，第二个目的是提供使用该引物用于牛疙瘩皮肤病病毒TaqMa-MGB探针实时荧光定量PCR检测的试剂盒，第三个目的是提供使用上述检测用引物的试剂盒的检测方法。

[0009] 为了实现上述第一目的本发明采用如下技术方案：本检测用引物包括牛疙瘩皮肤病病毒上游引物，其DNA序列为SEQ ID NO.1; 牛疙瘩皮肤病病毒下游引物，其DNA序列为SEQ ID NO.2；牛疙瘩皮肤病病毒MGB探针，其DNA序列为SEQ ID NO.3。

[0010] 为了实现上述第二目的本发明采用如下技术方案：一种牛疙瘩皮肤病病毒Taqman—MGB探针实时荧光定量PCR检测用试剂盒，包括扩增反应液管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，其中：

[0011] 所述扩增反应液管，管内由以下反应液组成：

[0012] DNA序列为SEQ ID NO.1的10μmol/L的牛疙瘩皮肤病病毒上游引物1μL；

[0013] DNA序列为SEQ ID NO.2的10μmol/L的牛疙瘩皮肤病病毒下游引物1μL；

[0014] DNA序列为SEQ ID NO.3的10μmol/L的牛疙瘩皮肤病病毒MGB探针0.4μL；

[0015] 2×Premix Ex TaqTM缓冲液 8μL；

[0016] 灭菌去离子水 8.6μL；

[0017] 合计19μL，为单次反应的用量；

[0018] 所述阳性对照管，管内为牛疙瘩皮肤病病毒阳性重组质粒DNA，体积为20μL；

[0019] 具体地，该阳性重组质粒DNA的制备为：核苷酸序列为SEQ ID NO.4的PCR上游引物和核苷酸序列为SEQ ID NO.5的PCR下游引物按常规方法进行PCR扩增，将PCR扩增产物与pMD19-T载体进行连接反应获得所述阳性重组质粒DNA;

[0020] 所述阴性对照管，管内为无牛疙瘩皮肤病病毒感染的牛组织基因组DNA，体积为20μL；

[0021] 所述灭菌去离子水管 1mL～2mL。

[0022] 为实现上述第三目的本发明提供一种牛疙瘩皮肤病病毒Taqman—MGB探针实时荧光定量PCR检测方法：包括如下步骤：

[0023] 1）制备待检模板DNA：选用商品化的细胞培养液DNA提取试剂盒，提取待测样品中DNA，获得待检模板DNA；

[0024] 2）扩增反应体系为：19μL扩增反应液；1μL待检模板DNA或阳性对照或阴性对照；反应体系的总体积为20μL;

[0025] 3）牛疙瘩皮肤病病毒荧光定量PCR扩增：将步骤2）配制好的扩增反应体系进行PCR扩增，反应条件：预变性95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 34s（使用ABI 7500议采用34s） 40个循环；在60℃ 34s进行荧光信号的采集。

[0026] 4）结果判定：将扩增反应在35个循环以内且扩增曲线良好的反应直接判定为阳性，35个循环以后的可直接判定为阴性，同时阳性对照的扩增明显，阴性对照没有扩增。

[0027] 本发明的原理是：针对一段靶序列保守区域设计2条引物和一条MGB探针，利用探针只与模板特异性地结合，其结合的位点在两条引物之间。探针的5，端标记有报告基团VIC，3，端标记有非淬灭基团，本身不产生荧光，可以大大降低本低信号的强度。同时探针上还连接有MGB修饰基团，可以将探针的Tm值提高10℃左右。因此为了获得同样的Tm值，可以将MGB探针设计的更短，既降低了合成车成本，也使得探针设计的成功率大为提高。这种实验方法所使用的仪器比较简单，同时克服了传统PCR 固有的检测时间长、容易污染及检测成本等缺点、此外，该检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简单，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。

[0028] TaqMan-MGB探针荧光定量PCR扩增技术是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增方法。将此基因扩增技术与普通PCR或普通的TaqMan探针技术进行比较，可发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上优于上面的技术，且不依赖于任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测。现有的60℃ 34s的检测周期较长，约1天，操作繁琐，而本发明的试剂盒仅需50min左右。

[0029] 本发明的优点是（1）、不需要特殊试剂与设备（；2）、高特异性：应用保守区段，二条引物及一条MGB探针，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，阳性率可达于99.6%，假阳性率小于0.1%；（3）、快速、高效扩增：检测时间50min左右（；4）、灵敏度高：最低检测极限达到1.48 拷贝/uL；（5）、鉴定简便：通过最后的扩增曲线就可以进行结果的精确的，无需电泳等其他任何分析步骤；（6）、用途：可用于畜产品及其相关产品的快速检测。

附图说明

[0030] 图1为特异性试验结果，图中横纵坐标表示扩增的循环数；

[0031] 图2为灵敏度试验结果，图中横纵坐标表示扩增的循环数;

[0032] 图3为稳定性试验结果，图中横纵坐标表示扩增的循环数；

[0033] 图4 为标准曲线的建立。

具体实施方式

[0034] 实施例1，引物的设计及筛选

[0035] 牛疙瘩皮肤病病毒荧光定量PCR扩增引物及探针，其设计是根据GenBank公布的牛疙瘩皮肤病病毒的参考序列，用MEGA5进行比对，分析序列并在其保守区域进行引物与探针的设计。采用探针设计软件Primer Express 3.0，设计2套荧光定量引物，由英骏（上海）有限公司合成，利用ABI 7500 FAST PCR仪对反应进程中的扩增情况进行实时监控，对不同引物组扩增的起始时间、进入最大扩增速率的时间、最大扩增速率及达到平台期所需时间等参数进行分析，筛选出扩增速率最高、特异性好的一组荧光定量PCR扩增引物，分别标记为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3。其中引物组中牛疙瘩皮肤病病毒上游引物: SEQ ID NO.1；牛疙瘩皮肤病病毒下游引物: SEQ ID NO.2；牛疙瘩皮肤病病毒探针: SEQ ID NO.3；SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3的浓度分别为10 μmol/L，10 μmol/L ，10 μmol/L，体积比为1:1:1。同时，利用PCR引物软件设计阳性重组质粒DNA的PCR引物，其核苷酸序列分别为：PCR上游引物：SEQ ID NO.4；PCR下游引物：SEQ ID NO.5；它们的体积比为1:1。

[0036] SEQ ID NO.1代表的序列为：5’- CCACCCCAATATTCTGCTGC -3’

[0037] SEQ ID NO.2代表的序列为：5’- ACATTAGGGAATCATGTGCAGTGA-3’

[0038] SEQ ID NO.3代表的序列为:5’ VIC-TCTTGCTAAAATgCCA-MGB 3’

[0039] SEQ ID NO.4代表的序列为：5’-TTGTCAGAAACGAGG-3’

[0040] SEQ ID NO.5代表的序列为：5’-ATGCCTCACTTGTATTTGG-3’

[0041] 实施例2，阳性对照品的制备

[0042] 用试剂盒提取牛疙瘩皮肤病病毒细胞培养物的核酸，将其核酸进行PCR及电泳鉴定，采用PCR上游引物SEQ ID NO.4和PCR下游引物SEQ ID NO.5进行扩增，并使用胶回收试剂盒回收扩增的条带。按照1：10的比例和PMD19-T载体进行连接反应，4℃连接过夜，转化DH5α菌，经抗性选择和PCR鉴定阳性后，再测序验证，利用分光光度计测定其核酸的OD值，使其260/280的比值在1.8~2.0之间。

[0043] 实施例3，阴性对照品的制备

[0044] 用试剂盒提取无牛疙瘩皮肤病病毒感染的牛组织的DNA，进行PCR及电泳鉴定。

[0045] 实施例4，牛疙瘩皮肤病病毒荧光定量PCR扩增快速检测方法：包括如下步骤：

[0046] 1）制备待检模板DNA：选用商品化的DNA提取试剂盒，提取样品中的DNA，获得待检模板DNA；

[0047] 2）扩增反应体系为：19μL扩增反应液；1μL待检模板DNA或阳性对照或阴性对照；反应体系的总体积为20μL;

[0048] 3）牛疙瘩皮肤病病毒荧光定量PCR扩增：将步骤2）配制好的扩增反应体系进行PCR扩增，反应条件：预变性95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 34s（使用ABI 7500建议采用34s） 40个循环；在60℃ 34s进行荧光信号的采集。

[0049] 4）结果判定：将扩增反应在35个循环以内且扩增曲线良好的反应直接判定为阳性，35个循环以后的可直接判定为阴性，同时阳性对照的扩增明显，阴性对照没有扩增。

[0050] 实施例5，牛疙瘩皮肤病病毒荧光定量PCR扩增的特异性试验

[0051] 采用实施例4的反应体系及反应条件进行特异性的试验，所采用的模板分别是牛疙瘩皮肤病病毒DNA，绵羊痘病毒DNA，山羊痘病毒DNA，牛痘病毒DNA，羊口疮病毒DNA，阴性对照。

[0052] 参见图1的结果显示：只有牛疙瘩皮肤病病毒有扩增曲线。图中两条曲线均表示牛疙瘩皮肤病病毒DNA扩增结果。

[0053] 实施例6，牛疙瘩皮肤病病毒荧光定量PCR扩增的灵敏度试验

[0054] 将所建立的牛疙瘩皮肤病病毒质控标准品进行10倍倍比稀释（1.48×109拷贝/μL~1.48拷贝/μL），采用实施例4的反应体系及反应条件进行灵敏度试验，结果显示出，建立的该方法最低能够检测出1.48拷贝/μL的DNA样品。

[0055] 参见图2的结果显示：图中的曲线从左到右分别表示倍比稀释后的模板浓度，依次分别为1.48×107拷贝/μL、1.48×106拷贝/μL、1.48×105拷贝/μL、1.48×104拷贝/μL、1.48×103拷贝/μL、1.48×102拷贝/μL、1.48×101拷贝/μL、1.48拷贝/μL。

[0056] 实施例7，牛疙瘩皮肤病病毒荧光定量PCR扩增的重复性试验

[0057] 以重组质粒标准品1.48×106拷贝/μL与 1.48×105 拷贝/μL为模板，采用实施例4的反应体系及反应条件进行重复性试验，组内与组间重复试验变异系数为0.45％~1.72％，表明该方法具有较好的重复性。

[0058] 参见图3的结果显示。

[0059] 实施例7，牛疙瘩皮肤病病毒荧光定量PCR扩增的标准曲线的建立

[0060] 把重组质粒的标准品进行五个倍比稀释，进行标准曲线的制作，以荧光强度的对数值为横坐标，循环数为纵坐标作图，得到标准曲线，相关系数R2=0.999，扩增效率达到108％，Y= -3.141X+38.54。由此可见本实验所建立的标准曲线的扩增效率较好，其荧光曲线与所检测的靶基因浓度之间的相关性较好，准确度较高。

[0061] 参见图4的结果显示。