本发明公开了超高效液相色谱技术测定血清中9种脂溶性维生素的方法，所述的9种脂溶性维生素分别为：维生素A、α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、辅酶Q10、番茄红素和叶黄素；采用超高效液相色谱仪检测经过预处理的血清中的上述9种脂溶性维生素，通过样品的响应值的大小与标准品的比较计算上述9种脂溶性维生素的含量。本发明方法的优势是：节省样品，200微升样品，可以实现九种脂溶性维生素分析；节约时间，将最佳吸收波长不同的九种目标组分整合在一个方案中在12.5分钟内可以完成分离分析；节约成本，避免大量有机试剂消耗及仪器损耗。
1.超高效液相色谱技术测定血清中9种脂溶性维生素的方法，其特征在于，所述的9种脂溶性维生素分别为：维生素A、α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、辅酶Q10、番茄红素和叶黄素；
采用超高效液相色谱仪检测经过预处理的血清中的上述9种脂溶性维生素，通过样品的响应值的大小与标准品的比较计算上述9种脂溶性维生素的含量，具体色谱条件为：(1)色谱柱型号：BEH C18 1.7μm*2.1μm*50mm；
流动相梯度见表1，流动相按照表1中的梯度保留时间均匀变化；
(3)流速：初始流速0.2mL/min，匀速提升至4.51分钟时升到0.3mL/min，8.51分钟再匀速下降，至8.6分钟时降至0.2mL/min；
(5)采用可调紫外可见光检测器，进行多波长切换，具体波长切换条件见表2；
其中，所述的经过预处理的血清按照如下方法制备得到：取200μL血清加入1.5mL离心管中，向其中加入200μL冷冻乙醇涡漩2min，加入800μL冷冻的0.4g/L 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚的正己烷溶液，1500rpm涡漩10min，3000rpm离心20min，取出上清液，离心后的沉淀部分加入800μL冷冻的0.4g/L 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚的正己烷溶液，
1500rpm涡漩10min，3000rpm离心20min，合并上清液，氮气流上吹至近干，然后用100μL冷冻乙醇复溶涡旋60s，过0.2μm滤膜。
2.根据权利要求1所述的超高效液相色谱技术测定血清中9种脂溶性维生素的方法，其特征在于，所述的血清为人或动物的血清。
3.根据权利要求1所述的超高效液相色谱技术测定血清中9种脂溶性维生素的方法，其特征在于，所述的标准品按照如下步骤制备得到：(a)标准品母液配制：分别称取维生素A 8.8mg、δ-生育酚10mg、γ-生育酚10mg、α-生育酚9.11mg，分别加入1mL含有0.4g/L 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚的乙醇溶液，另称取α-胡萝卜素10mg、β-胡萝卜素17.12mg、蕃茄红素10mg、辅酶Q10 5mg、叶黄素20mg分别定容于2mL、10mL、1mL、1mL、10mL正己烷中，分别得到各自标准品母液；
(b)校正液配制：分别从维生素A、α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚母液中移取
40μL、80μL、40μL、20μL标准品母液用乙醇定容至1000μL得到校正液A，分别从α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、蕃茄红素、辅酶Q10、叶黄素母液中移取40μL、200μL、20μL、
100μL、50μL标准品母液用正己烷定容至1000μL得到校正液B，分别取A、B各20μL用乙醇定容至1000μL，得到9种维生素标准品混合母液C，分别取其中12.5μL、25μL、50μL、
200μL、500μL用空白血清基质溶液定容至1000μL，得到5个浓度标准校正点S1、S2、S3、S4、S5，具体数值见表3；
(c)标准品处理：将上述所得S1、S2、S3、S4、S5五个浓度标准校正点各取200μL转移至1.5mL离心管中，向其中加入200μL乙醇，涡旋数秒，加入800μL冷冻0.4g/L 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚的正己烷溶液，1500rpm涡漩10min，3000rpm离心20min，待离心结束后，取出上清液，离心后的沉淀部分加入800μL冷冻0.4g/L 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚的正己烷溶液，1500rpm涡漩10min，3000rpm离心20min，合并上清液，在氮气流上吹至近干，然后用100μL冷冻乙醇复溶涡旋60s，过0.2μm滤膜。
4.根据权利要求3所述的超高效液相色谱技术测定血清中9种脂溶性维生素的方法，其特征在于，步骤(b)中，所述的空白血清基质溶液，是将4g牛血清蛋白用水定容至100mL制得。
5.根据权利要求2或3所述的超高效液相色谱技术测定血清中9种脂溶性维生素的方法，其特征在于，所述的冷冻乙醇为在－20℃条件下放置30min以上的乙醇。
超高效液相色谱技术测定血清中9种脂溶性维生素的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种超高效液相色谱技术测定血清中9种脂溶性维生素的方法，属于分析检测技术领域。
背景技术
[0002] 脂溶性维生素泛指可溶于脂肪及脂溶剂的一类维生素。本发明主要针对其中对人体正常生长代谢及机能调节至关重要的9种维生素进行分析，包括维生素A、α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、辅酶Q10、番茄红素和叶黄素。
[0003] 其中，维生素A对于良好的视力、胚胎和婴儿的正常发育、免疫系统的功能、生长、骨骼的形成、繁殖及伤口的愈合都是必不可少的；α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚是维生素E的三种常见形式，它们是高度活跃的自由基清除剂，保护脂质膜不被氧化，α–生育酚阻抑了蛋白酶C的活性，γ–生育酚作为活性氮氧化物，是一种对抗在体内引发疾病的化合物的强大后卫；胡萝卜素中比较重要的β-胡萝卜素可以转换成维生素A，胡萝卜的摄入有助于消除动脉硬化、癌症、眼疾等疾病的发生；蕃茄红素是目前被发现的最强抗氧化剂之一，它可以有效防治因衰老、免疫力下降引起的各种疾病；辅酶Q10是一种强还原剂，能防止脂质过氧化；叶黄素是一种性能优异的抗氧化剂，可抵御氧自由基在人体内造成细胞与器官损伤，另外对于保护视力、降低白内障的发生率、延缓动脉硬化、抗癌等都有非常重要的意义。
[0004] 上述这些脂溶性维生素与人体正常生长发育，代谢功能都息息相关，其在血清中含量的检测对考察这些物质在体内的代谢途径、探查疾病机理以及考察某些药物的作用效果等等都有着指导意义。目前尚未见同时检测这9种物质的方法的报道。
发明内容
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种能够利用超高效液相色谱技术同时测定血清中9种脂溶性维生素的方法。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
[0007] 超高效液相色谱技术测定血清中9种脂溶性维生素的方法，所述的9种脂溶性维生素分别为：维生素A、α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、辅酶Q10、番茄红素和叶黄素；
[0008] 采用超高效液相色谱仪检测经过预处理的血清中的上述9种脂溶性维生素，通过样品的响应值的大小与标准品的比较计算上述9种脂溶性维生素的含量，具体色谱条件为：
[0009] (1)色谱柱型号：BEH C18 1.7μm*2.1μm*50mm；
[0010] (2)流动相：
[0011] 流动相A：0.1％v/v三氟乙酸水溶液；
[0012] 流动相B：乙醇；
[0013] 流动相C：0.1％v/v三氟乙酸甲醇溶液；
[0014] 流动相梯度见表1，流动相按照表1中的梯度保留时间均匀变化；
[0015] 表1 流动相梯度洗脱参数
[0016]
[0017] 表2 波长切换参数
[0018]
[0019] (3)流速：初始流速0.2mL/min，匀速提升至4.51分钟时升到0.3mL/min，8.51分钟再匀速下降，至8.6分钟时降至0.2mL/min；；
[0020] (4)柱温：30℃；
[0021] (5)采用可调紫外可见光检测器，进行多波长切换，具体波长切换条件见表2；
[0022] (6)进样量：1μL。
[0023] 其中，所述的血清为人或动物的血清。
[0024] 其中，所述的经过预处理的血清按照如下方法制备得到：取200μL血清加入1.5mL离心管中，向其中加入200μL冷冻乙醇涡漩2min，加入800μL冷冻的0.4g/L 2，
6-二叔丁基-4-甲基苯酚的正己烷溶液，1500rpm涡漩10min，3000rpm离心20min，取出上清液，离心后的沉淀部分加入800μL冷冻的0.4g/L 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚的正己烷溶液，1500rpm涡漩10min，3000rpm离心20min，合并上清液，氮气流上吹至近干，然后用
100μL冷冻乙醇复溶涡旋60s，过0.2μm滤膜。
[0025] 其中，所述的标准品按照如下步骤制备得到：
[0026] (a)标准品母液配制：分别称取维生素A 8.8mg、δ-生育酚10mg、γ-生育酚10mg、α-生育酚9.11mg，分别加入1mL含有0.4g/L 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚的乙醇溶液，另称取α-胡萝卜素10mg、β-胡萝卜素17.12mg(纯度99.9％)、蕃茄红素10mg(纯度90％)、辅酶Q105mg(纯度98％)、叶黄素20mg(纯度98％)分别定容于2mL、10mL、1mL、
1mL、10mL正己烷中，分别得到各自标准品母液；
[0027] (b)校正液配制：分别从维生素A、α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚母液中移取40μL、80μL、40μL、20μL标准品母液用乙醇定容至1000μL得到校正液A，分别从α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、蕃茄红素、辅酶Q10、叶黄素母液中移取40μL、200μL、20μL、100μL、50μL标准品母液用正己烷定容至1000μL得到校正液B，分别取A、B各20μL用乙醇定容至1000μL，得到9种维生素标准品混合母液C，分别取其中12.5μL、25μL、50μL、
200μL、500μL用空白血清基质溶液定容至1000μL，得到5个浓度标准校正点S1、S2、S3、S4、S5，具体数值见表3；
[0028] (c)标准品处理：将上述所得S1、S2、S3、S4、S5五个浓度标准校正点各取200μL转移至1.5mL离心管中，向其中加入200μL乙醇，涡旋数秒，加入800μL冷冻0.4g/L 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚的正己烷溶液，1500rpm涡漩10min，3000rpm离心20min，待离心结束后，取出上清液，离心后的沉淀部分加入800μL冷冻0.4g/L 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚的正己烷溶液，1500rpm涡漩10min，3000rpm离心20min，合并上清液，在氮气流上吹至近干，然后用100μL冷冻乙醇复溶涡旋60s，过0.2μm滤膜。
[0029] 表3 9种维生素对应线性浓度范围单位μg/mL
[0030]
[0031] 步骤(b)中，所述的空白血清基质溶液，是将4g牛血清蛋白用水定容至100mL制得。
[0032] 步骤(c)中，所述的冷冻乙醇为在－20℃条件下放置30min以上。
[0033] 有益效果：本发明与现有技术相比具有如下优势：
[0034] 1、节省样品，200微升样品，可以实现九种脂溶性维生素分析；
[0035] 2、节约时间，将最佳吸收波长不同的九种目标组分整合在一个方案中在12.5分钟内可以完成分离分析；
[0036] 3、节约成本，避免大量有机试剂消耗及仪器损耗。
附图说明
[0037] 图1为9种脂溶性维生素标准品色谱图。
[0038] 图2为血清样品中9种脂溶性维生素色谱图。
[0039] 图3为9种脂溶性维生素标准品的线性曲线图。
具体实施方式
[0040] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0041] 实施例1：
[0042] 1.材料
[0043] (1)仪器：超高效液相色谱仪(UPLC，美国Waters公司，H-class型)；医用高速冷冻离心机(北京白洋医疗器械有限公司)；超纯水仪(成都优普超纯科技有限公司)；多管涡旋混合仪(杭州奥盛仪器有限公司)；快速混匀器(姜堰市康泰医疗器材厂)；氮吹仪(MD200，杭州奥盛仪器有限公司)；可调移液器(Thermo Scientific 5～50μL，10～100μL，20～200μL，100～1000μL)；玻璃仪器、烧杯、量筒等。
[0044] (2)试剂耗材：甲醇(HPLC级，Tedia High Purity Solvent Company.Inc)；乙 醇(HPLC 级，Anaqua Chemicals Supply)；正 己 烷 (HPLC级，Scharlab S.L)；三氟乙酸(Sigma-Aldrich)；超纯水；2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(Sigma-Aldrich)；
BSA(Sigma-Aldrich)；BEH-C18色谱柱(Waters公司)；
[0045] (3)标准品：维生素A、δ-生育酚、γ-生育酚、α-生育酚、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、蕃茄红素、辅酶Q10、叶黄素(分别购自国药生物制品检定所和Sigma公司)。
[0046] 2.方法
[0047] 超高效液相色谱技术测定血清中9种脂溶性维生素的方法，所述的9种脂溶性维生素分别为：维生素A、α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、辅酶Q10、番茄红素和叶黄素；
[0048] 采用超高效液相色谱仪检测经过预处理的血清中的上述9种脂溶性维生素，通过样品的响应值的大小与标准品的比较计算上述9种脂溶性维生素的含量，具体色谱条件为：
[0049] (1)色谱柱型号：BEH C18 1.7μm*2.1μm*50mm；
[0050] (2)流动相：
[0051] 流动相A：0.1％v/v三氟乙酸水溶液；
[0052] 流动相B：乙醇；
[0053] 流动相C：0.1％v/v三氟乙酸甲醇溶液；
[0054] 流动相梯度见表1，流动相按照表1中的梯度保留时间均匀变化；
[0055] (3)流速：初始流速0.2mL/min，匀速提升至4.51分钟时升到0.3mL/min，8.51分钟再匀速下降，至8.6分钟时降至0.2mL/min；
[0056] (4)柱温：30℃；
[0057] (5)采用可调紫外可见光检测器，进行多波长切换，具体波长切换条件见表2；
[0058] (6)进样量：1μL。
[0059] 其中，所述的血清为人或动物的血清。
[0060] 其中，所述的经过预处理的血清按照如下方法制备得到：取200μL血清加入1.5mL离心管中，向其中加入200μL冷冻乙醇涡漩2min，加入800μL冷冻的0.4g/L 2，
6-二叔丁基-4-甲基苯酚的正己烷溶液，1500rpm涡漩10min，3000rpm离心20min，取出上清液，离心后的沉淀部分加入800μL冷冻的0.4g/L 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚的正己烷溶液，1500rpm涡漩10min，3000rpm离心20min，合并上清液，氮气流上吹至近干，然后用
100μL冷冻乙醇(－20℃条件下放置30min以上的乙醇)复溶涡旋60s，过0.2μm滤膜。
[0061] 其中，所述的标准品按照如下步骤制备得到：
[0062] (a)标准品母液配制：分别称取维生素A 8.8mg、δ-生育酚10mg、γ-生育酚10mg、α-生育酚9.11mg，分别加入1mL含有0.4g/L 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚的乙醇溶液，另称取α-胡萝卜素10mg、β-胡萝卜素17.12mg(纯度99.9％)、蕃茄红素10mg(纯度90％)、辅酶Q105mg(纯度98％)、叶黄素20mg(纯度98％)分别定容于2mL、10mL、1mL、
1mL、10mL正己烷中，分别得到各自标准品母液；
[0063] (b)校正液配制：分别从维生素A、α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚母液中移取40μL、80μL、40μL、20μL标准品母液用乙醇定容至1000μL得到校正液A，分别从α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、蕃茄红素、辅酶Q10、叶黄素母液中移取40μL、200μL、20μL、100μL、50μL标准品母液用正己烷定容至1000μL得到校正液B，分别取A、B各20μL用乙醇定容至1000μL，得到9种维生素标准品混合母液C，分别取其中12.5μL、25μL、50μL、
200μL、500μL用空白血清基质溶液定容至1000μL，得到5个浓度标准校正点S1、S2、S3、S4、S5，具体数值见表3；
[0064] (c)标准品处理：将上述所得S1、S2、S3、S4、S5五个浓度标准校正点各取200μL转移至1.5mL离心管中，向其中加入200μL乙醇，涡旋数秒，加入800μL冷冻0.4g/L 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚的正己烷溶液，1500rpm涡漩10min，3000rpm离心20min，待离心结束后，取出上清液，离心后的沉淀部分加入800μL冷冻0.4g/L 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚的正己烷溶液，1500rpm涡漩10min，3000rpm离心20min，合并上清液，在氮气流上吹至近干，然后用100μL冷冻乙醇复溶涡旋60s，过0.2μm滤膜。
[0065] 实施例2：性能验证。
[0066] 1.标准品分离谱图：9种脂溶性维生素完全分离，峰型比较对称，基本上没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的分离，色谱图见图1。
[0067] 表4 批内精密度试验结果
[0068]
[0069] 表5 批间精密度试验结果
[0070]
[0071] 2.血清样品分离谱图：血清样品中9种脂溶性维生素完全分离，有部分杂峰，但对于目标峰来说没有影响，血清中9种脂溶性维生素对应的色谱图见图2。
[0072] 3.精密度试验：取正常人血清样品一次重复处理6批，以外标法定量测定9种脂溶性维生素浓度，批内精密度(CV％)范围为0.487％～3.942％，结果见表4；另外取正常人血清样品分10批进行重复处理，以外标法定量测定9种脂溶性维生素浓度，计算批间精密度(CV％)范围为1.40％～6.93％。结果见表5。
[0073] 4.线性范围试验：按照配制好不同浓度的标准品溶液，以浓度为横坐标(X)，对应的峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，9种脂溶性维生素的线性回归方程及相关系数见表6，在对应浓度(见表3)范围内线性良好(线性曲线见图3，表6)，相关系数为0.9985～
1.000，平行测定6次相对标准偏差小于4％。
[0074] 表6 9种脂溶性维生素线性回归方程及线性相关系数
[0075]
[0076] 本方法通过单通道在不同时间多波长之间切换来实现一次进样同时分离并检测9种脂溶性维生素，即保证了检测灵敏度，又可以节省大量有机试剂，在前处理提取方面也可以提高分析效率，在准确度、精密度方面均可以达到我们对脂溶性维生素检测的要求，可作为人体血清中脂溶性维生素检测分析的可靠方法。
[0077] 从不同批次处理的结果来看，批内与批间都有不同程度的差异性，因部分维生素如维生素A对氧、酸、紫外线敏感，胡萝卜素类像番茄红素易被氧化，辅酶Q10见光易降解，这些影响因素均会导致测试结果偏差，为尽量排除外界环境干扰，在整个处理过程中，都要在暗室中进行操作，提取液中要加入抗氧化剂且尽量冷冻试验过程中所用试剂，排除溶解氧的干扰。
[0078] 本方法实现9种脂溶性维生素同时提取，试剂用量少，灵敏度高，分析时间12.5min，稳定性好，是准确、快速、稳定、可靠的分析方法。
