绵羊痘病毒Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒和检测方法

摘要

本发明公开了一种绵羊痘病毒Taqman—MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒和检测方法。本方法根据靶序列的1个区域设计2条引物和一条探针，该试剂盒包括2×Premix Ex TaqTM缓冲液、阳性对照、阴性对照和灭菌去离子水。本发明只需要两步法扩增法及简单的反应条件就可以快速、高效、特异性、高灵敏度地检测目的靶序列，且操作简便，不需要昂贵的仪器和试剂，对操作人员没有技术上的要求，检测成本低，检测时间短。

权利要求

1. 绵羊痘病毒Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物及探针，其特征在于：包括绵羊痘病毒上游引物，其DNA序列为SEQ ID NO.1;绵羊痘病毒下游引物，其DNA序列为SEQ ID NO.2；

绵羊痘病毒MGB探针，其DNA序列为SEQ ID NO.3。

2.绵羊痘病毒Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用试剂盒，其特征在于：包括扩增反应液管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，其中：所述扩增反应液管，管内由以下反应液组成：

DNA序列为SEQ ID NO.1的10μmol/L的绵羊痘病毒上游引物1.0μL；

DNA序列为SEQ ID NO.2的10μmol/L的绵羊痘病毒下游引物1.0μL；

DNA序列为SEQ ID NO.3的10μmol/L的绵羊痘病毒MGB探针0.4μL；

2×Premix Ex Taq缓冲液 8μL；

灭菌去离子水 8.6μL；

合计19μL，为单次反应的用量；

所述阳性对照管，管内为绵羊痘病毒阳性重组质粒DNA，体积为20μL；

所述阴性对照管，管内为无绵羊痘病毒感染的羊组织基因组DNA，体积为20μL；

所述灭菌去离子水管 1mL～2mL。

3.根据权利要求2所述绵羊痘病毒Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用试剂盒，其特征在于：所述阳性重组质粒DNA由如下反应获得；

核苷酸序列为SEQ ID NO.4的PCR上游引物和核苷酸序列为SEQ ID NO.5的PCR下游引物按常规方法进行PCR扩增，将PCR扩增产物与pMD19-T载体进行连接反应获得所述阳性重组质粒DNA。

4.根据权利要求2所述绵羊痘病毒Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用试剂盒，其特征在于：所述DNA序列为SEQ ID NO.3的绵羊痘病毒MGB探针的5，端标记有报告基团NED，3，端标记有非淬灭基团，同时还连接有MGB修饰基团。

5.利用权利要求2所述试剂盒进行绵羊痘病毒Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测的非疾病诊断目的的检测方法，包括如下步骤：

1）制备待检模板DNA：选用商品化的细胞培养液DNA提取试剂盒，提取待测样品中DNA，获得待检模板DNA；

2）扩增反应体系为：19μL扩增反应液；1μL待检模板DNA或阳性对照或阴性对照；反应体系的总体积为20μL;

3）绵羊痘病毒荧光定量PCR扩增：将步骤2）配制好的扩增反应体系进行PCR扩增，反应条件：预变性95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 34s 40个循环；在60℃ 34s进行荧光信号的采集；

4）结果判定：将扩增反应在35个循环以内且扩增曲线良好的反应直接判定为阳性，35个循环以后的可直接判定为阴性，同时阳性对照的扩增明显，阴性对照没有扩增。

说明书

绵羊痘病毒Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物、试

剂盒和检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及动物疫病分子生物学检验方法及检验试剂领域，具体涉及一种绵羊痘病毒Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒和检测方法。

背景技术

[0002] 绵羊痘病毒（Sheeppox virus,SPPV）属羊痘病毒属（Capripoxvirus）病毒，可引起动物的绵羊痘，患病羊主要表现为发热，皮肤、黏膜、器官表面广泛性丘疹或结节，淋巴结肿大，皮肤水肿，感染动物消瘦，产乳量大幅度降低，严重时导致死亡，给养殖业带来较大的危害，造成严重的经济损失。绵羊痘与山羊痘并称“羊痘”，可以感染人，因而在公共卫生方面还具有重要意义(Key S J．，2007)。绵羊痘病毒和山羊痘病毒的某些分离毒株可同时感染山羊和绵羊(Ahmed A M．，2007)，临床症状和发病机理上相似，传统的病原学检测方法操作复杂，不适宜用于临床的检测，且与其他痘病毒在血清上存在交叉反应，血清型检测方法也难以区分确定。近年来，越来越多新型检测技术被应用于山羊痘病毒和绵羊痘病毒的检测和鉴别。Madhusudan H等人利用PCR-RFLP技术对山羊痘病毒和绵羊痘病毒进行了研究，可以用于这两种病毒的分类及鉴定(Madhusudan H．，2004)。但这种技术在聚合酶链式反应之后还需要对产物进行纯化和酶切，较费时费力。而目前国内外其他一些检测技术也不能区别检测这两种病毒，由此发明一种可鉴别检测绵羊痘病毒的方法，对这两种病毒及羊痘病毒属病毒的研究具有重要意义。在羊痘病毒检测方面，尚未有利用TaqMan-MGB荧光定量方法鉴别绵羊痘的检测方法。根据上述内容中羊痘可以感染人，对人类使用含有该病毒的肉制品，可能使人患病，因此对食品安全的监督和检测有重大的意义。

[0003] 由于该病毒的传染性极强，因此对于本病的防控就显得尤为重要。荧光定量PCR技术是一种能够快速、准确的检测方法，且具有高灵敏度、高特异性、较高的稳定性。而TaqMan-MGB是一种新型的探针，3’端经特殊处理的高特异性探针，能检测模板结合区甚至1个碱基的突变基因，且本底荧光信号低，准确率高。

[0004] TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团链接在探针的5，末端，淬灭基团则在3，端。当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3，端的淬灭基团接近而被淬灭。在进行延伸反应时，聚合酶的5，外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭基团分离，发射荧光。一分子的产物生成就会伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断的积累。因此TaqMan探针检测的是积累荧光。目前，水解探针已被用于基因检测、病毒定量、癌细胞基因微突变检测、细胞因子基因定量等，其结果都具有高特异性与高敏感性。

[0005] TaqMan-MGB探针是近年来的一种新型探针，它的淬灭基团是一种非荧光的淬灭基团，本身不会发生荧光，这样就降低了PCR反应荧光本底信号的强度，进一步提高了其敏感性。

[0006] 中国发明专利（申请号为：200710030435.0、200710030437.X、200710132320.2、200710026389.7、200810052321.0、200810015001.8、200810093986.6、200910041358.8、
200910251055.9、200910090037.7、201010555073.9、201110339104.X等）分别公开了采用荧光定量PCR扩增技术检测病菌和动物疫病的方法。但是，目前尚无利用TaqMan—MGB探针荧光定量PCR扩增技术检测绵羊痘病毒的试剂盒及检测方法的报道。

发明内容

[0007] 为克服现有技术的不足，本发明建立了针对TaqMan-MGB探针的优点，通过对绵羊痘病毒特异保守序列进行设计探针，建立了高度特异性、高灵敏度，并且稳定性好的检测方法。本发明的第一个目的是提供一种绵羊痘病毒TaqMa-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物，第二个目的是提供使用该引物用于绵羊痘病毒TaqMa-MGB探针实时荧光定量PCR检测的试剂盒，第三个目的是提供使用上述检测用引物的试剂盒的检测方法。

[0008] 为了实现上述第一目的本发明采用如下技术方案：本检测用引物包括绵羊痘病毒上游引物，其DNA序列为SEQ ID NO.1; 绵羊痘病毒下游引物，其DNA序列为SEQ ID NO.2；绵羊痘病毒MGB探针，其DNA序列为SEQ ID NO.3。

[0009] 为了实现上述第二目的本发明采用如下技术方案：一种绵羊痘病毒Taqman—MGB探针实时荧光定量PCR检测用试剂盒，包括扩增反应液管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，其中：

[0010] 所述扩增反应液管，管内由以下反应液组成：

[0011] DNA序列为SEQ ID NO.1的10μmol/L的绵羊痘病毒上游引物1μL；

[0012] DNA序列为SEQ ID NO.2的10μmol/L的绵羊痘病毒下游引物1μL；

[0013] DNA序列为SEQ ID NO.3的10μmol/L的绵羊痘病毒MGB探针0.4μL；

[0014] 2×Premix Ex TaqTM缓冲液 8μL；

[0015] 灭菌去离子水 8.6μL；

[0016] 合计19μL，为单次反应的用量；

[0017] 所述阳性对照管，管内为绵羊痘病毒阳性重组质粒DNA，体积为20μL；

[0018] 具体地，制备阳性重组质粒DNA的过程如下：核苷酸序列为SEQ ID NO.4的PCR上游引物和核苷酸序列为SEQ ID NO.5的PCR下游引物按常规方法进行PCR扩增，将PCR扩增产物与pMD19-T载体进行连接反应获得所述阳性重组质粒DNA;

[0019] 所述阴性对照管，管内为无绵羊痘病毒感染的羊组织基因组DNA，体积为20μL；

[0020] 所述灭菌去离子水管 1mL～2mL。

[0021] 为实现上述第三目的本发明提供一种绵羊痘病毒Taqman—MGB探针实时荧光定量PCR检测方法：包括如下步骤：

[0022] 1）制备待检模板DNA：选用商品化的细胞培养液DNA提取试剂盒，提取待测样品中DNA，获得待检模板DNA；

[0023] 2）扩增反应体系为：19μL扩增反应液；1μL待检模板DNA或阳性对照或阴性对照；反应体系的总体积为20μL;

[0024] 3）绵羊痘病毒荧光定量PCR扩增：将步骤2）配制好的扩增反应体系进行PCR扩增，反应条件：预变性95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 34s（使用ABI 7500议采用34s） 40个循环；在60℃ 34s进行荧光信号的采集。

[0025] 4）结果判定：将扩增反应在35个循环以内且扩增曲线良好的反应直接判定为阳性，35个循环以后的可直接判定为阴性，同时阳性对照的扩增明显，阴性对照没有扩增。

[0026] 本发明的原理是：针对一段500bp左右的靶序列保守区域设计2条引物和一条MGB探针，利用探针只与模板特异性地结合，其结合的位点在两条引物之间。探针的5，端标记有报告基团NED，3，端标记有非淬灭基团，本身不产生荧光，可以大大降低本低信号的强度。同时探针上还连接有MGB修饰基团，可以将探针的Tm值提高10℃左右。因此为了获得同样的Tm值，可以将MGB探针设计的更短，既降低了合成车成本，也使得探针设计的成功率大为提高。这种实验方法所使用的仪器比较简单，同时克服了传统PCR 固有的检测时间长、容易污染及检测成本等缺点、此外，该检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简单，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。

[0027] TaqMan-MGB探针荧光定量PCR扩增技术是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增方法。将此基因扩增技术与普通PCR或普通的TaqMan探针技术进行比较，可发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上优于上面的技术，且不依赖于任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测。现有的60℃ 34s的检测周期较长，约1天，操作繁琐，而本发明的试剂盒仅需50min左右。

[0028] 本发明的优点是（1）、不需要特殊试剂与设备（；2）、高特异性：应用保守区段，二条引物及一条MGB探针，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，阳性率可达于99.6%，假阳性率小于0.1%；（3）、快速、高效扩增：检测时间50min左右（；4）、灵敏度高：最低检测极限达到2.67 拷贝/uL；（5）、鉴定简便：通过最后的扩增曲线就可以进行结果的精确的，无需电泳等其他任何分析步骤；（6）、用途：可用于畜产品及其相关产品的快速检测。

附图说明

[0029] 图1为特异性试验结果，图中横纵坐标表示扩增的循环数；

[0030] 图2为灵敏度试验结果，图中横纵坐标表示扩增的循环数;

[0031] 图3为稳定性试验结果，图中横纵坐标表示扩增的循环数；

[0032] 图4为标准曲线的建立。

具体实施方式

[0033] 实施例1，引物的设计及筛选

[0034] 绵羊痘病毒荧光定量PCR扩增引物及探针，其设计是根据GenBank公布的绵羊痘病毒参考序列，用MEGA5进行比对，分析序列并在其保守区域进行引物与探针的设计。采用探针设计软件Primer Express 3.0，设计4套荧光定量引物，由英骏（上海）有限公司合成，利用ABI 7500 FAST PCR仪对反应进程中的扩增情况进行实时监控，对不同引物组扩增的起始时间、进入最大扩增速率的时间、最大扩增速率及达到平台期所需时间等参数进行分析，筛选出扩增速率最高、特异性好的一组荧光定量PCR扩增引物，分别标记为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3。其中引物组中引物上游: SEQ ID NO.1；引物下游: SEQ ID NO.2；探针: SEQ ID NO.3；SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3的浓度分别为10 μmol/L，10 μmol/L ，10 μmol/L，体积比为1:1:1。同时，利用PCR引物软件设计阳性重组质粒DNA的PCR引物，其核苷酸序列分别为：PCR上游引物：SEQ ID NO.4；PCR下游引物：SEQ ID NO.5；它们的体积比为1:1。

[0035] SEQ ID NO.1代表的序列为：5’- CCACCCCAATATTCTGCTGC -3’

[0036] SEQ ID NO.2代表的序列为：5’- ACATTAGGGAATCATGTGCAGTGA-3’

[0037] SEQ ID NO.3代表的序列为:5’ NED-CTTGCTAAAATtCCA-MGB 3’

[0038] SEQ ID NO.4代表的序列为：5’-TTGTCAGAAACGAGG-3’

[0039] SEQ ID NO.5代表的序列为：5’-ATGCCTCACTTGTATTTGG-3’

[0040] 实施例2，阳性对照品的制备

[0041] 用试剂盒提取绵羊痘病毒细胞培养物的核酸，将其核酸进行PCR及电泳鉴定，采用PCR上游引物SEQ ID NO.4和PCR下游引物SEQ ID NO.5进行扩增，并使用胶回收试剂盒回收扩增的条带。按照1：10的比例和PMD19-T载体进行连接反应，4℃连接过夜，转化DH5α菌，经抗性选择和PCR鉴定阳性后，再测序验证，利用分光光度计测定其核酸的OD值，使其260/280的比值在1.8~2.0之间。

[0042] 实施例3，阴性对照品的制备

[0043] 用试剂盒提取无绵羊痘病毒感染的羊组织的DNA，进行PCR及电泳鉴定。

[0044] 实施例4，绵羊痘病毒荧光定量PCR扩增快速检测方法：包括如下步骤：

[0045] 1）制备待检模板DNA：选用商品化的DNA提取试剂盒，提取样品中的DNA，获得待检模板DNA；

[0046] 2）扩增反应体系为：19μL扩增反应液；1μL待检模板DNA或阳性对照或阴性对照；反应体系的总体积为20μL;

[0047] 3）绵羊痘病毒荧光定量PCR扩增：将步骤2）配制好的扩增反应体系进行PCR扩增，反应条件：预变性95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 34s（使用ABI 7500建议采用34s） 40个循环；在60℃ 34s进行荧光信号的采集。

[0048] 4）结果判定：将扩增反应在35个循环以内且扩增曲线良好的反应直接判定为阳性，35个循环以后的可直接判定为阴性，同时阳性对照的扩增明显，阴性对照没有扩增。

[0049] 实施例5，绵羊痘病毒荧光定量PCR扩增的特异性试验

[0050] 采用实施例4的反应体系及反应条件进行特异性的试验，所采用的模板分别是绵羊痘病毒DNA，牛疙瘩皮肤病病毒DNA，山羊痘病毒DNA，牛痘病毒DNA，羊口疮病毒DNA，阴性对照。

[0051] 参见图1的结果显示：只有绵羊痘病毒有扩增曲线。图中两条曲线均表示绵羊痘病毒病毒DNA扩增结果。

[0052] 实施例6，绵羊痘病毒荧光定量PCR扩增的灵敏度试验

[0053] 将所建立的绵羊痘病毒质控标准品进行10倍倍比稀释（2.67×109拷贝/μL~2.67拷贝/μL），采用实施例4的反应体系及反应条件进行灵敏度试验，结果显示出，建立的该方法最低能够检测出2.67拷贝/μL的DNA样品。

[0054] 参见图2的结果显示：图中的曲线从左到右分别表示倍比稀释后的模板浓度，依次分别为2.67×107拷贝/μL、2.67×106拷贝/μL、2.67×105拷贝/μL、2.67×104拷贝/μL、2.67×103拷贝/μL、2.67×102拷贝/μL、2.67×101拷贝/μL、2.67拷贝/μL。

[0055] 实施例7，绵羊痘病毒荧光定量PCR扩增的重复性试验

[0056] 以重组质粒标准品2.67×106拷贝/μL与 2.67×105 拷贝/μL为模板，采用实施例4的反应体系及反应条件进行重复性试验，组内与组间重复试验变异系数为0.45％~1.68％，表明该方法具有较好的重复性。

[0057] 参见图3的结果显示。

[0058] 实施例7，绵羊痘病毒荧光定量PCR扩增的标准曲线的建立

[0059] 把重组质粒的标准品进行五个倍比稀释，进行标准曲线的制作，以荧光强度的对数值为横坐标，循环数为纵坐标作图，得到标准曲线，相关系数R2=0.999，扩增效率达到103.2％，Y= -3.351X+42.43。由此可见本实验所建立的标准曲线的扩增效率较好，其荧光曲线与所检测的靶基因浓度之间的相关性较好，准确度较高。

[0060] 参见图4的结果显示。