人源化的轻链小鼠

摘要

本发明提供了一种非人动物、组织、细胞和遗传物质，其包括对内源性非人源重链免疫球蛋白序列的修饰以及包括在小鼠中具有功能的ADAM6活性，其中所述非人动物表达人源免疫球蛋白重链可变结构域和同源的人源免疫球蛋白λ轻链可变结构域。

权利要求

1.一种非人动物，所述动物包括：

(a)在非人源免疫球蛋白轻链恒定区上游的一个或多个人源Vλ和Jλ基因区段的插入，(b)在非人源免疫球蛋白重链恒定区上游的一个或多个人源VH、一个或多个人源DH和一个或多个人源JH基因区段的插入，以及(c)编码ADAM6蛋白或其功能性片段的核苷酸序列，其中所述ADAM6蛋白由异位ADAM6核酸序列表达。

2.根据权利要求1所述的非人动物，其中所述非人源重链和/或轻链恒定区选自小鼠、大鼠或仓鼠恒定区。

3.根据权利要求1所述的非人动物，其中所述非人源轻链恒定区是啮齿动物恒定区。

4.根据权利要求1或2所述的非人动物，其中所述啮齿动物轻链恒定区是小鼠Cκ区。

5.根据权利要求1或2所述的非人动物，其中所述啮齿动物轻链恒定区是大鼠Cκ区。

6.根据权利要求1或2所述的非人动物，其中所述啮齿动物轻链恒定区是小鼠Cλ区。

7.根据权利要求1或2所述的非人动物，其中所述啮齿动物轻链恒定区是大鼠Cλ区。

8.根据前述任意一项权利要求所述的非人动物，其中所述非人动物包括至少12个到至少40个人源Vλ基因区段和至少一个人源Jλ基因区段。

9.根据权利要求8所述的非人动物，其中所述非人动物包括12个人源Vλ基因区段和至少一个人源Jλ基因区段。

10.根据权利要求8所述的非人动物，其中所述非人动物包括28个人源Vλ基因区段和至少一个人源Jλ基因区段。

11.根据权利要求8所述的非人动物，其中所述非人动物包括40个人源Vλ基因区段和至少一个人源Jλ基因区段。

12.根据前述任意一项权利要求所述的非人动物，其中所述至少一个人源Jλ基因区段选自Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ7及其组合。

13.根据前述任意一项权利要求所述的非人动物，其中所述非人动物包括至少四个人源Jλ基因区段。

14.根据权利要求13所述的非人动物，其中所述至少四个人源Jλ基因区段包括至少Jλ1、Jλ2、Jλ3和Jλ7。

15.根据前述任意一项权利要求所述的非人动物，其中所述编码ADAM6蛋白或其功能性片段的核苷酸序列在非人动物中是异位的。

16.根据前述任意一项权利要求所述的非人动物，其中所述编码ADAM6蛋白或其功能性片段的核苷酸序列存在于与野生型非人源ADAM6基因座相同的位置。

17.根据前述任意一项权利要求所述的非人动物，其中所述编码ADAM6蛋白或其功能性片段的核苷酸序列在非人动物的基因组中存在于异位位置。

18.根据前述任意一项权利要求所述的非人动物，其中所述编码ADAM6蛋白或其功能性片段的核苷酸序列存在于免疫球蛋白基因区段中。

19.根据权利要求18所述的非人动物，其中所述免疫球蛋白基因区段是重链基因区段。

20.根据权利要求19所述的非人动物，其中所述重链基因区段是人源的。

21.根据权利要求19所述的非人动物，其中所述重链基因区段是所述非人动物的内源性重链基因区段。

22.根据前述任意一项权利要求所述的非人动物，其中所述非人动物在内源性免疫球蛋白轻链基因座缺乏内源性免疫球蛋白VL和/或JL基因区段。

23.根据前述任意一项权利要求所述的非人动物，其中所述非人动物包括在所述非人动物中不能重排形成免疫球蛋白VL结构域的内源性免疫球蛋白VL和/或JL基因区段。

24.根据前述任意一项权利要求所述的非人动物，其中全部或基本上全部的内源性免疫球蛋白Vκ和Jκ基因区段被一个或多个人源Vλ和Jλ基因区段取代。

25.根据前述任意一项权利要求所述的非人动物，其中全部或基本上全部的内源性免疫球蛋白Vλ和Jλ基因区段被一个或多个人源Vλ和Jλ基因区段取代。

26.根据前述任意一项权利要求所述的非人动物，其中全部或基本上全部的内源性免疫球蛋白VL和JL基因区段在所述非人动物中是完好的，并且所述非人动物包括插入在内源性免疫球蛋白VL和/或JL基因区段与内源性免疫球蛋白轻链恒定区之间的一个或多个人源Vλ基因区段和一个或多个人源Jλ基因区段。

27.根据权利要求26所述的非人动物，其中所述完好的内源性免疫球蛋白VL和JL基因区段在非人动物中不能重排形成抗体的VL结构域。

28.根据前述任意一项权利要求所述的非人动物，其中所述非人动物还包括来自人源κ轻链基因座的人源Vκ-Jκ基因间区，其中所述人源Vκ-Jκ基因间区与一个或多个人源Vλ和Jλ基因区段邻近。

29.根据权利要求28所述的非人动物，其中所述人源Vκ-Jκ基因间区位于人源Vλ基因区段和人源Jλ基因区段之间。

30.一种来源于前述任意一项权利要求所述的非人动物的细胞或组织。

31.根据权利要求30所述的细胞或组织用于制备抗原结合蛋白的用途。

32.根据权利要求30所述的细胞或组织用于制备杂交瘤或四价体杂交瘤的用途。

33.根据权利要求31或32所述的用途，其中所述细胞是B细胞。

33.根据权利要求31或32所述的用途，其中所述组织来源于非人动物的脾脏、骨髓或淋巴结。

34.根据权利要求30所述的细胞或组织用于制备全人源抗体的用途。

35.根据权利要求30所述的细胞或组织用于制备人源Vλ结构域和/或人源VH结构域的用途。

36.根据权利要求31-35任意一项所述的用途，其中所述细胞或组织来源于小鼠。

37.一种制备与目标抗原结合的抗体的方法，其中所述方法包括：(a)将根据权利要求1-29任意一项所述的非人动物与目标抗原接触，(b)从所述非人动物中分离一个或多个B淋巴细胞，其中所述一个或多个B淋巴细胞表达与目标抗原结合的抗体，(c)鉴定编码与目标抗原结合的抗体的免疫球蛋白轻链的核酸序列，其中所述免疫球蛋白轻链包括人源Vλ结构域和非人源轻链恒定结构域，以及(d)采用(c)中所述的核酸序列和人源免疫球蛋白轻链恒定区核酸序列来制备与目标抗原结合的人源抗体。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述非人源轻链恒定区是小鼠Cκ。

39.根据权利要求37所述的方法，其中所述非人源轻链恒定区是小鼠Cλ。

40.根据权利要求37所述的方法，其中所述抗体包括免疫球蛋白重链，所述免疫球蛋白重链包括人源VH结构域和非人源CH结构域。

41.根据权利要求37-40任意一项所述的方法，其中所述非人动物是小鼠。

42.一种基因修饰的非人动物，所述动物包括：

(a)在非人动物内源性免疫球蛋白轻链基因座上的一个或多个未经重排的人源Vλ基因区段和一个或多个未经重排的人源Jλ基因区段，(b)在非人动物内源性免疫球蛋白重链基因座上的一个或多个人源VH基因区段、一个或多个人源DH基因区段和一个或多个人源JH基因区段，其中所述非人动物能够表达ADAM6蛋白或其功能性片段。

43.根据权利要求42所述的非人动物，其中所述非人动物表达包含重链和轻链的抗体，所述重链包括人源VH结构域和非人源重链恒定区，所述轻链包括人源Vλ结构域和非人源轻链恒定区。

44.根据权利要求42或41所述的非人动物，其中所述非人源轻链恒定结构域是Cκ或Cλ结构域。

45.根据权利要求42-44任意一项所述的非人动物，其中所述ADAM6蛋白或其功能性片段由在小鼠生殖细胞系中的异位序列来编码。

46.根据权利要求42-45任意一项所述的非人动物，其中所述ADAM6蛋白或其功能性片段由非人动物的内源性序列来编码。

47.根据权利要求42-46任意一项所述的非人动物，其中所述非人动物的内源性轻链基因座是免疫球蛋白λ轻链基因座。

48.根据权利要求42-46任意一项所述的非人动物，其中所述非人动物的内源性轻链基因座是免疫球蛋白κ轻链基因座。

49.根据权利要求42-48任意一项所述的非人动物，其中所述非人动物在内源性轻链基因座缺乏内源性VL和/或JL基因区段。

50.根据权利要求49所述的非人动物，其中所述VL和/或JL基因区段是Vκ和/或Jκ基因区段。

51.根据权利要求49所述的非人动物，其中所述VL和/或JL基因区段是Vλ和/或Jλ基因区段。

52.根据权利要求42-51任意一项所述的非人动物，其中所述非人动物的VL和JL基因区段被一个或多个人源Vλ和一个或多个人源Jλ基因区段取代。

53.根据权利要求52所述的非人动物，其中所述VL和JL基因区段是κ基因区段。

54.根据权利要求52所述的非人动物，其中所述VL和JL基因区段是λ基因区段。

55.根据权利要求42-54任意一项所述的非人动物，其中所述一个或多个人源Vλ基因区段来自人源免疫球蛋白λ轻链基因座的簇A的片段。

56.根据权利要求55所述的非人动物，其中所述簇A的片段从人源Vλ3-27延伸至人源Vλ3-1。

57.根据权利要求55所述的非人动物，其中所述簇A的片段从人源Vλ3-12延伸至人源Jλ1。

58.根据权利要求42-54任意一项所述的非人动物，其中所述一个或多个人源Vλ基因区段来自人源免疫球蛋白λ轻链基因座的簇B的片段。

59.根据权利要求58所述的非人动物，其中所述簇B的片段从人源Vλ5-52延伸至人源Vλ1-40。

60.根据权利要求42-54任意一项所述的非人动物，其中所述一个或多个人源Vλ基因区段来自所述人源免疫球蛋白λ轻链基因座的簇A的片段和簇B的片段。

61.根据权利要求42-60任意一项所述的非人动物，其中所述非人动物包括至少12个人源Vλ基因区段。

62.根据权利要求42-60任意一项所述的非人动物，其中所述非人动物包括至少28个人源Vλ基因区段。

63.根据权利要求42-60任意一项所述的非人动物，其中所述非人动物包括至少40个人源Vλ基因区段。

64.根据权利要求42-60任意一项所述的非人动物，其中所述至少一个人源Jλ基因区段选自下组：Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ7及其组合。

65.根据权利要求42-64任意一项所述的非人动物，其中所述非人动物是啮齿动物。

66.根据权利要求65所述的非人动物，其中所述啮齿动物是小鼠或大鼠。

67.权利要求42-66任意一项所述的非人动物制备抗原结合蛋白的用途。

68.根据权利要求67所述的用途，其中所述抗原结合蛋白是人源的。

69.根据权利要求67所述的用途，其中抗原结合蛋白是抗体。

70.一种来源于根据权利要求42-66任意一项所述的非人动物的细胞或组织。

71.根据权利要求70所述的细胞或组织，其中所述组织来源于脾脏、骨髓或淋巴结。

72.根据权利要求70所述的细胞或组织，其中所述细胞是B细胞。

73.根据权利要求70所述的细胞或组织，其中所述细胞是胚胎干(ES)细胞。

74.根据权利要求68所述的细胞或组织，其中所述细胞是生殖细胞。

75.一种具有生育能力的雄性非人动物，所述动物表达包括人源Vλ结构域或人源Vκ结构域的免疫球蛋白轻链和包括人源VH结构域的免疫球蛋白重链，其中所述雄性非人动物包括经修饰的重链可变区基因座和在雄性非人动物中具有功能的异位ADAM6基因。

76.根据权利要求75所述的具有生育能力的雄性非人动物，其中所述非人动物是小鼠。

说明书

人源化的轻链小鼠

发明领域

[0001] 基因修饰的具有生育能力的非人动物，所述动物表达与人源重链可变序列同源的人源免疫球蛋白λ轻链可变序列。本申请描述了基因修饰的小鼠、细胞、胚胎和组织，其包括编码在小鼠ADAM6基因座中有功能的ADAM6a的核酸序列，其中所述小鼠、细胞、胚胎和组织包括能够重排形成功能性免疫球蛋白轻链可变结构域的人源免疫球蛋白λ轻链基因区段。修饰包括人源和/或人源化的免疫球蛋白基因座。本申请描述了包括ADAM6功能的小鼠，包括含有编码ADAM6蛋白的异位核酸序列的小鼠。本申请描述了包括基因修饰的内源性小鼠免疫球蛋白VH区基因座并且还包括ADAM6活性的基因修饰的雄性小鼠，包括含有恢复雄性小鼠生育能力的异位核酸序列的小鼠。

[0002] 基因修饰的具有生育能力的非人动物，所述动物包括内源性ADAM6基因或者其同源物或直系同源物的缺失或修饰，并且所述动物包括全部或部分恢复ADAM6(或其同源物或直系同源物)功能的基因修饰，其中所述非人动物在λ或κ轻链恒定序列背景下表达人源免疫球蛋白λ可变序列。

[0003] 背景

[0004] 抗体在过去二十年的药学应用为大量制备适用于人用疗法的抗体的研究起到了推波助澜的作用。基于小鼠抗体的早期抗体疗法并不是理想的人用疗法，因为重复给予人小鼠抗体后会导致免疫原性问题，这个问题可能会干扰长期治疗方案。基于将小鼠抗体人源化以使抗体更加像人并且更少像小鼠的解决方案被开发出来。表达供抗体使用的人源免疫球蛋白序列的方法随之产生，这大部分是基于人源免疫球蛋白文库在噬菌体、细菌或酵母中的体外表达。最后，尝试从体外的人源淋巴细胞中，从植入人源造血细胞的小鼠中以及从使内源性免疫球蛋白基因座丧失功能的转染色体或转基因小鼠中来制备有用的人源抗体。在转基因小鼠中，使内源性小鼠免疫球蛋白基因丧失功能是必要的，这使得随机整合的全人源转基因作为小鼠中所表达的免疫球蛋白序列的来源。这种小鼠能够制备适合在人用疗法中使用的人源抗体，但是这些小鼠的免疫系统均存在严重的问题。这些问题(1)使得小鼠无法产生足够多样性的抗体库，(2)需要使用大量再工程化的修复，(3)可能是由于人与小鼠元件之间的不相容性提供了欠佳的克隆选择过程，以及(4)使得这些小鼠成为所需的真正用于制备人用疗法的、人源可变序列大量和多样性群体的不可靠来源。

[0005] 含有全人源抗体转基因的转基因小鼠包含随机插入的转基因，所述转基因包含与人源重链恒定序列连接的、未经重排的人源免疫球蛋白重链可变序列(V、D和J序列)以及与人源轻链恒定序列连接的、未经重排的人源免疫球蛋白轻链可变序列(V和J)。因此，所述小鼠从内源性小鼠基因座以外的基因座产生重排的抗体基因，其中所述重排的抗体基因是全人源的。尽管已经报道了具有至少一些人源λ序列的小鼠，但是在通常情况下，所述小鼠含有人源重链序列和人源κ轻链序列。转基因小鼠通常具有损坏的和非功能性的内源性免疫球蛋白基因座，或者内源性免疫球蛋白基因座敲除，以使得所述小鼠不能在内源性小鼠免疫球蛋白基因座上重排人源抗体序列。这种转基因小鼠的变化莫测使其不能理想地在小鼠中产生足够多样性的人源抗体库，这可能至少部分是由于在内源性小鼠选择系统中连接全人源抗体分子的是欠佳的克隆选择过程。

[0006] 在本领域中仍需要制备改进的基因修饰的非人动物，所述动物用于生产免疫球蛋白序列(包括人源抗体序列)以及用于生产足够多样性的人源抗体库。还需要一种小鼠，所述小鼠能够重排免疫球蛋白基因区段以形成有用的经重排的免疫球蛋白基因，包括与人源λ或人源κ可变结构域同源的人源重链可变结构域，或者所述小鼠能够由改变的免疫球蛋白基因座来制备蛋白，包括含有足够多样选择性的人源λ和/或人源κ轻链可变序列的基因座。需要一种非人动物，所述动物能够由人源κ和人源λ区段产生抗体可变区，其中所述人源κ和人源λ区段与人源重链可变结构域同源。还需要增加人源λ序列基因修饰动物的使用量。

[0007] 发明概述

[0008] 本申请描述了一种基因修饰的非人动物，所述动物包括可降低或消除了ADAM6基因或者其同源物或直系同源物活性的修饰，其中所述修饰造成是生育能力的丧失，并且所述动物还包括编码某种活性的序列，所述活性补足或挽救失去的或降低的ADAM6活性(或者同源物或直系同源物活性)，并且所述非人动物还包括某种修饰，所述修饰能够使其表达与人源免疫球蛋白λ轻链可变区具有同源性的人源免疫球蛋白重链可变区。在各种方面，所表达的人源免疫球蛋白λ轻链可变区与λ或κ恒定区融合。

[0009] 在各种方面，编码ADAM6活性的序列与人源免疫球蛋白序列相邻。在各种方面，编码ADAM6活性的序列与非人源免疫球蛋白序列相邻。在各种方面，所述序列与非人动物的内源性非人源免疫球蛋白重链基因座存在于相同的染色体上。在各种方面，所述序列与非人动物的免疫球蛋白重链基因座存在于不同的染色体上。

[0010] 本申请描述了一种基因修饰的非人动物，所述动物包括可维持ADAM6基因或者其同源物或直系同源物活性的修饰，其中所述修饰包括在非人源免疫球蛋白重链恒定区上游插入一个或多个人源免疫球蛋白重链基因区段，并且所述非人动物还包括某种修饰，所述修饰能够使其表达与人源免疫球蛋白重链可变区具有同源性的人源免疫球蛋白λ轻链可变区。在各种方面，所表达的人源免疫球蛋白λ轻链可变区与λ或κ恒定区融合。

[0011] 在各种方面，所述插入一个或多个人源免疫球蛋白重链基因区段是在非人动物ADAM6基因的3’端或其下游进行。在各种方面，所述插入一个或多个人源免疫球蛋白重链基因区段是以某种方式进行，使得非人动物的ADAM6基因不被破坏、缺失和/或功能性沉默，这样非人动物ADAM6的活性与不含这种插入的非人动物在相同或相当的水平。示例性的破坏、缺失和/或功能性沉默的修饰包括导致由非人动物DAM6基因编码的ADAM6蛋白的活性降低、消除和/或丧失的任意修饰。

[0012] 在一个方面，本申请提供了用于制备小鼠的核酸构建体、细胞、胚胎、小鼠和方法，所述小鼠包括导致产生无功能的内源性小鼠ADAM6蛋白或ADAM6基因(例如内源性ADAM6基因的敲除或缺失)的修饰，其中所述小鼠包括编码在雄性小鼠中具有功能的ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物或片段的核酸序列。

[0013] 在一个方面，本申请提供了用于制备小鼠的核酸构建体、细胞、胚胎、小鼠和方法，所述小鼠包括内源性小鼠免疫球蛋白基因座的修饰，其中所述小鼠包括在雄性小鼠中具有功能的ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物或片段。在一个实施方式中，所述内源性小鼠免疫球蛋白基因座是免疫球蛋白重链基因座，并且所述修饰降低或消除雄性小鼠细胞或组织的ADAM6活性。

[0014] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括编码小鼠ADAM6或者其直系同源物或同源物或功能性片段的异位核苷酸序列；本申请还提供了一种小鼠，所述小鼠包括编码小鼠ADAM6或者其直系同源物或同源物或功能性片段的内源性核苷酸序列，以及至少一个基因修饰的重链免疫球蛋白基因座。

[0015] 在一个方面，本申请提供了制备小鼠的方法，所述小鼠包括修饰的内源性小鼠免疫球蛋白基因座，其中所述小鼠包括在雄性小鼠中具有功能的ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物或片段。

[0016] 在一个方面，本申请提供了制备小鼠的方法，所述小鼠包括基因修饰的重链免疫球蛋白基因座，其中应用所述方法得到包括经修饰的重链免疫球蛋白基因座(或使其缺失)的雄性小鼠，并且所述雄性小鼠能够通过交配产生后代。在一个实施方式中，所述雄性小鼠能够生产精子，所述精子可以小鼠的子宫进入小鼠的输卵管使小鼠的卵子受精。

[0017] 在一个方面，本申请提供了一种制备小鼠的方法，所述小鼠包括基因修饰的免疫球蛋白重链基因座和免疫球蛋白轻链基因座，其中应用所述方法修饰重链基因座使得雄性小鼠显示出降低的生育能力，并且所述小鼠包括使降低的生育能力全部或部分恢复的基因修饰。在各种实施方式中，生育能力降低的特征为雄性小鼠的精子不能从小鼠的子宫迁移至小鼠的输卵管使小鼠的卵子受精。在各种实施方式中，生育能力降低的特征为精子显示出体内迁移缺陷。在各种实施方式中，使降低的生育能力全部或部分恢复的基因修饰是编码在雄性小鼠中具有功能的小鼠ADAM6基因或者其直系同源物或同源物或片段的核酸序列。

[0018] 在一个实施方式中，所述基因修饰包括使用另一物种(例如不是小鼠的物种)的免疫球蛋白重链可变基因座来取代内源性免疫球蛋白重链可变基因座。在一个实施方式中，所述基因修饰包括将直系同源的免疫球蛋白重链可变基因座插入内源性免疫球蛋白重链可变基因座。在一个特定的实施方式中，所述物种是人。在一个实施方式中，所述基因修饰包括内源性免疫球蛋白重链可变基因座的全部或部分缺失，其中所述缺失导致内源性ADAM6功能的丧失。在一个特定的实施方式中，内源性ADAM6功能的丧失与雄性小鼠生育能力的降低相关。

[0019] 在一个实施方式中，所述基因修饰包括内源性非人源免疫球蛋白重链可变基因座的全部或部分失活，其中所述失活不会导致内源性ADAM6功能的丧失。失活可以包括一个或多个内源性非人源基因区段的取代或缺失，以使得内源性非人源免疫球蛋白重链基因座基本上不能重排以编码包括内源性非人源基因区段的抗体重链。失活可以包括使得内源性免疫球蛋白重链基因座不能重排以编码抗体重链的其他修饰，其中所述修饰不包括内源性基因区段的取代或缺失。示例性的修饰包括通过分子技术介导的染色体翻转和/或转位，例如使用位点特异性重排位点的精确放置(例如Cre-lox技术)。其他的示例性修饰包括使非人源免疫球蛋白可变基因区段与非人源免疫球蛋白恒定区之间不能操作性连接。

[0020] 在一个实施方式中，所述基因修饰包括将DNA片段插入非人动物的基因组，所述DNA片段包括可操作地与一个或多个恒定区序列(例如IgM和/或IgG基因)连接的另一物种(例如不是小鼠的物种)的一个或多个人源VH基因区段、一个或多个人源DH基因区段和一个或多个人源JH基因区段。在一个实施方式中，所述DNA片段能够在非人动物的基因组中重排以形成编码抗体重链可变结构域的序列。在一个实施方式中，所述物种是人。在一个实施方式中，所述基因修饰包括将一个或多个人源免疫球蛋白重链基因区段插入到非人动物内源性ADAM6基因的下游或3’端，以使得ADAM6活性(例如编码蛋白的表达和/或功能)与不包括该插入的非人动物相同或相当。

[0021] 在一个方面，本申请提供了包括修饰的小鼠，所述修饰从内源性ADAM6等位基因上降低或消除小鼠ADAM6的表达，以使得由于内源性ADAM6功能的降低或消除，具有该修饰的雄性小鼠显示出降低的生育能力(例如通过交配产生后代的能力大大降低)，或者基本上是不育的，其中所述小鼠还包括异位ADAM6序列或者其同源物或直系同源物或功能性片段。在一个方面，所述降低或消除小鼠ADAM6表达的修饰是在小鼠免疫球蛋白基因座的修饰(例如插入、缺失、取代等)。

[0022] 在一个实施方式中，ADAM6功能的降低或丧失包括小鼠不能或基本上不能产生可以从小鼠子宫进入小鼠输卵管使小鼠卵子受精的精子。在一个特定的实施方式中，在小鼠的一次射精体积中至少约95％、96％、97％、98％或99％的精子细胞在交配后在体内不能进入输卵管并使小鼠的卵子受精。

[0023] 在一个实施方式中，ADAM6功能的降低或丧失包括在小鼠的精子细胞表面不能形成或基本上不能形成ADAM2和/或ADAM3和/或ADAM6的复合物。在一个实施方式中，ADAM6功能的丧失包括基本上不能通过与雌性小鼠交配来使小鼠的卵子受精。

[0024] 在一个方面，本申请提供了某种小鼠，所述小鼠缺乏功能性内源性ADAM6基因，但是包括使小鼠具有ADAM6功能的蛋白(或者编码蛋白的异位核苷酸序列)。在一个实施方式中，所述小鼠是雄性小鼠，并且所述功能包括与缺乏功能性内源性ADAM6基因的小鼠相比具有增强的生育能力。

[0025] 在一个实施方式中，所述蛋白由位于小鼠生殖细胞系免疫球蛋白基因座中的基因组序列编码。在一个特定的实施方式中，所述免疫球蛋白基因座是重链基因座。在另一个特定的实施方式中，所述重链基因座包括至少一个人源VH、至少一个人源DH和至少一个人源JH基因区段。在一个实施方式中，所述异位蛋白由小鼠生殖细胞系非免疫球蛋白基因座中的基因组序列编码。在一个实施方式中，所述非免疫球蛋白基因座是具有转录活性的基因座。在一个特定的实施方式中，所述具有转录活性的基因座是ROSA26基因座。在一个特定的实施方式中，所述具有转录活性的基因座与组织特异性表达相关。在一个实施方式中，所述组织特异性表达存在于生殖组织中。在一个实施方式中，所述蛋白由随机插入小鼠生殖细胞系中的基因组序列编码。

[0026] 在一个实施方式中，所述小鼠包括人源或嵌合的人源/小鼠或嵌合的人源/大鼠轻链(例如人源可变、小鼠或大鼠恒定)和嵌合的人源可变/小鼠或大鼠恒定重链。在一个特定的实施方式中，所述小鼠包括转基因，所述转基因包含与具有转录活性的启动子(例如ROSA26启动子)可操作连接的嵌合的人源可变/大鼠或小鼠恒定轻链基因。在进一步特定的实施方式中，在小鼠生殖细胞系中的所述嵌合的人源/小鼠或大鼠轻链转基因包括重排的人源轻链可变区序列。

[0027] 在一个实施方式中，所述异位核苷酸序列位于小鼠生殖细胞系的免疫球蛋白基因座中。在一个特定的实施方式中，所述免疫球蛋白基因座是重链基因座。在一个实施方式中，所述重链基因座包括至少一个人源VH、至少一个人源DH和至少一个人源JH基因区段。在一个实施方式中，所述异位核苷酸序列位于小鼠生殖细胞系的非免疫球蛋白基因座中。在一个实施方式中，所述非免疫球蛋白基因座是具有转录活性的基因座。在一个特定的实施方式中，所述具有转录活性的基因座是ROSA26基因座。在一个实施方式中，所述异位核苷酸序列的位置随机插入小鼠的生殖细胞系中。

[0028] 在一个方面，本申请提供了一种缺乏功能性内源性ADAM6基因的小鼠，其中所述小鼠包括对小鼠ADAM6功能的缺失进行补偿的异位核苷酸序列。在一个实施方式中，所述异位核苷酸序列使小鼠生育后代的能力与包含功能性内源ADAM6基因的野生型小鼠相当。在一个实施方式中，所述序列使小鼠具有在小鼠的精子细胞表面形成ADAM2和/或ADAM3和/或ADAM6复合物的能力。在一个实施方式中，所述序列使小鼠能够从小鼠子宫通过小鼠输卵管到小鼠的卵子以使小鼠的卵子受精。

[0029] 在一个实施方式中，缺乏功能性内源性ADAM6基因并且包括异位核苷酸序列的小鼠产生在六个月时间段内同龄和同品系的野生型小鼠至少约50％、60％、70％、80％或90％的整窝胎仔数。

[0030] 在一个实施方式中，所述缺乏功能性内源性ADAM6基因并且包括异位核苷酸序列的小鼠当在六个月时间段内交配时，与同龄和相同或类似品系但缺乏功能性内源性ADAM6基因并且缺乏异位核苷酸序列的小鼠在基本上相同的时间段和基本上相同的条件下交配相比，产生至少约1.5倍、约2倍、约2.5倍、约3倍、约4倍、约6倍、约7倍、约8倍或约10倍或者更多的后代。

[0031] 在一个实施方式中，所述缺乏功能性内源性ADAM6基因并且包括异位核苷酸序列的小鼠在4个月或6个月的交配期内，与缺乏功能性内源性ADAM6基因并且缺乏异位核苷酸序列且交配时间段相同的小鼠相比，产生的平均窝胎仔数高至少约2倍、3倍或4倍。

[0032] 在一个实施方式中，所述缺乏功能性内源性ADAM6基因并且包括异位核苷酸序列的小鼠是雄性小鼠，并且所述雄性小鼠产生的精子，当在交配后约5-6小时从输卵管中回收时反映的输卵管迁移，与缺乏功能性内源性ADAM6基因并且缺乏异位核苷酸序列的小鼠相比，为其至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、100倍、110倍或120倍或者更高。

[0033] 在一个实施方式中，所述缺乏功能性内源性ADAM6基因并且包括异位核苷酸序列的小鼠，当与雌性小鼠交配时产生的精子能够在约6小时内以同野生型小鼠的精子大致相同的效率通过子宫并且进入和通过输卵管。

[0034] 在一个实施方式中，所述缺乏功能性内源性ADAM6基因并且包括异位核苷酸序列的小鼠，与缺乏功能性ADAM6基因并且缺乏异位核苷酸序列的小鼠相比，在相当的时间段内产生约1.5倍、约2倍、约3倍或约4倍或者更多的整窝胎仔。

[0035] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠在其生殖细胞系中包括编码免疫球蛋白的非小鼠核酸序列，其中所述非小鼠免疫球蛋白序列包括插入小鼠ADAM6基因或者其同源物或直系同源物或功能性片段。在一个实施方式中，所述非小鼠免疫球蛋白序列包括人源免疫球蛋白序列。在一个实施方式中，所述序列包括人源免疫球蛋白重链序列。在一个实施方式中，所述序列包括人源免疫球蛋白轻链序列。在一个实施方式中，所述序列包括一个或多个V基因区段、一个或多个D基因区段和一个或多个J基因区段；在一个实施方式中，所述序列包括一个或多个V基因区段和一个或多个J基因区段。在一个实施方式中，所述一个或多个V、D和J基因区段或者一个或多个V和J基因区段是未经重排的。在一个实施方式中，所述一个或多个V、D和J基因区段，或者一个或多个V和J基因区段是经过重排的。在一个实施方式中，在一个或多个V、D和J基因区段或者一个或多个V和J基因区段重排后，所述小鼠在其基因组中包括至少一个编码小鼠ADAM6基因或者其同源物或直系同源物或功能性片段的核酸序列。在一个实施方式中，重排后所述小鼠在其基因组中包括至少两个编码小鼠ADAM6基因或者其同源物或直系同源物或功能性片段的核酸序列。在一个实施方式中，重排后所述小鼠在其基因组中包括至少一个编码小鼠ADAM6基因或者其同源物或直系同源物或功能性片段的核酸序列。在一个实施方式中，所述小鼠在B细胞中包括ADAM6基因或者其同源物或直系同源物或功能性片段。在一个实施方式中，所述小鼠在非B细胞中包括ADAM6基因或者其同源物或直系同源物或功能性片段。

[0036] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠表达来自内源性小鼠免疫球蛋白重链基因座的人源免疫球蛋白重链可变区或其功能性片段，其中所述小鼠包括在雄性小鼠中具有功能的ADAM6活性。

[0037] 在一个实施方式中，所述雄性小鼠在内源性ADAM6基因座包括单一未经修饰的内源性ADAM6等位基因或者其直系同源物或同源物或功能性片段。

[0038] 在一个实施方式中，所述雄性小鼠包括编码具有ADAM6功能的蛋白的异位小鼠ADAM6序列或者其同源物或直系同源物或功能性片段。

[0039] 在一个实施方式中，所述雄性小鼠在小鼠基因组中的一个位置包括ADAM6序列或者其同源物或直系同源物或功能性片段，该位置大致在内源性小鼠ADAM6等位基因的位置，例如V基因区段序列的3’端和初始D基因区段的5’端。

[0040] 在一个实施方式中，所述雄性小鼠在编码免疫球蛋白可变基因区段的核酸序列的上游、下游或者上游和下游(相对于ADAM6序列的转录方向)的翼侧包括ADAM6序列或者其同源物或直系同源物或功能性片段。在一个特定的实施方式中，所述免疫球蛋白可变基因区段是人源基因区段。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白可变基因区段是人源基因区段，并且在小鼠中具有功能的编码小鼠ADAM6或者其直系同源物或同源物或片段的序列位于人源V基因区段之间；在一个实施方式中，所述小鼠包括两个或多个人源V基因区段，并且所述序列位于最后一个V基因区段和倒数第二个V基因区段之间；在一个实施方式中，所述序列位于最后一个V基因区段和第一个D基因区段之间。

[0041] 在一个实施方式中，所述雄性小鼠在内源性免疫球蛋白基因座的一个位置包括ADAM6序列或者其同源物或直系同源物或功能性片段，所述位置与在野生型雄性小鼠中相同或基本上相同。在一个特定的实施方式中，所述内源性基因座不能编码抗体的重链可变区，其中所述可变区包括或来源于内源性非人源基因区段。在一个特定的实施方式中，所述内源性基因座位于雄性小鼠基因组中的一个位置上，这使其不能编码抗体的重链可变区。在各种实施方式中，所述雄性小鼠包括的ADAM6序列与人源免疫球蛋白基因区段位于相同的染色体上，并且所述ADAM6序列编码功能性ADAM6蛋白。

[0042] 在一个方面，本申请提供了一种雄性小鼠，所述小鼠在其生殖细胞系中包括无功能的内源性ADAM6基因或者内源性ADAM6基因的缺失；其中所述小鼠的精子细胞能够进入雌性小鼠的输卵管并且使卵子受精。

[0043] 在一个方面，本申请提供了一种雄性小鼠，所述小鼠包括功能性内源性ADAM6基因以及内源性免疫球蛋白重链基因座的修饰。在一个实施方式中，所述修饰在内源性ADAM6基因的下游或3’端。在一个实施方式中，所述修饰使用一个或多个人源免疫球蛋白重链基因区段来取代一个或多个内源性免疫球蛋白重链基因区段。在一个实施方式中，所述修饰是在内源性免疫球蛋白重链恒定区基因的上游插入一个或多个人源免疫球蛋白重链基因区段。

[0044] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括降低内源性小鼠ADAM6功能的基因修饰，其中所述小鼠包括至少一些ADAM6的功能，所述功能由具有全部或部分功能的内源性未经修饰的等位基因(例如杂合子)来提供，或者由编码在雄性小鼠中具有功能的ADAM6或者其直系同源物或同源物或功能性片段的异位序列表达来提供。

[0045] 在一个实施方式中，与缺乏功能性ADAM6的雄性小鼠相比，所述小鼠包括的ADAM6功能足以使雄性小鼠能够通过交配产生后代。在一个实施方式中，所述ADAM6功能由存在编码小鼠ADAM6或者其同源物或直系同源物或功能片段的异位核苷酸序列赋予。在一个实施方式中，所述ADAM6功能由在内源性免疫球蛋白基因座中存在的内源性ADAM6基因赋予，其中所述内源性免疫球蛋白基因座不能编码抗体的重链可变区。在雄性小鼠中具有功能的ADAM6同源物或其直系同源物或片段包括使缺乏足够内源性小鼠ADAM6活性的雄性小鼠中观察到的产生后代能力的丧失(例如在ADAM6敲除小鼠中观察到的能力的丧失)完全或部分恢复的那些ADAM6同源物或其直系同源物或片段。从这个意义上讲，ADAM6敲除小鼠包括含有内源性基因座或其片段但是其不具有功能的小鼠，即根本不表达ADAM6(ADAM6a和/或ADAM6b)，或者表达ADAM6(ADAM6a和/或ADAM6b)的水平不足以支持野生型雄性小鼠的基本的正常产生后代的能力。功能的丧失可能是由于例如对基因座结构基因(即ADAM6a或ADAM6b编码区)或者基因座调控区(例如在ADAM6a基因的5’端序列，或者ADAM6a或ADAM6b编码区的3’端，其中所述序列完全或部分控制ADAM6基因的转录、ADAM6RNA的表达或者ADAM6蛋白的表达)的修饰导致的。在各种实施方式中，在雄性小鼠中具有功能的其直系同源物或同源物或片段是能够使雄性小鼠的精子(或者雄性小鼠射精中的大部分精子细胞)进入小鼠输卵管并且使小鼠卵子受精的那些直系同源物或同源物或片段。

[0046] 在一个实施方式中，表达人源免疫球蛋白可变区或其功能性片段的雄性小鼠包括足够的ADAM6活性，所述活性赋予了雄性小鼠通过与雌性小鼠交配产生后代的能力，并且在一个实施方式中，当与雌性小鼠交配时所述雄性小鼠显示出的产生后代的能力为具有一个或两个内源性未经修饰ADAM6等位基因小鼠的在一个实施方式中至少25％，在一个实施方式中至少30％，在一个实施方式中至少40％，在一个实施方式中至少50％，在一个实施方式中至少60％，在一个实施方式中至少70％，在一个实施方式中至少80％，在一个实施方式中至少90％以及在一个实施方式中大致是相同的。

[0047] 在一个实施方式中，雄性小鼠表达足量的ADAM6(或者其直系同源物或同源物或功能性片段)使得雄性小鼠的精子细胞能够进入雌性小鼠的输卵管并且使小鼠的卵子受精。

[0048] 在一个实施方式中，ADAM6的功能由与小鼠染色体序列邻近的(contiguous)核酸序列(例如核酸随机整合至小鼠染色体；或者位于特定位置，例如通过将核酸靶向至特定位置例如位点特异性重组酶介导的(例如Cre-介导的)插入或同源重组)所赋予。在一个实施方式中，ADAM6序列存在于与小鼠染色体不同的核酸上(例如ADAM6序列存在于游离基因上，即染色体外，例如在表达构建体、载体、YAC、转移染色体等中)。

[0049] 在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠和细胞，其包括内源性免疫球蛋白重链基因座的修饰，其中所述小鼠表达至少一部分免疫球蛋白重链序列，例如至少一部分人源序列，其中所述小鼠包括在雄性小鼠中具有功能的ADAM6活性。在一个实施方式中，所述修饰降低或消除小鼠的ADAM6活性。在一个实施方式中，所述小鼠被修饰，以使得编码ADAM6活性的两个等位基因要么不存在要么表达的ADAM6基本上不具有支持雄性小鼠正常交配的功能。在一个实施方式中，所述小鼠还包括编码小鼠ADAM6或者其直系同源物或同源物或功能性片段的异位核酸序列。在一个实施方式中，所述修饰维持小鼠的ADAM6活性并且使内源性免疫球蛋白重链基因座不能编码抗体的重链可变区。在一个特定的实施方式中，包括染色体翻转和或转位的修饰使内源性免疫球蛋白重链可变基因区段不能重排以编码与重链恒定区可操作连接的抗体的重链可变区。

[0050] 在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠和细胞，其包括内源性免疫球蛋白重链基因座的修饰，其中所述修饰降低或消除由基因座ADAM6序列所表达的ADAM6的活性，并且其中所述小鼠包括ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物或功能性片段。在各种实施方式中，ADAM6蛋白或其片段由异位ADAM6序列编码。在各种实施方式中，ADAM6蛋白或其片段由内源性ADAM6等位基因表达。在各种实施方式中，所述小鼠包括含有第一修饰的第一免疫球蛋白重链等位基因，所述第一修饰降低或消除来自所述第一免疫球蛋白重链等位基因的功能性ADAM6的表达，以及所述小鼠包括含有第二修饰的第二免疫球蛋白重链等位基因，所述第二修饰基本上不降低或不消除来自第二免疫球蛋白重链等位基因表达的功能性ADAM6的表达。

[0051] 在各种实施方式中，所述修饰是在内源性免疫球蛋白重链恒定区基因的上游或5’端插入一个或多个人源免疫球蛋白重链基因区段。在各种实施方式中，所述修饰保持了位于内源性免疫球蛋白重链基因座的内源性ADAM6基因。

[0052] 在一个实施方式中，所述第二修饰位于最后一个小鼠V基因区段的3’端(相对于小鼠V基因区段的转录方向)和小鼠(或嵌合的人/小鼠)免疫球蛋白重链恒定基因或其片段(例如编码人和/或小鼠：CH1和/或铰链和/或CH2和/或CH3的核酸序列)的5’端(相对于恒定序列的转录方向)。

[0053] 在一个实施方式中，所述修饰是在编码第一ADAM6等位基因的第一基因座上的第一免疫球蛋白重链等位基因上，并且所述ADAM6功能来自于在编码功能性ADAM6的第二基因座上的第二免疫球蛋白重链等位基因上表达的内源性ADAM6，其中所述第二免疫球蛋白重链等位基因包括至少一个V、D和/或J基因区段的修饰。在一个特定的实施方式中，至少一个V、D和或J基因区段的修饰是将其缺失，使用人源V、D和/或J基因区段取代，使用骆驼V、D和/或J基因区段取代，使用人源化或骆驼源化V、D和/或J基因区段取代，使用轻链序列取代重链序列，及其组合。在一个实施方式中，所述至少一个修饰是将一个或多个重链V、D和/或J基因区段缺失并且在重链基因座使用一个或多个轻链V和/或J基因区段(例如人源轻链V和/或J基因区段)取代。

[0054] 在一个实施方式中，所述修饰是在第一基因座的第一免疫球蛋白重链等位基因和第二基因座的第二免疫球蛋白重链等位基因上，并且所述ADAM6功能来自于小鼠生殖细胞系中非免疫球蛋白基因座中异位ADAM6的表达。在一个特定的实施方式中，所述非免疫球蛋白基因座是ROSA26基因座。在一个特定的实施方式中，所述非免疫球蛋白基因座在生殖组织中具有转录活性。

[0055] 在一个实施方式中，所述修饰是在第一基因座的第一免疫球蛋白重链等位基因和第二基因座的第二免疫球蛋白重链等位基因上，并且所述ADAM6功能来自于小鼠生殖细胞系中的内源性ADAM6基因。在一个特定的实施方式中，所述内源性ADAM6基因与小鼠免疫球蛋白基因区段是毗邻(juxtapose)的。

[0056] 在一个实施方式中，所述修饰是在第一基因座的第一免疫球蛋白重链等位基因和第二基因座的第二免疫球蛋白重链等位基因上，并且所述ADAM6功能来自于在第一免疫球蛋白重链等位基因上异位ADAM6序列的表达。在一个实施方式中，所述修饰是在第一基因座的第一免疫球蛋白重链等位基因和第二基因座的第二免疫球蛋白重链等位基因上，并且所述ADAM6功能或活性来自于在第二免疫球蛋白重链等位基因上异位ADAM6的表达。

[0057] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括杂合或纯合的ADAM6敲除。在一个实施方式中，所述小鼠还包括修饰的免疫球蛋白序列，所述序列是人源或人源化的免疫球蛋白序列，或者骆驼或骆驼源化的人源或小鼠免疫球蛋白序列。在一个实施方式中，所述经修饰的免疫球蛋白序列存在于内源性重链免疫球蛋白基因座。在一个实施方式中，所述经修饰的免疫球蛋白序列在内源性重链免疫球蛋白基因座上包括人源重链可变基因序列。在一个实施方式中，所述人源重链可变基因序列在内源性免疫球蛋白重链基因座上取代内源性重链可变序列。

[0058] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠不能由内源性小鼠ADAM6基因座表达功能性内源性小鼠ADAM6。在一个实施方式中，所述小鼠包括在小鼠中具有功能的异位核酸序列，所述序列编码ADAM6或其功能性片段。在一个特定的实施方式中，所述异位核酸序列编码的蛋白挽救ADAM6敲除纯合子雄性小鼠显示出的产生后代能力的丧失。在一个特定的实施方式中，所述异位核酸序列编码小鼠ADAM6蛋白。

[0059] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠缺乏功能性内源性ADAM6基因座，并且包括使其具有小鼠ADAM6功能的异位核酸序列。在一个实施方式中，所述核酸序列包括内源性小鼠ADAM6序列或其功能性片段。在一个实施方式中，所述内源性小鼠ADAM6序列包括在野生型小鼠3’-端小鼠免疫球蛋白重链V基因区段(VH)和5’-端小鼠免疫球蛋白重链D基因区段(DH)之间的ADAM6a-和ADAM6b-编码序列。

[0060] 在一个实施方式中，核酸序列包括编码小鼠ADAM6a或其功能性片段的序列和/或编码小鼠ADAM6b或其功能性片段的序列，其中ADAM6a和/或ADAM6b或其功能性片段与启动子可操作地连接。在一个实施方式中，所述启动子是人源启动子。在一个实施方式中，所述启动子是小鼠ADAM6启动子。在一个特定的实施方式中，所述ADAM6启动子包括位于与小鼠5’-端DH基因区段最接近的第一ADAM6基因的第一密码子和5’-端DH基因区段的重组信号序列之间的序列，其中以5’端是相对于小鼠免疫球蛋白基因的转录方向而言。在一个实施方式中，所述启动子是病毒启动子。在一个特定的实施方式中，所述病毒启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子。在一个实施方式中，所述启动子是泛素启动子。

[0061] 在一个实施方式中，所述启动子是可诱导的启动子。在一个实施方式中，所述可诱导的启动子在非生殖组织中调控表达。在一个实施方式中，所述可诱导的启动子在生殖组织中调控表达。在一个特定的实施方式中，小鼠ADAM6a和/或ADAM6b序列或其功能性片段的表达受到可诱导的启动子在生殖组织中的发育调控。

[0062] 在一个实施方式中，所述小鼠ADAM6a和/或ADAM6b选自SEQ ID NO:1所示的ADAM6a和/或SEQ ID NO:2所示的ADAM6b序列。在一个实施方式中，所述小鼠ADAM6启动子是SEQ ID NO:3所示的启动子。在一个特定的实施方式中，所述小鼠ADAM6启动子包括ADAM6a的第一密码子直接上游(相对于ADAM6a的转录方向)的SEQ ID NO:3所示的核酸序列并且延伸至ADAM6编码区上游SEQ ID NO:3的末端。在另一个特定实施方式中，所述ADAM6启动子是由ADAM6a起始密码子上游约5至约20个核苷酸以内延伸至ADAM6a起
始密码子上游约0.5kb、1kb、2kb或3kb或者更大的片段。

[0063] 在一个实施方式中，当将包括SEQ ID NO:3或其片段的核酸序列置于由于缺乏ADAM6而不育或生育能力降低的小鼠中时，小鼠的生育能力改善或生育能力大约恢复至野生型生育能力。在一个实施方式中，SEQ ID NO:3或其片段使雄性小鼠具有产生能够进入雌性小鼠的输卵管以使得小鼠卵子受精的精子细胞的能力。

[0064] 在一个实施方式中，所述核酸序列是编码ADAM6基因或其同源物或直系同源物或功能性片段的任意序列，当将其置于或保持在小鼠中时，产生的生育能力水平与野生型小鼠相同或相当。示例性的生育能力水平可以由雄性小鼠产生能够进入雌性小鼠的输卵管以使得小鼠卵子受精的精子细胞的能力所证实。

[0065] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括编码ADAM6蛋白的内源性核苷酸序列的缺失，内源性小鼠VH基因区段被人源VH基因区段的取代，以及编码在雄性小鼠中具有功能的小鼠ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物或片段的异位核苷酸序列。

[0066] 在一个实施方式中，所述小鼠包括免疫球蛋白重链基因座，所述基因座包括含有内源性ADAM6基因的内源性免疫球蛋白基因座核苷酸序列的缺失，其包括编码一个或多个人源免疫球蛋白基因区段的核苷酸序列，并且其中编码小鼠ADMA6蛋白的异位核苷酸序列在编码一个或多个人源免疫球蛋白基因区段的核苷酸序列中或与之紧邻。

[0067] 在一个实施方式中，所述小鼠包括全部或基本上全部的内源性VH基因区段被编码一个或多个人源VH基因区段的核苷酸序列取代，并且编码小鼠ADMA6蛋白的异位核苷酸序列在编码一个或多个人源VH基因区段的核苷酸序列中或与之紧邻。在一个实施方式中，所述小鼠还包括在内源性DH基因座的一个或多个内源性DH基因区段被一个或多个人源DH基因区段取代。在一个实施方式中，所述小鼠还包括在内源性JH基因座的一个或多个内源性JH基因区段被一个或多个人源JH基因区段取代。在一个实施方式中，所述小鼠包括全部或基本上全部内源性VH、DH和JH基因区段并且在内源性VH、DH和JH基因座上被人源VH、DH和JH基因区段取代，其中所述小鼠包括编码小鼠ADAM6蛋白的异位序列。在一个实施方式中，所述小鼠包括在内源性免疫球蛋白重链基因座插入人源VH、DH和JH基因区段，其中所述小鼠包括在小鼠中具有功能的ADAM6基因。在一个特定的实施方式中，编码小鼠ADAM6蛋白的异位序列位于人源VH基因区段3’-端倒数第二个VH基因区段与人源VH基因区段的3’端最后一个VH基因区段之间。在一个特定的实施方式中，所述小鼠包括全部或基本上全部小鼠VH基因区段的缺失，和全部或基本上全部人源VH基因区段的取代，并且编码小鼠ADAM6蛋白的异位核苷酸序列位于人源基因区段VH1-2的下游和人源基因区段VH6-1的上游。

[0068] 在一个特定的实施方式中，所述小鼠包括全部或基本上全部的内源性VH基因区段被编码一个或多个人源VH基因区段的核苷酸序列取代，并且编码小鼠ADAM6蛋白的异位核苷酸序列在编码一个或多个人源VH基因区段的核苷酸序列中或与之紧邻。

[0069] 在一个实施方式中，编码小鼠ADAM6蛋白的异位核苷酸序列存在于小鼠基因组中的转基因上。在一个实施方式中，编码小鼠ADAM6蛋白的异位核苷酸序列存在于小鼠中的染色体外。

[0070] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括内源性免疫球蛋白重链基因座的修饰，其中所述小鼠表达一种B细胞，所述B细胞包括与重链恒定区基因序列可操作地连接的经重排的免疫球蛋白序列，并且所述B细胞在其基因组(例如在B细胞的染色体上)中包括编码在雄性小鼠中具有功能的ADAM6或其直系同源物或同源物或片段的基因。在一个实施方式中，与重链恒定区基因序列可操作地连接的经重排的免疫球蛋白序列包括人源重链V、D和/或J序列；小鼠重链V、D和/或J序列；人源或小鼠轻链V和/或J序列。在一个实施方式中，重链恒定区基因序列包括选自CH1、铰链、CH2、CH3及其组合的人源或小鼠重链序列。

[0071] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括功能沉默的内源性免疫球蛋白重链可变基因座，其中在小鼠中维持了ADAM6的功能，并且所述小鼠还包括在一个或多个小鼠重链恒定区上游或5’端插入一个或多个人源免疫球蛋白基因区段。在一个实施方式中，所述一个或多个人源免疫球蛋白基因区段包括一个或多个人源VH基因区段、一个或多个人源DH基因区段和一个或多个人源JH基因区段。在一个特定的实施方式中，所述小鼠还包括功能沉默的内源性轻链基因座，其中所述小鼠包括的ADAM6活性与野生型小鼠相同或相当，并且所述小鼠还包括在小鼠轻链恒定区上游或5’端插入一个或多个人源λ轻链基因区段。在一个实施方式中，所述人源λ轻链基因区段包括12个人源Vλ基因区段和一个或多个人源Jλ基因区段。在一个实施方式中，所述人源λ轻链基因区段包括12个人源Vλ基因区段和4个人源Jλ基因区段。在一个实施方式中，所述人源λ轻链基因区段包括28个人源Vλ基因区段和一个或多个人源Jλ基因区段。在一个实施方式中，所述人源λ轻链基因区段包括28个人源Vλ基因区段和4个人源Jλ基因区段。在一个实施方式中，所述人源λ轻链基因区段包括40个人源Vλ基因区段和一个或多个人源Jλ基因区段。在一个实施方式中，所述人源λ轻链基因区段包括40个人源Vλ基因区段和4个人源Jλ基因区段。在各种实施方式中，所述4个人源Jλ基因区段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3和Jλ7。在各种实施方式中，所述小鼠轻链恒定区是小鼠Cκ或小鼠Cλ。

[0072] 在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠，其中所述小鼠包括功能沉默的免疫球蛋白轻链基因，并且还包括一个或多个内源性免疫球蛋白轻链可变区基因区段被一个或多个人源免疫球蛋白重链可变区基因区段取代，其中所述小鼠缺乏功能性内源性ADAM6基因座，并且其中所述小鼠包括表达在雄性小鼠中具有功能的小鼠ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物或片段的异位核苷酸序列。

[0073] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠缺乏功能性内源性小鼠ADAM6基因座或序列，并且包括编码小鼠ADAM6基因座或者小鼠ADAM6基因座或序列的功能性片段的异位核苷酸序列，其中所述小鼠能够与相反性别的小鼠交配以产生包括异位ADAM6基因座或序列的后代。在一个实施方式中，所述小鼠是雄性的。在一个实施方式中，所述小鼠是雌性的。

[0074] 在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠，其中所述小鼠在内源性小鼠免疫球蛋白重链可变区基因座上包括人源免疫球蛋白重链可变区基因区段，所述小鼠在内源性小鼠免疫球蛋白重链可变区基因座上缺乏内源性功能性ADAM6序列，并且其中所述小鼠包括表达在雄性小鼠中具有功能的小鼠ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物或片段的异位核苷酸序列。

[0075] 在一个实施方式中，表达小鼠ADAM6蛋白的异位核苷酸序列是染色体外的。在一个实施方式中，表达小鼠ADAM6蛋白的异位核苷酸序列整合至小鼠基因组的一个或多个基因座上。在一个特定的实施方式中，所述一个或多个基因座包括免疫球蛋白基因座。

[0076] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠表达来自经修饰的内源性小鼠免疫球蛋白重链基因座的免疫球蛋白重链序列，其中所述重链来源于人源V基因区段、D基因区段和J基因区段，其中所述小鼠包括在小鼠中具有功能的ADAM6活性。

[0077] 在一个实施方式中，所述小鼠包括多个人源V基因区段、多个D基因区段和多个J基因区段。在一个实施方式中，所述D基因区段是人源D基因区段。在一个实施方式中，所述J基因区段是人源J基因区段。在一个实施方式中，所述小鼠还包括人源化的重链恒定区序列，其中所述人源化包括取代选自CH1、铰链、CH2、CH3及其组合的序列。在一个特定的实施方式中，所述重链来源于人源V基因区段、人源D基因区段、人源J基因区段、人源CH1序列、人源或小鼠铰链序列、小鼠CH2序列和小鼠CH3序列。在另一个特定实施方式中，所述小鼠还包括人源轻链恒定序列。

[0078] 在一个实施方式中，所述小鼠包括ADAM6基因，所述ADAM6基因的5’和3’翼侧是内源性免疫球蛋白重链基因区段。在一个特定的实施方式中，所述内源性免疫球蛋白重链基因区段不能编码抗体的重链。在一个特定的实施方式中，小鼠的ADAM6基因在与野生型小鼠相同的位置上，并且小鼠的内源性免疫球蛋白重链可变基因座不能重排以编码抗体的重链。

[0079] 在一个实施方式中，所述V基因区段的5’翼侧(相对于V基因区段的转录方向)是编码在雄性小鼠中具有功能的ADAM6活性的序列。

[0080] 在一个实施方式中，所述V基因区段的3’翼侧(相对于V基因区段的转录方向)是编码在雄性小鼠中具有功能的ADAM6活性的序列。

[0081] 在一个实施方式中，所述D基因区段的5’翼侧(相对于D基因区段的转录方向)是编码在雄性小鼠中具有功能的ADAM6活性的序列。

[0082] 在一个实施方式中，在小鼠中具有功能的ADAM6的活性来自于位于经修饰的内源性小鼠重链免疫球蛋白基因座的5’-端(5’-most)D基因区段5’端和3’-端(3’-most)V基因区段3’端(相对于V基因区段的转录方向)的核苷酸序列的表达。

[0083] 在一个实施方式中，在小鼠中具有功能的ADAM6的活性来自于位于经修饰的内源性小鼠重链免疫球蛋白基因座中两个人源V基因区段之间的核苷酸序列的表达。在一个实施方式中，所述两个人源V基因区段是人源VH1-2基因区段和VH6-1基因区段。

[0084] 在一个实施方式中，所述核苷酸序列包括选自下组的序列：小鼠ADAM6b序列或其功能性片段、小鼠ADAM6a序列或其功能性片段及其组合。

[0085] 在一个实施方式中，在两个人源V基因区段之间的核苷酸序列与人源V基因区段位于相反的转录方向。在一个特定的实施方式中，核苷酸序列相对于ADAM6基因的转录方向由5’至3’编码，并且ADAM6a序列之后是ADAM6b序列。

[0086] 在一个实施方式中，所述小鼠包括在人源V基因区段VH1-2和VH6-1之间的人源ADAM6假基因序列被小鼠ADAM6序列或其功能性片段取代。

[0087] 在一个实施方式中，编码在小鼠中具有功能的ADAM6活性的序列是小鼠ADAM6序列或其功能性片段。

[0088] 在一个实施方式中，所述小鼠包括内源性小鼠DFL16.1基因区段(例如在针对经修饰的内源性小鼠免疫球蛋白重链基因座的小鼠杂合子中)或人源DH1-1基因区段。在一个实施方式中，由小鼠表达的免疫球蛋白重链的D基因区段来源于内源性小鼠DFL16.1基因区段或人源DH1-1基因区段。

[0089] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括在非重排B细胞谱系的携带DNA的细胞中编码小鼠ADAM6(或者其同源物或直系同源物或功能性片段)的核酸序列，但是不包括在包含重排的免疫球蛋白基因座的B细胞中编码小鼠ADAM6(或者其同源物或直系同源物或功能性片段)的核酸序列，其中所述编码小鼠ADAM6(或者其同源物或直系同源物或功能性片段)的核酸序列出现在基因组中的位置不同于小鼠ADAM6基因出现在野生型小鼠中的位置。在一个实施方式中，所述编码小鼠ADAM6(或者其同源物或直系同源物或功能性片段)的核酸序列全部或基本上全部存在于非重排B细胞谱系中携带DNA的细胞中；在一个实施方式中，所述核酸序列存在于小鼠的生殖细胞中，但是不在重排B细胞的染色体中。

[0090] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括在全部或基本上全部的携带DNA的细胞中编码小鼠ADAM6(或者其同源物或直系同源物或功能性片段)的核酸序列，所述细胞包括含有重排的免疫球蛋白基因座的B细胞，其中所述编码小鼠ADAM6(或者其同源物或直系同源物或功能性片段)的核酸序列出现在基因组中的位置不同于小鼠ADAM6基因出现在野生型小鼠中的位置。在一个实施方式中，所述编码小鼠ADAM6(或者其同源物或直系同源物或功能性片段)的核酸序列在与重排的免疫球蛋白基因座邻近的核酸上。在一个实施方式中，与重排的免疫球蛋白基因座邻近的核酸是染色体。在一个实施方式中，所述染色体是在野生型小鼠中发现的染色体，并且所述染色体包括对小鼠免疫球蛋白基因座的修饰。

[0091] 在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠，其中所述小鼠包括B细胞，所述B细胞在其基因组中包含ADAM6序列或者其直系同源物或同源物。在一个实施方式中，所述ADAM6序列或者其直系同源物或同源物在免疫球蛋白重链基因座上。在一个实施方式中，所述ADAM6序列或者其直系同源物或同源物在非免疫球蛋白基因座的基因座上。在一个实施方式中，所述ADAM6序列是由异源启动子驱动的转基因。在一个特定的实施方式中，所述异源启动子是非免疫球蛋白启动子。在一个特定的实施方式中，B细胞表达ADAM6蛋白或其直系同源物或同源物。

[0092] 在一个实施方式中，90％或更多的小鼠B细胞包括在小鼠中具有功能的编码ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物或片段的基因。在一个特定的实施方式中，所述小鼠是雄性小鼠。

[0093] 在一个实施方式中，B细胞基因组包括含有ADAM6序列或其直系同源物或同源物的第一等位基因和第二等位基因。在一个实施方式中，B细胞基因组包括含有ADAM6序列或其直系同源物或同源物的第一等位基因但不包括第二等位基因。

[0094] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括在一个或多个内源性免疫球蛋白重链等位基因的修饰，其中所述修饰保留一个或多个内源性ADAM6等位基因，并且所述小鼠还包括在小鼠轻链恒定区上游插入一个或多个人源Vλ基因区段和一个或多个人源Jλ基因区段。在各种实施方式中，所述小鼠轻链恒定区是小鼠Cκ或小鼠Cλ。

[0095] 在一个实施方式中，所述修饰使小鼠不能表达一种功能性重链，所述功能性重链包括来自至少一个重链等位基因的、经重排的内源性重链基因区段，并且保留了位于至少一个内源性免疫球蛋白重链等位基因中的内源性ADAM6等位基因。

[0096] 在一个实施方式中，所述小鼠不能表达一种功能性重链，所述功能性重链包括来自至少一个内源性免疫球蛋白重链等位基因的、经重排的内源性重链基因区段，并且所述小鼠表达来自内源性ADAM6等位基因的ADAM6蛋白。在一个特定的实施方式中，所述小鼠不能表达一种功能性重链，所述功能性重链包括来自两个内源性免疫球蛋白重链等位基因的、经重排的内源性重链基因区段的功能性重链，并且所述小鼠表达来自一个或多个内源性ADAM6等位基因的ADAM6蛋白。

[0097] 在一个实施方式中，所述小鼠不能表达来自各内源性重链等位基因的功能性重链，并且所述小鼠包括位于小鼠免疫球蛋白重链恒定区序列上游(相对于小鼠重链基因座转录的方向)1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110或120或者更多个Mbp内的功能性ADMA6等位基因。在一个特定的实施方式中，所述功能性ADAM6等位基因在内源性免疫球蛋白重链基因座上(例如在基因间的V-D区、在两个V基因区段之间、在V与D基因区段之间、在D与J基因区段之间等)。在一个特定的实施方式中，所述功能性ADAM6等位基因位于最后一个小鼠V基因区段与第一个小鼠D基因区段之间90至100kb的基因间序列中。

[0098] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括在一个或多个内源性ADAM6等位基因的修饰。

[0099] 在一个实施方式中，所述修饰使小鼠不能表达来自一个或多个内源性ADAM6等位基因中的至少一个功能性ADAM6蛋白。在一个特定的实施方式中，所述小鼠不能表达来自各内源性ADAM6等位基因的功能性ADAM6蛋白。

[0100] 在一个实施方式中，所述小鼠不能表达来自各内源性ADAM6等位基因的功能性ADAM6蛋白，并且所述小鼠包括异位ADAM6序列。

[0101] 在一个实施方式中，所述小鼠不能表达来自各内源性ADAM6等位基因的功能性ADAM6蛋白，并且所述小鼠包括位于小鼠免疫球蛋白重链恒定区序列上游(相对于小鼠重链基因座转录的方向)1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110或120或者更多个kb内的异位ADMA6序列。在一个特定的实施方式中，所述异位ADAM6序列在内源性重链基因座上(例如在基因间的V-D区、在两个V基因区段之间、在V与D基因区段之间、在D与J基因区段之间等)。在一个特定的实施方式中，所述异位ADAM6序列位于最后一个小鼠V基因区段与第一个小鼠D基因区段之间的90至100kb的基因间序列中。在另一个特定实施方式中，内源性90至100kb基因间V-D序列被除去，并且异位ADAM6序列位于最后一个V与第一个D基因区段之间。

[0102] 在一个方面，本申请提供了一种不具有生育能力的小鼠，其中所述小鼠包括两个或更多个内源性ADAM6等位基因的缺失。在一个方面，本申请提供了一种携带雄性不育性状的雌性小鼠，其中所述雌性小鼠在其生殖细胞系中包括无功能的ADAM6等位基因或内源性ADAM6等位基因的敲除。

[0103] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括内源性免疫球蛋白重链V、D和或J基因区段，其不能重排以编码抗体的重链，其中大部分的小鼠B细胞包括功能性ADAM6基因。在各种实施方式中，大部分的小鼠B细胞还包括在小鼠免疫球蛋白轻链恒定区上游的一个或多个人源Vλ基因区段和一个或多个人源Jλ基因区段。在一个实施方式中，所述小鼠的免疫球蛋白轻链恒定区选自小鼠Cκ和小鼠Cλ。

[0104] 在一个实施方式中，所述小鼠包括完好的内源性免疫球蛋白重链V、D和J基因区段，其不能重排以编码抗体的功能性重链。在一个实施方式中，所述小鼠包括至少1个和至多89个V基因区段、至少1个和至多13个D基因区段、至少1个和至多4个J基因区段及其组合；其中所述至少1个和至多89个V基因区段、至少1个和至多13个D基因区段、至少1个和至多4个J基因区段不能重排以编码抗体的重链可变区。在一个特定的实施方式中，所述小鼠包括位于完好的内源性免疫球蛋白重链V、D和J基因区段中的功能性ADAM6基因。在一个实施方式中，所述小鼠包括含有内源性ADAM6基因座的内源性重链基因座，其中所述内源性重链基因座包括89个V基因区段、13个D基因区段和4个J基因区段，其中所述内源性重链基因区段不能重排以编码抗体的重链可变区并且ADAM6基因座编码在小鼠中具有功能的ADAM6蛋白。

[0105] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠缺乏内源性免疫球蛋白重链V、D和J基因区段，其中大部分的小鼠B细胞包括ADAM6序列或其直系同源物或同源物。在一个实施方式中，大部分的小鼠B细胞表达包括人源λ可变结构域和内源性免疫球蛋白轻链恒定区的免疫球蛋白轻链。

[0106] 在一个实施方式中，所述小鼠缺乏选自下组的内源性免疫球蛋白重链基因区段：两个或多个V基因区段、两个或多个D基因区段、两个或多个J基因区段及其组合。在一个实施方式中，所述小鼠缺乏选自下组的免疫球蛋白重链基因区段：至少1个至至多89个V基因区段、至少1个和至多13个D基因区段、至少1个和至多4个J基因区段及其组合。在一个实施方式中，所述小鼠缺乏来自染色体12的基因组DNA片段，其包含约3百万碱基的内源性免疫球蛋白重链基因座。在一个特定的实施方式中，所述小鼠缺乏全部功能性的内源性重链V、D和J基因区段。在一个特定的实施方式中，所述小鼠缺乏89个VH基因区段、
13个DH基因区段和4个JH基因区段。

[0107] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，其中所述小鼠在其生殖细胞系中具有包括免疫球蛋白重链基因座修饰的基因组，其中对免疫球蛋白重链基因座的修饰包括使用一个或多个非小鼠免疫球蛋白可变区序列来取代一个或多个小鼠免疫球蛋白可变区序列，并且其中所述小鼠包括编码小鼠ADAM6蛋白的核酸序列。在一个优选的实施方式中，免疫球蛋白重链基因座的DH和JH序列以及至少3个、至少10个、至少20个、至少40个、至少60个或至少80个VH序列被非小鼠免疫球蛋白可变区序列取代。在进一步优选的实施方式中，免疫球蛋白重链基因座的DH、JH和全部VH序列被非小鼠免疫球蛋白可变区序列取代。所述非小鼠免疫球蛋白可变区序列可以是未经重排的。在一个优选的实施方式中，所述非小鼠免疫球蛋白可变区序列包括非小鼠物种的全部未经重排的DH和JH区以及至少3个、至少10个、至少20个、至少40个、至少60个或至少80个未经重排的VH序列。在进一步优选的实施方式中，所述非小鼠免疫球蛋白可变区序列包括非小鼠物种的全部的可变区，包括全部VH、DH和JH区。所述非小鼠物种可以是智人(Homo sapiens)并且所述非小鼠免疫球蛋白可变区序列可以是人源序列。

[0108] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠表达包括至少一个人源可变结构域/非人源恒定结构域免疫球蛋白多肽的抗体，其中所述小鼠表达来自不同于免疫球蛋白基因座的基因座的小鼠ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物。

[0109] 在一个实施方式中，所述ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物在小鼠的B细胞中表达，其中所述B细胞包括重排的免疫球蛋白序列，其包含人源可变序列和非人源恒定序列。

[0110] 在一个实施方式中，所述非人源恒定序列是啮齿动物序列。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。

[0111] 在一个方面，本申请提供了一种制备不育雄性小鼠的方法，所述方法包括使供体ES细胞内源性ADAM6等位基因无功能(或敲除所述等位基因)，将供体ES细胞引入宿主胚胎，将所述宿主胚胎在代孕母体中妊娠，并且使代孕母体生出全部或部分来源于所述供体ES细胞的后代。在一个实施方式中，所述方法还包括繁殖后代以获得不育的雄性小鼠。

[0112] 在一个方面，本申请提供了一种制备具有目标基因修饰的小鼠的方法，其中所述小鼠是不育的，所述方法包括下述步骤：(a)在基因组中制备目标基因修饰；(b)修饰所述基因组以敲除内源性ADAM6等位基因，或者使内源性ADAM6等位基因不具有功能；以及(c)利用所述基因组以制备小鼠。在各种实施方式中，所述基因组来自ES细胞或在核转移实验中使用。

[0113] 在一个方面，本申请提供了一种使用本申请描述的靶向载体、核苷酸构建体或细胞制备的小鼠。

[0114] 在一个方面，本申请提供了一种将如本申请所描述的小鼠与另一种野生型或基因修饰的小鼠交配的后代。

[0115] 在一个方面，本申请提供了一种用于保持小鼠品系的方法，其中所述小鼠品系包括使用一个或多个异源性免疫球蛋白重链序列取代小鼠免疫球蛋白重链序列。在一个实施方式中，所述一个或多个异源性免疫球蛋白重链序列是人源免疫球蛋白重链序列。

[0116] 在一个实施方式中，所述小鼠品系包括一个或多个小鼠VH、DH和/或JH基因区段的缺失。在一个实施方式中，所述小鼠还包括一个或多个人源VH基因区段、一个或多个人源DH基因区段和/或一个或多个人源JH基因区段。在一个实施方式中，所述小鼠包括至少3个、至少10个、至少20个、至少40个、至少60个或至少80个人源VH区段，至少27个人源DH基因区段以及至少6个JH基因区段。在一个特定的实施方式中，所述小鼠包括与恒定区基因可操作地连接的至少3个、至少10个、至少20个、至少40个、至少60个或至少80个人源VH区段，至少27个人源DH基因区段以及至少6个JH基因区段。在一个实施方式中，所述恒定区基因是小鼠恒定区基因。在一个实施方式中，所述恒定区基因包括选自CH1、铰链、CH2、CH3和/或CH4或其组合的小鼠恒定区基因序列。

[0117] 在一个实施方式中，所述方法包括针对小鼠免疫球蛋白重链序列取代而产生雄性小鼠杂合子，并且使用野生型雌性小鼠或针对人源重链序列是纯合子或杂合子的雌性小鼠来繁殖杂合雄性小鼠。在一个实施方式中，所述方法包括通过使用野生型或者针对人源重链序列是纯合子或杂合子的雌性与杂合雄性反复繁殖以保持所述品系。

[0118] 在一个实施方式中，所述方法包括从针对人源重链序列是纯合子或杂合子的雄性或雌性小鼠中获得细胞，并且利用这些细胞作为供体细胞或利用其核作为供体核，并且使用所述细胞或核以制备使用宿主细胞和/或在代孕母体中将所述细胞和/或核妊娠的基因修饰的动物。

[0119] 在一个实施方式中，将仅针对在重链基因座的取代是杂合子的雄性小鼠与雌性小鼠交配。在一个特定的实施方式中，所述雌性小鼠相对于取代的重链基因座是纯合子、杂合子或野生型。

[0120] 在一个实施方式中，所述小鼠还包括使用异源性免疫球蛋白轻链序列取代在内源性免疫球蛋白轻链基因座的λ和/或κ轻链可变序列。在一个实施方式中，所述异源性免疫球蛋白轻链序列是人源免疫球蛋白λ和/或κ轻链可变序列。

[0121] 在一个实施方式中，所述小鼠还包括在不同于内源性免疫球蛋白基因座的基因座上的转基因，其中所述转基因包括一种序列，所述序列编码与免疫球蛋白轻链恒定区序列可操作地连接(针对未经重排的)或融合(针对重排的)的经重排的或未经重排的异源性λ或κ轻链序列(例如未经重排的VL和未经重排的JL或者重排的VJ)。在一个实施方式中，所述异源性λ或κ轻链序列是人源的。在一个实施方式中，所述恒定区序列选自啮齿动物、人源和非人灵长类。在一个实施方式中，所述恒定区序列选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述转基因包括驱动轻链序列表达的非免疫球蛋白启动子。在一个特定的实施方式中，所述启动子是转录活化的启动子。在一个特定的实施方式中，所述启动子是ROSA26启动子。

[0122] 在一个方面，本申请提供了一种核酸构建体，所述核酸构建体包括上游同源臂和下游同源臂，其中所述上游同源臂包括与人源免疫球蛋白重链可变区序列相同或基本上相同的序列，所述下游同源臂包括与人源或小鼠免疫球蛋白可变区序列相同或基本上相同的序列，并且在所述上游和下游同源臂之间排列的是包括编码小鼠ADAM6蛋白的核苷酸序列的序列。在一个特定的实施方式中，所述编码小鼠ADAM6基因的序列与小鼠启动子可操作地连接，在野生型小鼠中通过其与小鼠ADAM6连接。

[0123] 在一个方面，本申请提供了一种靶向载体，所述靶向载体包括(a)与人源可变区基因区段的核苷酸序列相同或基本上相同的核苷酸序列；以及(b)编码在小鼠中具有功能的小鼠ADAM6或者其直系同源物或同源物或片段的核苷酸序列。

[0124] 在一个实施方式中，所述靶向载体还包括与编码小鼠ADAM6的序列可操作地连接的启动子。在一个特定的实施方式中，所述启动子是小鼠ADAM6启动子。

[0125] 在一个方面，本申请提供了一种用于修饰小鼠免疫球蛋白重链可变基因座的核苷酸构建体，其中所述构建体包括至少一个位点特异性重组酶识别位点和编码在小鼠中具有功能的小鼠ADAM6或者其直系同源物或同源物或片段的序列。

[0126] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠细胞和小鼠胚胎，包括但不限于ES细胞、多能干细胞和诱导性多能干细胞，其包括如上文所描述的基因修饰。本申请提供了XX细胞和XY细胞。本申请还提供了包括含有如本申请所述修饰的核的细胞，例如通过原核注射引入细胞的修饰。本申请还提供了包括通过病毒引入的ADAM6基因的细胞、胚胎和小鼠，例如包括含有在小鼠中具有功能的ADAM6基因的转导构建体的细胞、胚胎和小鼠。

[0127] 在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠细胞，其中所述细胞缺乏功能性内源性小鼠ADAM6基因座，并且所述细胞包括编码小鼠ADAM6蛋白或其功能性片段的异位核苷酸序列。在一个实施方式中，所述细胞还包括内源性免疫球蛋白重链可变基因序列的修饰。在一个特定的实施方式中，所述内源性免疫球蛋白重链可变基因序列的修饰包括选自下组的缺失：小鼠VH基因区段缺失、小鼠DH基因区段缺失、小鼠JH基因区段缺失及其组合。在一个特定的实施方式中，所述小鼠包括使用人源免疫球蛋白序列取代一个或多个小鼠免疫球蛋白VH、DH和/或JH序列。在一个特定的实施方式中，所述人源免疫球蛋白序列选自人源VH、人源VL、人源DH、人源JH、人源JL及其组合。

[0128] 在一个实施方式中，所述细胞是全能干细胞、多能干细胞或诱导性多能干细胞。在一个特定的实施方式中，所述细胞是小鼠ES细胞。

[0129] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠B细胞，其中所述小鼠B细胞包括重排的免疫球蛋白重链基因，其中所述B细胞在B细胞染色体上包括编码在雄性小鼠中具有功能的ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物或片段的核酸序列。在一个实施方式中，所述小鼠B细胞包括核酸序列的两个等位基因。

[0130] 在一个实施方式中，所述核酸序列在与重排的小鼠免疫球蛋白重链基因座邻近的核酸分子(例如B细胞染色体)上。

[0131] 在一个实施方式中，所述核酸序列在与包括重排的小鼠免疫球蛋白重链基因座的核酸分子不同的核酸分子(例如B细胞染色体)上。

[0132] 在一个实施方式中，所述小鼠B细胞包括与小鼠或人源免疫球蛋白恒定区基因可操作地连接的经重排的非小鼠免疫球蛋白可变基因序列，其中所述B细胞包括编码在雄性小鼠中具有功能的ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物或片段的核酸序列。

[0133] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠体细胞，所述细胞包括含有经修饰的免疫球蛋白重链基因座的染色体，以及编码在雄性小鼠中具有功能的ADAM6或者其直系同源物和或同源物或片段的核酸序列。在一个实施方式中，所述核酸序列与经修饰的免疫球蛋白重链基因座在相同的染色体上。在一个实施方式中，所述核酸序列与经修饰的免疫球蛋白重链基因座在不同的染色体上。在一个实施方式中，所述体细胞包括单拷贝的核酸序列。在一个实施方式中，所述体细胞包括至少两个拷贝的核酸序列。在一个特定的实施方式中，所述体细胞是B细胞。在一个特定的实施方式中，所述细胞是生殖细胞。在一个特定的实施方式中，所述细胞是干细胞。

[0134] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠生殖细胞，所述细胞包括在生殖细胞的染色体上的编码小鼠ADAM6(或者其同源物或直系同源物或功能性片段)的核酸序列，其中编码小鼠ADAM6(或者其同源物或直系同源物或功能性片段)的核酸序列在染色体上的位置与其在野生型小鼠生殖细胞染色体上的位置不同。在一个实施方式中，所述核酸序列在小鼠免疫球蛋白基因座上。在一个实施方式中，所述核酸序列与小鼠免疫球蛋白基因座在生殖细胞相同的染色体上。在一个实施方式中，所述核酸序列与小鼠免疫球蛋白基因座在生殖细胞不同的染色体上。在一个实施方式中，所述小鼠免疫球蛋白基因座包括使用至少一个非小鼠免疫球蛋白序列来取代至少一个小鼠免疫球蛋白序列。在一个特定的实施方式中，所述至少一个非小鼠免疫球蛋白序列是人源免疫球蛋白序列。

[0135] 在一个方面，本申请提供了来源于如本申请所述小鼠的多能、诱导多能或全能干细胞。在一个特定的实施方式中，所述细胞是小鼠胚胎干(ES)细胞。

[0136] 在一个方面，本申请提供了来源于如本申请所述小鼠的细胞或组织。在一个实施方式中，所述细胞或组织来源于如本申请所述小鼠的脾脏、淋巴结或骨髓。在一个实施方式中，所述细胞是B细胞。在一个实施方式中，所述细胞是胚胎干细胞。在一个实施方式中，所述细胞是生殖细胞。

[0137] 在一个实施方式中，所述组织选自结缔、肌肉、神经和上皮组织。在一个特定的实施方式中，所述组织是生殖组织。

[0138] 在一个实施方式中，分离来源于如本申请所述小鼠的细胞和/或组织以用于一项或多项间接体内检测。在各种实施方式中，所述一项或多项间接体内检测包括物理、热、电、机械或光学性质检测，外科手术，不同组织类型相互作用的检测，影像技术显影或其组合。

[0139] 在一个方面，本申请提供了使用来源于如本申请所述小鼠的细胞或组织来制备抗体的用途。在一个方面，本申请提供了使用来源于如本申请所述小鼠的细胞或组织来制备杂交瘤或四价体杂交瘤(quadroma)的用途。

[0140] 在一个方面，非人源细胞包括如本申请所述非人动物的染色体或其片段。在一个实施方式中，所述非人源细胞包括如本申请所述非人动物的核。在一个实施方式中，所述非人源细胞包括核转移所得到的染色体或其片段。

[0141] 在一个方面，本申请提供了一种来源于如本申请所述小鼠的核。在一个实施方式中，所述核来自非B细胞的二倍体细胞。

[0142] 在一个方面，本申请提供了在如本申请所述小鼠中制备的编码免疫球蛋白可变区的核苷酸序列。

[0143] 在一个方面，本申请提供了在如本申请所述小鼠中制备的抗体的免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链可变区氨基酸序列。

[0144] 在一个方面，本申请提供了在如本申请所述小鼠中制备的编码抗体可变区的免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列。

[0145] 在一个方面，本申请提供了在如本申请所述小鼠中制备的抗体或其抗原结合片段(例如Fab、F(ab)2、scFv)。

[0146] 在一个方面，本申请提供了一种制备基因修饰的小鼠的方法，所述方法包括使用一个或多个人源免疫球蛋白重链基因区段来取代小鼠内源性ADAM6基因座上游(相对于免疫球蛋白重链基因区段的转录方向)的一个或多个免疫球蛋白重链基因区段，并且使用一个或多个人源免疫球蛋白重链或轻链基因区段来取代小鼠ADAM6基因座下游(相对于免疫球蛋白重链基因区段的转录方向)的一个或多个免疫球蛋白基因区段。在一个实施方式中，将小鼠内源性ADAM6基因座上游的一个或多个内源性免疫球蛋白基因区段进行取代的所述一个或多个人源免疫球蛋白基因区段包括V基因区段。在一个实施方式中，将小鼠内源性ADAM6基因座上游的一个或多个内源性免疫球蛋白基因区段进行取代的所述人源免疫球蛋白基因区段包括V和D基因区段。在一个实施方式中，将小鼠内源性ADAM6基因座下游的一个或多个内源性免疫球蛋白基因区段进行取代的所述一个或多个人源免疫球蛋白基因区段包括J基因区段。在一个实施方式中，将小鼠内源性ADAM6基因座下游的一个或多个内源性免疫球蛋白基因区段进行取代的所述一个或多个人源免疫球蛋白基因区段包括D和J基因区段。在一个实施方式中，将小鼠内源性ADAM6基因座下游的一个或多个内源性免疫球蛋白基因区段进行取代的所述一个或多个人源免疫球蛋白基因区段包括V、D和J基因区段。

[0147] 在一个实施方式中，所述ADAM6基因上游和/或下游的一个或多个免疫球蛋白重链基因区段在多能、诱导多能或全能干细胞中被取代，以形成基因修饰的祖细胞；经所述基因修饰的祖细胞被引入宿主；并且将包括所述基因修饰的祖细胞的宿主进行妊娠以形成某种小鼠，所述小鼠包括来源于基因修饰的祖细胞的基因组。在一个实施方式中，所述宿主是胚胎。在一个特定的实施方式中，所述宿主选自小鼠的桑葚胚(例如8或4细胞期)、四倍体胚胎、胚胎细胞聚集物或胚泡。

[0148] 在一个方面，本申请提供了一种制备基因修饰的小鼠的方法，所述方法包括使用包括人免疫球蛋白基因区段的序列来取代包括小鼠免疫球蛋白基因区段和小鼠ADAM6(或者在雄性小鼠中具有功能的其直系同源物或同源物或片段)核苷酸序列的小鼠核苷酸序列以形成第一嵌合基因座，然后将包括小鼠ADAM6编码序列(或者编码其直系同源物或同源物或功能性片段的序列)的序列插入包括所述人源免疫球蛋白基因区段的序列以形成第二嵌合基因座。

[0149] 在一个实施方式中，所述第二嵌合基因座包括人源免疫球蛋白重链可变(VH)基因区段。在一个实施方式中，所述第二嵌合基因座包括人源免疫球蛋白轻链可变(VL)基因区段。在一个特定的实施方式中，所述第二嵌合基因座包括与人源DH基因区段和人源JH基因区段可操作地连接的人源VH基因区段或人源VL基因区段。在进一步特定的实施方式中，所述第二嵌合基因座与第三嵌合基因座可操作地连接，所述第三嵌合基因座包括与小鼠CH2+CH3序列融合的人源CH1序列或者人源CH1和人源铰链序列。

[0150] 在一个方面，本申请提供了使用包括含有小鼠ADAM6基因座或序列的异位核苷酸序列的小鼠来制备具有生育能力的雄性小鼠的用途，其中所述用途包括将包括含有小鼠ADAM6基因座或序列的异位核苷酸序列的小鼠与缺乏功能性内源性小鼠ADAM6基因座或序列的小鼠进行交配，并且获得能产生具有异位ADAM6基因座或序列的后代的雌性后代或包括异位ADAM6基因座或序列的雄性后代，并且所述雄性显示出的生育能力与野生型雄性小鼠显示出的生育能力大致相同。

[0151] 在一个方面，本申请提供了使用如本申请所述小鼠来制备免疫球蛋白可变区核苷酸序列的用途。

[0152] 在一个方面，本申请提供了使用如本申请所述小鼠来制备全人源Fab或全人源F(ab)2的用途。

[0153] 在一个方面，本申请提供了使用如本申请所述小鼠来制备永生化细胞系的用途。

[0154] 在一个方面，本申请提供了使用如本申请所述小鼠来制备杂交瘤或四价体杂交瘤的用途。

[0155] 在一个方面，本申请提供了使用如本申请所述小鼠来制备包含人源重链可变区和人源轻链可变区的噬菌体文库的用途。

[0156] 在一个方面，本申请提供了使用如本申请所述小鼠来产生用于制备人源抗体的可变区序列的用途，包括(a)使用目标抗原来免疫如本申请所描述的小鼠，(b)从(a)中经免疫的小鼠中来分离淋巴细胞，(c)将所述淋巴细胞与一种或多种标记抗体接触，(d)鉴定能够与目标抗原结合的淋巴细胞，以及(e)扩增来自所述淋巴细胞的一个或多个可变区核酸序列以产生可变区序列。

[0157] 在一个实施方式中，所述淋巴细胞来源于小鼠的脾脏。在一个实施方式中，所述淋巴细胞来源于小鼠的淋巴结。在一个实施方式中，所述淋巴细胞来源于小鼠的骨髓。

[0158] 在一个实施方式中，所述标记抗体是荧光团偶联的抗体。一个实施方式中，所述一种或多种荧光团偶联的抗体选自IgM、IgG和/或其组合。

[0159] 在一个实施方式中，所述淋巴细胞是B细胞。

[0160] 在一个实施方式中，所述一个或多个可变区核酸序列包含重链可变区序列。在一个实施方式中，所述一个或多个可变区核酸序列包含轻链可变区序列。在一个特定实施方式中，所述轻链可变区序列是免疫球蛋白κ轻链可变区序列。在一个实施方式中，所述一个或多个可变区核酸序列包含重链和κ轻链可变区序列。

[0161] 在一个实施方式中，本申请提供了一种使用如本申请所述小鼠来产生用于制备人源抗体的重链和κ轻链可变区序列的用途，包括(a)使用目标抗原来免疫如本申请所描述的小鼠，(b)从(a)中经免疫的小鼠中来分离脾脏，(c)将来自于脾脏的B淋巴细胞与一种或多种标记抗体接触，(d)鉴定(c)中能够与目标抗原结合的B淋巴细胞，以及(e)从B淋巴细胞中扩增重链可变区核酸序列和κ轻链可变区核酸序列以产生重链和κ轻链可变区序列。

[0162] 在一个实施方式中，本申请提供了一种使用如本申请所述小鼠来产生用于制备人源抗体的重链和κ轻链可变区序列的用途，包括(a)使用目标抗原来免疫如本申请所描述的小鼠，(b)从(a)中经免疫的小鼠中来分离一个或多个淋巴结，(c)将来自于一个或多个淋巴结的B淋巴细胞与一种或多种标记抗体接触，(d)鉴定(c)中能够与目标抗原结合的B淋巴细胞，以及(e)从B淋巴细胞中扩增重链可变区核酸序列和κ轻链可变区核酸序列以产生重链和κ轻链可变区序列。

[0163] 在一个实施方式中，本申请提供了一种使用如本申请所述小鼠来产生用于制备人源抗体的重链和κ轻链可变区序列的用途，包括(a)使用目标抗原来免疫如本申请所描述的小鼠，(b)从(a)中经免疫的小鼠中来分离骨髓，(c)将来自于骨髓的B淋巴细胞与一种或多种标记的抗体接触，(d)鉴定(c)中能够与目标抗原结合的B淋巴细胞，以及(e)从B淋巴细胞中扩增重链可变区核酸序列和κ轻链可变区核酸序列以产生重链和κ轻链可变区序列。在各种实施方式中，所述一种或多种标记抗体选自IgM、IgG和/或其组合。

[0164] 在各种实施方式中，本申请提供了使用如本申请所述小鼠来产生用于制备人源抗体的重链和κ轻链可变区序列的用途，所述用途还包括将经扩增的重链和轻链可变区序列与人源重链和轻链恒定区序列融合，在细胞中表达融合的重链和轻链序列，并且回收所表达的重链和轻链序列以产生人源抗体。

[0165] 在各种实施方式中，所述人源重链恒定区选自IgM、IgD、IgA、IgE和IgG。在各种特定实施方式中，所述IgG选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在各种实施方式中，所述人源重链恒定区包含CH1、铰链、CH2、CH3、CH4或其组合。在各种实施方式中，所述重链恒定区是免疫球蛋白κ恒定区。在各种实施方式中，所述细胞选自HeLa细胞、DU145细胞、Lncap细胞、MCF-7细胞、MDA-MB-438细胞、PC3细胞、T47D细胞、THP-1细胞、U87细胞、SHSY5Y(人神经母细胞瘤)细胞、Saos-2细胞、Vero细胞、CHO细胞、GH3细胞、PC12细胞、人视网膜细TM胞(例如PER.C6 细胞)和MC3T3细胞。在一个特定实施方式中，所述细胞是CHO细胞。

[0166] 在一个方面，本申请提供了一种产生特异性针对目标抗原的反向嵌合啮齿动物-人源抗体的方法，所述方法包括步骤：使用所述抗原来免疫如本申请所描述的小鼠，从产生特异性针对所述抗原的反向嵌合小鼠-人源抗体的小鼠中分离至少一种细胞，培养产生所述特异性针对所述抗原的反向嵌合小鼠-人源抗体的至少一种细胞，并且获得所述抗体。

[0167] 在一个实施方式中，所述反向-嵌合小鼠-人源抗体包含与小鼠或大鼠重链恒定基因融合的人源重链可变结构域，以及与小鼠或大鼠或人源轻链恒定基因融合的人源轻链可变结构域。

[0168] 在一个实施方式中，培养至少一种产生特异性针对抗原的反向嵌合啮齿动物-人源抗体的细胞是在从小鼠分离的至少一种细胞产生的至少一种杂交瘤细胞上进行。

[0169] 在一个方面，本申请提供了一种用于产生特异性针对目标抗原的全人源抗体的方法，所述方法包括步骤：使用所述抗原来免疫如本申请所描述的小鼠，从产生特异性针对所述抗原的反向嵌合啮齿动物-人源抗体的小鼠中分离至少一种细胞，产生至少一种生产来源于特异性针对所述抗原的反向-嵌合啮齿动物-人源抗体的全人源抗体的细胞，并且培养至少一种生产所述全人源抗体的细胞，并且获得所述全人源抗体。

[0170] 在各种实施方式中，从产生特异性针对所述抗原的反向-嵌合啮齿动物-人源抗体的小鼠分离的至少一种细胞是脾细胞或B细胞。

[0171] 在各种实施方式中，所述抗体是单克隆抗体。

[0172] 在各种实施方式中，使用蛋白、DNA、DNA和蛋白的组合或者表达所述抗原的细胞来实施目标抗原的免疫。

[0173] 在一个方面，本申请提供了一种使用如本申请所述小鼠来制备编码免疫球蛋白可变区或其片段的核酸序列的用途。在一个实施方式中，所述核酸序列用于制备人源抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，所述小鼠用于制备选自下组的抗原结合蛋白：抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、scFv、双特异性scFv、二体、三体、四体、V-NAR、VHH、VL、F(ab)、F(ab)2、DVD(即双可变结构域抗原结合蛋白)、SVD(即单可变结构域抗原结合蛋白)或者双特异性T细胞募召剂(Bispecific T cell Engager)(BiTE)。

[0174] 在一个方面，本申请提供了使用如本申请所述小鼠将异位ADAM6序列引入到缺乏功能性内源性小鼠ADAM6序列的小鼠中的用途，其中所述用途包括将如本申请所述小鼠与缺乏功能性内源性小鼠ADAM6序列的小鼠交配。

[0175] 在一个方面，本申请提供了使用来自如本申请所述小鼠的遗传物质来制备具有异位ADAM6序列的小鼠的用途。在一个实施方式中，所述用途包括使用如本申请所述小鼠的细胞核进行核转移。在一个实施方式中，所述用途包括将如本申请所述小鼠的细胞克隆以产生来源于所述细胞的动物。在一个实施方式中，所述用途包括在制备包括异位ADMA6序列的小鼠的过程中利用如本申请所述小鼠的精子或卵子。

[0176] 在一个方面，本申请提供了一种制备包括经修饰的免疫球蛋白重链基因座的、具有生育能力的雄性小鼠的方法，所述方法包括使用包括在雄性小鼠中具有功能的ADAM6基因或者其直系同源物或同源物或片段的第二小鼠生殖细胞将包括经修饰的内源性免疫球蛋白重链基因座的第一小鼠生殖细胞受精；形成已受精的细胞；使已受精的细胞发育成胚胎；并且将所述胚胎在代孕母体中妊娠以获得小鼠。

[0177] 在一个实施方式中，通过将雄性小鼠与雌性小鼠交配来完成受精。在一个实施方式中，所述雌性小鼠包括ADAM6基因或者其直系同源物或同源物或片段。在一个实施方式中，所述雄性小鼠包括ADAM6基因或者其直系同源物或同源物或片段。

[0178] 在一个方面，本申请提供了使用编码小鼠ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物或相应ADAM6蛋白功能性片段的核酸序列的用途，所述用途是恢复或增强具有包括免疫球蛋白重链基因座修饰的基因组的小鼠的生育能力，其中所述修饰降低或消除内源性ADAM6的功能。

[0179] 在一个实施方式中，所述核酸序列在异位整合至小鼠基因组。在一个实施方式中，所述核酸序列在内源性免疫球蛋白基因座处整合至小鼠基因组。在一个特定的实施方式中，所述内源性免疫球蛋白基因座是重链基因座。在一个实施方式中，所述核酸序列在不同于内源性免疫球蛋白基因座的位置整合至小鼠基因组。

[0180] 在一个方面，本申请提供了一种使用如本申请所描述的小鼠用于生产药物(例如抗原结合蛋白)，或者用于生产编码药物(例如抗原结合蛋白)可变序列的序列的用途，所述药物用于治疗人类疾病或病症。

[0181] 在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠细胞，所述细胞不能表达包括经重排的内源性免疫球蛋白重链基因区段的重链，并且所述细胞包括编码小鼠ADAM6蛋白或其功能性片段的功能性ADAM6基因。在一个实施方式中，所述细胞还包括人源免疫球蛋白基因区段的插入。在一个特定的实施方式中，所述人源免疫球蛋白基因区段是与小鼠重链恒定区可操作地连接的重链基因区段，以使得重排后其编码包括人源可变区的抗体的功能性重链。

[0182] 本申请提供了基因修饰的非人动物、胚胎、细胞、组织和用于修饰非人动物的核酸构建体，以及用于制备和使用其的方法和组合物。本申请提供了在κ轻链背景下产生λ可变区(人源或非人源的)的动物和细胞，其中所述动物和细胞包括可消除或降低ADAM6蛋白或者其同源物或直系同源物活性的重链免疫球蛋白基因座的修饰，其中所述动物还包括全部或部分恢复ADAM6活性(或者其同源物或直系同源物的活性)的基因修饰。本申请提供了具有生育能力并且表达与人源重链可变结构域具有同源性的人源λ可变结构域的小鼠，其中在小鼠中表达的人源λ可变结构域与λ或κ恒定区邻近，并且在各种实施方式中，所述λ或κ可变区是内源性(例如小鼠或大鼠)恒定区。本申请还提供了在κ或λ轻链(例如来自内源性小鼠轻链基因座)的背景下产生人源λ可变区的小鼠和细胞。本申请还提供了用于制备包括λ可变区的抗体的方法。本申请还提供了用于选择表达与λ可变区同源的重链的方法。

[0183] 本申请提供了嵌合的和人源抗原结合蛋白(例如抗体)以及编码其的核酸，其包括体细胞突变的可变区，包括具有轻链的抗体，所述轻链包含来源于与小鼠轻链恒定结构域融合的人源Vλ和人源Jλ基因区段的可变结构域。

[0184] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠在包括小鼠恒定区的轻链上表达人源λ可变区序列。在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠在包括κ恒定区的轻链上表达人源λ可变区序列。在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠由包括人源λ可变区序列的内源性小鼠轻链基因座来表达。在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括经重排的轻链基因，所述轻链基因包含与小鼠恒定区序列连接的人源λ可变序列；在一个实施方式中，所述小鼠恒定区序列是λ恒定序列；在一个实施方式中，所述小鼠恒定区序列是κ恒定序列。

[0185] 在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠，其中所述小鼠包括未经重排的人源λ轻链可变基因区段(hVλ)和人源λ连接基因区段(hJλ)。在一个实施方式中，所述未经重排的hVλ和hJλ在小鼠轻链基因座。在一个实施方式中，所述未经重排的hVλ和未经重排的hJλ在转基因上并且与人源或小鼠恒定区序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述未经重排的hVλ和未经重排的hJλ在游离基因上。在一个实施方式中，所述小鼠能够制备免疫球蛋白，所述免疫球蛋白包括来源于未经重排的hVλ序列和hJλ序列的轻链以及小鼠轻链恒定区(CL)核酸序列。本申请还提供了用于制备和使用基因修饰的小鼠的方法和组合物。本申请提供了一种抗体，所述抗体包括(a)与小鼠重链恒定区融合的人源重链可变结构域(hVH)，以及(b)与小鼠CL结构域融合的人源 包括其中一个或多个可变结构域是例如在本发明小鼠的抗体或免疫细胞的选择中的体细胞突变。在一个实施方式中，所述未经重排的hVλ和未经重排的hJλ与人源或小鼠κ恒定区(Cκ)可操作地连接。在一个实施方式中，所述未经重排的hVλ和未经重排的hJλ与人源或小鼠λ恒定区(Cλ)可操作地连接。

[0186] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠在其生殖细胞系的内源性小鼠轻链基因座中包括人源λ轻链可变区序列，其中所述人源λ可变区序列在包括小鼠免疫球蛋白恒定区基因序列的轻链中表达。

[0187] 在一个实施方式中，所述内源性小鼠轻链基因座是λ基因座。在一个实施方式中，所述内源性小鼠轻链基因座是κ基因座。

[0188] 在一个实施方式中，所述小鼠在内源性小鼠轻链基因座中缺乏内源性轻链可变序列。

[0189] 在一个实施方式中，全部或基本上全部的内源性小鼠轻链可变区基因区段被一个或多个人源λ可变区基因区段取代。

[0190] 在一个实施方式中，所述人源λ轻链可变区序列包括人源Jλ序列。在一个实施方式中，所述人源Jλ序列选自下组：Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ7及其组合。

[0191] 在一个实施方式中，所述人源λ轻链可变区序列包括人源轻链基因座簇A的片段。在一个特定的实施方式中，所述人源λ轻链基因座簇A的片段由hVλ3-27延伸至hVλ3-1。

[0192] 在一个实施方式中，所述人源λ轻链可变区序列包括人源轻链基因座簇B的片段。在一个特定的实施方式中，所述人源λ轻链基因座簇B的片段由hVλ5-52延伸至hVλ1-40。

[0193] 在一个实施方式中，所述人源λ轻链可变区序列包括簇A的基因组片段和簇B的基因组片段。在一个实施方式中，所述人源λ轻链可变区序列包括簇A的至少一个基因区段和簇B的至少一个基因区段。

[0194] 在一个实施方式中，10％以上的小鼠轻链天然库来源于选自2-8、2-23、1-40、5-45和9-49的至少两个hVλ基因区段。在一个实施方式中，20％以上的小鼠轻链天然库来源于选自2-8、2-23、1-40、5-45和9-49的至少三个hVλ基因区段。在一个实施方式中，30％以上的小鼠轻链天然库来源于选自2-8、2-23、1-40、5-45和9-49的至少四个hVλ基因区段。

[0195] 在一个方面，本申请提供了一种表达免疫球蛋白轻链的小鼠，所述免疫球蛋白轻链包括与小鼠恒定区融合的人源λ可变序列，其中所述小鼠显示出的κ与λ的比例为约1:1。

[0196] 在一个实施方式中，所述免疫球蛋白轻链由内源性小鼠轻链基因座表达。

[0197] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括与小鼠κ轻链恒定区序列邻近的λ轻链可变区序列(Vλ)和至少一个J序列(J)。

[0198] 在一个实施方式中，所述小鼠缺乏功能性小鼠Vκ和/或小鼠Jκ基因区段。

[0199] 在一个实施方式中，所述Vλ是人源Vλ(hVλ)和所述J是人源Jλ(hJλ)。在一个实施方式中，所述hVλ和hJλ是未经重排的基因区段。

[0200] 在一个实施方式中，所述小鼠包括多个未经重排的hVλ基因区段和至少一个hJλ基因区段。在一个特定的实施方式中，所述多个未经重排的hVλ基因区段是至少12个基因区段、至少28个基因区段或至少40个基因区段。

[0201] 在一个实施方式中，所述至少一个hJλ基因区段选自下组：Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ7及其组合。

[0202] 在一个实施方式中，内源性小鼠λ轻链基因座全部或部分缺失。

[0203] 在一个实施方式中，所述小鼠κ轻链恒定区序列是内源性小鼠κ轻链基因座。

[0204] 在一个实施方式中，约10％至约45％的小鼠B细胞表达包括轻链的抗体，所述轻链包括人源λ轻链可变(Vλ)结构域和小鼠κ轻链恒定(Cκ)结构域。

[0205] 在一个实施方式中，所述人源λ可变结构域来源于经重排的hVλ/hJλ序列，所述序列选自下组：3-1/1、3-1/7、4-3/1、4-3/7、2-8/1、3-9/1、3-10/1、3-10/3、3-10/7、2-14/1、3-19/1、2-23/1、3-25/1、1-40/1、1-40/2、1-40/3、1-40/7、7-43/1、7-43/3、1-44/1、
1-44/7、5-45/1、5-45/2、5-45/7、7-46/1、7-46/2、7-46/7、9-49/1、9-49/2、9-49/7 和
1-51/1。

[0206] 在一个实施方式中，所述小鼠还包括来自人源κ轻链基因座的人源Vκ-Jκ基因间区，其中所述人源Vκ-Jκ基因间区与Vλ序列和J序列邻近。在一个特定的实施方式中，所述人源Vκ-Jκ基因间区位于Vλ序列和J序列之间。

[0207] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括(a)在内源性小鼠轻链基因座上的至少12个至至少40个未经重排的人源λ轻链可变区基因区段和至少1个人源Jλ基因区段；(b)位于至少12个到至少40个人源轻链可变区基因区段和至少1个人源Jλ序列之间的人源Vκ-Jκ基因间序列；其中所述小鼠表达包括轻链的抗体，所述轻链包含人源Vλ结构域和小鼠Cκ结构域。

[0208] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠表达包括轻链的抗体，所述轻链包含λ可变序列和κ恒定序列。

[0209] 在一个实施方式中，所述小鼠显示出κ与λ的比例为约1:1。

[0210] 在一个实施方式中，来自小鼠骨髓的未成熟B细胞群显示出的κ与λ的比例为约1:1。

[0211] 在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠，其中所述小鼠包括与包含小鼠CL基因的小鼠轻链基因座可操作地连接的、未经重排的免疫球蛋白Vλ和Jλ基因区段。

[0212] 在一个实施方式中，所述Vλ和/或Jλ基因区段是人源基因区段。在一个实施方式中，所述Vλ和/或Jλ基因区段是小鼠基因区段，并且所述CL是小鼠Cκ。

[0213] 在一个实施方式中，所述内源性小鼠轻链基因座是κ轻链基因座。在一个实施方式中，所述内源性小鼠轻链基因座是λ轻链基因座。

[0214] 在一个实施方式中，所述未经重排的Vλ和Jλ基因区段在内源性小鼠轻链基因座。

[0215] 在一个实施方式中，所述未经重排的免疫球蛋白Vλ和Jλ基因区段在转基因上。

[0216] 在一个实施方式中，所述小鼠还包括在内源性小鼠重链免疫球蛋白基因座上使用一个或多个人源V、D和/或J基因区段取代一个或多个重链V、D和/或J基因区段。

[0217] 在一个实施方式中，所述小鼠在含有小鼠Cκ基因的内源性小鼠κ轻链基因座上包括未经重排的免疫球蛋白Vλ和Jλ基因区段。

[0218] 在一个实施方式中，所述小鼠在含有小鼠Cλ基因的内源性小鼠λ轻链基因座上包括未经重排的人源免疫球蛋白λ轻链可变基因区段(Vλ)和λ连接基因区段(Jλ)。

[0219] 在一个实施方式中，所述轻链可变基因座(“VL基因座”)包括至少一个人源Vλ(hVλ)基因区段。在一个实施方式中，所述VL基因座包括至少一个人源Jλ(hJλ)基因区段。在另一个实施方式中，VL基因座包括至多四个hJλ基因区段。在一个实施方式中，所述VL基因座包括邻近序列，所述邻近序列包含人源λ和人源κ基因组序列。

[0220] 在一个实施方式中，所述κ轻链可变基因座(“κ基因座”)包括至少一个人源Vλ(hVλ)基因区段。在一个实施方式中，所述κ基因座包括至少一个人源Jλ(hJλ)基因区段。在一个实施方式中，所述κ基因座包括至多四个hJλ基因区段。在一个实施方式中，所述κ基因座包括至少一个hVλ和至少一个hJλ，并且缺乏或基本上缺乏功能性Vκ区基因区段和缺乏或基本上缺乏功能性Jκ区基因区段。在一个实施方式中，所述小鼠包括无功能的Vκ区基因区段。在一个实施方式中，所述小鼠包括无功能的Jκ区基因区段。

[0221] 在一个实施方式中，所述λ轻链可变基因座(“λ基因座”)包括至少一个hVλ基因区段。在一个实施方式中，所述λ基因座包括至少一个人源Jλ(hJλ)基因区段。在另一个实施方式中，所述λ基因座包括至多四个hJλ基因区段。

[0222] 在一个实施方式中，所述VL基因座包括多个hVλ。在一个实施方式中，选择多个hVλ以使得表达λ轻链可变区库，反映了在人中观察到的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、或约90％或者更多的Vλ使用。在一个实施方式中，所述VL基因座包括基因区段hVλ1-40、1-44、2-8、2-14、3-21及其组合。

[0223] 在一个实施方式中，所述hVλ包括3-1、4-3、2-8、3-9、3-10、2-11和3-12。在一个特定的实施方式中，所述VL基因座包括跨距为Vλ3-12至Vλ3-1的人源λ轻链基因座的邻近序列。在一个实施方式中，所述VL基因座包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个hVλ。在一个特定的实施方式中，所述hVλ包括3-1、4-3、2-8、3-9、3-10、2-11和3-12。在一个特定的实施方式中，所述VL基因座包括跨距为Vλ3-12至Vλ3-1的人源λ基因座的邻近序列。在一个实施方式中，所述VL基因座在内源性κ基因座。在一个特定的实施方式中，所述VL基因座在内源性κ基因座上，并且所述内源性λ轻链基因座部分或全部缺失。在一个实施方式中，所述VL基因座在内源性λ基因座上。在一个特定的实施方式中，所述VL基因座在内源性λ基因座上，并且所述内源性κ基因座部分或全部缺失。

[0224] 在一个实施方式中，所述VL基因座包括13至28个或更多的hVλ。在一个特定的实施方式中，所述hVλ包括2-14、3-16、2-18、3-19、3-21、3-22、2-23、3-25和3-27。在一个特定的实施方式中，所述κ基因座包括跨距为Vλ3-27至Vλ3-1的人源λ基因座的邻近序列。在一个实施方式中，所述VL基因座在内源性κ基因座上。在一个特定的实施方式中，所述VL基因座在内源性κ基因座上，并且所述内源性λ轻链基因座部分或全部缺失。在另一个实施方式中，所述VL基因座在内源性λ基因座上。在一个特定的实施方式中，所述VL基因座在内源性λ基因座上，并且所述内源性κ基因座部分或全部缺失。

[0225] 在一个实施方式中，所述VL基因座包括29至40个hVλ。在一个特定的实施方式中，所述κ基因座包括跨距为Vλ3-29至Vλ3-1的人源λ基因座的邻近序列，以及跨距为Vλ5-52至Vλ1-40的人源λ基因座的邻近序列。在一个特定的实施方式中，在基因修饰小鼠中hVλ1-40和hVλ3-29之间的全部或基本上全部的序列基本上由hVλ1-40基因区段下游(在3’非翻译部分下游)天然存在的(例如在人群中)约959bp人源λ序列、限制性酶位点(例如PI-SceI)、后接的天然存在的hVλ3-29基因区段上游约3,431bp的人源λ序列组成。在一个实施方式中，所述VL基因座在内源性小鼠κ基因座上。在一个特定的实施方式中，所述VL基因座在内源性小鼠κ基因座上，并且所述内源性小鼠λ轻链基因座部分或全部缺失。在另一个实施方式中，所述VL基因座在内源性小鼠λ基因座上。
在一个特定的实施方式中，所述VL基因座在内源性小鼠λ基因座上，并且所述内源性小鼠κ基因座的部分或全部缺失。

[0226] 在一个实施方式中，所述VL基因座包括至少一个hJλ。在一个实施方式中，所述VL基因座包括多个hJλ。在一个实施方式中，所述VL基因座包括至少2、3、4、5、6或7个hJλ。在一个特定的实施方式中，所述VL基因座包括四个hJλ。在一个特定的实施方式中，所述四个hJλ是hJλ1、hJλ2、hJλ3和hJλ7。在一个实施方式中，所述VL基因座是κ基因座。在一个特定的实施方式中，所述VL基因座在内源性κ基因座上，并且所述内源性λ轻链基因座部分或全部缺失。在一个实施方式中，所述VL基因座包括一个hJλ。在一个特定的实施方式中，所述一个hJλ是hJλ1。在一个实施方式中，所述VL基因座在内源性κ基因座上。在一个特定的实施方式中，所述VL基因座在内源性κ基因座上，并且所述内源性λ轻链基因座部分或全部缺失。在另一个实施方式中，所述VL基因座在内源性λ基因座上。在一个特定的实施方式中，所述VL基因座在内源性λ基因座上，并且所述内源性κ基因座部分或全部缺失。

[0227] 在一个实施方式中，所述VL基因座包括至少一个hVλ、至少一个hJλ和小鼠Cκ基因。在一个实施方式中，所述VL基因座包括至少一个hVλ、至少一个hJλ和小鼠Cλ基因。在一个特定的实施方式中，所述小鼠Cλ基因是Cλ2。在一个特定的实施方式中，所述小鼠Cλ基因与小鼠Cλ2具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％或至少99％一致性。

[0228] 在一个实施方式中，所述小鼠包括使用一个或多个hVλ基因区段取代内源性小鼠Vκ基因区段的内源性小鼠κ基因座，其中所述hVλ基因区段与内源性小鼠Cκ区基因可操作地连接，以使得小鼠重排人源Vλ基因区段并且表达包括人源Vλ结构域和小鼠Cκ的反向嵌合免疫球蛋白轻链。在一个实施方式中，90-100％的未经重排的小鼠Vκ基因区段被至少一个未经重排的hVλ基因区段取代。在一个特定的实施方式中，全部或基本上全部的内源性小鼠Vκ基因区段被至少一个未经重排的hVλ基因区段取代。在一个实施方式中，所述取代是被至少12个、至少28个或至少40个未经重排的hVλ基因区段取代。在一个实施方式中，所述取代是被至少7个功能性未经重排的hVλ基因区段、至少16个功能性未经重排的hVλ基因区段或者至少27个功能性未经重排的hVλ基因区段取代。在一个实施方式中，所述小鼠包括用至少一个未经重排的hJλ基因区段来取代全部小鼠Jκ基因区段。在一个实施方式中，所述至少一个未经重排的hJλ基因区段选自Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ4、Jλ5、Jλ6、Jλ7及其组合。在一个特定的实施方式中，所述一个或多个hVλ基因区段选自3-1、4-3、2-8、3-9、3-10、2-11、3-12、2-14、3-16、2-18、3-19、3-21、3-22、2-23、3-25、3-27、1-40、7-43、1-44、5-45、7-46、1-47、5-48、9-49、1-50、1-51、5-52hVλ基因区段及其组合。在一个特定的实施方式中，所述至少一个未经重排的hJλ基因区段选自Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ7及其组合。

[0229] 在一个实施方式中，所述小鼠包括使用在内源性小鼠λ基因座的一个或多个人源Vλ基因区段来取代在内源性小鼠λ基因座的内源性小鼠Vλ基因区段，其中所述hVλ基因区段与小鼠Cλ区基因可操作地连接，以使得所述小鼠重排hVλ基因区段并且表达包括hVλ结构域和小鼠Cλ的反向嵌合免疫球蛋白轻链。在一个特定的实施方式中，所述小鼠Cλ基因是Cλ2。在一个特定的实施方式中，所述小鼠Cλ基因与小鼠Cλ2具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％的一致性。在一个实施方式中，90-100％的未经重排的小鼠Vλ基因区段被至少一个未经重排的hVλ基因区段取代。
在一个特定的实施方式中，全部或基本上全部的内源性小鼠Vλ基因区段被至少一个未经重排的hVλ基因区段取代。在一个实施方式中，所述取代是被至少12个、至少28个或至少40个未经重排的hVλ基因区段取代。在一个实施方式中，所述取代是被至少7个功能性未经重排的hVλ基因区段、至少16个功能性未经重排的hVλ基因区段或至少27个功能性未经重排的hVλ基因区段取代。在一个实施方式中，所述小鼠包括用至少一个未经重排的hJλ基因区段来取代全部小鼠Jλ基因区段。在一个实施方式中，所述至少一个未经重排的hJλ基因区段选自Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ4、Jλ5、Jλ6、Jλ7及其组合。在一个特定的实施方式中，所述一个或多个hVλ基因区段选自3-1、4-3、2-8、3-9、3-10、2-11、3-12、
2-14、3-16、2-18、3-19、3-21、3-22、2-23、3-25、3-27、1-40、7-43、1-44、5-45、7-46、1-47、
5-48、9-49、1-50、1-51、5-52hVλ基因区段及其组合。在一个特定的实施方式中，所述至少一个未经重排的hJλ基因区段选自Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ7及其组合。

[0230] 在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠，所述小鼠包括位于内源性小鼠κ轻链基因座的人源Vκ-Jκ基因间区序列。

[0231] 在一个实施方式中，所述人源Vκ-Jκ基因间区序列在包括hVλ和hJλ基因区段的小鼠内源性κ轻链基因座上，并且所述人源Vκ-Jκ基因间区序列位于hVλ和hJλ基因区段之间。在一个特定的实施方式中，所述hVλ和hJλ基因区段能够在小鼠中重组形成功能性人源λ轻链可变结构域。

[0232] 在一个实施方式中，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括多个hVλ和一个或多个hJλ，并且所述人源Vκ-Jκ基因间区序列，相对于转录方向，位于hVλ序列的近端下游或3’端(3’most)和第一hJλ序列的上游或5’端。

[0233] 在一个实施方式中，所述人源Vκ-Jκ基因间区是位于人源Vκ4-1基因区段下游约130bp或3’端、人源Vκ4-1基因区段3’端非翻译区下游约130bp的区域，并且跨距至人源Jκ1基因区段上游约600bp或5’端。在一个特定的实施方式中，所述人源Vκ-Jκ基因间区的大小约22.8kb。在一个实施方式中，所述Vκ-Jκ基因间区与人源Vκ-Jκ基因间区具有约90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上或者约95％或以上的一致性，所述人源Vκ-Jκ基因间区由人源Vκ4-1基因区段的3’非翻译区末端延伸至人源Jκ1基因区段上游约600bp。在一个实施方式中，所述Vκ-Jκ基因间区包括SEQ ID NO:158。在一个特定的实施方式中，所述Vκ-Jκ基因间区包括SEQ ID NO:158的功能性区段。在一个特定的实施方式中，所述Vκ-Jκ基因间区是SEQ ID NO:158。

[0234] 在一个方面，本申请提供了一种非人动物、非人细胞(例如ES细胞或多能干细胞)、非人胚胎或非人组织，其包括所述人源Vκ-Jκ基因间区序列，其中所述基因间区序列是异位的。在一个特定的实施方式中，所述异位序列位于人源化的内源性非人源免疫球蛋白基因座。在一个实施方式中，所述非人动物选自小鼠、大鼠、仓鼠、山羊、牛、绵羊和非人灵长类。

[0235] 在一个方面，本申请提供了一种分离的核酸构建体，所述核酸构建体包括所述人源Vκ-Jκ基因间区序列。在一个实施方式中，所述核酸构建体包括将人源Vκ-Jκ基因间区序列靶向至小鼠轻链基因座的靶向臂。在一个特定的实施方式中，所述小鼠轻链基因座是κ基因座。在一个特定的实施方式中，所述靶向臂将人源Vκ-Jκ基因间区靶向至经修饰的内源性小鼠κ基因座，其中所述靶向是靶向至hVλ序列和hJλ序列之间的位置。

[0236] 在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠，其中所述小鼠包括不超过两个轻链等位基因，其中所述轻链等位基因包括(a)在包括小鼠CL基因的内源性小鼠轻链基因座上的未经重排的免疫球蛋白人源Vλ和Jλ基因区段；以及(b)在包括小鼠CL基因的内源性小鼠轻链基因座上的未经重排的免疫球蛋白VL和JL基因区段。

[0237] 在一个实施方式中，所述内源性小鼠轻链基因座是κ基因座。在另一个实施方式中，所述内源性小鼠轻链基因座是λ基因座。

[0238] 在一个实施方式中，所述不超过两个轻链等位基因选自κ等位基因和λ等位基因、两个κ等位基因和两个λ等位基因。在一个特定的实施方式中，所述两个轻链等位基因之一是包括Cλ2基因的λ等位基因。

[0239] 在一个实施方式中，所述小鼠包括一个功能性免疫球蛋白轻链基因座和一个无功能的轻链基因座，其中所述功能性轻链基因座在含有小鼠Cκ基因的内源性小鼠κ轻链基因座上包括未经重排的免疫球蛋白人源Vλ和Jλ基因区段。

[0240] 在一个实施方式中，所述小鼠包括一个功能性免疫球蛋白轻链基因座和一个无功能的轻链基因座，其中所述功能性轻链基因座在含有小鼠Cλ基因的内源性小鼠λ轻链基因座上包括未经重排的免疫球蛋白人源Vλ和Jλ基因区段。在一个实施方式中，所述Cλ基因是Cλ2。在一个特定的实施方式中，所述小鼠Cλ基因与小鼠Cλ2具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％的一致性。

[0241] 在一个实施方式中，所述小鼠还包括至少一个免疫球蛋白重链等位基因。在一个实施方式中，所述至少一个免疫球蛋白重链等位基因在内源性小鼠重链基因座上包括人源VH基因区段、人源DH基因区段和人源JH基因区段，所述内源性小鼠重链基因座包括表达人源/小鼠重链的人源重链基因。在一个特定的实施方式中，所述小鼠包括两个免疫球蛋白重链等位基因，并且所述小鼠表达人源/小鼠重链。

[0242] 在一个实施方式中，所述小鼠在包括内源性Cκ基因的内源性小鼠κ基因座上包括第一轻链等位基因，所述第一轻链等位基因包括未经重排的hVκ和未经重排的hJκ，；并且在包括内源性Cκ基因的内源性小鼠κ基因座上包括第二轻链等位基因，所述第二轻链等位基因包括未经重排的hVλ和未经重排的hJλ。在一个特定的实施方式中，所述第一和第二轻链等位基因仅是基因修饰小鼠的功能性轻链等位基因。在一个特定的实施方式中，所述小鼠包括无功能的λ基因座。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠不表达包括λ恒定区的轻链。

[0243] 在一个实施方式中，所述小鼠在包括内源性Cκ基因的内源性小鼠κ基因座上包括第一轻链等位基因，所述第一轻链等位基因包括未经重排的hVκ和未经重排的hJκ；并且在包括内源性Cλ基因的内源性小鼠λ基因座上包括第二轻链等位基因，所述第二轻链等位基因包括未经重排的hVλ和未经重排的hJλ。在一个特定的实施方式中，所述第一和第二轻链等位基因仅是基因修饰小鼠的功能性轻链等位基因。在一个实施方式中，所述内源性Cλ基因是Cλ2。在一个特定的实施方式中，所述小鼠Cλ基因与小鼠Cλ2具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％的一致性。

[0244] 在一个实施方式中，所述小鼠包括六个免疫球蛋白等位基因，其中所述第一等位基因在包括小鼠Cκ基因的内源性小鼠κ轻链基因座上包括未经重排的免疫球蛋白Vλ和Jλ基因区段，所述第二等位基因在包括小鼠Cκ基因的内源性小鼠κ轻链基因座上包括未经重排的免疫球蛋白Vκ和Jκ基因区段，所述第三等位基因在包括小鼠Cλ基因的内源性小鼠λ轻链基因座上包括未经重排的免疫球蛋白Vλ和Jλ基因区段，所述第四和第五等位基因在包括小鼠重链基因的内源性小鼠重链基因座上各自独立地包括未经重排的VH和DH和JH基因区段，并且所述第六等位基因包括(a)在包括小鼠Cλ基因的内源性小鼠λ轻链基因座上的未经重排的免疫球蛋白Vλ和Jλ基因区段，(b)无功能的λ基因座，或(c)λ基因座全部或部分缺失。

[0245] 在一个实施方式中，所述第一等位基因包括未经重排的hVλ和hJλ。在一个实施方式中，所述第二等位基因包括未经重排的hVκ和hJκ。在一个实施方式中，所述第三等位基因包括未经重排的hVλ和hJλ。在一个实施方式中，所述第四和第五各自独立地包括未经重排的hVH和hDH和hJH。在一个实施方式中，所述第六等位基因包括内源性小鼠λ基因座的全部或部分缺失。

[0246] 在一个实施方式中，所述小鼠包括六个免疫球蛋白等位基因，其中所述第一等位基因在包括小鼠Cλ基因的内源性小鼠λ轻链基因座上包括未经重排的免疫球蛋白Vλ和Jλ基因区段，所述第二等位基因在包括小鼠Cλ基因的内源性小鼠λ轻链基因座上包括未经重排的免疫球蛋白Vλ和Jλ基因区段，所述第三等位基因在包括小鼠Cκ基因的内源性小鼠κ轻链基因座上包括未经重排的免疫球蛋白Vκ和Jκ基因区段，所述第四和第五等位基因在包括小鼠重链基因的内源性小鼠重链基因座上各自独立地包括的未经重排的VH和DH和JH基因区段，并且所述第六等位基因包括(a)在包括小鼠Cκ基因的内源性小鼠κ轻链基因座上的未经重排的免疫球蛋白Vκ和Jκ基因区段，(b)无功能的κ基因座，或(c)κ基因座的一个或多个元件缺失。

[0247] 在一个实施方式中，所述第一等位基因包括未经重排的hVλ和hJλ基因区段。在一个实施方式中，所述第二等位基因包括未经重排的hVλ和hJλ基因区段。在一个实施方式中，所述第三等位基因包括未经重排的hVκ和hJκ基因区段。在一个实施方式中，所述第四和第五各自独立地包括未经重排的hVH和hDH和hJH基因区段。在一个实施方式中，所述第六等位基因包括功能沉默的内源性小鼠κ基因座。

[0248] 在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠包括含有重排的抗体基因B细胞，所述重排的抗体基因包括与小鼠CL结构域可操作地连接的重排的hVλ结构域。在一个实施方式中，所述小鼠CL结构域选自小鼠Cκ和小鼠Cλ结构域。在一个特定的实施方式中，所述小鼠Cλ结构域来源于Cλ2基因。在一个特定的实施方式中，所述小鼠Cλ结构域来源于与小鼠Cλ2具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的Cλ结构域。

[0249] 在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠，所述小鼠在CL上表达Vλ区，所述CL是Cκ。在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠，所述小鼠在CL上表达hVλ区，所述CL选自人源Cκ、人源Cλ或小鼠Cκ。在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠，所述小鼠在小鼠Cκ上表达hVλ区。

[0250] 在一个实施方式中，约10-50％的小鼠脾细胞是B细胞(即CD19-阳性)，或者其约9-28％表达免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包括与小鼠Cκ结构域融合的hVλ结构域。

[0251] 在一个特定的实施方式中，约23-34％的小鼠脾细胞是B细胞(即CD19-阳性)，或者其约9-11％表达免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包括与小鼠Cκ结构域融合的hVλ结构域。

[0252] 在一个特定的实施方式中，约19-31％的小鼠脾细胞是B细胞(即CD19-阳性)，或者其约9-17％表达免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包括与小鼠Cκ结构域融合的hVλ结构域。

[0253] 在一个特定的实施方式中，约21-38％的小鼠脾细胞是B细胞(即CD19-阳性)，或者其约24-27％表达免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包括与小鼠Cκ结构域融合的hVλ结构域。

[0254] 在一个特定的实施方式中，约10-14％的小鼠脾细胞是B细胞(即CD19-阳性)，或者其约9-13％表达免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包括与小鼠Cκ结构域融合的hVλ结构域。

[0255] 在一个特定的实施方式中，约31-48％的小鼠脾细胞是B细胞(即CD19-阳性)，或者其约15-21％表达免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包括与小鼠Cκ结构域融合的hVλ结构域。在一个特定的实施方式中，约30-38％的小鼠脾细胞是B细胞(即CD19-阳性)，或者其约33-48％表达免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包括与小鼠Cκ结构域融合的hVλ结构域。

[0256] 在一个实施方式中，约52-70％的小鼠骨髓是B细胞(即CD19-阳性)，或者其约31-47％的未成熟B细胞(即CD-阳性/B220-中间阳性/IgM-阳性)表达免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包括与小鼠Cκ结构域融合的hVλ结构域。

[0257] 在一个实施方式中，约60％的小鼠骨髓是B细胞(即CD19-阳性)，或者其约38.3％的未成熟B细胞(即CD-阳性/B220-中间阳性/IgM-阳性)表达免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包括与小鼠Cκ结构域融合的hVλ结构域。

[0258] 在一个实施方式中，所述小鼠表达包括轻链的抗体，所述轻链包括来源于人源V和人源J基因区段的可变结构域，以及来源于小鼠恒定区基因的恒定结构域。在一个实施方式中，所述小鼠恒定区基因是Cκ基因。在另一个实施方式中，所述小鼠恒定区基因是Cλ基因。在一个特定的实施方式中，所述Cλ区是Cλ2。在一个特定的实施方式中，所述小鼠Cλ基因是来源于与小鼠Cλ2具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的Cλ基因。在一个特定的实施方式中，所述抗体还包括重链，所述重链包含来源于人源V、人源D和人源J基因区段的可变结构域，以及来源于小鼠重链恒定区基因的重链恒定结构域。在一个实施方式中，所述小鼠重链恒定区基因包括重链恒定结构域的铰链-CH2-CH3序列。在另一个实施方式中，所述小鼠重链恒定区基因包括重链恒定结构域的CH1-铰链-CH2-CH3序列。在另一个实施方式中，所述小鼠重链恒定区基因包括重链恒定结构域的CH1-CH2-CH3-CH4序列。在另一个实施方式中，所述小鼠重链恒定区基因包括重链恒定结构域的CH2-CH3-CH4序列。

[0259] 在一个实施方式中，所述小鼠表达包括轻链的抗体，所述轻链包含重排的人源Vλ-Jλ序列和小鼠Cκ序列。在一个实施方式中，所述重排的人源Vλ-Jλ序列来源于hVλ基因区段的重排，所述hVλ基因区段选自3-1、4-3、2-8、3-9、3-10、2-14、3-19、2-23、3-25、1-40、7-43、1-44、5-45、7-46、1-47、9-49和1-51基因区段。在一个实施方式中，所述重排的人源Vλ-Jλ序列来源于hJλ基因区段的重排，所述hJλ基因区段选自Jλ1、Jλ2、Jλ3和Jλ7基因区段。

[0260] 在一个实施方式中，所述小鼠表达包括轻链的抗体，所述轻链包括含有人源Vλ/Jλ序列的经重排的免疫球蛋白λ轻链可变区，所述人源Vλ/Jλ序列选自3-1/1、3-1/7、4-3/1、4-3/7、2-8/1、3-9/1、3-10/1、3-10/3、3-10/7、2-14/1、3-19/1、2-23/1、3-25/1、
1-40/1、1-40/2、1-40/3、1-40/7、7-43/1、7-43/3、1-44/1、1-44/7、5-45/1、5-45/2、5-45/7、
7-46/1、7-46/2、7-46/7、9-49/1、9-49/2、9-49/7和1-51/1。在一个特定的实施方式中，所述B细胞表达抗体，所述抗体包括与小鼠重链恒定结构域融合的人源免疫球蛋白重链可变结构域，以及与小鼠κ轻链恒定结构域融合的人源免疫球蛋白λ轻链可变结构域。

[0261] 在一个方面，本申请提供了一种表达抗体的小鼠，所述抗体包括(a)重链，所述重链包含来源于未经重排的人源重链可变区基因区段的重链可变结构域，其中所述重链可变结构域与小鼠重链恒定(CH)区融合；以及(b)轻链，所述轻链包含来源于未经重排的hVλ和hJλ的轻链可变结构域，其中所述轻链可变结构域与小鼠CL区融合。

[0262] 在一个实施方式中，所述小鼠包括(i)重链基因座，所述重链基因座包含全部或基本上全部功能性内源性小鼠V、D和J基因区段被全部或基本上全部功能性人源V、D和J基因区段取代，和小鼠CH基因，(ii)第一κ轻链基因座，所述第一κ轻链基因座包含全部或基本上全部功能性内源性小鼠Vκ和Jκ基因区段被全部、基本上全部或多个功能性hVλ和hJλ基因区段取代，和小鼠Cκ基因，(iii)第二κ轻链基因座，所述第二κ轻链基因座包含全部或基本上全部功能性内源性小鼠Vκ和Jκ基因区段被全部、基本上全部或多个功能性hVλ和hJλ基因区段取代，和小鼠Cκ基因。在一个实施方式中，所述小鼠不表达包括Cλ区的抗体。在一个实施方式中，所述小鼠包括Cλ基因和/或Vλ和/或Jλ基因区段的缺失。在一个实施方式中，所述小鼠包括无功能的λ轻链基因座。在一个特定的实施方式中，所述λ轻链基因座全部或部分缺失。

[0263] 在一个实施方式中，所述小鼠包括(i)重链基因座，所述重链基因座包含全部或基本上全部功能性内源性小鼠V、D和J基因区段被全部或基本上全部功能性人源V、D和J基因区段取代，和小鼠CH基因，(ii)第一λ轻链基因座，所述第一λ轻链基因座包含全部或基本上全部功能性内源性小鼠Vλ和Jλ基因区段被全部、基本上全部或多个功能性hVλ和hJλ基因区段取代，和小鼠Cλ基因，(iii)第二λ轻链基因座，所述第二λ轻链基因座包含全部或基本上全部功能性内源性小鼠Vλ和Jλ基因区段被全部、基本上全部或多个功能性hVλ和hJλ基因区段取代，和小鼠Cλ基因。在一个特定的实施方式中，所述小鼠Cλ基因是Cλ2。在一个特定的实施方式中，所述小鼠Cλ基因是来源于与小鼠Cλ2具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的Cλ基因。

[0264] 在一个实施方式中，所述小鼠包括Cκ基因和/或Vκ和/或Jκ基因区段的缺失。在一个实施方式中，所述小鼠包括无功能的κ轻链基因座。

[0265] 在一个方面，本申请提供了一种表达抗体的基因修饰的小鼠，其中由所述小鼠生产的总IgG抗体的超过10％、超过15％、超过20％、超过25％、超过30％、超过35％、超过40％、超过60％、超过70％、超过80％或超过90％包括λ来源可变结构域，并且其中所述小鼠表达包括与小鼠Cκ区融合的κ来源可变结构域的抗体。在特定的实施方式中，由所述小鼠生产的总抗体的约15-40％、20-40％、25-40％、30-40％或35-40％包括λ来源可变结构域。

[0266] 在一个实施方式中，所述λ来源的可变结构域来源于hVλ和hJλ。在一个实施方式中，所述λ来源的可变结构域在包括小鼠Cκ区的轻链中。在一个特定的实施方式中，所述λ来源的可变结构域在包括小鼠Cλ区的轻链中。在另一个特定的实施方式中，所述Cλ区是Cλ2区。在一个实施方式中，所述κ来源的可变结构域来源于hVκ和hJκ，并且在特定实施方式中，其在包括小鼠Cκ区的轻链中。

[0267] 在一个方面，本申请提供了一种分离的DNA构建体，所述构建体包括上游同源臂和下游同源臂，其中所述上游和下游同源臂将所述构建体靶向至小鼠κ基因座，并且所述构建体包括功能性未经重排的hVλ区段和功能性未经重排的hJλ区段以及选择或标记序列。

[0268] 在一个方面，本申请提供了一种分离的DNA构建体，所述构建体相对于转录的方向从5’至3’包括，用于靶向小鼠Vλ2上游的小鼠λ序列的靶向臂、在重组酶识别位点5’和3’翼侧的选择性表达盒(cassette)以及用于靶向小鼠Jλ2的3’端的小鼠λ序列的靶向臂。在一个实施方式中，所述选择性表达盒是Frt化的(Frt’ed)Hyg-TK表达盒。在一个实施方式中，所述3’靶向臂包括小鼠Cλ2、Jλ4、Cλ4和小鼠增强子2.4。

[0269] 在一个方面，本申请提供了一种分离的DNA构建体，所述构建体相对于转录的方向从5’至3’包括，用于靶向相对于Vλ1为5’端的小鼠λ基因座的靶向臂、在重组酶识别位点5’和3’翼侧的选择性表达盒以及用于靶向相对于小鼠Cλ1为3’端的小鼠λ序列的3’端靶向臂。在一个实施方式中，所述选择性表达盒是loxed新霉素表达盒。在一个实施方式中，所述3’靶向臂包括小鼠λ3’增强子和小鼠λ3’增强子3.1。

[0270] 在一个方面，本申请提供了一种分离的DNA构建体，所述构建体相对于转录的方向从5’至3’包括，用于靶向相对于Vλ2为5’端的小鼠λ基因座的靶向臂、在重组酶识别位点5’和3’翼侧的选择性表达盒以及用于靶向相对于小鼠Jλ2为3’端和相对于小鼠Cλ2为5’端的小鼠λ序列的3’靶向臂。在一个实施方式中，所述选择性表达盒是Frt化的潮霉素-TK表达盒。在一个实施方式中，所述3’靶向臂包括小鼠Cλ2-Jλ4-Cλ4基因区段和小鼠λ增强子2.4。

[0271] 在一个方面，本申请提供了一种分离的DNA构建体，所述构建体相对于转录的方向从5’至3’包括，用于靶向相对于Vλ2为5’端的小鼠λ基因座的靶向臂、在重组酶识别位点5’和3’翼侧的选择性表达盒、包括从hVλ3-12下游至hJλ1末端的人源λ轻链基因座邻近区域的人源基因组片段以及用于靶向相对于小鼠Jλ2为3’端的小鼠λ序列的3’靶向臂。在一个实施方式中，所述选择性表达盒是Frt化的新霉素表达盒。在一个实施方式中，所述3’靶向臂包括小鼠Cλ2-Jλ4-Cλ4基因区段和小鼠λ增强子2.4。

[0272] 在一个方面，本申请提供了一种分离的DNA构建体，所述构建体包括由hVλ3-12下游至hJλ1末端的人源λ轻链基因座的连续区域。

[0273] 在一个方面，本申请提供了一种分离的DNA构建体，所述构建体相对于转录的方向从5’至3’包括，用于靶向相对于Vλ2为5’端的小鼠λ基因座的靶向臂、在重组酶识别位点5’和3’翼侧的选择性表达盒以及包括从hVλ3-27下游至hVλ2-8末端的人源λ轻链基因座邻近区域的人源基因组片段。在一个实施方式中，所述选择性表达盒是Frt化的潮霉素表达盒。在一个实施方式中，所述人源基因组片段包括3’靶向臂。在一个特定的实施方式中，所述3’靶向臂包括从hVλ3-12下游至hVλ2-8末端的约53kb的人源λ轻链基因座。

[0274] 在一个方面，本申请提供了一种分离的DNA构建体，所述构建体包括由hVλ3-27下游至h Vλ3-12末端的人源λ轻链基因座的邻近区域。

[0275] 在一个方面，本申请提供了一种分离的DNA构建体，所述构建体相对于转录的方向从5’至3’包括，用于靶向相对于Vλ2为5’端的小鼠λ基因座的靶向臂、在重组酶识别位点5’和3’翼侧的选择性表达盒、包括从hVλ5-52下游至hVλ1-40末端的人源λ轻链基因座邻近区域的第一人源基因组片段、限制性酶位点以及包括从hVλ3-29下游至hVλ82K末端的人源λ轻链基因座邻近区域的第二人源基因组片段。在一个实施方式中，所述选择性表达盒是Frt化的新霉素表达盒。在一个实施方式中，所述限制性酶位点是归巢核酸内切酶的位点。在一个特定的实施方式中，所述归巢核酸内切酶是PI-SceI。在一个实施方式中，所述第二人源基因组片段是3’靶向臂。在一个特定的实施方式中，所述3’靶向臂包括从hVλ3-29下游至hVλ82K末端的约27kb的人源λ轻链基因座。

[0276] 在一个方面，本申请提供了一种分离的DNA构建体，所述构建体包括由hVλ5-52下游至hVλ1-40末端的人源λ轻链基因座的邻近区域。

[0277] 在一个方面，本申请提供了一种分离的DNA构建体，所述构建体相对于转录的方向从5’至3’包括，用于靶向相对于内源性Vκ基因区段为5’端的小鼠κ基因座的靶向臂、两个并列的重组酶识别位点、在并列重组酶识别位点的3’的选择性表达盒以及用于靶向相对于κ轻链可变基因区段为5’端的小鼠κ序列的3’靶向臂。在一个实施方式中，所述并列的重组酶识别位点彼此之间的方向相反。在一个特定的实施方式中，所述重组酶识别位点是不同的。在另一个特定实施方式中，所述重组酶识别位点是loxP位点和lox511位点。在一个实施方式中，所述选择性表达盒是新霉素表达盒。

[0278] 在一个方面，本申请提供了一种分离的DNA构建体，所述构建体相对于转录的方向从5’至3’包括，用于靶向相对于小鼠Jκ基因区段为5’端的小鼠κ基因座的靶向臂、选择性表达盒、在选择性表达盒3’端的重组酶识别位点以及用于靶向相对于小鼠Jκ基因区段为3’端和小鼠κ内部增强子(intronic enhancer)为5’端的小鼠κ序列的3’靶向臂。在一个实施方式中，所述选择性表达盒是潮霉素-TK表达盒。在一个实施方式中，所述重组酶识别位点与选择性表达盒具有相同的转录方法。在一个特定的实施方式中，所述重组酶识别位点是loxP位点。

[0279] 在一个方面，本申请提供了一种分离的DNA构建体，所述构建体相对于转录的方向从5’至3’包括，含有内源性小鼠Vκ基因区段5’端序列的第一小鼠基因组片段、第一重组酶识别位点、第二重组酶识别位点以及含有内源性小鼠Jκ基因区段3’端和小鼠κ内部增强子5’端序列的第二小鼠基因组片段。

[0280] 在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠，其中所述基因修饰包括具有如上文或本申请中所描述的一个或多个DNA构建体的修饰。

[0281] 在一个方面，本申请提供了一种使用分离的DNA构建体来制备如本申请所述小鼠的用途。在一个方面，本申请提供了使用如本申请所描述的分离的DNA构建体在用于制备抗原结合蛋白的方法中的用途。

[0282] 在一个方面，本申请提供了一种非人源干细胞，所述干细胞包括含有如上文和本文中所描述的DNA构建体的靶向载体。在一个方面，本申请提供了一种非人源干细胞，其中所述非人源干细胞来源于本申请所描述的小鼠。

[0283] 在一个实施方式中，所述非人源干细胞是胚胎干(ES)细胞。在一个特定的实施方式中，所述ES细胞是小鼠ES细胞。

[0284] 在一个方面，本申请提供了使用如本申请所述非人源干细胞来制备如本申请所述小鼠的用途。在一个方面，本申请提供了使用如本申请所述非人源干细胞来制备抗原结合蛋白的用途。

[0285] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠胚胎，其中所述小鼠胚胎包括如本申请所提供的基因修饰。在一个实施方式中，本申请提供了一种包含供体ES细胞的宿主小鼠胚胎，其中所述供体ES细胞包括如本申请所描述的基因修饰。在一个实施方式中，所述小鼠胚胎是前桑葚胚(pre-morula)阶段胚胎。在一个特定的实施方式中，所述前桑葚胚阶段胚胎是4-细胞阶段胚胎或8-细胞阶段胚胎。在另一个特定实施方式中，所述小鼠胚胎是囊胚。

[0286] 在一个方面，本申请提供了使用如本申请所述小鼠胚胎来制备如本申请所述小鼠的用途。在一个方面，本申请提供了使用如本申请所述小鼠胚胎来制备抗原结合蛋白的用途。

[0287] 在一个方面，本申请提供了一种非人源细胞，其中所述非人源细胞包括从如本申请所述经基因修饰的小鼠来源的重排的免疫球蛋白轻链基因序列。在一个实施方式中，所述细胞是B细胞。在一个实施方式中，所述细胞是杂交瘤。在一个实施方式中，所述细胞编码体细胞突变的免疫球蛋白轻链可变结构域和/或免疫球蛋白重链可变结构域。

[0288] 在一个方面，本申请提供了一种非人源细胞，其中所述非人源细胞包括从如本申请所述基因修饰的小鼠来源的经重排的免疫球蛋白轻链基因序列。在一个实施方式中，所述细胞是B细胞。在一个实施方式中，所述细胞是杂交瘤。在一个实施方式中，所述细胞编码体细胞突变的免疫球蛋白轻链可变结构域和/或免疫球蛋白重链可变结构域。

[0289] 在一个方面，本申请提供了使用如本申请所描述的非人源细胞来制备如本申请所描述的非人动物的用途。在一个方面，本申请提供了使用如本申请所描述的非人源细胞来制备抗原结合蛋白的用途。在一个实施方式中，所述非人动物选自小鼠、大鼠、仓鼠、绵羊、山羊、牛和非人灵长类。

[0290] 在一个方面，本申请提供了一种表达免疫球蛋白轻链的小鼠B细胞，所述免疫球蛋白轻链包括(a)来源于hVλ基因区段和hJλ基因区段的可变区；以及(b)小鼠CL基因。在一个实施方式中，所述小鼠CL基因选自Cκ和Cλ基因。在一个特定的实施方式中，所述Cλ基因是Cλ2。在一个特定的实施方式中，所述小鼠的Cλ基因来源于与小鼠Cλ2具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的Cλ基因。在一个实施方式中，所述小鼠B细胞还表达同源的重链，所述重链包括(c)来源于hVH、hDH的可变区和(d)hJH区段。在一个实施方式中，所述B细胞不包括重排的λ基因。在另一个实施方式中，所述B细胞不包括重排的κ基因。

[0291] 在一个方面，本申请提供了一种在基因修饰的非人动物中制备抗体的方法，所述方法包括：(a)将基因修饰的非人动物暴露于抗原，其中所述动物具有在内源性轻链基因座上包括至少一个hVλ和至少一个hJλ的基因组，其中所述内源性轻链基因座包括非人源CL基因；(b)使所述基因修饰的动物针对所述抗原出现免疫应答；以及(c)从来自(b)的动物分离特异性识别所述抗原的抗体，或者从来自(b)的动物分离的包括特异性识别所述抗原的免疫球蛋白结构域的细胞，其中所述抗体包括来源于hVλ、hJλ和动物CL基因的轻链。在一个特定的实施方式中，所述非人源CL基因是小鼠Cκ基因。在一个实施方式中，所述非人动物选自小鼠、大鼠、仓鼠、兔、绵羊、山羊、牛和非人灵长类。

[0292] 在一个实施方式中，本申请提供了一种用于在基因修饰的非人动物中制备抗体的方法，所述方法包括：(a)将基因修饰的动物暴露于抗原，其中所述动物具有包括在内源性κ基因座上的至少一个hVλ和在κ基因座上的至少一个hJλ的基因组，其中所述κ基因座包括非人源Cκ基因；(b)使所述基因修饰的动物针对所述抗原出现免疫应答；以及(c)从来自(b)的动物分离特异性识别所述抗原的抗体，或者从来自(b)的小鼠分离包括特异性识别所述抗原的免疫球蛋白结构域的细胞，其中所述抗体包括来源于hVλ、hJλ和非人源Cκ基因的轻链。

[0293] 在一个实施方式中，所述κ轻链恒定基因选自人源Cκ基因和小鼠Cκ基因。

[0294] 在一个实施方式中，本申请提供了一种在基因修饰的非人动物中制备抗体的方法，所述方法包括：(a)将基因修饰的非人动物暴露于抗原，其中所述动物具有包括在λ轻链基因座上的至少一个hVλ和在λ轻链基因座上的至少一个Jλ的基因组，其中所述λ轻链基因座包括非人源Cλ基因；(b)使所述基因修饰的动物针对所述抗原出现免疫应答；以及(c)从来自(b)的动物分离特异性识别所述抗原的抗体，或者从来自(b)的动物分离的包括特异性识别所述抗原的免疫球蛋白结构域的细胞，或者鉴定动物B中编码与所述抗原结合的重链和/或轻链可变结构域的核酸序列，其中所述抗体包括来源于hVλ、hJλ和非人源Cλ基因的轻链。在一个实施方式中，所述非人动物选自小鼠、大鼠、仓鼠、绵羊、山羊、牛和非人灵长类。

[0295] 在一个实施方式中，所述λ轻链恒定基因选自人源Cλ基因和非人源Cλ基因。在一个实施方式中，所述λ轻链恒定基因是人源Cλ基因。在一个特定的实施方式中，所述人源Cλ基因选自Cλ1、Cλ2、Cλ3和Cλ7。在一个实施方式中，所述λ轻链恒定基因是小鼠或大鼠Cλ基因。在一个特定的实施方式中，所述小鼠Cλ基因选自Cλ1、Cλ2和Cλ3。在一个更特定的实施方式中，所述小鼠Cλ基因是Cλ2。在另一个特定的实施方式中，所述小鼠Cλ基因来源于与小鼠Cλ2具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的Cλ基因。

[0296] 在一个方面，本申请提供了一种在基因修饰的非人动物中制备重排的抗体基因的方法，所述方法包括：(a)将基因修饰的非人动物暴露于抗原，其中所述基因修饰包括在内源性轻链基因座上的hVλ和hJλ，其中所述内源性轻链基因座包括非人源CL基因或其功能性片段；以及(b)鉴定在所述非人动物中的重排的免疫球蛋白基因，其中所述重排的免疫球蛋白基因包括λ轻链可变区基因区段和CL基因或其功能性片段。

[0297] 在一个实施方式中，所述方法还包括克隆编码来自所述动物的重链和/或轻链可变区的核酸序列，其中所述重链和/或轻链可变区来自包括人源Vλ和小鼠CL的抗体。

[0298] 在一个实施方式中，所述小鼠CL基因或其功能性片段选自人源CL基因和小鼠CL基因或其功能性片段。

[0299] 在一个实施方式中，本申请提供了一种在基因修饰的非人动物中制备重排的抗体基因的方法，所述方法包括：(a)将基因修饰的非人动物暴露于抗原，其中所述基因修饰包括在κ轻链基因座上的hVλ和hJλ，其中所述κ轻链基因座包括非人源Cκ基因或其功能性片段；以及(b)鉴定在所述动物中的重排的免疫球蛋白基因，其中所述重排的免疫球蛋白基因包括λ轻链可变区基因区段和Cκ基因或其功能性片段。

[0300] 在一个实施方式中，所述κ轻链恒定基因或其功能性片段选自人源Cκ基因和非人源(例如小鼠或大鼠)Cκ基因，或者其功能性片段。

[0301] 在一个实施方式中，所述方法还包括克隆编码来自所述动物的重链和/或轻链可变区的核酸序列，其中所述重链和/或轻链可变区来自包括人源Vλ和非人源(例如小鼠或大鼠)Cκ的抗体。

[0302] 在一个实施方式中，本申请提供了一种在基因修饰的非人动物中制备重排的抗体基因的方法，所述方法包括：(a)将基因修饰的非人动物暴露于抗原，其中所述基因修饰包括在非人动物λ轻链基因座上的hVλ和hJλ，其中所述λ轻链基因座包括非人源Cλ基因或其功能性片段；以及(b)鉴定在所述动物中的重排的免疫球蛋白基因，其中所述重排的免疫球蛋白基因包括λ轻链可变区基因区段和Cλ基因或其功能性片段。

[0303] 在一个实施方式中，所述λ轻链恒定基因或其功能性片段选自人源Cλ基因和小鼠或大鼠Cλ基因，或者其功能性片段。在一个特定的实施方式中，所述λ轻链恒定基因是小鼠或大鼠Cλ基因，或者其功能性片段。

[0304] 在一个实施方式中，所述方法还包括克隆来自所述动物的重链和/或轻链可变区的核酸序列，其中所述重链和/或轻链可变区来自包括人源Vλ和非人源(例如小鼠或大鼠)Cλ的抗体。

[0305] 在一个方面，本申请提供了一种制备抗体的方法，所述方法包括将如本申请所描述的非人动物暴露于抗原，使所述动物激发包括制备特异性结合所述抗原的抗体的免疫应答，鉴定在所述动物中编码重链的、重排的核酸序列和在所述动物中编码抗体的同源轻链可变结构域序列的、重排的核酸序列，其中所述抗体与所述抗原特异性结合，以及使用与人源恒定结构域融合的所述重链和轻链可变结构域的核酸序列以制备所需的抗体，其中所述所需的抗体包括含有与CL结构域融合的Vλ结构域的轻链。在一个实施方式中，所述Vλ结构域是人源的并且所述CL结构域是人源或小鼠或大鼠Cλ结构域。在一个实施方式中，所述Vλ结构域是小鼠或大鼠的并且所述CL结构域是人源或小鼠Cκ结构域。

[0306] 在一个实施方式中，本申请提供了一种制备抗体的方法，所述方法包括将如本申请所描述的非人动物暴露于抗原，使所述动物激发包括制备特异性结合所述抗原的抗体的免疫应答，鉴定在所述小鼠中编码重链的、重排的核酸序列和在所述动物中编码抗体的同源轻链可变结构域序列的、重排的核酸序列，其中所述抗体与所述抗原特异性结合，以及使用与人源恒定结构域核酸序列融合的所述重链和轻链可变结构域的核酸序列以制备所需的抗体，其中所述所需的抗体包括含有与Cκ结构域融合的Vλ结构域的轻链。

[0307] 在一个实施方式中，本申请提供了一种制备抗体的方法，所述方法包括将如本申请所描述的非人动物暴露于抗原，使所述动物激发包括制备特异性结合所述抗原的抗体的免疫应答，鉴定在所述动物中编码重链可变结构域的、重排的核酸序列和在所述动物中编码抗体的同源轻链可变结构域序列的、重排的核酸序列，其中所述抗体与所述抗原特异性结合，以及使用与编码人源重链恒定结构域和人源轻链恒定结构域融合的核酸序列融合的所述核酸序列以制备来源于人源序列的抗体，其中所述抗体与包括轻链的所述抗原特异性结合，所述轻链含有与非人源(例如小鼠或大鼠)Cλ区融合的人源Vλ结构域。

[0308] 在一个实施方式中，所述Cλ区是小鼠的，并且在一个实施方式中选自Cλ1、Cλ2和Cλ3。在一个特定的实施方式中，所述小鼠Cλ区是Cλ2。

[0309] 在一个方面，本申请提供了一种制备重排的抗体轻链可变区基因序列的方法，所述方法包括(a)将如本申请所描述的非人动物暴露于抗原；(b)使所述动物激发免疫应答；(c)鉴定在动物中包括编码与非人源CL结构域融合的重排的人源λ结构域序列的核酸序列的细胞，其中所述细胞还编码包括人源VH结构域和非人源CH结构域的同源重链，并且其中所述细胞表达与所述抗原结合的抗体；(d)从所述细胞中克隆编码人源Vλ结构域的核酸序列和编码同源的人源VH结构域的核酸序列；以及(e)使用所述编码人源Vλ结构域的克隆的核酸序列和所述编码同源的人源VH结构域的克隆的核酸序列以制备全人源抗体。在一个实施方式中，所述非人动物和非人动物结构域选自小鼠和大鼠。

[0310] 在一个实施方式中，本申请提供了一种制备重排的抗体轻链可变区基因序列的方法，所述方法包括(a)将如本公开中所描述的非人动物暴露于抗原；(b)使所述动物激发免疫应答；(c)鉴定在动物中包括编码重排人源Vλ结构域序列的核酸序列的细胞，所述核酸序列与编码非人动物Cκ结构域的核酸序列在相同核酸分子上相邻，其中所述细胞还编码包括人源VH结构域和非人动物CH结构域的同源重链，并且其中所述细胞表达与所述抗原结合的抗体；(d)从所述细胞中克隆编码所述人源Vλ结构域的核酸序列和编码所述同源人源VH结构域的核酸序列；以及(e)使用所述编码人源Vλ结构域的克隆的核酸序列和所述编码同源的人源VH结构域的克隆的核酸序列以制备全人源抗体。

[0311] 在一个实施方式中，本申请提供了一种制备重排的抗体轻链可变区基因序列的方法，所述方法包括(a)将如本申请中所描述的非人动物暴露于抗原；(b)使所述动物激发针对所述抗原的免疫应答；(c)鉴定在动物中包括一种DNA的细胞，所述DNA编码与所述动物的非人源Cλ结构域融合的重排的人源Vλ结构域序列，其中所述细胞还编码包括所述动物的人源VH结构域和非人源CH结构域的同源重链，并且其中所述细胞表达与所述抗原结合的抗体；(d)从所述细胞中克隆编码重排的人源Vλ结构域的核酸序列和编码同源的人源VH结构域的核酸序列；以及(e)使用所述编码人源Vλ结构域的克隆的核酸序列和所述编码同源的人源VH结构域的克隆的核酸序列以制备全人源抗体。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠且所述Cλ结构域是小鼠Cλ2。在一个特定的实施方式中，所述小鼠Cλ结构域来源于与小鼠Cλ2具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的Cλ基因。

[0312] 在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的非人动物，所述动物表达与内源性轻链恒定区(CL)融合的人源λ来源的轻链，其中所述动物使用抗原免疫后制备抗体，所述抗体包括与所述动物的非人源CL结构域融合的人源Vλ结构域。在一个实施方式中，所述非人源CL结构域选自Cκ结构域和Cλ结构域。在一个实施方式中，所述CL结构域是Cκ结构域。在一个实施方式中，所述动物是小鼠。在一个实施方式中，所述小鼠CL结构域是Cλ结构域。在一个特定的实施方式中，所述Cλ结构域是Cλ2。在一个特定的实施方式中，所述小鼠Cλ结构域来源于与小鼠Cλ2具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的Cλ基因。

[0313] 在一个方面，本申请提供了一种包括如本申请所描述的经修饰的内源性κ或λ轻链基因座的基因修饰的非人动物，所述动物表达与多个免疫球蛋白重链结合的多个免疫球蛋白λ轻链。在一个实施方式中，所述重链包括人源序列。在各种实施方式中，所述人源序列选自可变序列、CH1、铰链、CH2、CH3及其组合。在一个实施方式中，所述多个免疫球蛋白λ轻链包括人源序列。在各种实施方式中，所述人源序列选自可变序列、恒定序列及其组合。在一个实施方式中，所述动物包括失能的内源性免疫球蛋白基因座，并且表达来自转基因或染色体外游离基因的重链和/或λ轻链。在一个实施方式中，所述动物包括使用一个或多个人源免疫球蛋白序列来取代内源性(非人源)基因座的一些或全部内源性非人源重链基因区段(即V、D、J)、和/或一些或全部内源性非人源重链恒定序列(例如CH1、铰链、CH2、CH3或其组合)和/或一些或全部非人源轻链序列(例如V、J、恒定或其组合)。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。

[0314] 在一个方面，本申请提供了一种适于制备具有人源λ来源轻链的抗体的非人动物，其中在非人动物中制备的全部或基本上全部的抗体表达人源λ来源的轻链。在一个实施方式中，所述人源λ来源的轻链由内源性轻链基因座表达。在一个实施方式中，所述内源性轻链基因座是κ轻链基因座。在一个特定的实施方式中，所述动物是小鼠，并且所述κ轻链基因座是小鼠κ轻链基因座。

[0315] 在一个方面，本申请提供了一种制备用于人源抗体的λ来源轻链的方法，所述方法包括从本申请所描述的非人动物中获得轻链序列和重链序列，并且使用所述轻链序列和所述重链序列以制备人源抗体。

[0316] 在一个方面，本申请提供了一种用于制备抗原结合蛋白的方法，所述方法包括将如本申请所描述的非人动物暴露于抗原；使所述非人动物激发免疫应答；以及从所述非人动物中获得与所述抗原结合的抗原结合蛋白，或者从所述非人动物中获得在制备与所述抗原结合的抗原结合蛋白中使用的序列。

[0317] 在一个方面，本申请提供了一种来源于如本申请所描述的非人动物(例如小鼠或大鼠)的细胞。在一个实施方式中，所述细胞选自胚胎干细胞、多能干细胞、诱导性多能干细胞、B细胞和杂交瘤。

[0318] 在一个方面，本申请提供了包括如本申请所描述的基因修饰的细胞。在一个实施方式中，所述细胞是小鼠细胞。在一个实施方式中，所述细胞选自杂交瘤和四价体杂交瘤。在一个实施方式中，所述细胞表达包括与小鼠恒定序列融合的人源λ可变序列的免疫球蛋白轻链。在一个特定的实施方式中，所述小鼠恒定序列是小鼠κ恒定序列。

[0319] 在一个方面，本申请提供了一种来源于如本申请所描述的非人动物的组织。

[0320] 在一个方面，本申请提供了使用如本申请所描述的非人动物或细胞来制备抗原结合蛋白的用途。在一个实施方式中，所述抗原结合蛋白是人源蛋白。在一个实施方式中，所述人源蛋白是人源抗体。

[0321] 在一个方面，本申请提供了一种使用如本申请所描述的非人动物、细胞、组织或方法制备的抗原结合蛋白。在一个实施方式中，所述抗原结合蛋白是人源蛋白。在一个实施方式中，所述人源蛋白是人源抗体。

[0322] 除非另有明示或从上下文看是明显的，否则本申请所描述的任意实施方式和方面均能够彼此结合使用。通过后文的描述，对本领域技术人员而言其他的实施方式将是显而易见的。

[0323] 附图的简要说明

[0324] 图1A显示了直接基因组取代的一般说明(未按照比例)，所述直接基因组取代是使用约1百万碱基(Mb)人源免疫球蛋白重链可变基因座(空心符号)来取代约3百万碱基(Mb)小鼠免疫球蛋白重链可变基因座(实心符号)。

[0325] 图1B显示了直接基因组取代的一般说明(未按照比例)，所述直接基因组取代使用约0.5百万碱基(Mb)的两个几乎相同的人源免疫球蛋白κ轻链可变基因座中的第一个或近端(空心符号)来取代约3百万碱基(Mb)小鼠免疫球蛋白κ轻链可变基因座(实心符号)。

[0326] 图2A显示了三个初始步骤(A-C)的详细说明(未按照比例)，所述三个初始步骤(A-C)是针对小鼠免疫球蛋白重链可变基因座的直接基因组取代(所述取代使得小鼠VH、DH和JH基因区段全部缺失)以及使用三个人源VH、全部人源DH和JH基因区段的取代。图中显示了用于人源免疫球蛋白重链基因区段第一插入的靶向载体(3hVH BACvec)，具有67kb5’小鼠同源臂、选择性表达盒(空心矩形)、位点特异性重组位点(空心三角形)、145kb人源基因组片段和8kb 3’小鼠同源臂。图中显示了由随后的靶向载体插入的人源(空心符号)和小鼠(实心符号)免疫球蛋白基因区段、其他选择性表达盒(空心矩形)和位点特异性重组位点(空心三角形)。

[0327] 图2B显示了6个附加步骤(D-I)的详细说明(未按照比例)，所述6个附加步骤(D-I)是针对小鼠免疫球蛋白重链可变基因座的直接基因组取代，所述取代使得插入77个附加的人源VH基因区段和除去最后的选择性表达盒。图中显示了用于将附加人源VH基因区段(18hVH BACvec)插入人源重链基因区段初始插入(3hVH-CRE杂交等位基因)的靶向载体，所述载体具有20kb 5’小鼠同源臂、选择性表达盒(空心矩形)、196kb人源基因组片段和62kb人源同源臂，附加人源VH基因区段与人源重链基因区段初始插入的5’端重叠，如图所示其具有位于人源基因区段5’的位点特异性重组位点(空心三角形)。图中显示了由随后靶向载体插入的人源(空心符号)和小鼠(实心符号)免疫球蛋白基因区段和附加的选择性表达盒(空心矩形)。

[0328] 图2C显示了三个初始步骤(A-C)的详细说明(未按照比例)，所述三个初始步骤(A-C)是针对小鼠免疫球蛋白κ轻链可变基因座的直接基因组取代，所述取代使得所有小鼠Vκ和Jκ基因区段(Igκ-CRE杂交等位基因)缺失。图中显示了由靶向载体插入的选择性表达盒(空心矩形)和位点特异性重组位点(空心三角形)。

[0329] 图2D显示了五个附加步骤(D-H)的详细说明(未按照比例)，所述五个附加步骤(D-H)是针对小鼠免疫球蛋白κ轻链可变基因座的直接基因组取代，所述取代使得在近端重复中插入所有人源Vκ和Jκ基因区段并且缺失最后的选择性表达盒(40hVκdHyg杂交等位基因)。图中显示了由随后靶向载体插入的人源(空心符号)和小鼠(实心符号)免疫球蛋白基因区段和附加的选择性表达盒(空心矩形)。

[0330] 图3A显示了筛选策略的一般说明(未按照比例)，所述筛选策略包括定量PCR(qPCR)引物/探针的位置以检测在经靶向的胚胎干(ES)细胞中人重链基因序列的插入和小鼠重链基因序列的缺失。图中显示了在ES细胞和小鼠中针对第一人源重链基因插入的筛选策略，所述筛选策略具有针对在未经修饰的小鼠染色体(上图)和正确靶向的染色体(下图)上的缺失区(“丢失”探针C和D)、插入区(“hIgH”探针G和H)和翼侧区
(“保留”探针A、B、E和F)的qPCR引物/探针组。

[0331] 图3B的代表性计算结果显示了在母体和经修饰的ES细胞中针对人源免疫球蛋白重链基因区段第一插入的所观察到的探针拷贝数。探针A至F所观察到的探针拷贝数以2/2ΔΔCt计算。ΔΔCt根据ave[ΔCt(样品)–medΔCt(对照)]计算，其中ΔCt是待测和参照探针(参照探针为4-6个，视检测而定)Ct之间的差值。术语medΔCt(对照)是多个(>60)来自母体ES细胞的非靶向DNA样品的中位数ΔCt。对各经修饰ES细胞克隆的检测均重复六次。为计算母体ES细胞中IgH探针G和H的拷贝数，我们假设即使未观察到扩增，在经修饰的ES细胞中具有的拷贝数为1并且使用35作为最大Ct。

[0332] 图3C的代表性计算结果显示了仅使用探针D和H计算的各基因型的四只小鼠的拷贝数。野生型小鼠：WT小鼠；针对人源免疫球蛋白基因区段第一插入的小鼠杂合子：HET小鼠；针对人源免疫球蛋白基因区段第一插入的小鼠纯合子：Homo小鼠。

[0333] 图4A显示了用于通过细菌同源重组(BHR)构建3hVH BACvec的三个步骤地详细图示(未按照比例)。图中显示了从靶向载体插入的人源(空心符号)和小鼠(实心符号)免疫球蛋白基因区段、选择性表达盒(空心矩形)和位点特异性重组位点(空心三角形)。

[0334] 图4B显示了在NotI消化后三个BAC克隆(B1、B2和B3)的脉冲场凝胶电泳(PFGE)。标记物M1、M2和M3分别为低范围、中范围和λ梯度PFG标记物(马萨诸塞州伊普斯威奇(Ipswich)的NEB公司(New England BioLabs))。

[0335] 图5A显示了使用增加量的人源免疫球蛋白重链基因区段来按序修饰小鼠免疫球蛋白重链基因座的示意性说明(未按照比例)。从各自三个不同阶段的重链免疫来制备纯合小鼠。空心符号表示人源序列；实心符号表示小鼠序列。

[0336] 图5B显示了使用增加量的人源免疫球蛋白κ轻链基因区段来按序修饰小鼠免疫球蛋白κ轻链基因座的示意性说明(未按照比例)。从各自三个不同阶段的κ轻链免疫来制备纯合小鼠。空心符号表示人源序列；实心符号表示小鼠序列。

[0337] 图6显示了在野生型和 人源化小鼠中B细胞群的FACS点图。对来自野生型(wt)、 1(V1)、 2(V2)或
3(V3)小鼠的脾脏(最上面行，由上数第三行和最下面一行)或腹股沟
淋巴结(由上数第二行)的细胞进行染色，所述染色是针对表面IgM表达的B细胞(最上面一行和由上面数第二行)、含有κ或λ轻链的表面免疫球蛋白(由上面数第三行)或特定单体型(haplotype)的表面IgM(最下面一行)，并使用FACS分群。

[0338] 图7A显示了在VH-DH-JH(CDR3)连接周围的随机选择的 抗体的代表性重链CDR3序列，显示了连接的多样性和核苷酸的加入。根据所使用的DH基因区段对重链CDR3序列进行分组，上述各组的生殖细胞系以黑体表示。各重链CDR3序列的VH基因区段在各序列5’末端的括号中列出(例如3-72是人源VH3-72)。各重链CDR3的JH基因区段在各序列3’末端的括号中列出(例如3是人源JH3)。所显示的各序列的SEQ ID NO从上至下如下所示：SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:27；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:30；SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:38；SEQ ID NO:39。

[0339] 图7B显示了在Vκ-Jκ(CDR3)连接周围的随机选择的 抗体的代表性轻链CDR3序列，显示了连接的多样性和核苷酸的加入。各轻链CDR3序列的Vκ基因区段在各序列5’末端的括号中列出(例如1-6是人源Vκ1-6)。各轻链CDR3的Jκ基因区段在各序列3’末端的括号中列出(例如1是人源Jκ1)。所显示的各序列的SEQ ID NO从上至下如下所示：SEQ ID NO:40；SEQ ID NO:41；SEQ ID NO:42；SEQ ID NO:43；SEQ ID NO:44；SEQ ID NO:45；SEQ ID NO:46；SEQ ID NO:47；SEQ ID NO:48；SEQ ID NO:49；SEQ ID NO:50；SEQ ID NO:51；SEQ ID NO:52；SEQ ID NO:53；SEQ ID NO:54；SEQ ID NO:55；SEQ ID NO:56；SEQ ID NO:57；SEQ ID NO:58。

[0340] 图8显示了 抗体重链和轻链的体细胞高频突变频率，所述高频突变频率是以在38(未经免疫的IgM)、28(未经免疫的IgG)、32(未经免疫的来自IgG的Igκ)、36(经免疫的IgG)或36(经免疫的来自IgG的Igκ)序列的集合中各核苷酸(NT；
左栏)或氨基酸(AA；右栏)位置上所改变的序列的百分率来进行评分。用阴影表示的柱子表示CDR的位置。

[0341] 图9A显示了在野生型(空心柱子)或 小鼠(实心柱子)IgM和IgG同种型的血清免疫球蛋白水平。

[0342] 图9B显示了在野生型(空心柱子)或 小鼠(实心柱子)IgA同种型的血清免疫球蛋白水平。

[0343] 图9C显示了在野生型(空心柱子)或 小鼠(实心柱子)IgE同种型的血清免疫球蛋白水平。

[0344] 图10A显示了在使用白介素-6受体(IL-6R)胞外域免疫接种2(第1次取血)或3(第2次取血)轮后，7只 (VI)和5只野生型(WT)小鼠血清中针对白
介素-6受体(IL-6R)的抗原特异性IgG的效价(titer)。

[0345] 图10B显示了7只 (VI)和5只野生型(WT)小鼠的IL-6R-特异性IgG同种型特异性效价。

[0346] 图11A显示了在 小鼠中产生的抗-白介素-6受体单克隆抗体的亲和性分布。

[0347] 图11B显示了在 (VI)和野生型(WT)小鼠中产生的抗-白介素-6受体单克隆抗体的抗原特异性阻断。

[0348] 图12显示了在小鼠免疫球蛋白重链基因座中的小鼠ADAM6a和ADAM6b基因的示意性说明(未按照比例)。图中显示了用于将小鼠ADAM6a和ADAM6b插入人源化内源性重链基因座的靶向载体(mADAM6靶向载体)，所述载体具有选择性表达盒(HYG：潮霉素)，其翼侧为在5’和3’末端包括工程改造的限制性位点的位点特异性重组位点(Frt)。

[0349] 图13显示了位于人源重链可变基因区段1-2(VH1-2)和6-1(VH6-1)之间的人源ADAM6假基因(hADAM6Ψ)的示意性说明(未按照比例)。图中显示了用于将细菌同源重组以缺失人源性ADAM6假基因并将独特的限制性位点插入人源重链基因座的靶向载体(hADAM6Ψ靶向载体)，所述载体具有选择性表达盒(NEO：新霉素)，其翼侧为在5’和3’末端包括工程改造的限制性位点的位点特异性重组位点(loxP)。图中显示了(未按照比例)所得的靶向人源化重链基因座，该基因座包括编码小鼠ADAM6a和ADAM6b基因的基因组片断，并且ADAM6b基因包括翼侧为位点特异性重组位点的选择性表达盒。
+/+ +/+

[0350] 图14A显示了在针对人源重链和人源κ轻链可变基因座的小鼠纯合子(H κ )以及针对人源重链和具有包括小鼠ADAM6基因的小鼠基因组片段插入的人源κ轻链可变+/+ res +/+基因座的小鼠纯合子(H A6 κ )的骨髓中，对IgM和B220表面表达的以单个门控的淋int + 高 +
巴细胞FACS等值线图。在各等值线图中显示了未成熟(B220 IgM)和成熟(B220 IgM)
B细胞的百分率。

[0351] 图14B显示了在从针对人源重链和人源κ轻链可变基因座的小鼠纯合子+/+ +/+
(H κ )以及针对人源重链和具有编码小鼠ADAM6基因的易位小鼠基因组片段的人源κ+/+ res +/+ int +
轻链可变基因座的小鼠纯合子(H A6 κ )的股骨中分离的骨髓中，未成熟(B220 IgM)高 +
和成熟(B220 IgM)B细胞的总数。
+/+ +/+

[0352] 图15A显示了在针对人源重链和人源κ轻链可变基因座的小鼠纯合子(H κ )以及针对人源重链和具有编码小鼠ADAM6基因的易位小鼠基因组片段的人源κ轻链可变+/+ res +/+ +基因座的小鼠纯合子(H A6 κ )的骨髓中，对c-kit和CD43表面表达的以CD19-门
控的B细胞FACS等值线图。在各等值线图中的右上和左下象限分别显示了原-B(pro-B)+ + + + - -
(CD19CD43ckit)和前-B(pre-B)(CD19CD43ckit)细胞的百分率。
+/+ +/+

[0353] 图15B显示了在针对人源重链和人源κ轻链可变基因座的小鼠纯合子(H κ )以及针对人源重链和具有包含小鼠ADAM6基因的易位小鼠基因组片段的人源κ轻链可变+/+ res +/+ + + +基因座的小鼠纯合子(H A6 κ )的股骨中分离的骨髓中，原-B细胞(CD19CD43ckit)
+ - -
和前-B细胞(CD19CD43ckit)的总数。
+/+ +/+

[0354] 图16A显示了在针对人源重链和人源κ轻链可变基因座的小鼠纯合子(H κ )以及针对人源重链和具有编码小鼠ADAM6基因的易位小鼠基因组片段的人源κ轻链+/+ res +/+
可变基因座的小鼠纯合子(H A6 κ )的骨髓中，对CD19和CD43表面表达的以单
+ -
个门控的淋巴细胞FACS等值线图。在各等值线图中显示了未成熟的B(CD19CD43)、
+ int + +
前-B(CD19CD43 )和原-B(CD19CD43)细胞的百分率。

[0355] 图16B显示了在针对人源重链和人源κ轻链可变基因座的小鼠纯合子+/+ +/+
(H κ )以及针对人源重链和具有编码小鼠ADAM6基因的易位小鼠基因组片段的人源
+/+ res +/+ + -
κ轻链可变基因座的小鼠纯合子(H A6 κ )的骨髓中，未成熟的B(CD19CD43)和
+ int
前-B(CD19CD43 )细胞的直方图。

[0356] 图17A显示了在针对人源重链和人源κ轻链可变基因座的小鼠纯合子(H+/+κ+/+)以及针对人源重链和具有编码小鼠ADAM6基因的易位小鼠基因组片段的人源κ轻链可变+/+ res +/+基因座的小鼠纯合子(H A6 κ )的脾细胞中，对CD19和CD3表面表达的以单个门控的+ - - +
淋巴细胞FACS等值线图。在各等值线图中显示了B(CD19CD3)和T(CD19CD3)细胞的百
分率。

[0357] 图17B显示了在针对人源重链和人源κ轻链可变基因座的小鼠纯合子(H+/+κ+/+)以及针对人源重链和具有编码小鼠ADAM6基因的易位小鼠基因组片段的人源κ轻链可变+/+ res +/+ +基因座的小鼠纯合子(H A6 κ )的脾脏中，对Igλ和Igκ轻链表面表达的以CD19-门+ +
控的B细胞FACS等值线图。在各等值线图中显示了Igλ(左上象限)和Igκ(右下象
限)B细胞的百分率。

[0358] 图17C显示了在针对人源重链和人源κ轻链可变基因座的小鼠纯合子(H+/+κ+/+)以及针对人源重链和具有编码小鼠ADAM6基因的易位小鼠基因组片段的人源κ轻链可变+/+ res +/+ +基因座的小鼠纯合子(H A6 κ )的脾脏中，CD19B细胞的总数。

[0359] 图18A显示了在针对人源重链和人源κ轻链可变基因座的小鼠纯合子(H+/+κ+/+)以及针对人源重链和具有编码小鼠ADAM6基因的易位小鼠基因组片段的人源κ轻链可变+/+ res +/+ +基因座的小鼠纯合子(H A6 κ )的脾脏中，对IgD和IgM表面表达的CD19-门控的B
+ 高 int
细胞FACS等值线图。在各等值线图中显示了成熟的B细胞(CD19IgD IgM )的百分率。
在右侧等值线图中的箭头表示与IgM和IgD表面表达相关的B细胞成熟过程。

[0360] 图18B显示了在由CD19+IgM高IgDint向CD19+IgMintIgD高成熟的过程中，在针对+/+ +/+人源重链和人源κ轻链可变基因座的小鼠纯合子(H κ )以及针对人源重链和具有
编码小鼠ADAM6基因的易位小鼠基因组片段的人源κ轻链可变基因座的小鼠纯合子
+/+ res +/+
(H A6 κ )的脾脏中，B细胞的总数。

[0361] 图19显示了包括Vλ基因区段(A、B和C)的簇以及Jλ和Cλ区对(J-C对)的人源λ轻链基因座的详细说明(未按照比例)。

[0362] 图20显示了用于将内源性小鼠λ轻链基因座失活的靶向策略的一般说明(未按照比例)。

[0363] 图21显示了用于将内源性小鼠κ轻链基因座失活的靶向策略的一般说明(未按照比例)。

[0364] 图22A显示了使用包括12个hVλ基因区段和hJλ1基因区段的人源λ轻链序列靶向内源性小鼠λ轻链基因座的初始靶向载体(12/1-λ靶向载体)的一般说明(未按照比例)。

[0365] 图22B显示了用于使用人源λ轻链序列靶向内源性小鼠κ轻链基因座的四个初始靶向载体的一般说明(未按照比例)，所述人源λ轻链序列包括12个hVλ基因序列和hJλ1基因序列(12/1-κ靶向载体)，12个hVλ基因区段与hJλ1、2、3和7基因区段(12/4-κ靶向载体)，12个hVλ基因区段、人源Vκ-Jκ基因组序列和hJλ1基因区段(12(κ)1-κ靶向载体)以及12个hVλ基因区段、人源Vκ-Jκ基因组片段与hJλ1、2、3和7基因区段(12(κ)4-κ靶向载体)。

[0366] 图23A显示了用于将40个hVλ基因区段和单一hJλ基因区段进行性(progressive)插入小鼠λ轻链基因座的靶向策略的一般说明(未按照比例)。

[0367] 图23B显示了用于将40个hVλ基因区段和单一hJλ基因区段进行性插入小鼠κ基因座的靶向策略的一般说明(未按照比例)。

[0368] 图24显示了用于制备独特的人源λ-κ杂交靶向载体所使用的靶向和分子工程步骤的一般说明(未按照比例)，所述靶向载体用于构建含有人源κ基因间序列、多个hJλ基因区段或两者的杂交轻链基因座。

[0369] 图25A显示了基因座结构的一般说明(未按照比例)，所述基因座结构是针对含有40个hVλ基因区段和与内源性Cλ2基因可操作地连接的单一hJλ基因区段的经修饰的小鼠λ轻链基因座。

[0370] 图25B显示了用于四个独立的经修饰的小鼠κ轻链基因座的基因座结构的一般说明(未按照比例)，所述小鼠κ轻链基因座含有40个hVλ基因区段以及一个或四个hJλ基因区段，具有或不具有与内源性Cκ基因可操作地连接的连续的人源Vκ-Jκ基因组序列。

[0371] 图26A显示了来自野生型小鼠(WT)、针对包括人源Vκ-Jκ基因组序列的12个hVλ和4个hJλ基因区段的小鼠纯合子(12hVλ-VκJκ-4hJλ)以及针对40个hVλ和+ + +
1个hJλ基因区段的小鼠纯合子(40hVλ-1hJλ)的CD19 门控的Igλ 和Igκ 脾细胞等值线图。

[0372] 图26B显示了在来自野生型小鼠(WT)、针对包括人源Vκ-Jκ基因组序列的12个hVλ和4个hJλ基因区段的小鼠纯合子(12hVλ-VκJκ-4hJλ)以及针对40个hVλ和+
1个hJλ基因区段的小鼠纯合子(40hVλ-1hJλ)所收集的脾脏中，CD19B细胞的总数。

[0373] 图27A，上图显示了来自野生型小鼠(WT)以及针对包括人源Vκ-Jκ基因组序列的40个hVλ和4个Jλ基因区段的小鼠纯合子(40hVλ-VκJκ-4hJλ)，单一门控和针+ +对B和T细胞(分别为CD19 和CD3)染色的脾细胞等值线图。下图显示了来自野生型小
鼠(WT)以及包括人源Vκ-Jκ基因组序列的40个hVλ和4个Jλ基因区段的小鼠纯合
+ + +
子(40hVλ-VκJκ-4hJλ)中，以CD19 门控和针对Igλ 和Igκ 表达染色的脾细胞等值线图。

[0374] 图27B显示了从野生型小鼠(WT)以及针对包括人源Vκ-Jκ基因组序列的40个+hVλ和4个Jλ基因区段的小鼠纯合子(40hVλ-VκJκ-4hJλ)所收集的脾脏中，CD19、+ + + +
CD19Igκ 和CD19IgλB细胞的总数。

[0375] 图27C显示了来自野生型小鼠(WT)以及针对包括人源Vκ-Jκ基因组序列的+
40个hVλ和4个Jλ基因区段的小鼠纯合子(40hVλ-VκJκ-4hJλ)，以CD19 门控
以及针对免疫球蛋白D(IgD)和免疫球蛋白M(IgM)染色的脾细胞等值线图。在各个等
值线图中显示了成熟的(WT为72，40hVλ-VκJκ-4hJλ为51)和过渡态的(WT为13，
40hVλ-VκJκ-4hJλ为22)B细胞。

[0376] 图27D显示了从野生型小鼠(WT)以及针对包括人源Vκ-Jκ基因组序列的40个+hVλ和4个Jλ基因区段的小鼠纯合子(40hVλ-VκJκ-4hJλ)所收集的脾脏中，CD19B+ hi lo + lo hi
细胞、过渡态的B细胞(CD19IgM IgD )和成熟的B细胞(CD19IgM IgD )的总数。

[0377] 图28A，上图显示了来自野生型小鼠(WT)以及针对包括人源Vκ-Jκ基因组序列的40个hVλ和4个Jλ基因区段的小鼠纯合子(40hVλ-VκJκ-4hJλ)，对B和T细+ +
胞染色(分别为CD19 和CD3)的骨髓等值线图。下图显示了来自野生型小鼠(WT)以
及针对包括人源Vκ-Jκ基因组序列的40个hVλ和4个Jλ基因区段的小鼠纯合子
+ + +
(40hVλ-VκJκ-4hJλ)，以CD19 门控并对ckit 和CD43 染色的骨髓等值线图。在下图的等值线图中显示了原B细胞和前B细胞。

[0378] 图28B显示了从野生型小鼠(WT)以及针对包括人源Vκ-Jκ基因组序列的40个hVλ和4个Jλ基因区段的小鼠纯合子(40hVλ-VκJκ-4hJλ)的股骨收集的骨髓中，原+ + + + – –(CD19CD43ckit)和前(CD19CD43 ckit )B细胞的数量。

[0379] 图28C显示了来自野生型小鼠(WT)以及针对包括人源Vκ-Jκ基因组序列的40个hVλ和4个Jλ基因区段的小鼠纯合子(40hVλ-VκJκ-4hJλ)，以单一门控以及针对免疫球蛋白M(IgM)和B220染色的骨髓等值线图。各等值线图中分别显示了未成熟的、成熟的和原/前B细胞。

[0380] 图28D显示了从野生型小鼠(WT)以及针对包括人源Vκ-Jκ基因组序列的40个hVλ和4个Jλ基因区段的小鼠纯合子(40hVλ-VκJκ-4hJλ)的股骨分离的骨髓中，未int + hi +成熟的(B220 IgM)和成熟的(B220 IgM)B细胞的总数。

[0381] 图28E显示了从野生型小鼠(WT)以及针对包括人源Vκ-Jκ基因组序列的40个hVλ和4个Jλ基因区段的小鼠纯合子(40hVλ-VκJκ-4hJλ)的股骨分离的，以未成熟int + hi +的(B220 IgM)和成熟的(B220 IgM)B细胞门控的针对Igλ和Igκ表达染色的骨髓等
值线图。

[0382] 图29显示了18个独立RT-PCT克隆的Vλ-Jλ-Cκ连接的核苷酸序列比对结果，所述独立RT-PCT克隆由在内源性小鼠κ轻链基因座上携带人源λ轻链基因序列的小鼠脾细胞RNA中扩增。A6＝SEQ ID NO:115；B6＝SEQ ID NO:116；F6＝SEQ ID NO:117；B7＝SEQ ID NO:118；E7＝SEQ ID NO:119；F7＝SEQ ID NO:120；C8＝SEQ ID NO:121；E12＝SEQ ID NO:122；1-4＝SEQ ID NO:123；1-20＝SEQ ID NO:124；3B43＝SEQ ID NO:125；5-8＝SEQ ID NO:126；5-19＝SEQ ID NO:127；1010＝SEQ ID NO:128；11A1＝SEQ ID NO:129；7A8＝SEQ ID NO:130；3A3＝SEQ ID NO:131；2-7＝SEQ ID NO:132。小写字母碱基表示由在重组过程中的突变和/或N加入所产生的非生殖细胞系碱基。在框架4区(FWR4)中由hJλ1和小鼠Cκ的核苷酸序列编码的共有氨基酸序列示于序列比对的底部。

[0383] 图30显示了12个独立RT-PCT克隆的Vλ-Jλ-Cκ连接的核苷酸序列比对结果，所述独立RT-PCT克隆是由在内源性小鼠κ轻链基因座上携带包括连续的人源Vκ-Jκ基因组序列的人源λ轻链基因序列的小鼠脾细胞RNA中扩增。5-2＝SEQ ID NO:145；2-5＝SEQ ID NO:146；1-3＝SEQ ID NO:147；4B-1＝SEQ ID NO:148；3B-5＝SEQ ID NO:149；7A-1＝SEQ ID NO:150；5-1＝SEQ ID NO:151；4A-1＝SEQ ID NO:152；11A-1＝SEQ ID NO:153；5-7＝SEQ ID NO:154；5-4＝SEQ ID NO:155；2-3＝SEQ ID NO:156。小写字母碱基表示由在重组过程中的突变和/或N加入所产生的非生殖细胞系碱基。在框架4区(FWR4)中由各个人源Jλ和小鼠Cκ的核苷酸序列编码的共有氨基酸序列示于序列比对的底部。

[0384] 图31显示了3个独立RT-PCT克隆的Vλ-Jλ-Cλ连接的核苷酸序列比对结果，所述独立RT-PCT克隆由在内源性小鼠λ轻链基因座上携带人源λ轻链基因序列的小鼠脾细胞RNA中扩增。2D1＝SEQ ID NO:159；2D9＝SEQ ID NO:160；3E15＝SEQ ID NO:161。小写字母碱基表示由在重组过程中的突变和/或N加入所产生的非生殖细胞系碱基。在框架4区(FWR4)中由hJλ1和小鼠Cλ2的核苷酸序列编码的共有氨基酸序列示于序列比对的底部。

[0385] 详述

[0386] 本发明不限于所描述的特定方法以及实验条件，因为这些方法和条件可以改变。还应理解本申请所使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并且其并不旨在限定，因为本发明的范围是由权利要求所定义的。

[0387] 除非另有定义，否则本申请使用的所有术语和短语包括所述术语和短语在本领域中所具有的含义，除非有相反的明确说明或根据使用所述术语或短语的上下文是显而易见的。尽管在实施或检验本发明中可以使用与本申请所描述的那些相似或等效的任意方法和材料，但是在本申请中仅描述了特定的方法和材料。所提及的全部出版物均通过引用并入本申请。

[0388] 当使用短语“基本上的”或“基本上地”指基因区段的数量(例如“基本上全部的”V基因区段)包括功能性和非功能性基因区段，并且包括，在各种实施方式中，例如全部基因区段的80％或以上、85％或以上、90％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上或者99％或以上；在各种实施方式中，“基本上全部的”基因区段包括例如至少
95％、96％、97％、98％或99％的功能性(即非假基因)基因区段。

[0389] 术语“取代”包括其中将DNA序列置于细胞的基因组中，使得在所述基因组序列的基因座上使用异源性序列(例如在小鼠中的人源序列)来取代基因组中的序列。这样放置的DNA序列可以包括一个或多个调控序列，所述调控序列作为用于获得这样放置的所述序列的来源DNA的一部分(例如启动子、增强子、5’-或3’-非翻译区、适宜的重组信号序列等)。例如，在各种实施方式中，所述取代是异源性序列对内源性序列的取代，以使得产生这样放置的DNA序列(包含异源性序列)的基因产物，但是不表达内源性序列；所述取代是用DNA序列来取代内源性基因组序列，所述DNA序列编码与内源性基因组序列编码的蛋白(例如内源性基因组序列编码免疫球蛋白基因或结构域，以及DNA片段编码一个或多个人源免疫球蛋白基因或结构域)具有相似功能的蛋白。在各种实施方式中，使用相应的人源基因或其片段取代内源性基因或其片段。相应的人源基因或其片段是被取代的内源性基因或其片段的直系同源物、同源物或与其在结构和/或功能上基本相等或相同的人源基因或其片段。

[0390] 术语“邻近的(contiguous)”指出现在相同的核酸分子上，例如如果两条核酸出现在相同核酸分子上但是被另一条核酸序列所中断，则两条核酸序列是“邻近的”。例如，重排的V(D)J序列与恒定区基因序列是“邻近的”，尽管V(D)J序列的最后一个密码子之后并不是紧随着恒定区序列的第一个密码子。在另一个例子中，如果两个V基因区段序列出现在相同的基因组片段上，那么所述两个V基因区段序列是“邻近的”，尽管其可能被不编码V区密码子的序列所分隔，例如其可能被调控序列所分隔，所述调控序列例如启动子或其他非编码序列。在一个实施方式中，邻近的序列包括含有以如在野生型基因组中所见的方式排布的基因组序列的基因组片段。

[0391] 当用“来源于”所引用的基因或基因区段的可变区时，短语“来源于”包括能够将所述序列追溯至经重排以形成表达可变结构域的基因的(考虑如适用的剪接差异和体细胞突变)、特定的未经重排的一段或多段基因区段。

[0392] 短语“功能性”当用在可变区基因区段或连接基因区段时是指在表达抗体库中的用途；例如在人源Vλ基因区段3-1、4-3、2-8等中是功能性的，而在Vλ基因区段3-2、3-4、2-5等中是无功能的。

[0393] “重链基因座”包括在染色体(例如小鼠染色体)上的某个位置，其可见于野生型小鼠重链可变(VH)、重链多样性(DH)、重链连接(JH)和重链恒定(CH)区DNA序列中。

[0394] “κ基因座”包括在染色体(例如小鼠染色体)上的某个位置，其可见于野生型小鼠κ可变(Vκ)、κ连接(Jκ)和κ恒定(Cκ)区DNA序列中。

[0395] “λ基因座”包括在染色体(例如小鼠染色体)上的某个位置，其可见于野生型小鼠λ可变(Vλ)、λ连接(Jλ)和λ恒定(Cλ)区DNA序列中。

[0396] 当与表达某序列相关时，术语“细胞”包括适于表达重组核酸序列的任意细胞。细胞包括那些原核生物和真核生物(单细胞或多细胞)、细菌细胞(例如大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)等的菌株)、分枝杆菌细胞、真菌细胞、酵母细胞(例如酿酒酵母(S.cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、甲醇毕赤酵母(P.methanolica)等)、植物细胞、昆虫细胞(例如SF-9、SF-21、杆状病毒感染的昆虫细胞、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)等)、非人动物细胞、人细胞、B细胞或细胞融合例如杂交瘤或四价体杂交瘤。在一些实施方式中，所述细胞是人、猴、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在一些实施方式中，所述细胞是真核细胞并且选自下述细胞：CHO(例如CHO K1、DXB-11CHO、Veggie-CHO)、COS(例如COS-7)、视网膜细胞、Vero、CV1、肾(例如HEK293、293EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo205、HB
8065、HL-60、(例如BHK21)、Jurkat、Daudi、A431(表皮)、CV-1、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT 060562、Sertoli细胞、BRL 3A细胞、HT1080细胞、骨髓瘤细胞、肿瘤细胞和来源于前述细胞的细胞系。在一些实施方式中，所述细胞包括一种或多种病毒基因，TM
例如表达病毒基因的视网膜细胞(例如PER.C6 细胞)。

[0397] 短语“互补性决定区”或术语“CDR”包括由生物体免疫球蛋白基因的核酸序列编码的氨基酸序列，所述免疫球蛋白基因通常(即在野生型动物中)出现在免疫球蛋白分子(例如抗体或T细胞受体)的轻链或重链可变区中的两个框架区之间。CDR可以由例如生殖细胞系序列或者重排的或未经重排的序列，以及例如由天然存在的或者成熟的B细胞或T细胞来编码。在一些情况下(例如针对CDR3)，CDR可由两条或更多条序列(例如生殖细胞系序列)编码，所述序列(例如在未经重排的核酸序列中)不是邻近的，但是在B细胞核酸序列中是邻近的，例如作为所述序列剪接或连接的结果(例如V-D-J重组以形成重链CDR3)。

[0398] 短语“基因区段”或“区段”包括指V(轻链或重链)或D或J(轻链或重链)免疫球蛋白基因区段，这包括在免疫球蛋白基因座(在例如人和小鼠中)中未经重排的序列，其能够参与重排(由例如内源性重组酶所介导)以形成重排的V/J或V/D/J序列。除非另有明示，否则所述V、D和J区段包括重组信号序列(RSS)，所述重组信号序列允许根据12/23规则来进行V/J重组或V/D/J重组。除非另有明示，否则所述区段还包括与其在性质上相关的序列或其功能性等效物的序列(例如V区段的一个或多个启动子和一个或多个先导序列)。

[0399] 术语“未经重排的”包括免疫球蛋白基因座的状态，其中V基因区段和J基因区段(对于重链，还有D基因区段)均保持独立但是其能够结合在一起形成包括V(D)J库的单一V、(D)、J的重排的V(D)J基因。

[0400] 短语“微摩范围”旨在表示1-999微摩；短语“纳摩范围”旨在表示1-999纳摩；短语“皮摩范围”旨在表示1-999皮摩。

[0401] 术语“非人动物”旨在包括任意非人动物例如圆口类、硬骨鱼类、软骨鱼类如鲨鱼和鳐鱼、两栖动物、爬行动物、哺乳动物和鸟类。适宜的非人动物包括哺乳动物。适宜的哺乳动物包括非人灵长类、山羊、绵羊、猪、犬、牛和啮齿类。适宜的非人哺乳动物选自啮齿动物家族(包括大鼠和小鼠)。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。

[0402] 小鼠作为一种遗传模型通过转基因和敲除技术已经被极大地增强，小鼠已能够用于研究定向的过表达或缺失特定基因的作用。尽管所有的均为其优势，但是所述小鼠仍存在遗传障碍，这使小鼠是用于人类疾病的不完善模型并且是检测人用疗法或制备所述疗法的不完善的平台。首先，尽管约99％的人类基因与小鼠具有同源性(Waterston,R.H.等，(2002)Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome(小鼠基因组的起始测序和比较研究)，Nature 420,520-562)，但是潜在的疗法常常不能与拟采用的人靶点的小鼠直系同源物发生交叉反应或者交叉反应不充分。为了避免这个问题，可以将所选择的靶基因人源化，也就是说，可以将小鼠基因消除并使用相应的人源直系同源基因序列来取代(例如US 6,586,251、US 6,596,541和US 7,105,348，其通过引用并入本申请)。最初，努力通过“敲除加转基因人源化”的策略将小鼠基因人源化，使得携带内源性基因缺失(即敲除)的小鼠与携带随机整合的人源转基因的小鼠杂交(参见例如Bril,W.S.等，(2006)Tolerance to factor VIII in a transgenic mouse expressing human factor VIII cDNA carrying an Arg(593)to Cys substitution(在表达载有Arg(593)到Cys取代的人源因子VIII cDNA的转基因小鼠中对因子VIII的耐受性)，Thromb Haemost95,341-347；Homanics,G.E. 等，(2006)Production and characterization of murine models of classic and intermediate maple syrup urine disease(经典型和中间型枫糖尿症的鼠模型的生成和定性)，BMC Med Genet 7,33；Jamsai,D.等，(2006)A humanized BAC transgenic/knockout mouse model for HbE/beta-thalassemia(针对HbE/β-地中海贫血的人源化BAC转基因/敲出小鼠模型)，Genomics88(3):309-15；Pan,Q.等，(2006)Different role for mouse and human CD3delta/epsilon heterodimer in preT cell receptor(preTCR)function:human CD3delta/epsilon heterodimer restores the defective preTCR function in CD3gamma-and CD3gammadelta-deficient mice(前T细胞受体(preTCR)功能中小鼠和人CD3δ/ε异二聚体的不同作用：人CD3δ/ε异
二聚体在CD3γ-和CD3γδ-缺陷小鼠中恢复有缺陷的preTCR的功能)，Mol Immunol
43,1741-1750)。但是那些努力受到尺寸限制的阻碍；常规的敲除技术不足以直接使用其较大的人源基因组对应基因(counterpart)来取代较大的小鼠基因。因为存在技术困难，很少尝试直接同源取代的简单方法，即直接使用人源对应基因在小鼠基因相同的精确基因位置(即在内源性小鼠基因座)上取代内源性小鼠基因。直到现在，直接取代的努力涉及复杂和繁琐的程序，因此限制了能够被处理的遗传物质的长度以及其能够被操作的精确度。

[0403] 在小鼠的前体B细胞中外源性的引入了人源免疫球蛋白转基因重排(Alt,F.W.,Blackwell,T.K.和Yancopoulos,G.D.(1985).Immunoglobulin genes in transgenic mice(转基因小鼠中的免疫球蛋白基因)，Trends Genet 1,231-236)。这一发现是通过使用敲除加转基因方法将小鼠工程改造以表达人源抗体(Green,L.L.等，(1994)
Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy and light chain YACs(来自使用人源Ig重链和轻链YAC工程改造的小鼠的抗原特异性人源单克隆抗体)，Nat Genet 7,13-21；Lonberg,N.(2005).Human antibodies from transgenic animals(来自转基因动物的人源抗体)，Nat Biotechnol 23,1117-1125；
Lonberg,N.等，(1994)Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications(来自包含四个不同的基因修饰的小鼠的抗原特异性人源抗体)，Nature 368,856-859；Jakobovits,A.等，(2007)From XenoMouse technology to panitumumab,the first fully human antibody product from transgenic mice(从XenoMouse技术到帕尼单抗，来自转基因小鼠的第一个全人源抗体产物)，Nat Biotechnol
25,1134-1143)。在这些小鼠中通过将各内源性基因座小而关键的部分靶向缺失来使内源性小鼠免疫球蛋白重链和κ轻链基因座失活，随后通过如上文所描述的随机整合大的转基因或者微染色体来引入人源免疫球蛋白基因座(Tomizuka,K.等，(2000)Double trans-chromosomic mice:maintenance of two individual human chromosome fragments containing Ig heavy and kappa loci and expression of fully human antibodies(双转染色体小鼠：包含Ig重链和κ基因座的两个个人染色体片段的维持和全人源抗体的表达)，Proc Natl Acad Sci U S A 97,722-727)。这种小鼠代表了基因工程的一个重要进展；从其中分离的全人源单克隆抗体对于治疗多种人类疾病具有有希望的治疗潜力(Gibson,T.B.等，(2006)Randomized phase III trial results of panitumumab,a fully human anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody,in metastatic colorectal cancer(转移性结直肠癌中，全人源抗表皮生长因子受体单克隆抗体帕尼单抗的随机的III期试验结果)，Clin Colorectal Cancer 6,29-31；Jakobovits等，
2007；Kim,Y.H. 等，(2007)Clinical efficacy of zanolimumab(HuMax-CD4):two Phase II studies in refractory cutaneous T-cell lymphoma(zanolimumab的临床效果：
难治性皮肤T细胞淋巴瘤的两个II期研究)，Blood 109(11):4655-62；Lonberg,2005；
Maker,A.V.等，(2005)Tumor regression and autoimmunity in patients treated with cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4blockade and interleukin 2:a phase I/II study(用细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4阻断和白介素2治疗的患者中的肿瘤
抑制和自身免疫)，Ann Surg Oncol 12,1005-1016；McClung,M.R.,Lewiecki,E.M.等，(2006)Denosumab in postmenopausal women with low bone mineral density(具有低骨密度的绝经后妇女中的地诺单抗)，N Engl J Med 354,821-831)。但是，如上文所讨论的，当与野生型小鼠相比时，这些小鼠显示出受损的B细胞发育和免疫缺陷。这样的问题可能限制了小鼠支持较强体液免疫应答的能力，因此产生针对某些抗原的全人源抗体。所述缺陷可能是由于：(1)由于随机引入人源免疫球蛋白转基因所导致的低效的功能性，以及由于缺乏上游和下游控制元件所导致的不正确的表达(Garrett,F.E.等，(2005)Chromatin architecture near a potential 3'end of the igh locus involves modular regulation of histone modifications during B-Cell development and in vivo occupancy at CTCF sites(在igh基因座的潜在3'末端附近的染色质结构包括
B细胞发育过程中的组蛋白修饰的模块调节和CTCF位点的体内占有)，Mol Cell Biol
25,1511-1525；Manis,J.P.等，(2003)Elucidation of a downstream boundary of the
3'IgH regulatory region(3'IgH调节区的下游边界的说明)，Mol Immunol 39,753-760；
Pawlitzky,I.等，(2006)Identification of a candidate regulatory element within the 5'flanking region of the mouse Igh locus defined by pro-B cell-specific hypersensitivity associated with binding of PU.1,Pax5,and E2A(由原B细胞特异性过敏症相关的PU.1、Pax5和E2A结合所定义的小鼠Igh基因座的5'侧翼区中的候选调控元件的鉴定)，J Immunol 176,6839-6851)；(2)人源恒定结构域与小鼠细胞表面B细胞受体信号转导复合物元件之间低效率的种间相互作用，这可能使B细胞的正常的成熟、增殖和存活所需的信号转导过程受损(Hombach,J.等，(1990)Molecular components of the B-cell antigen receptor complex of the IgM class(IgM类的B细胞抗原受体复合物的分子组成),Nature 343,760-762)；以及(3)可溶性人源免疫球蛋白与小鼠Fc受体之间低效率的种间相互作用可能会降低亲和性选择(Rao,S.P.等，(2002)Differential expression of the inhibitory IgG Fc receptor FcgammaRIIB on germinal center cells:implications for selection of high-affinity B cells(生发中心细胞上抑制性IgG Fc受体FcγRIIB的差异表达：对高亲和性B细胞选择性的影响)，J Immunol
169,1859-1868)以及免疫球蛋白的血清浓度(Brambell,F.W.等，(1964)A Theoretical Model of Gamma-Globulin Catabolism(γ球蛋白分解代谢的理论模型)，Nature
203,1352-1354；Junghans,R.P. 和 Anderson,C.L.(1996).The protection receptor for IgG catabolism is the beta2-microglobulin-containing neonatal intestinal transport receptor(IgG分解代谢的保护受体是包含β2微球蛋白的新生儿肠道转运受体)，Proc Natl Acad Sci U S A 93,5512-5516；Rao等，2002；Hjelm,F.等，(2006)Antibody-mediated regulation of the immune response(免疫应答的抗体介导的调控)，Scand J Immunol 64,177-184；Nimmerjahn,F.和Ravetch,J.V.(2007)Fc-receptors as regulators of immunity(Fc受体作为免疫调节剂)，Adv Immunol 96,179-204)。能够通过仅仅针对在内源性重链和轻链基因座上其天然位置中的小鼠免疫球蛋白基因座的可变区的原位人源化来纠正这些缺陷。这将有效地产生制备“反向嵌合”(即人源V:小鼠C)抗体的小鼠，所述抗体将能够基于保留小鼠恒定区在小鼠环境中产生正常的相互作用和选择性。此外这种反向嵌合抗体可以容易地重新形成用于治疗目的的全人源抗体。

[0404] 基因修饰的动物包括在内源性免疫球蛋白重链基因座上使用异源性(例如来自其他物种的)免疫球蛋白序列的取代，所述基因修饰的动物能够从与内源性免疫球蛋白轻链基因座的取代相结合来制备或者与免疫球蛋白轻链转基因相结合来制备(例如嵌合的免疫球蛋白轻链转基因或者全人源全小鼠等)。作为异源性免疫球蛋白重链序列来源的物种可以与在免疫球蛋白轻链序列取代或免疫球蛋白轻链转基因中使用的免疫球蛋白轻链序列存在较大差异。

[0405] 免疫球蛋白可变区核酸序列例如V、D和/或J区段在各种实施方式中来自人源或非人动物。适于提供V、D和/或J区段的非人动物包括例如硬骨鱼类、软骨鱼类如鲨鱼和鳐鱼、两栖动物、爬行动物、哺乳动物、鸟类(例如鸡)。非人动物包括例如哺乳动物。哺乳动物包括例如非人灵长类、山羊、绵羊、猪、犬、牛(例如奶牛、公牛、水牛)、鹿、骆驼、雪貂和啮齿动物以及非人灵长类(例如黑猩猩、猩猩、大猩猩、狨猴、猕猴、狒狒)。适宜的非人动物选自啮齿动物家族，包括大鼠、小鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。如从上下文中可知，各种非人动物可以作为可变结构域或可变基因区段的来源(例如鲨鱼、鳐鱼、哺乳动物(例如骆驼、啮齿动物如小鼠和大鼠)。

[0406] 根据上下文，非人动物还作为用于与可变序列或区段连接的恒定区序列的来源，例如啮齿动物的恒定序列可以作为与人源或非人源可变序列可操作地连接的转基因(例如人源或非人源灵长类可变序列与例如啮齿动物如小鼠或大鼠或仓鼠的恒定序列可操作地连接)。这样，在各种实施方式中，人源V、D和/或J区段与啮齿动物(例如小鼠或大鼠或仓鼠)的恒定区基因序列可操作地连接。在一些实施方式中，所述人源V、D和/或J区段(或者一个或多个重排的VDJ或VJ基因)与在例如转基因整合至基因座中的小鼠、大鼠或仓鼠恒定区基因序列可操作地连接或融合，所述基因座不是内源性免疫球蛋白基因座。

[0407] 在一个特定的实施方式中，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠在内源性免疫球蛋白重链基因座上包括用一个或多个人源VH、DH和JH区段来取代VH、DH和JH基因区段被，其中所述一个或多个人源VH、DH和JH区段与内源性免疫球蛋白重链恒定基因可操作地连接；其中所述小鼠包括在与内源性免疫球蛋白基因座不同的基因座上的转基因，其中所述转基因包括与小鼠或大鼠或人源恒定区可操作地连接的未经重排的或重排的人源VL和人源JL区段。

[0408] 在一个特定的实施方式中，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括在内源性免疫球蛋白重链基因座上插入一个或多个人源VH、DH和JH基因区段。在一个实施方式中，所述插入在内源性免疫球蛋白重链恒定基因的上游；在一个实施方式中，所述插入在内源性可变(V)基因区段的下游；在一个实施方式中，所述插入在内源性多样性(D)基因区段的下游；在一个实施方式中，所述插入在内源性连接(J)基因区段的下游。在各种实施方式中，所述插入是所述一个或多个人源VH、DH和JH基因区段位于与一个或多个内源性重链恒定基因的可操作连接处。

[0409] 本申请描述了一种方法，所述方法用于使用人源生殖细胞系免疫球蛋白可变基因座大量原位基因取代小鼠生殖细胞系免疫球蛋白可变基因座，但同时保持小鼠产生后代的能力。特别地，本申请描述了使用其人源对应基因精确取代6百万碱基的小鼠重链和κ轻链免疫球蛋白可变基因座，但同时完好保留小鼠的恒定区。其结果是，建立了一种小鼠，其整个生殖细胞系免疫球蛋白可变库被等效的人源生殖细胞系免疫球蛋白可变序列精确取代，但同时保留小鼠的恒定区。人源可变区与小鼠恒定区连接以形成嵌合人源-小鼠免疫球蛋白基因座，所述基因座在生理上适宜的水平重排和表达。所表达的抗体是“反向嵌合的”，即抗体包括人源可变区序列和小鼠恒定区序列。这些小鼠具有表达具有人源可变区和小鼠恒定区的抗体的人源化免疫球蛋白可变区，，将所述小鼠称为 小鼠。

[0410] 人源化小鼠显示出与野生型小鼠本质上不同的全功能体液免疫系统。所述小鼠显示出在B细胞发育所有阶段的正常的细胞群。所述小鼠显示出正常的淋巴器官形态。 小鼠的抗体序列显示出正常的V(D)J重排和正常的体
细胞高频突变频率。在这些小鼠中的抗体群反映出由正常的类型转换(例如正常同种型顺式(cis)转换)产生的同种型分布。免疫 小鼠产生强的体液免疫应答，
所述体液免疫应答产生具有适于作为治疗候选物的人源免疫球蛋白可变结构域的大量的、多样性的抗体库。该平台提供了用于制备药学上可接受的抗体和其他抗原结合蛋白的天然亲和性成熟的人源免疫球蛋白可变区序列的充足来源。

[0411] 使用人源免疫球蛋白可变序列精确取代小鼠免疫球蛋白可变序列能够制备小鼠。尽管通过按序重组非常大跨距的人源免疫球蛋白序列来使用等
效的人源免疫球蛋白序列在重链和轻链基因座上精确取代内源性小鼠免疫球蛋白序列，但是由于小鼠和人之间免疫球蛋白基因座的趋异进化使得可能存在某些挑战。例如，在免疫球蛋白基因座中散布的基因间序列在小鼠和人之间不是相同的，并且在一些情况下，可能功能上并不等效。小鼠和人在其免疫球蛋白基因座之间的差异仍会导致人源化小鼠的异常，特别是当人源化或操作内源性小鼠免疫球蛋白重链基因座的某些部分时。在小鼠免疫球蛋白重链基因座上的一些修饰是有害的。有害的修饰可能包括例如经修饰的小鼠交配和产生后代能力的丧失。在各种实施方式中，在小鼠基因组中工程改造人源免疫球蛋白序列包括，当其在经修饰的小鼠品系中缺失是有害的时维持内源性序列的方法。示例性的有害作用可以包括不能繁殖经修饰的品系、必需基因功能的丧失、不能表达多肽等。这种有害作用可能直接或间接地与工程改造进入小鼠基因组的修饰相关。

[0412] 精确地、大规模地使用相应1.4百万个人源基因组序列在原位取代6百万个小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因座的可变区(VH-DH-JH和Vκ-Jκ)，同时在杂交基因座中使小鼠翼侧序列保留完好并具有功能，包括所有的小鼠恒定链基因和基因座转录控制区(图1A和图1B)。特别地，使用 基因工程技术通过将13个携带人源生殖细胞系可变基因座的重叠片段的嵌合BAC靶向载体逐步插入小鼠ES细胞中，从而引入人源VH、DH、JH、Vκ和Jκ基因序列(参见例如US专利号6,586,251和Valenzuela,D.M.等，(2003).High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis(与高分辨率表达分析的偶联的小鼠基因组的高通量工程改造).Nat Biotechnol 21,652-659)。

[0413] 小鼠免疫球蛋白基因的人源化是迄今为止对小鼠基因组的最大的基因修饰。尽管此前使用随机整合的人源免疫球蛋白转基因已经取得了一些成功(上述已讨论)，但是使用人源对应基因直接取代小鼠免疫球蛋白基因显著增加了能够在其他正常小鼠中有效产生全人源抗体的效率。而且，与携带失能的内源性基因座和全人源抗体转基因的小鼠相比，这种小鼠在使用几乎任何抗原免疫后均能够获得的全人源抗体的多样性显著增加。经过多种方式取代后，人源化的基因座显示出完全正常水平的成熟和未成熟的B细胞，而与之相反的是随机整合了人源转基因的小鼠在不同的分化阶段显示出显著减少的B细胞群。尽管通过在人源转基因小鼠中努力增加人源基因区段的数量已减少了这种缺陷，但是扩大的免疫球蛋白库还不能完全纠正与野生型小鼠相比B细胞群的减少。

[0414] 尽管在具有经取代的免疫球蛋白基因座的小鼠(即 小鼠)中观察到了接近野生型的体液免疫功能，但是当使用在用随机整合的转基因的一些方法中未遇到过的免疫球蛋白的直接取代时，还会遇到其他挑战。小鼠和人之间免疫球蛋白基因座基因组成的差异导致发现了对具有经取代的免疫球蛋白基因区段的小鼠繁殖有益的序列。
特别地，由于其在生育能力方面的作用，在具有经取代的免疫球蛋白基因座的小鼠中，最好存在位于内源性免疫球蛋白基因座中的小鼠ADAM基因。

[0415] 小鼠ADAM6在基因组中的位置和功能

[0416] 缺乏表达任何功能性ADAM6蛋白能力的雄性小鼠惊人地显示出所述小鼠缺乏交配和产生后代的能力。由于全部或几乎全部小鼠免疫球蛋白可变区基因区段被人源可变区基因区段取代，所述小鼠缺乏表达功能性ADAM6蛋白的能力。产生ADAM6功能丧失的结果是由于ADAM6基因座位于内源性小鼠免疫球蛋白重链可变区基因座区域内，邻近位于DH基因区段上游的VH基因区段基因座的3’末端。为了繁殖针对全部或基本上全部内源性小鼠重链可变基因区段被人源重链可变基因区段取代的纯合子小鼠，通常比较麻烦的方法是建立针对所述取代各自为纯合子的雄性和雌性并等待产生交配。窝仔成功的频率和大小均比较低。取而代之的是，使用针对所述取代是杂合子的雄性与针对所述取代是纯合子的雌性交配，以产生针对所述取代是杂合子的后代，然后从其上繁殖纯合子小鼠。本发明人已确定导致雄性小鼠生育能力的丧失的可能的原因是在纯合雄性小鼠中缺乏功能性ADAM6蛋白。

[0417] 在各种方面，包括受损的(即无功能或具有轻微功能)ADAM6基因的雄性小鼠显示出生育能力的降低或消失。由于在小鼠(和其他啮齿动物)中ADAM6基因位于免疫球蛋白重链基因座，因此本发明人已确定为了繁殖小鼠或建立和维持包括经取代的免疫球蛋白重链基因座的小鼠品系，应使用涉及交配和繁殖方案的多种修饰。在针对内源性免疫球蛋白重链可变基因座的取代是纯合子的低生育或无生育能力的雄性小鼠使得在小鼠品系中的维持这种修饰是困难的。在各种实施方式中，维持所述品系包括避免针对所述取代是纯合子的雄性小鼠所显示出不具有生育能力的问题。

[0418] 在一个方面，本申请提供了一种维持如本申请所描述的小鼠品系的方法。所述小鼠品系不需要包括异位ADAM6序列，并且在各种实施方式中所述小鼠品系是针对ADAM6敲除(例如功能性敲除)的纯合子或杂合子。

[0419] 所述小鼠品系包括在内源性免疫球蛋白重链基因座的修饰，所述修饰使得在雄性小鼠中生育能力降低或丧失。在一个实施方式中，所述修饰包括ADAM6基因调控区和/或编码区的缺失。在一个特定的实施方式中，所述修饰包括内源性ADAM6基因(调控和/或编码区)的修饰，所述修饰使得包括所述修饰的雄性小鼠的生育能力降低或消除；在一个特定的实施方式中，所述修饰使得针对所述修饰是纯合子的雄性小鼠的生育能力降低或消除。

[0420] 在一个实施方式中，所述小鼠品系是针对ADAM6基因的敲除(例如功能性敲除)或缺失的纯合子或杂合子。

[0421] 在一个实施方式中，保持所述小鼠品系是通过从针对所述修饰是纯合子或杂合子的小鼠中分离细胞，和在宿主胚胎中使用供体细胞，并将所述宿主胚胎以及供体细胞在代孕母体中妊娠，并且由所述代孕母体中获得包括所述基因修饰的后代。在一个实施方式中，所述供体细胞是ES细胞。在一个实施方式中，所述供体细胞是多能细胞，例如诱导性多能细胞。

[0422] 在一个实施方式中，保持所述小鼠品系是通过从针对所述修饰是纯合子或杂合子的小鼠中分离包括所述修饰的核酸序列，和将所述核酸序列引入宿主细胞核，并将包括所述核酸序列和所述宿主细胞核的细胞在适宜的动物中妊娠。在一个实施方式中，将所述核酸序列引入宿主卵母细胞胚胎。

[0423] 在一个实施方式中，保持所述小鼠品系是通过从针对所述修饰是纯合子或杂合子的小鼠中分离细胞核，和将所述细胞核引入宿主细胞，并且将所述细胞核以及宿主细胞在适宜的动物中妊娠以获得针对所述修饰是纯合子或杂合子的后代。

[0424] 在一个实施方式中，保持所述小鼠品系是通过使用包括所述基因修饰的雄性小鼠的精子对雌性小鼠(野生型，针对所述修饰是纯合子，或者针对所述修饰是杂合子)进行体外受精(IVF)。在一个实施方式中，所述雄性小鼠针对所述基因修饰是杂合子。在一个实施方式中，所述雄性小鼠针对所述基因修饰是纯合子。

[0425] 在一个实施方式中，保持所述小鼠品系是通过将针对所述基因修饰是杂合子的雄性小鼠与雌性小鼠繁殖以获得包括所述基因修饰的后代，鉴定包括所述基因修饰的雄性和雌性后代，并且使用针对所述基因修饰是杂合子的雄性与野生型、针对所述基因修饰是纯合子或杂合子的雌性繁殖以获得包括所述基因修饰的后代。在一个实施方式中，将针对所述基因修饰是杂合子的雄性与野生型雌性、针对所述修饰是杂合子的雌性或针对所述修饰是纯合子的雌性繁殖的步骤重复，以维持在小鼠品系中的所述基因修饰。

[0426] 在一个方面，本申请提供了一种保持小鼠品系的方法，所述小鼠品系包括使用一个或多个人源免疫球蛋白重链序列取代内源性免疫球蛋白重链可变基因座，所述方法包括将所述小鼠品系繁殖以产生杂合子雄性小鼠，其中将所述杂合子雄性小鼠繁殖以维持在该品系中的所述基因修饰。在一个特定的实施方式中，所述品系不通过将纯合子雄性与野生型雌性、或者针对所述基因修饰是纯合子或杂合子的雌性的任意交配来维持。

[0427] ADAM6蛋 白 是ADAM 蛋 白 家 族 成 员，其 中 ADAM是 A Disintegrin And Metalloprotease(去整合蛋白和金属蛋白酶)的首字母缩略词。ADAM家族的蛋白较大而且多样，具有包括细胞粘附在内的多样性功能。ADAM家族的一些成员参与精子发生和受精。例如，ADAM2编码受精素的亚基，受精素参与精子和卵子的相互作用。ADAM3或cyritestin似乎是精子与透明带结合所必需的。ADAM2或ADAM3的缺乏造成不具有生育能力。已假设ADAM2、ADAM3和ADAM6在小鼠精子细胞表面上形成复合物。

[0428] 人源ADAM6基因，正常存在于人源VH基因区段VH1-2和VH6-1之间，似乎是假基因(图12)。在小鼠中，有两个ADAM6基因——ADAM6a和ADAM6b，是两个ADAM6基因存在于小鼠VH和DH基因区段之间的基因间区，并且在小鼠中ADAM6a和ADAM6b基因的方向与周围的免疫球蛋白基因区段的转录方向相反(图12)。在小鼠中，功能性的ADAM6基因座显然是正常生育所需的。然后，功能性ADAM6基因座或序列是指一种ADAM6基因座或序列，所述ADAM6基因座或序列能够补足或挽救在具有丧失功能或无功能的内源性ADAM6基因座的雄性小鼠中显示出的大幅下降的生育能力。

[0429] 在编码ADAM6a和ADAM6b的小鼠中的基因间序列的位置使得当修饰内源性小鼠重链时所述基因间序列易于修饰。当VH基因区段缺失或被取代时，或者当DH基因区段缺失或被取代时，所得到的小鼠在生育能力方面显示出严重缺陷的概率较高。为了补偿该缺陷，对所述小鼠进行修饰以使其包括编码蛋白的核苷酸序列，所述蛋白将与由于内源性小鼠ADAM6基因座的修饰而导致的ADAM6活性的丧失补足。在各种实施方式中，所述补足核苷酸序列是编码挽救生育能力缺陷的小鼠ADAM6a、小鼠ADAM6b或者其同源物或直系同源物或功能性片段的核苷酸序列。或者，可以使用保留内源性ADAM6基因座的适宜方法，同时使小鼠ADAM6基因座翼侧的内源性免疫球蛋白重链序列不能重排以编码功能性内源性重链可变区。示例性的替代方法包括以操纵位于内源性免疫球蛋白重链可变区基因座的大部分小鼠染色体，以使其不能重排以编码与内源性重链恒定基因可操作地连接的功能性重链可变区。在各种实施方式中，所述方法包括将含有内源性免疫球蛋白重链基因区段的小鼠染色体片段倒置和/或转位。

[0430] 可以将挽救生育能力的核苷酸序列置于任意适宜的位置。可以将其置于基因间区，或者基因组中任意适宜的位置(即异位的)。在一个实施方式中，可以将所述核苷酸序列引入到随机整合至小鼠基因组中的转基因上。在一个实施方式中，所述序列可以维持在游离基因上，也就是说在小鼠染色体以外的独立核酸上。适宜的位置包括允许转录或具有转录活性的位置，例如ROSA26基因座(Zambrowicz等，1997,PNAS USA 94:3789-3794)、BT-5基 因 座 (Michael 等，1999,Mech.Dev.85:35-47)或 Oct4 基 因 座(Wallace 等，2000,Nucleic Acids Res.28:1455-1464)。对将核苷酸序列靶向至具有转录活性的基因座的描述例如参见US 7,473,557，其通过引用并入本申请。

[0431] 或者，可以将挽救生育能力的核苷酸序列与诱导性启动子偶联，以促进在适宜的细胞和/或组织例如生殖组织中最佳表达。示例性的诱导性启动子包括以物理(例如热休克启动子)和/或化学方法(例如IPTG或四环素)活化的启动子。

[0432] 而且，所述核苷酸的表达能够与其他基因相关联，以实现在发育特定阶段或在特定组织中的表达。这种表达能够通过将所述核苷酸序列与在发育特定阶段表达的基因启动子可操作地连接来实现。例如，工程改造至宿主物种基因组中的来自一个物种的免疫球蛋白序列，位于与宿主物种CD19基因(B细胞特异性基因)的启动子序列可操作地连接的位置上。实现了在精确发育阶段的B细胞特异性表达时，免疫球蛋白表达。

[0433] 实现插入的核苷酸序列强表达的另一种方法是使用组成性启动子。示例性的组成性启动子包括SV40、CMV、UBC、EF1A、PGK和CAGG。按照类似的方式，将所需的核苷酸序列置于与选定的组成性启动子可操作地连接的位置上，所述启动子提供了核苷酸序列编码的一种或多种蛋白的高水平表达。

[0434] 术语“异位”旨在包括移位，或者在自然界中正常情况下不存在的位置上安置(例如核酸序列所在的位置在不同于野生型小鼠中所发现的该核酸序列的位置上安置)。该术语在各种实施方式中用于对象不在正常的或正确的位置的情况下。例如，短语“编码……的异位核苷酸序列”指核苷酸序列出现在小鼠中的正常情况下不出现的位置上。例如，在编码小鼠ADAM6蛋白(或对雄性小鼠的生育能力提供相同或相近的益处的其直系同源物或同源物或片段)的异位核苷酸序列的情况下，所述序列可以位于小鼠基因组中与在野生型小鼠中在正常情况下所发现的不同位置上。在这种情况下，通过将所述序列置于小鼠基因组中与野生型小鼠不同的位置上，从而形成新的小鼠序列的序列连接。小鼠ADAM6的功能性同-/-源物或直系同源物是能挽救在ADAM6 小鼠中观察到的生育能力丧失(例如雄性小鼠通过交配产生后代的能力丧失)的序列。功能性同源物或直系同源物包括与ADAM6a的氨基酸序列和/或ADAM6b的氨基酸序列具有至少约89％一致性或者更高(例如达99％一致性)的蛋白，并且所述蛋白能够补足或挽救具有包括ADAM6a和/或ADAM6b缺失或敲除基因型的小鼠成功交配的能力。

[0435] 异位位置可以在任意位置(例如作为含有小鼠ADAM6序列的转基因的随机插入)，或者可以例如在与其在野生型小鼠中的位置接近(但不是精确地相同)的位置(例如在经修饰的内源性小鼠免疫球蛋白基因座，但是在其天然位置的上游或下游，例如在经修饰的免疫球蛋白基因座内但是在不同的基因区段之间，或者在小鼠V-D基因间序列的不同位置)。异位安置的一个例子是将在野生型小鼠中正常发现的位置维持在内源性免疫球蛋白重链基因座中，但是使得周围的内源性重链基因区段不能重排以编码含有内源性重链恒定区的功能性重链。在这个例子中，这可以通过使含有所述内源性免疫球蛋白重链可变基因座的染色体片段翻转来实现，例如使用在所述可变区基因座翼侧位置上的工程改造的位点特异性重组位点。这样，重组后，内源性重链可变区基因座置于远离内源性重链恒定区基因的位置上，以阻止重排以编码含有内源性重链恒定区的功能性重链。本领域技术人员在阅读了本公开和/或与本领域公知的方法结合后，对获得内源性免疫球蛋白重链可变基因座功能性沉默并维持功能性ADAM6基因座的其他示例性方法将是显而易见的。内源性重链基因座具有这种安置时，维持了所述内源性ADAM6基因，并且所述内源性免疫球蛋白重链基因座被功能性沉默。

[0436] 异位安置的另一个例子是在人源化免疫球蛋白重链基因座中安置。例如，包括一个或多个内源性VH基因区段被人源VH基因区段取代的小鼠(其中所述取代除去内源性ADAM6序列)能够被工程改造为在位于含有人源VH基因区段的序列中具有小鼠ADAM6序列。所得到的修饰将在人源基因序列中产生(异位)小鼠ADAM6序列，并且在人源基因序列中(异位)安置小鼠ADAM6序列可以接近人源ADAM6假基因的位置(即在两个V区段之间)或者可以接近小鼠ADAM6序列的位置(即在V-D基因间区中)。通过将在小鼠生殖细胞系中的人源基因序列(例如免疫球蛋白基因序列)中或与之邻近的(异位)小鼠ADAM6序列连接以形成所得到的序列连接，与在野生型小鼠基因组中的相同或相近位置相比所述所得到的序列连接是新的。

[0437] 在各种实施方式中，本申请提供了一种非人动物，所述动物缺乏ADAM6或者其直系同源物或同源物，其中所述缺乏使非人动物不具有生育能力，或者实质性降低所述非人动物的生育能力。在各种实施方式中，ADAM6或者其直系同源物或同源物的缺乏是由于内源性免疫球蛋白重链基因座的修饰导致。实质性降低生育能力是指例如生育能力(例如繁殖频率、窝胎仔数、年窝数等)降低约50％、60％、70％、80％、90％或95％或者更多。在各种实施方式中，所述非人动物补充了在雄性非人动物中具有功能的小鼠ADAM6基因或者其直系同源物或同源物或功能性片段，其中所补充的ADAM6基因或者其直系同源物或同源物或功能性片段全部或大部分挽救了生育能力的降低。大部分挽救了生育能力是指例如使生育能力恢复，以使得所述非人动物显示出的生育能力与未经修饰的(即不具有ADAM6基因或者其直系同源物或同源物修饰的动物)重链基因座相比为至少70％、80％或90％或者更高。

[0438] 赋予所述经基因修饰的动物(即由于例如免疫球蛋白重链基因座的修饰而缺乏功能性ADAM6或者其直系同源物或同源物的动物)的序列，在各种实施方式中，选自ADAM6基因或者其直系同源物或同源物。例如，在一个实施方式中，在小鼠中，ADAM6功能的丧失通过加入小鼠ADAM6基因来挽救。在一个实施方式中，在小鼠中ADAM6功能的丧失通过加入与小鼠密切相关物种的直系同源物或同源物来挽救，所述物种例如啮齿动物，例如不同品系或物种的小鼠，任意物种的大鼠，啮齿动物；其中加入小鼠的直系同源物或同源物挽救了由于ADAM6功能的丧失或者ADAM6基因的缺失而导致的生育能力的丧失。来自其他物种的直系同源物和同源物，在各种实施方式中，选自在系统发育上有关的物种以及，在各种实施方式中，显示出与所述内源性ADAM6(或者直系同源物)的一致性百分率为约80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、96％或更高或者97％或更高；并且挽救ADAM6有关的或者(在非小鼠中)ADAM6的直系同源物有关的生育能力丧失。例如，在缺乏ADAM6功能的经基因修饰的雄性大鼠中(例如内源性免疫球蛋白重链可变区被人源免疫球蛋白重链可变区取代的大鼠，或者在大鼠的免疫球蛋白重链区中敲除的大鼠)，在大鼠中挽救生育能力丧失是通过加入大鼠ADAM6，或者在一些实施方式中，是通过加入大鼠ADAM6的直系同源物(例如来自其他大鼠品系或物种，或者在一个实施方式中来自小鼠的ADAM6直系同源物)。

[0439] 因此，在各种实施方式中，经基因修饰的动物显示出由于编码ADAM6蛋白(或者其直系同源物或同源物)的核酸序列的修饰或者与所述核酸序列可操作地连接的调控区的修饰而导致无生育能力或生育能力降低，所述经基因修饰的动物包括补足或恢复生育能力丧失的核酸序列，其中补足或恢复生育能力丧失的所述核酸序列来自相同物种的不同品系或者来自系统发育上有关的物种。在各种实施方式中，补足的核酸序列是ADAM6直系同源物或其同源物或功能性片段。在各种实施方式中，所述补足的ADAM6直系同源物或其同源物或功能性片段来自与具有生育能力缺陷的所述经基因修饰的动物密切相关的非人动物。例如，当所述经基因修饰的动物是特定品系的小鼠时，ADAM6直系同源物或其同源物或功能性片段可以来自于另一个品系的小鼠，或者相关物种的小鼠。在一个实施方式中，当包括生育能力缺陷的所述经基因修饰的动物是啮齿目时，ADAM6直系同源物或其同源物或功能性片段来自于啮齿目中的另一种动物。在一个实施方式中，包括生育能力缺陷的所述经基因修饰的动物是鼠型亚目(Myomoropha)(例如跳鼠、跳鼠、小鼠样仓鼠、仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠、真小鼠和大鼠、沙鼠、多刺鼠、黄冠鼠、攀鼠、岩鼠、白尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠、多刺睡鼠、鼹鼠、竹鼠、鼢鼠)并且ADAM6直系同源物或其同源物或功能性片段选自啮齿目(Rodentia)或鼠型亚目的动物。

[0440] 在一个实施方式中，所述经基因修饰的动物来自跳鼠科(Dipodoidea)总科，并且所述ADAM6直系同源物或其同源物或功能性片段来自鼠科(Muroidea)总科。在一个实施方式中，所述经基因修饰的动物来自鼠科总科，并且所述ADAM6直系同源物或其同源物或功能性片段来自跳鼠科总科。

[0441] 在一个实施方式中，所述经基因修饰的动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠科总科，并且所述ADAM6直系同源物或同源物来自鼠科总科的不同物种。在一个实施方式中，所述经基因修饰的动物来自选自下述的科：丽仓鼠科(Calomyscidae)(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(Cricetidae)(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠科(Muridae)(真小鼠和大鼠、沙鼠、多刺鼠、黄冠鼠)、马岛鼠科(Nesomyidae)(攀鼠、岩鼠、白尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺山鼠科(Platacanthomyidae)(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(Spalacidae)(例如鼹鼠、竹鼠和鼢鼠)；以及所述ADAM6直系同源物或同源物选自同一科的不同物种。在一个特定的实施方式中，所述经基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠科)，并且所述ADAM6直系同源物或同源物来自选自下述的物种：沙鼠、多刺小鼠或黄冠鼠。在一个实施方式中，所述经基因修饰的小鼠来自鼠科成员，并且所述ADAM6直系同源物或同源物来自鼠科的不同物种。在一个特定的实施方式中，所述经基因修饰的啮齿动物是鼠科中的小鼠，并且所述ADAM6直系同源物或同源物来自鼠科中的大鼠、沙鼠、多刺小鼠或黄冠鼠。

[0442] 在各种实施方式中，使用科中啮齿动物的一种或多种啮齿动物ADAM6直系同源物或其同源物或功能性片段，从而使相同科的缺乏ADAM6直系同源物或同源物的、经基因修饰的啮齿动物的生育能力恢复(例如仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)；鼠科(例如真小鼠和大鼠、沙鼠、多刺鼠、黄冠鼠))。

[0443] 在各种实施方式中，通过确定所述直系同源物、同源物或片段使缺乏ADAM6活性的经基因修饰的非人动物(例如包括ADAM6或其直系同源物敲除的啮齿动物，例如小鼠或大鼠)是否恢复生育能力来评估ADAM6直系同源物、其同源物及片段的功能性。在各种实施方式中，将功能性定义为缺乏内源性ADAM6或其直系同源物或同源物的经基因修饰的动物的精子迁移至输卵管并且使经基因修饰的相同物种动物的卵子受精的能力。

[0444] 在各种方面，可以制备包括内源性重链可变区基因座或其部分的缺失或取代的小鼠，所述小鼠含有异位核苷酸序列，所述异位核苷酸序列编码赋予与小鼠ADAM6(例如在雄性小鼠中具有功能的其直系同源物或同源物或片段)具有相似生育能力益处的蛋白。所述异位核苷酸序列可以包括编码蛋白的核苷酸序列，所述蛋白是不同小鼠品系或不同物种(例如不同的啮齿动物物种)的ADAM6同源物或直系同源物(或其片段)，并且在生育能力方面具有益处，例如在特定时间段内增加窝数，和/或增加每窝胎仔数，和/或使雄性小鼠的精子细胞能够穿过小鼠的输卵管使小鼠的卵子受精。

[0445] 在一个实施方式中，ADAM6是与小鼠ADAM6蛋白具有至少89％至99％一致性的同源物或直系同源物(例如与小鼠ADAM6a或小鼠ADAM6b具有至少89％至99％一致性)。在一个实施方式中，所述异位核苷酸序列编码一种或多种蛋白，所述蛋白独立地选自与小鼠ADAM6a具有至少89％一致性的蛋白、与小鼠ADAM6b具有至少89％一致性的蛋白，及其组合。在一个实施方式中，所述同源物或直系同源物是大鼠、仓鼠、小鼠或豚鼠蛋白，所述蛋白为或被修饰为与小鼠ADAM6a和/或小鼠ADAM6b具有约89％或者更高的一致性。在一个实施方式中，所述同源物或直系同源物为或与小鼠ADAM6a和/或小鼠ADAM6b具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。

[0446] 在一个方面，本申请提供了一种非人动物，其中所述非人动物包括(a)在非人源免疫球蛋白轻链恒定区上游插入一个或多个人源Vλ和Jλ基因区段，(b)在非人源免疫球蛋白重链恒定区上游插入一个或多个人源VH、一个或多个人源DH以及一个或多个人源JH基因区段，和(c)编码ADAM6蛋白或其功能性片段的核苷酸序列。在一个实施方式中，所述非人源重链和/或轻链恒定区是啮齿动物恒定区(例如选自小鼠、大鼠或仓鼠恒定区)。在一个实施方式中，所述非人源轻链恒定区是啮齿动物恒定区。在一个特定的实施方式中，所述轻链恒定区是小鼠Cκ或大鼠Cκ区。在一个特定的实施方式中，所述轻链恒定区是小鼠Cλ或大鼠Cκ区。适宜的非人动物包括啮齿动物，例如小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物是小鼠或大鼠。

[0447] 在一个实施方式中，所述非人动物包括至少12个到至少40个人源Vλ基因区段和至少1个人源Jλ基因区段。在一个特定的实施方式中，所述非人动物包括12个人源Vλ基因区段和至少1个人源Jλ基因区段。在一个特定的实施方式中，所述非人动物包括28个人源Vλ基因区段和至少1个人源Jλ基因区段。在一个实施方式中，所述非人动物包括40个人源Vλ基因区段和至少1个人源Jλ基因区段。在各种实施方式中，所述至少1个人源Jλ基因区段选自Jλ1、Jλ2、Jλ3和Jλ7。在一个特定的实施方式中，所述非人动物包括至少4个人源Jλ基因区段。在一个实施方式中，所述至少4个人源Jλ基因区段包括至少Jλ1、Jλ2、Jλ3和Jλ7。

[0448] 在一个实施方式中，编码ADAM6蛋白或其功能性片段的核苷酸序列在非人动物中是异位的。在一个实施方式中，编码ADAM6蛋白或其功能性片段(其在非人动物中具有功能)的核苷酸序列存在于与野生型非人ADAM6基因座相同的位置。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠，并且所述核苷酸序列编码小鼠的ADAM6蛋白或其功能性片段且存在于非人动物基因组的异位位置。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠，并且所述核苷酸序列编码小鼠ADAM6蛋白或其功能性片段且存在于免疫球蛋白基因区段中。在一个特定的实施方式中，所述免疫球蛋白基因区段是重链基因区段。在一个实施方式中，所述重链基因区段是人源的。在一个实施方式中，所述重链基因区段是非人动物的内源性重链基因区段。在一个实施方式中，所述小鼠包括含有一个或多个内源性未经重排的重链基因区段的异位邻近的序列，并且ADAM6序列在所述异位邻近的序列中。

[0449] 在一个实施方式中，所述非人动物在内源性免疫球蛋白轻链基因座上缺乏内源性免疫球蛋白VL和/或JL基因区段。在一个实施方式中，所述非人动物包括在非人动物中不能重排形成免疫球蛋白VL结构域的内源性免疫球蛋白VL和/或JL基因区段。在一个实施方式中，全部或基本上全部内源性免疫球蛋白Vκ和Jκ基因区段被一个或多个人源Vλ和Jλ基因区段取代。在一个实施方式中，全部或基本上全部内源性免疫球蛋白Vλ和Jλ基因区段被一个或多个人源Vλ和Jλ基因区段取代。在一个实施方式中，全部或基本上全部内源性免疫球蛋白VL和JL基因区段在非人动物中是完好的，并且所述非人动物包括插入内源性免疫球蛋白VL和/或JL基因区段和内源性免疫球蛋白轻链恒定区之间的一个或多个人源Vλ基因区段和一个或多个人源Jλ基因区段。在一个特定的实施方式中，所述完好的内源性免疫球蛋白VL和JL基因区段在非人动物中不能重排形成抗体的VL结构域。在各种实施方式中，所述非人动物的内源性免疫球蛋白轻链基因座是免疫球蛋白κ轻链基因座。在各种实施方式中，所述非人动物的内源性免疫球蛋白轻链基因座是免疫球蛋白λ轻链基因座。在各种实施方式中，所述内源性免疫球蛋白VL和JL基因区段是Vκ和Jκ基因区段。在各种实施方式中，所述内源性免疫球蛋白VL和JL基因区段是Vλ和Jλ基因区段。

[0450] 在一个实施方式中，所述非人动物还包括来自人源κ轻链基因座的人源Vκ-Jκ基因间区，其中所述人源Vκ-Jκ基因间区与一个或多个人源Vλ和Jλ基因区段邻近。在一个特定的实施方式中，所述人源Vκ-Jκ基因间区位于人源Vλ基因区段和人源Jλ基因区段之间。

[0451] 在一个方面，本申请提供了来源于如本申请所描述的非人动物的细胞和/或组织，其中所述细胞和/或组织包括(a)在非人源免疫球蛋白轻链恒定区上游插入一个或多个人源Vλ和Jλ基因区段，(b)在非人源免疫球蛋白重链恒定区上游插入一个或多个人源VH、一个或多个人源DH以及一个或多个人源JH基因区段，和(c)编码ADAM6蛋白或其功能性片段的核苷酸序列。在一个实施方式中，所述非人源重链和/或轻链恒定区是小鼠恒定区。在一个实施方式中，所述非人源重链和/或轻链恒定区是大鼠恒定区。在一个实施方式中，所述非人源重链和/或轻链恒定区是仓鼠恒定区。

[0452] 在一个实施方式中，编码ADAM6蛋白或其功能性片段的核苷酸序列在所述细胞和/或组织中是异位的。在一个实施方式中，编码ADAM6蛋白或其功能性片段的核苷酸序列存在于与野生型非人源ADAM6基因座相同的位置。在一个实施方式中，所述非人源细胞和/或组织来源于小鼠，并且所述核苷酸序列编码小鼠ADAM6蛋白或其功能性片段并存在于异位位置。在一个实施方式中，所述非人源细胞和/或组织来源于小鼠，并且所述核苷酸序列编码小鼠ADAM6蛋白或其功能性片段并存在于免疫球蛋白基因区段中。在一个特定的实施方式中，所述免疫球蛋白基因区段是重链基因区段。在一个实施方式中，内源性重链基因区段的连续序列在非人动物中位于异位，其中位于内源性重链基因区段异位的邻近序列包括在小鼠中(例如在雄性小鼠中)具有功能的ADAM6基因。

[0453] 在一个方面，本申请提供了使用如本申请所描述的非人动物来制备抗原结合蛋白的用途，其中所述非人动物表达(a)抗体，所述抗体包括(i)含有人源Vλ结构域和非人源轻链恒定区的免疫球蛋白轻链，以及(ii)含有人源VH结构域和非人源恒定区的免疫球蛋白重链；以及(b)ADAM6蛋白或其功能性片段。在一个实施方式中，所述抗原结合蛋白是人源的。在一个实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，并且所述非人源恒定区是啮齿动物恒定区。在一个特定的实施方式中，所述啮齿动物是小鼠。

[0454] 在一个方面，本申请提供了一种来源于如本申请所描述的非人动物的非人源细胞或组织。在一个实施方式中，所述非人源细胞或组织包括与非人源免疫球蛋白轻链恒定区基因邻近的一个或多个人源免疫球蛋白Vλ基因区段和至少一个人源免疫球蛋白Jλ基因区段，以及与非人源免疫球蛋白重链恒定区基因邻近的一个或多个人源VH、一个或多个人源DH和一个或多个人源JH基因区段，其中所述细胞或组织表达ADAM6蛋白或其功能性片段。在一个实施方式中，所述非人源轻链恒定区基因是小鼠Cκ或小鼠Cλ。

[0455] 在一个实施方式中，编码ADAM6蛋白或其功能性片段的核苷酸序列是异位的。在一个实施方式中，编码ADAM6蛋白或其功能性片段的核苷酸序列的位置与野生型非人源细胞的位置相同。在各种实施方式中，所述非人源细胞是小鼠B细胞。在各种实施方式中，所述非人源细胞是胚胎干细胞。

[0456] 在一个实施方式中，所述组织来源于非人动物的脾脏、骨髓或淋巴结。

[0457] 在一个方面，本申请提供了使用来源于如本申请所描述的非人动物的细胞或组织来制备杂交瘤或四价体杂交瘤的用途。

[0458] 在一个方面，本申请提供了包括如本申请所述经修饰的基因组的非人细胞，其中所述非人细胞是来自如本申请所描述的非人动物的卵母细胞、宿主胚胎或者来自如本申请所描述的非人动物的细胞与来自不同非人动物的细胞的融合。

[0459] 在一个方面，本申请提供了使用来源于如本申请所描述的非人动物的细胞或组织来制备全人源抗体的用途。在一个实施方式中，所述全人源抗体包括分离自如本申请所描述的非人动物的人源VH结构域和人源Vλ结构域。

[0460] 在一个方面，本申请提供了一种用于制备与目标抗原结合的抗体的方法，其中所述方法包括(a)将如本申请所描述的非人动物暴露于目标抗原，(b)从非人动物分离一种或多种B淋巴细胞，其中所述一种或多种B淋巴细胞表达与目标抗原结合的抗体，以及(c)鉴定编码与目标抗原结合的抗体的免疫球蛋白轻链的核酸序列，其中所述免疫球蛋白轻链包括人源Vλ结构域和非人源轻链恒定结构域，以及(d)使用(c)的核酸序列和人源免疫球蛋白轻链恒定区核酸序列来制备与目标抗原结合的人源抗体。

[0461] 在一个实施方式中，所述非人源轻链恒定结构域是小鼠Cκ。在一个实施方式中，所述非人源轻链恒定结构域是小鼠Cλ。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。

[0462] 在一个方面，本申请提供了一种具有生育能力的雄性小鼠，所述小鼠包括在免疫球蛋白重链基因座的修饰，其中所述具有生育能力的小鼠包括在雄性小鼠中具有功能的异位ADAM6序列。

[0463] 在人源化重链小鼠中的异位ADAM6

[0464] 在基因靶向方面的发展，例如在细菌人工染色体(BAC)方面的发展，使得目前能够对相对较大的基因组片段进行重组。BAC工程化使得能够制备较大的缺失以及将较大的插入引入小鼠ES细胞。

[0465] 制备人源抗体的小鼠在过去一段时间内已经能够得到。尽管这代表了在人源治疗性抗体发展中的一个重要的进步，但是这些小鼠显示出多种显著异常，这些异常限制了小鼠的应用性。例如，小鼠显示出B细胞发育受损。所述发育受损可能是由于转基因小鼠与野生型小鼠之间存在的多种差异所致。

[0466] 人源抗体可能无法与小鼠前B细胞或小鼠细胞表面的B细胞受体发生最佳的相互作用，所述B细胞受体是在克隆选择过程中针对成熟、增殖或存活的信号。全人源抗体可能无法与小鼠Fc受体系统发生最佳的相互作用；小鼠表达的Fc受体与相应的人源Fc受体并不是一一对应的。最后，多种制备全人源抗体的小鼠不包括所有真正的小鼠序列，例如下游增强子元件和其他基因座控制元件，这些可能是野生型B细胞发育所需的。

[0467] 制备全人源抗体的小鼠通常包括在某种程度上失能的内源性免疫球蛋白基因座，以及将包括可变和恒定免疫球蛋白基因区段的人源转基因引入小鼠基因组中的随机位置。只要内源性基因座充分失能使得无法重排基因区段以形成功能性免疫球蛋白基因，那么在这种小鼠中制备全人源抗体的目标就能够实现——尽管B细胞的发育受损。

[0468] 尽管不得不从人源转基因的基因座制备全人源抗体，但是在小鼠中产生人源抗体显然是一个困难的过程。在一些小鼠中，该过程非常困难，使得无法通过反式转换的机制来形成嵌合的人源可变/小鼠恒定重链(而非轻链)。通过这种机制，编码全人源抗体的转录经历由人源同种型向小鼠同种型的反式形式同种型转换。该过程是反式的，因为全人源转基因的位置远离保留了未受损的小鼠重链恒定区基因拷贝的内源性基因座。尽管在这种小鼠中反式转换是显而易见的，但是这个现象仍不足以挽救B细胞的发育，B细胞的发育仍然明显受损。在任何情况下，因为反式转换现象显然不针对轻链发生，所以在这种小鼠中制备的反式转换抗体均保留全人源轻链；假定反式转换依靠在正常同种型顺式转换中使用的内源性基因座中(尽管不同)的转换序列。因此，即使当经过工程改造以制备全人源抗体的小鼠选择反式转换机制来制备具有小鼠恒定区的抗体时，该策略仍不足以挽救正常的B细胞发育。

[0469] 在发展基于抗体的人用疗法时，首要关注的是制备具有足够大量多样性的人源免疫球蛋白可变区序列以鉴定有用的可变结构域，所述可变结构域特异性识别特定表位并以所需的亲和性(通常但并不总是较高的亲和性)与其结合。在开发 小鼠(本申请所述)以前，没有迹象表明表达人源可变区和小鼠恒定区的小鼠将与制备来自转基因的人源抗体的小鼠显示出任何显著的差异。然而，这种假设是不正确的。

[0470] 小鼠在内源性小鼠基因座上含有人源免疫球蛋白可变区对小鼠免疫球蛋白可变区的精确取代，所述 小鼠在B细胞发育
方面显示出与野生型小鼠的令人吃惊的和显著的相似性。在一项令人吃惊和惊叹的
研发中， 小鼠针对免疫接种显示出基本正常的野生型应答，所述
小鼠与野生型小鼠仅有的一个显著差异是其响应免疫接种产生的可
变区是全人源的。

[0471] 小鼠在内源性基因座上含有使用相应的人源免疫球蛋白可变区来精确地、大规模地取代生殖细胞系中小鼠免疫球蛋白重链(IgH)和免疫球蛋白轻链(例如κ轻链，Igκ)的可变区。总的来说，小鼠基因座的约6百万个碱基被人源基因组序列的约1.5百万个碱基取代。这种精确的取代使得在小鼠中具有杂交的免疫球蛋白基因座，所述基因座产生具有人源可变区和小鼠恒定区的重链和轻链。小鼠VH-DH-JH和Vκ-Jκ区段的精确取代保留了在杂交免疫球蛋白基因座翼侧小鼠序列的完好性和功能性。所述小鼠体液免疫系统的功能与野生型小鼠类似。B细胞发育在全部重要方面都没有受到阻碍，并且在受到抗原攻击后，在所述小鼠中产生丰度多样的人源可变区。

[0472] 小鼠是可能的，因为在人和小鼠中重链和κ轻链免疫球蛋白基因区段的重排是类似的，但这并不是说它们的基因座是相同的或者甚至是接近的，因为显然不是这样的。然而，所述基因座是足够相似的，能够通过使用基本上覆盖人源免疫球蛋白基因座等价序列的约1百万个碱基的连续的人源基因组序列来取代含有全部VH、DH和JH基因区段的约3百万个碱基对的连续的小鼠序列，从而实现重链可变基因座的人源化。

[0473] 在一些实施方式中，进一步使用人源基因序列取代某些小鼠的恒定区基因序列(例如使用人源CH1序列取代小鼠CH1序列，和使用人源CL序列取代小鼠CL序列)使得产生具有杂交免疫球蛋白基因座的小鼠，所述基因座制备具有人源可变区和部分人源恒定区的抗体，所述抗体适于例如制备全人源抗体片段例如全人源Fab。具有杂交免疫球蛋白基因座的小鼠显示出正常的可变基因区段重排，正常的体细胞高频突变和正常的类别转换。这些小鼠显示出与野生型小鼠无法区分的体液免疫系统，并且显示出在所有B细胞发育阶段都正常的细胞群和正常的淋巴器官结构——即使是缺乏全人源可变区基因区段库的小鼠也是如此。对这些小鼠进行免疫产生强的体液应答，所述体液应答显示出可变基因区段用途的广泛的多样性。

[0474] 小鼠生殖细胞系可变区基因区段的精确取代使得可以制备出具有部分人源免疫球蛋白基因座的小鼠。由于所述部分人源免疫球蛋白基因座正常地重排、高频突变和类别转换，因而所述部分人源免疫球蛋白基因座在小鼠中产生包括人源可变区的抗体。可以对编码所述可变区的核苷酸序列进行鉴定和克隆，然后与所选择的任意序列(例如适于特定用途的任意免疫球蛋白同种型)融合(例如在体外系统中)，以产生全部来源于人源序列的抗体或抗原结合蛋白。

[0475] 通过使用重组工程方法来大规模人源化修饰小鼠胚胎干(ES)细胞，以使用含有一些或基本上全部人源VH、DH和JH基因区段的达1百万个碱基的人源基因组序列的等价基因区段来精确取代包括基本上全部小鼠VH、DH和JH基因区段的达3百万个碱基的小鼠重链免疫球蛋白基因座。使用包含编码基本上全部人源Vκ和Jκ基因区段的两个重复之一的达0.5百万个碱基的人源基因组区段来取代包含基本上全部小鼠Vκ和Jκ基因区段的3百万个碱基的小鼠免疫球蛋白κ轻链基因座的区段。

[0476] 具有这种取代的免疫球蛋白基因座的小鼠可以包括内源性小鼠ADAM6基因座的破坏或缺失，所述基因座正常出现在小鼠免疫球蛋白重链基因座的3’-端VH基因区段和5’-端DH基因区段之间。该区域的破坏能够导致内源性小鼠ADAM6基因座功能的降低或消除。如果在该取代中使用人源重链库的3’-端VH基因区段，则在这些VH基因区段之间即人源VH1-2和VH1-6之间存在含有似乎是人源ADAM6假基因的假基因的基因间区。然而，包括这种人源基因间序列的雄性小鼠显示出生育能力的降低。

[0477] 本申请描述了一种包括如上文所述经取代的基因座的小鼠，并且所述小鼠还包括编码小鼠ADAM6的异位核酸序列，其中所述小鼠显示出基本正常的生育能力。在一个实施方式中，所述异位核酸序列包括在经修饰的内源性重链基因座人源VH1-2基因区段和人源VH6-1基因区段之间的小鼠ADAM6a和/或小鼠ADAM6b序列或其功能性片段。在一个实施方式中，所述异位核酸序列是位于经修饰的内源性重链基因座的人源VH1-2和VH1-6之间的SEQ ID NO:3。SEQ ID NO:3所示的ADAM6基因的转录方向与其周围人源VH基因区段的转录方向相反。尽管本申请中的实施例显示了通过取代所示的人源VH基因区段之间的异位序列来挽救生育能力，但是本领域技术人员将理解在小鼠基因组中(或者甚至染色体外)任意适宜的可转录的基因座的异位序列的取代均预期在雄性小鼠中可相似地挽救生育能力。

[0478] 使用包括小鼠ADAM6a基因或者其直系同源物或同源物或功能性片段的异位序列来补足缺乏功能性ADAM6基因座的小鼠，这一现象是适用于挽救具有无功能或仅有极低功能的内源性ADAM6基因座的任意小鼠的通常方法。因此，能够使用本发明的组合物和方法来挽救包括免疫球蛋白重链基因座的破坏ADAM6的修饰的大量小鼠。因此，本发明包括具有损坏内源性ADAM6功能的多种免疫球蛋白重链基因座修饰的小鼠。在本说明书中提供了一些(非限制性的)例子。除了所描述的 小鼠以外，与ADAM6有关的所述组合物和方法可以用于很多种应用，例如以多种方式修饰重链基因座。

[0479] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括编码功能性ADAM6蛋白(或者其直系同源物或同源物或功能性片段)的异位ADAM6序列，使用一个或多个人源VH基因区段取代全部或基本上全部小鼠VH基因区段，使用人源DH和人源JH基因区段取代全部或基本上全部小鼠DH基因区段和JH基因区段；其中所述小鼠缺乏CH1和/或铰链区。在一个实施方式中，所述小鼠制备的单一可变结构域结合蛋白是选自下述的免疫球蛋白链的二聚体：(a)人源VH–小鼠CH1–小鼠CH2–小鼠CH3；(b)人源VH–小鼠铰链–小鼠CH2–小鼠CH3；和(c)人源VH–小鼠CH2–小鼠CH3。

[0480] 在一个方面，挽救生育能力的核苷酸序列位于小鼠中的人源免疫球蛋白重链可变区序列中(例如在人源VH1-2和VH1-6基因区段之间)，所述小鼠具有一个或多个小鼠免疫球蛋白重链可变基因区段(mVH、mDH和/或mJH)被一个或多个人源免疫球蛋白重链可变基因区段(hVH、hDH和/或hJH)取代，并且所述小鼠还包括一个或多个小鼠免疫球蛋白κ轻链可变基因区段(mVκ和/或mJκ)被一个或多个人源免疫球蛋白κ轻链可变基因区段(hVκ和/或hJκ)取代。在一个实施方式中，所述核苷酸序列位于 小鼠中的人源VH1-2基因区段和人源VH1-6基因区段之间(US6,596,541和US 7,105,348，其通过引用并入本申请)。在一个实施方式中，这样修饰的 小鼠包括使用
全部或基本上全部人源免疫球蛋白重链可变基因区段(全部hVH、hDH和hJH)和全部或基本上全部人源免疫球蛋白κ轻链可变基因区段(hVκ和hJκ)的取代。

[0481] 在一个实施方式中，所述一个或多个小鼠免疫球蛋白重链可变基因区段包括约3百万个碱基的小鼠免疫球蛋白重链基因座。在一个实施方式中，所述一个或多个小鼠免疫球蛋白重链可变基因区段包括小鼠免疫球蛋白重链基因座的至少89个VH基因区段、至少13个DH基因区段、至少4个JH基因区段或其组合。在一个实施方式中，所述一个或多个人源免疫球蛋白重链可变基因区段包括1百万个碱基的人源免疫球蛋白重链基因座。在一个实施方式中，所述一个或多个人源免疫球蛋白重链可变基因区段包括人源免疫球蛋白重链基因座的至少80个VH基因区段、至少27个DH基因区段、至少6个JH基因区段或其组合。

[0482] 在一个实施方式中，所述一个或多个小鼠免疫球蛋白κ轻链可变基因区段包括约3百万个碱基的小鼠免疫球蛋白κ轻链基因座。在一个实施方式中，所述一个或多个小鼠免疫球蛋白κ轻链可变基因区段包括小鼠免疫球蛋白κ轻链基因座的至少137个Vκ基因区段、至少5个Jκ基因区段或其组合。在一个实施方式中，所述一个或多个人源免疫球蛋白κ轻链可变基因区段包括约0.5百万个碱基的人源免疫球蛋白κ轻链基因座。在一个特定的实施方式中，所述一个或多个人源免疫球蛋白κ轻链可变基因区段包括人源免疫球蛋白κ轻链基因座的近端重复(相对于免疫球蛋白κ恒定区)。在一个实施方式中，所述一个或多个人源免疫球蛋白κ轻链可变基因区段包括人源免疫球蛋白κ轻链基因座的至少40个Vκ基因区段、至少5个Jκ基因区段或其组合。

[0483] 在一个实施方式中，所述核苷酸序列位于两个人源免疫球蛋白基因区段之间。在一个特定的实施方式中，所述两个人源免疫球蛋白基因区段是重链基因区段。

[0484] 在一个方面，功能性小鼠ADAM6基因座(或者其直系同源物或同源物或功能性片段)存在于内源性小鼠重链可变区基因座的小鼠基因区段中间，所述基因座不能重排以编码包含内源性重链恒定区的功能性重链。在一个实施方式中，所述内源性小鼠重链基因座包括至少1个到至多89个VH基因区段、至少1个到至多13个DH基因区段、至少1个到至多4个JH基因区段及其组合。在各种实施方式中，功能性小鼠ADAM6基因座(或者其直系同源物或同源物或功能性片段)编码在小鼠中具有功能的一个或多个ADAM6蛋白，其中所述一个或多个ADAM6蛋白包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或其组合。

[0485] 在一个方面，功能性小鼠ADAM6基因座(或者其直系同源物或同源物或功能性片段)存在于人源VH基因区段中间，所述人源VH基因区段取代了内源性小鼠VH基因区段。在一个实施方式中，至少89个小鼠VH基因区段被除去并且使用一个或多个人源VH基因区段取代，并且所述小鼠ADAM6基因座位于与人源VH基因区段的3’端紧邻，或者在两个人源VH基因区段之间。在一个特定的实施方式中，所述小鼠ADAM6基因座存在于插入的人源VH基因区段3’末端的约20千碱基(kb)至约40千碱基(kb)中的两个VH基因区段之间。在一个特定的实施方式中，所述小鼠ADAM6基因座存在于插入的人源VH基因区段3’末端的约29kb至约31kb中的两个VH基因区段之间。在一个特定的实施方式中，所述小鼠ADAM6基因座存在于插入的人源VH基因区段3’末端约30kb中。在一个特定的实施方式中，所述小鼠ADAM6基因座存在于插入的人源VH基因区段3’末端约30,184bp中。在一个特定的实施方式中，所述取代包括人源VH基因区段VH1-2和VH6-1，并且所述小鼠ADAM6基因座存在于VH1-2基因区段的下游和VH6-1基因区段的上游。在一个特定的实施方式中，所述小鼠ADAM6基因座存在于人源VH1-2基因区段和人源VH6-1基因区段之间，其中所述小鼠ADAM6基因座的5’末端距人源VH1-2基因区段3’末端约13,848bp，并且所述ADAM6基因座的3’末端距人源VH6-1基因区段5’末端约29,737bp。在一个特定的实施方式中，所述小鼠ADAM6基因座包括在小鼠细胞中赋予ADAM6功能的SEQ ID NO:3或其片段。在一个特定的实施方式中，然后重排的人源VH基因区段如下(相对于人源VH基因区段的转录方向从上游至下游)：人源VH1-2–小鼠ADAM6基因座–人源VH6-1。在一个特定的实施方式中，在人源VH1-2和人源VH6-1之间的ADAM6假基因被小鼠ADAM6基因座取代。在一个实施方式中，与人源VH基因区段的方向相比，小鼠ADAM6基因座的一个或多个小鼠ADAM6a和小鼠ADAM6b的转录方向是相反的。或者，所述小鼠ADAM6基因座存在于3’-端人源VH基因区段和5’-端DH基因区段之间的基因间区。无论所述5’-端DH区段是小鼠的还是人源的，都可以是这样的情况。

[0486] 类似地，可以修饰一种小鼠，所述小鼠具有用一个或多个人源VL基因区段(例如Vκ或Vλ区段)来取代全部或基本上全部内源性小鼠VH基因区段的修饰，以使得例如通过使用具有包括小鼠ADAM6基因座或其功能性片段的下游同源臂的靶向载体来维持如上文所描述的内源性小鼠ADAM6基因座，或者使用位于两个人源VL基因区段之间或者人源VL基因区段和DH基因区段(人源或小鼠，例如Vλ+m/hDH)或J基因区段(人源或小鼠，例如Vκ+JH)之间的异位序列来取代受损的小鼠ADAM6基因座。在一个实施方式中，所述取代包括两个或多个人源VL基因区段，并且所述小鼠ADAM6基因座或其功能性片段存在于两个3’-端VL基因区段之间。在一个特定的实施方式中，人源VL基因区段的重排如下(相对于人源基因区段的转录方向从上游至下游)：人源VL3’-1–小鼠ADAM6基因座–人源VL3’。
在一个实施方式中，与人源VL基因区段的方向相比，小鼠ADAM6基因座的一个或多个小鼠ADAM6a和小鼠ADAM6b的转录方向是相反的。或者，所述小鼠ADAM6基因座存在于3’-端人源VL基因区段和5’-端DH基因区段之间的基因间区。无论所述5’-端DH区段是小鼠的还是人源的，都可以是这样的情况。

[0487] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠具有一个或多个内源性小鼠VH基因区段的取代，并且所述小鼠包括至少一个内源性小鼠DH基因区段。在这样的小鼠中，内源性小鼠VH基因区段的修饰可以包括一个或多个3’-端VH基因区段而不是5’-端DH基因区段的修饰，在此处已经多加谨慎以使得一个或多个3’-端VH基因区段的修饰不会破坏内源性小鼠ADAM6基因座或使得内源性小鼠ADAM6基因座不具有功能。例如，在一个实施方式中，所述小鼠包括使用一个或多个人源VH基因区段来取代全部或基本上全部的内源性小鼠VH基因区段，并且所述小鼠包括一个或多个内源性DH基因区段和功能性内源性小鼠ADAM6基因座。

[0488] 在另一个实施方式中，所述小鼠包括内源性小鼠3’-端VH基因区段的修饰，以及一个或多个内源性小鼠DH基因区段的修饰，并且实施所述修饰以维持内源性小鼠ADAM6基因座的完整性，使得达到使所述内源性ADAM6基因座维持功能性的程度。在一个例子中，这种修饰是分两步进行的：(1)使用一个或多个人源VH基因区段取代3’-端内源性小鼠VH基因区段，所述人源VH基因区段使用具有上游同源臂和下游同源臂的靶向载体，其中所述下游同源臂包括全部或部分功能性的小鼠ADAM6基因座；(2)然后使用具有上游同源臂的靶向载体来取代内源性小鼠DH基因区段，所述上游同源臂包括小鼠ADAM6基因座的全部或功能性部分。

[0489] 在各种方面，使用含有编码小鼠ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物或功能性同源物的异位序列的小鼠是有用的，该修饰破坏内源性小鼠ADAM6的功能。当对小鼠免疫球蛋白基因座进行修饰时，特别是当对小鼠免疫球蛋白重链可变区及其周围序列进行修饰时，破坏内源性小鼠ADAM6功能的概率较高。因此，当制备具有免疫球蛋白重链基因座全部或部分缺失，全部或部分人源化，或者全部或部分被取代(例如使用Vκ或Vλ序列)的小鼠时，这种小鼠提供了特别的益处。制备用于对下文所描述的小鼠进行所述基因修饰的方法是本领域技术人员所公知的。

[0490] 含有编码小鼠ADAM6蛋白或者与赋予生育能力益处的小鼠ADAM6蛋白基本相同或相似的蛋白的小鼠，在破坏或缺失内源性小鼠ADAM6序列的小鼠免疫球蛋白重链可变基因座的修饰方面特别有用。尽管主要描述了表达具有人源可变区和小鼠恒定区的抗体的小鼠，但是这种小鼠在破坏内源性小鼠ADAM6基因的任何基因修饰中均是有用的。本领域技术人员将理解这包含了多种多样的基因修饰小鼠，所述小鼠含有小鼠免疫球蛋白重链可变基因座的修饰。这些包括例如不管其他修饰，具有全部或部分小鼠免疫球蛋白重链基因区段缺失或取代的小鼠。非限制性的例子如下文所述。

[0491] 在一些方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠，所述小鼠包括在小鼠中具有功能的异位的小鼠、啮齿动物或其他ADAM6基因(或者其直系同源物或同源物或片段)，以及一个或多个人源免疫球蛋白可变和/或恒定区基因区段。在各种实施方式中，在小鼠中具有功能的其他ADAM6基因直系同源物或同源物或片段可以包括来自牛、犬、灵长类、家兔或其他非人源序列的序列。

[0492] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括编码功能性ADAM6蛋白的异位ADAM6序列，使用一个或多个人源VH基因区段取代全部或基本上全部的小鼠VH基因区段；使用一个或多个人源DH基因区段取代全部或基本上全部的小鼠DH基因区段；以及使用一个或多个人源JH基因区段取代全部或基本上全部的小鼠JH基因区段。

[0493] 在一个实施方式中，所述小鼠还包括使用人源CH1核苷酸序列取代小鼠CH1核苷酸序列。在一个实施方式中，所述小鼠还包括使用人源铰链核苷酸序列取代小鼠铰链核苷酸序列。在一个实施方式中，所述小鼠还包括使用人源免疫球蛋白轻链可变基因座取代免疫球蛋白轻链可变基因座(VL和JL)。在一个实施方式中，所述小鼠还包括使用人源免疫球蛋白轻链恒定区核苷酸序列取代小鼠免疫球蛋白轻链恒定区核苷酸序列。在一个特定的实施方式中，所述VL、JL和CL是免疫球蛋白κ轻链序列。在一个特定的实施方式中，所述小鼠包括与人源铰链和人源CH1序列融合的小鼠CH2和小鼠CH3免疫球蛋白恒定区序列，这样所述小鼠的免疫球蛋白基因座重排以形成编码结合蛋白的基因，所述结合蛋白包括(a)具有人源可变区、人源CH1区、人源铰链区以及小鼠CH2和小鼠CH3区的重链；和(b)编码包括人源可变结构域和人源恒定区的免疫球蛋白轻链的基因。

[0494] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括编码功能性ADAM6蛋白的异位ADAM6序列，使用一个或多个人源VL基因区段取代全部或基本上全部的小鼠VH基因区段，以及任选地使用一个或多个人源DH基因区段和/或人源JH基因区段取代全部或基本上全部的DH基因区段和/或JH基因区段，或者任选地使用一个或多个人源JL基因区段取代全部或基本上全部的DH基因区段和JH基因区段。

[0495] 在一个实施方式中，所述小鼠包括使用一个或多个VL、一个或多个DH和一个或多个J基因区段(例如Jκ或Jλ)取代全部或基本上全部的小鼠VH、DH和JH基因区段，其中所述基因区段与内源性小鼠铰链区任选地连接，其中所述小鼠形成重排的免疫球蛋白链基因，所述基因从5’至3’的转录方向含有：人源VL–人源或小鼠DH–人源或小鼠J–小鼠铰链–小鼠CH2–小鼠CH3。在一个实施方式中，所述J区是人源Jκ区。在一个实施方式中，所述J区是人源JH区。在一个实施方式中，所述J区是人源Jλ区。在一个实施方式中，所述人源VL区选自人源Vλ区和人源Vκ区。

[0496] 在特定实施方式中，所述小鼠表达具有小鼠或人源恒定区和可变区的单一可变结构域抗体，所述可变区来源于人源Vκ、人源DH和人源Jκ；人源Vκ、人源DH和人源JH；人源Vλ、人源DH和人源Jλ；人源Vλ、人源DH和人源JH；人源Vκ、人源DH和人源Jλ；人源Vλ、人源DH和人源Jκ。在特定实施方式中，对重组识别序列进行修饰，以使得能够在所述的V、D和J基因区段之间或者在所述的V和J基因区段之间产生多产的重排。

[0497] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括编码功能性ADAM6蛋白(或者其直系同源物或同源物或功能性片段)的异位ADAM6序列，使用一个或多个人源VL基因区段取代全部或基本上全部小鼠VH基因区段，使用人源JL基因区段取代全部或基本上全部小鼠DH基因区段和JH基因区段；其中所述小鼠缺乏CH1和/或铰链区。

[0498] 在一个实施方式中，所述小鼠缺乏编码CH1结构域的序列。在一个实施方式中，所述小鼠缺乏编码铰链区的序列。在一个实施方式中，所述小鼠缺乏编码CH1结构域和铰链区的序列。

[0499] 在一个特定的实施方式中，所述小鼠表达包括人源免疫球蛋白轻链可变结构域(λ或κ)的结合蛋白，所述轻链可变结构域与同小鼠CH3结构域连接的小鼠CH2结构域融合。

[0500] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括编码功能性ADAM6蛋白(或者其直系同源物或同源物或功能性片段)的异位ADAM6序列，使用一个或多个人源VL基因区段取代全部或基本上全部小鼠VH基因区段，使用人源JL基因区段取代全部或基本上全部小鼠DH和JH基因区段。

[0501] 在一个实施方式中，所述小鼠包括编码CH1区、铰链区、CH1和铰链区、或者CH1区和铰链区和CH2区的免疫球蛋白重链恒定区基因序列的缺失。

[0502] 在一个实施方式中，所述小鼠制备单一可变结构域结合蛋白，所述结合蛋白包括选自下述的同源二聚体：(a)人源VL–小鼠CH1–小鼠CH2–小鼠CH3；(b)人源VL–小鼠铰链–小鼠CH2–小鼠CH3；(c)人源VL–小鼠CH2–小鼠CH3。

[0503] 在一个方面，本申请提供了一种具有失能的内源性重链免疫球蛋白基因座的小鼠，所述小鼠包括失能的或缺失的内源性小鼠ADAM6基因座，其中所述小鼠包括表达人源或小鼠或人源/小鼠或其他嵌合抗体的核酸序列。在一个实施方式中，所述核酸序列存在于随机整合至小鼠的基因组的经整合的转基因上。在一个实施方式中，所述核酸序列在野生型小鼠中不存在的游离基因(例如染色体)上。

[0504] 在一个实施方式中，所述小鼠还包括失能的内源性免疫球蛋白轻链基因座。在一个特定的实施方式中，所述内源性免疫球蛋白轻链基因座选自κ和λ轻链基因座。在一个特定的实施方式中，所述小鼠包括失能的内源性κ轻链基因座和失能的λ轻链基因座，其中所述小鼠表达包括人源免疫球蛋白重链可变结构域和人源免疫球蛋白轻链结构域的抗体。在一个实施方式中，所述人源免疫球蛋白轻链结构域选自人源κ轻链结构域和人源λ轻链结构域。在一个特定的实施方式中，所述小鼠包括失能的内源性κ轻链基因座，其中所述小鼠表达抗体，所述抗体包括人源/小鼠(即人源可变/小鼠恒定)免疫球蛋白重链和含有人源Vλ结构域的人源/小鼠免疫球蛋白轻链。在一个实施方式中，所述人源/小鼠免疫球蛋白轻链包括小鼠Cκ。在一个实施方式中，所述人源/小鼠免疫球蛋白轻链包括小鼠Cλ。在一个特定的实施方式中，所述小鼠Cλ是Cλ2。

[0505] 在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的动物，所述动物表达嵌合抗体并且表达在基因修饰的动物中具有功能的ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物。

[0506] 在一个实施方式中，所述基因修饰的动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物是小鼠，并且所述ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物来源于与基因修饰的动物不同品系的小鼠品系。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物是仓鼠科啮齿动物(例如仓鼠、新世界大鼠或小鼠、田鼠)，并且所述ADAM6蛋白直系同源物或同源物来自鼠科啮齿动物(例如真小鼠或大鼠、沙鼠、多刺小鼠、黄冠鼠)。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物是鼠科啮齿动物，并且所述ADAM6蛋白直系同源物或同源物来自仓鼠科啮齿动物。

[0507] 在一个实施方式中，嵌合抗体包括人源可变结构域和啮齿动物的恒定区序列。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自仓鼠科啮齿动物和鼠科啮齿动物。在一个特定的实施方式中，所述仓鼠科和所述鼠科啮齿动物是小鼠。在一个特定的实施方式中，所述仓鼠科和所述鼠科啮齿动物是大鼠。在一个实施方式中，嵌合抗体包括人源可变结构域以及来自选自小鼠或大鼠的动物的恒定结构域；在一个特定的实施方式中，所述小鼠或大鼠选自仓鼠科和鼠科。在一个实施方式中，嵌合抗体包括人源重链可变结构域、人源轻链可变结构域以及来源于选自小鼠和大鼠的啮齿动物的恒定区序列，其中所述人源重链可变结构域和人源轻链是同源的。在一个特定的实施方式中，同源包括来自单一B细胞的人源重链和人源轻链可变结构域，所述B细胞同时表达人源轻链可变结构域和人源重链可变结构域并且所述可变结构域均存在于单个B细胞的表面上。

[0508] 在一个实施方式中，嵌合抗体由免疫球蛋白基因座表达。在一个实施方式中，嵌合抗体的重链可变结构域由重排的内源性免疫球蛋白重链基因座表达。在一个实施方式中，嵌合抗体的轻链可变结构域由重排的内源性免疫球蛋白轻链基因座表达。在一个实施方式中，嵌合抗体的重链可变结构域和/或嵌合抗体的轻链可变结构域由重排的转基因(例如来源于未经重排的核酸序列的重排的核酸序列，所述未经重排的核酸序列在不同于内源性免疫球蛋白基因座的基因座上整合至动物基因组)表达。在一个实施方式中，嵌合抗体的轻链可变结构域由重排的转基因(例如来源于未经重排的核酸序列的重排的核酸序列，所述未经重排的核酸序列在不同于内源性免疫球蛋白基因座的基因座上整合至动物基因组)表达。

[0509] 在一个特定的实施方式中，所述转基因由转录活化的基因座表达，所述基因座例如ROSA26基因座，例如鼠源性(如小鼠)ROSA26基因座。

[0510] 在一个方面，本申请提供了一种非人动物，所述非人动物包括人源化的免疫球蛋白重链基因座，其中所述人源化的免疫球蛋白重链基因座包括非人源的ADAM6序列或者其直系同源物或同源物。

[0511] 在一个实施方式中，所述非人动物是选自小鼠、大鼠和仓鼠的啮齿动物。

[0512] 在一个实施方式中，所述非人动物ADAM6直系同源物或同源物是与小鼠ADAM6序列直系同源和/或同源的序列，其中所述直系同源物或同源物在非人动物中具有功能。

[0513] 在一个实施方式中，所述非人动物选自小鼠、大鼠和仓鼠，并且所述ADAM6直系同源物或同源物来自选自小鼠、大鼠和仓鼠的非人动物。在一个特定的实施方式中，所述非人动物是小鼠，并且所述ADAM6直系同源物或同源物来自选自不同小鼠物种、大鼠和仓鼠的动物。在特定的实施方式中，所述非人动物是大鼠，并且所述ADAM6直系同源物或同源物来自选自不同大鼠物种、小鼠和仓鼠的啮齿动物。在一个特定的实施方式中，所述非人动物是仓鼠，并且所述ADAM6直系同源物或同源物来自选自不同仓鼠物种、小鼠和大鼠的啮齿动物。

[0514] 在一个特定的实施方式中，所述非人动物来自鼠形亚目(Myomorpha)，并且所述ADAM6序列来自选自跳鼠总科(Dipodoidea)的啮齿动物和鼠总科(Muroidea)的啮齿动物的动物。在一个特定的实施方式中，所述啮齿动物是鼠总科中的小鼠，并且所述ADAM6直系同源物或同源物来自鼠总科中的小鼠或大鼠或仓鼠。

[0515] 在一个实施方式中，所述人源化重链基因座包括一个或多个人源VH基因区段、一个或多个人源DH基因区段和一个或多个人源JH基因区段。在一个特定的实施方式中，所述一个或多个人源VH基因区段、一个或多个人源DH基因区段和一个或多个人源JH基因区段与一个或多个人源、嵌合和/或啮齿动物(例如小鼠或大鼠)恒定区基因任选地连接。在一个实施方式中，所述恒定区基因是小鼠的。在一个实施方式中，所述恒定区基因是大鼠的。在一个实施方式中，所述恒定区基因是仓鼠的。在一个实施方式中，所述恒定区基因包括选自铰链、CH2、CH3及其组合的序列。在特定实施方式中，所述恒定区基因包括铰链、CH2和CH3序列。

[0516] 在一个实施方式中，所述非人源ADAM6序列与人源免疫球蛋白重链序列邻近。在一个实施方式中，所述非人源ADAM6序列位于人源免疫球蛋白重链序列中。在一个特定的实施方式中，所述人源免疫球蛋白重链序列包括V、D和/或J基因区段。

[0517] 在一个实施方式中，所述非人源ADAM6序列与V基因区段是毗邻的。在一个实施方式中，所述非人源ADAM6序列位于两个V基因区段之间。在一个实施方式中，所述非人源ADAM6序列在V和D基因区段之间是毗邻的。在一个实施方式中，所述小鼠ADAM6序列位于V和J基因区段之间。在一个实施方式中，所述小鼠ADAM6序列在D和J基因区段之间是毗邻的。

[0518] 在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的非人动物，所述动物包括表达与来自免疫球蛋白基因座的人源VL结构域同源的人源VH结构域的B细胞，其中所述非人动物表达来自免疫球蛋白基因座的非免疫球蛋白非人源蛋白。在一个实施方式中，所述非免疫球蛋白非人源蛋白是ADAM蛋白。在一个特定的实施方式中，所述ADAM蛋白是ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物或功能性片段。

[0519] 在一个实施方式中，所述非人动物是啮齿动物(例如小鼠或大鼠)。在一个实施方式中，所述啮齿动物是鼠科的。在一个实施方式中，所述啮齿动物是鼠总科的。在一个特定的实施方式中，所述鼠总科的啮齿动物选自小鼠和大鼠。

[0520] 在一个实施方式中，所述非免疫球蛋白非人源蛋白是啮齿动物蛋白。在一个实施方式中，所述啮齿动物是鼠科的。在一个实施方式中，所述啮齿动物是鼠总科的。在一个特定的实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。

[0521] 在一个实施方式中，所述人源VH和VL结构域直接或通过接头与免疫球蛋白恒定结构域序列连接。在一个特定的实施方式中，所述恒定结构域序列包括选自铰链、CH2、CH3及其组合的序列。在一个特定的实施方式中，所述人源VL结构域选自Vκ或Vλ结构域。

[0522] 在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的非人动物，所述动物在其生殖细胞系中包括人源免疫球蛋白序列，其中所述雄性非人动物的精子的特征是体内迁移缺陷。在一个实施方式中，所述在体内迁移缺陷包括雄性非人动物的精子不能由子宫迁移至相同物种雌性非人动物的输卵管。在一个实施方式中，所述非人动物缺乏编码ADAM6蛋白或其功能性片段的核苷酸序列。在一个特定的实施方式中，所述ADAM6蛋白或其功能性片段包括ADAM6a和/或ADAM6b蛋白或其功能性片段。在一个实施方式中，所述非人动物是啮齿动物。在一个特定的实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。

[0523] 在一个方面，本申请提供了一种非人动物，所述动物包括与编码ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物或功能性片段的非人序列邻近的人源免疫球蛋白序列。在一个实施方式中，所述非人动物是啮齿动物。在一个特定的实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。

[0524] 在一个实施方式中，所述人源免疫球蛋白序列是免疫球蛋白重链序列。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白序列包括一个或多个VH基因区段。在一个实施方式中，所述人源免疫球蛋白序列包括一个或多个DH基因区段。在一个实施方式中，所述人源免疫球蛋白序列包括一个或多个JH基因区段。在一个实施方式中，所述人源免疫球蛋白序列包括一个或多个VH基因区段、一个或多个DH基因区段和一个或多个JH基因区段。

[0525] 在一个实施方式中，所述免疫球蛋白序列包括在天然人源库中具有较高频率的一个或多个VH基因区段。在一个特定的实施方式中，所述一个或多个VH基因区段包括不超过两个VH基因区段、不超过3个VH基因区段、不超过4个VH基因区段、不超过5个VH基因区段、不超过6个VH基因区段、不超过7个VH基因区段、不超过8个VH基因区段、不超过9个VH基因区段、不超过10个VH基因区段、不超过11个VH基因区段、不超过12个VH基因区段、不超过13个VH基因区段、不超过14个VH基因区段、不超过15个VH基因区段、不超过16个VH基因区段、不超过17个VH基因区段、不超过18个VH基因区段、不超过19个VH基因区段、不超过20个VH基因区段、不超过21个VH基因区段、不超过22个VH基因区段或不超过23个VH基因区段。

[0526] 在一个特定的实施方式中，所述一个或多个VH基因区段包括5个VH基因区段。在一个特定的实施方式中，所述一个或多个VH基因区段包括10个VH基因区段。在一个特定的实施方式中，所述一个或多个VH基因区段包括15个VH基因区段。在一个特定的实施方式中，所述一个或多个VH基因区段包括20个VH基因区段。

[0527] 在各种实施方式中，所述VH基因区段选自VH6-1、VH1-2、VH1-3、VH2-5、VH3-7、VH1-8、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH1-18、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH1-24、VH2-26、VH4-28、VH3-30、VH4-31、VH3-33、VH4-34、VH3-35、VH3-38、VH4-39、VH3-43、VH1-45、VH1-46、VH3-48、VH3-49、VH5-51、VH3-53、VH1-58、VH4-59、VH4-61、VH3-64、VH3-66、VH1-69、VH2-70、VH3-72、VH3-73和VH3-74。在各种实施方式中，所述VH基因区段选自VH1-2、VH1-8、VH1-18、VH1-46、VH1-69、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-33、VH3-43、VH3-48、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH5-51和VH6-1。在各种实施方式中，所述VH基因区段选自VH1-18、VH1-46、VH1-69、VH3-7、VH3-11、VH3-15、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-33、VH3-48、VH4-34、VH4-39、VH4-59和VH5-51。在各种实施方式中，所述VH基因区段选自VH1-18、VH1-69、VH3-7、VH3-11、VH3-15、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-43、VH3-48、VH4-39、VH4-59和VH5-51。在各种实施方式中，所述VH基因区段选自VH1-18、VH3-11、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH4-39和VH4-59。在各种实施方式中，所述VH基因区段选自VH1-18、VH3-21、VH3-23、VH3-30和VH4-39。在各种实施方式中，所述VH基因区段选自VH1-18、VH3-23和VH4-39。在各种实施方式中，所述VH基因区段选自VH3-21、VH3-23和VH3-30。在各种实施方式中，所述VH基因区段选自VH3-23、VH3-30和VH4-39。

[0528] 在一个特定的实施方式中，人源免疫球蛋白序列包括至少18个VH基因区段、27个DH基因区段和6个JH基因区段。在一个特定的实施方式中，所述人源免疫球蛋白序列包括至少39个VH基因区段、27个DH基因区段和6个JH基因区段。在一个特定的实施方式中，所述人源免疫球蛋白序列包括至少80个VH基因区段、27个DH基因区段和6个JH基因区段。

[0529] 在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠，并且所述小鼠包括使用一个或多个人源VH基因区段取代内源性小鼠VH基因区段，其中所述人源VH基因区段与小鼠CH区基因可操作地连接，以使得所述小鼠重排所述人源VH基因区段并且表达包括人源VH结构域和小鼠CH的反向嵌合免疫球蛋白重链。在一个实施方式中，90-100％的未经重排的小鼠VH基因区段被至少一个未经重排的人源VH基因区段取代。在一个特定的实施方式中，全部或基本上全部的内源性小鼠VH基因区段被至少一个未经重排的人源VH基因区段取代。在一个实施方式中，所述取代是使用至少19个、至少39个、或者至少80或81个未经重排的人源VH基因区段。在一个实施方式中，所述取代是使用至少12个功能性未经重排的人源VH基因区段、至少25个功能性未经重排的人源VH基因区段或者至少43个功能性未经重排的人源VH基因区段。在一个实施方式中，所述小鼠包括使用至少一个未经重排的人源DH区段和至少一个未经重排的人源JH区段取代全部小鼠DH和JH区段。在一个实施方式中，所述至少一个未经重排的人源DH区段选自1-1、1-7、1-26、2-8、2-15、3-3、3-10、3-16、3-22、5-5、5-12、6-6、6-13、7-27及其组合。在一个实施方式中，所述至少一个未经重排的人源JH区段选自1、2、
3、4、5、6及其组合。在一个特定的实施方式中，所述一个或多个人源VH基因区段选自1-2、
1-8、1-24、1-69、2-5、3-7、3-9、3-11、3-13、3-15、3-20、3-23、3-30、3-33、3-48、3-53、4-31、
4-39、4-59、5-51、6-1人源VH基因区段及其组合。

[0530] 在各种实施方式中，所述人源免疫球蛋白序列是在与非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠、大鼠或仓鼠)生殖细胞系的恒定区的可操作连接中。在一个实施方式中，所述恒定区是人源、嵌合人源/小鼠或嵌合人源/大鼠或嵌合人源/仓鼠、小鼠、大鼠或仓鼠恒定区。在一个实施方式中，所述恒定区是啮齿动物(例如小鼠或大鼠或仓鼠)恒定区。在一个特定的实施方式中，所述啮齿动物是小鼠或大鼠。在各种实施方式中，所述恒定区包括至少CH2结构域和CH3结构域。

[0531] 在一个实施方式中，所述人源免疫球蛋白重链序列位于非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠或仓鼠)生殖细胞系中的免疫球蛋白重链基因座。在一个实施方式中，所述人源免疫球蛋白重链序列位于非人动物生殖细胞系中的非免疫球蛋白重链基因座，其中所述非重链基因座是转录活化的基因座。在一个特定的实施方式中，所述非重链基因座是ROSA26基因座。

[0532] 在各种方面，所述非人动物还包括在非人动物生殖细胞系中的人源免疫球蛋白轻链序列(例如一个或多个未经重排的轻链V和J序列，或者一个或多个重排的VJ序列)。在一个特定的实施方式中，所述免疫球蛋白轻链序列是免疫球蛋白λ轻链序列。在一个实施方式中，所述人源免疫球蛋白轻链序列包括一个或多个Vλ基因区段。在一个实施方式中，所述人源免疫球蛋白轻链序列包括一个或多个Jλ基因区段。在一个实施方式中，所述人源免疫球蛋白轻链序列包括一个或多个Vλ基因区段和一个或多个Jλ基因区段。

[0533] 在一个特定的实施方式中，所述人源免疫球蛋白轻链序列包括至少12个Vλ基因区段和1个Jλ基因区段。在一个特定的实施方式中，所述人源免疫球蛋白轻链序列包括至少12个Vλ基因区段和4个Jλ基因区段。

[0534] 在一个特定的实施方式中，所述人源免疫球蛋白轻链序列包括至少28个Vλ基因区段和1个Jλ基因区段。在一个特定的实施方式中，所述人源免疫球蛋白轻链序列包括至少28个Vλ基因区段和4个Jλ基因区段。

[0535] 在一个特定的实施方式中，所述人源免疫球蛋白轻链序列包括至少40个Vλ基因区段和1个Jλ基因区段。在一个特定的实施方式中，所述人源免疫球蛋白轻链序列包括至少40个Vλ基因区段和4个Jλ基因区段。

[0536] 在各种实施方式中，所述人源免疫球蛋白轻链序列是在与非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠、大鼠或仓鼠)生殖细胞系的恒定区的可操作连接中。在一个实施方式中，所述恒定区是人源、嵌合人源/啮齿动物、小鼠、大鼠或仓鼠恒定区。在一个特定的实施方式中，所述恒定区是小鼠或大鼠恒定区。在一个特定的实施方式中，所述恒定区是小鼠κ恒定(mCκ)区或大鼠κ恒定(rCκ)区。在一个特定的实施方式中，所述恒定区是小鼠λ恒定(mCl)区或大鼠λ恒定(rCλ)区。在一个实施方式中，所述小鼠Cλ区是小鼠Cλ2区。

[0537] 在一个实施方式中，所述人源免疫球蛋白轻链序列位于非人动物生殖细胞系中的免疫球蛋白轻链基因座。在一个特定的实施方式中，在非人动物生殖细胞系中的所述免疫球蛋白轻链基因座是免疫球蛋白κ轻链基因座。在一个特定的实施方式中，在非人动物生殖细胞系中的所述免疫球蛋白轻链基因座是免疫球蛋白λ轻链基因座。在一个实施方式中，所述人源免疫球蛋白轻链序列是转录活化的、位于非人动物生殖细胞系中的非免疫球蛋白轻链基因座。在一个特定的实施方式中，所述非免疫球蛋白基因座是ROSA26基因座。

[0538] 在一个方面，本申请提供了一种制备人源抗体的方法，其中所述人源抗体包括来源于在如本申请所描述的非人动物细胞中由一个或多个可变区核酸序列编码的可变结构域。

[0539] 在一个方面，本申请提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括含有抗体或抗体片段的多肽，所述抗体或抗体片段来源于分离自如本申请所描述的非人动物的一个或多个可变区核酸序列。在一个实施方式中，所述多肽是抗体。在一个实施方式中，所述多肽是仅具有重链的抗体。在一个实施方式中，所述多肽是单链可变片段(例如scFv)。

[0540] 在一个方面，本申请提供了使用如本申请所描述的非人动物制备抗体的用途。在各种实施方式中，所述抗体包括一个或多个可变结构域，所述可变结构域来源于分离自所述非人动物的一个或多个可变区核酸序列。在一个特定的实施方式中，所述可变区核酸序列包括免疫球蛋白重链基因区段。在一个特定的实施方式中，所述可变区核酸序列包括免疫球蛋白轻链基因区段。

[0541] 表达人源λ可变结构域的小鼠

[0542] 包括由于ADAM蛋白活性(例如ADAM6依赖性)丧失导致生育能力降低的修饰的经基因修饰的非人动物(例如小鼠、大鼠等)可以与如本申请所描述的在内源性非人源或(例如转基因)人源恒定轻链基因上包括人源λ可变序列的非人动物交配。例如，将包括ADAM6基因受损(或ADAM6基因缺失)的非人动物如小鼠或大鼠(例如具有人源化免疫球蛋白重链基因座的动物)，与包括轻链基因座(内源性或转基因)的小鼠结合，所述轻链基因座包括与人源或非人源(例如内源性小鼠或大鼠)轻链恒定区基因连接的人源λ区段和JL区段，其中所述非人动物包括恢复ADAM依赖的生育能力的活性。恢复ADAM依赖的生育能力的基因修饰可以在非人动物(例如具有人源化重链的小鼠)中，或者在具有人源化λ可变区段的小鼠中。后代包括形成人源化重链(即造成表达人源重链可变结构域)和人源化轻链基因座(即造成表达与人源或非人源λ或κ区融合的人源λ轻链可变结构域)的基因，其中所述动物显示出与缺乏ADAM6活性或者缺乏ADAM6直系同源物或同源物的活性的小鼠相比增加的生育能力。

[0543] 基因工程改造的小鼠包括在内源性小鼠基因座上使用人源V(D)J基因区段取代未经重排的V(D)J基因区段。 小鼠表达具有人源
可变结构域和小鼠恒定结构域的嵌合抗体(参见例如美国专利号7,605,237)。大多数其他报告涉及表达来自小鼠中全人源转基因的全人源抗体的小鼠，所述小鼠具有已失能的内源性免疫球蛋白基因座。

[0544] 抗体轻链由下面两个独立的基因座之一编码：κ和λ。小鼠抗体轻链主要为κ型。制备小鼠抗体的小鼠和制备全人源或嵌合型人源-小鼠抗体的经修饰的小鼠均显示出对轻链使用的偏好。在人类中也表现出轻链偏好，但是不如在小鼠中明显；在小鼠中κ轻链与λ轻链之比为约95:5，而在人类中该比率为约60:40。在小鼠中更加显著的偏好并不会严重影响抗体的多样性，因为在第一个例子中在小鼠中λ可变基因座并不是非常多样的。而在人类中不是这样的。人源λ轻链基因座是非常多样的。

[0545] 人源λ轻链基因座延续超过1,000kb并且含有超过80个基因，所述基因编码可变(V)或连接(J)区段(图19)。在人源λ轻链基因座中，在所有已观察到的Vλ结构域中半数以上是由基因区段1-40、1-44、2-8、2-14和3-21编码。总之，据信约30个左右的人源Vλ基因区段是功能性的。共有7个Jλ基因区段，认为其中仅有4个是通常具有功能性的Jλ基因区段-Jλ1、Jλ2、Jλ3和Jλ7。

[0546] 在人类中的λ轻链基因座在结构上与小鼠和人源的λ基因座类似，因为在人源λ轻链基因座中具有若干能够重组以形成功能性轻链蛋白的可变区基因区段。人源λ轻链基因座含有约70个V基因区段和7个Jλ-Cλ基因区段对。在这些Jλ-Cλ基因区段对中仅有4个似乎是功能性的。在一些等位基因中，据报道第五个Jλ-Cλ基因区段对是假基因(Cλ6)。所述70个Vλ基因区段似乎含有38个功能性基因区段。所述70个Vλ序列排布在3个簇中，簇全都含有独特的V基因家族群的不同成员(簇A、B和C，图19)。这是用于在非人动物中产生具有人源V区抗体的相对未开发的多样性的潜在丰富来源。

[0547] 与之形成鲜明对比的是，小鼠λ轻链基因座仅含有2或3个(取决于品系)小鼠Vλ区基因区段(图20)。至少因为这个原因，并不认为在小鼠中严重的κ偏好会对总的抗体多样性产生特别的不利影响。

[0548] 根据小鼠λ轻链基因座的已公开的谱图，所述基因座基本上由在约200kb跨距中的两个基因区段簇组成(图20)。这两个簇含有能够独立重排的两个V、J和C基因集合：λ2-Jλ2-Cλ2-Jλ4-Cλ4和Vλ1-Jλ3-Cλ3-Jλ1-Cλ1。尽管已发现Vλ2与所有Jλ基因区段重组，但是Vλ1似乎仅与Cλ1重组。据信Cλ4是具有剪接位点缺陷的假基因。

[0549] 小鼠κ轻链基因座是截然不同的。参与重组事件以便由小鼠κ基因座产生功能性轻链蛋白的基因区段的结构和数量是更加复杂的(图21)。因此，在典型的小鼠中，小鼠λ轻链对抗体群多样性的贡献并不太大。

[0550] 利用小鼠中人源λ轻链基因座丰富的多样性将可能产生除其他方面以外更加完整的人源轻链V结构域库的来源。此前挖掘这种多样性的尝试是使用随机整合至小鼠基因组的含有人源λ轻链基因座块的人源转基因(参见例如US 6,998,514和US7,435,871)。已报道含有这些随机整合的转基因的小鼠表达全人源λ轻链，然而，在一些例子中，一个或两个内源性轻链基因座仍是完好的。这种情况是不理想的，因为在所表达的小鼠抗体库中人源λ轻链序列与小鼠轻链(κ或λ)相竞争。

[0551] 而相反的是，本发明人描述了一种基因修饰的小鼠，所述小鼠能够直接从小鼠轻链基因座(包括通过在内源性小鼠轻链基因座的取代)表达一种或多种λ轻链核酸序列。能够从内源性基因座表达人源λ轻链序列的基因修饰的小鼠可以进一步与包括人源重链基因座的小鼠繁殖，以用于表达包括全人源的V区(重链和轻链)的抗体。在各种实施方式中，V区表达小鼠恒定区。在各种实施方式中，不存在内源性小鼠免疫球蛋白基因区段，并且V区表达人源恒定区。这些抗体在诊断和治疗方面的很多应用中将被证明是有用的。

[0552] 针对在小鼠中表达来源于人源Vλ和Jλ基因区段的结合蛋白的各种实施方式能够实现多种优势。能够通过在内源性轻链基因座(例如小鼠κ或λ基因座)上使用人源λ序列取代来实现优势。使用这种小鼠制备的抗体可以具有轻链，所述轻链包括与小鼠CL区特别是小鼠Cκ或Cλ区融合的人源Vλ结构域。所述小鼠还将表达人源Vλ结构域，所述Vλ结构域适于使用人源CL区特别是Cκ和/或Cλ区的鉴别和克隆。由于在这种小鼠中B细胞发育是正常的，所以可能在Cλ或Cκ区背景下产生相容的Vλ结构域(包括体细胞突变的Vλ结构域)。

[0553] 本申请描述了一种基因修饰的小鼠，所述小鼠包括在免疫球蛋白κ或λ轻链基因座上的未经重排的Vλ基因区段。本申请描述了一种表达抗体的小鼠，所述抗体包括具有与Cκ和/或Cλ区融合的人源Vλ结构域的轻链。

[0554] 在一个方面，本申请描述了一种基因修饰的非人动物，所述动物包括(1)在非人动物的内源性免疫球蛋白轻链基因座上的一个或多个未经重排的人源Vλ基因区段和一个或多个未经重排的人源Jλ基因区段，(2)在非人动物的内源性免疫球蛋白重链基因座上的一个或多个人源VH基因区段、一个或多个人源DH基因区段和一个或多个人源JH基因区段，其中所述非人动物能够表达ADAM6蛋白或其功能性片段，其中所述ADAM6蛋白在雄性非人动物中具有功能。在一个方面，本申请描述了一种基因修饰的非人动物，所述动物表达含有包括人源VH结构域和非人源重链恒定区的重链以及包括人源Vλ结构域和非人源轻链恒定区的轻链的抗体，其中所述非人动物能够表达ADAM6蛋白或其功能性片段。在各种实施方式中，所述非人动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物是小鼠或大鼠。

[0555] 在一个实施方式中，所述非人动物轻链恒定结构域是Cκ或Cλ结构域。在一个实施方式中，所述ADAM6蛋白或其功能性片段是由小鼠生殖细胞系中的异位序列所编码。在一个实施方式中，所述ADAM6蛋白或其功能性片段是由非人动物的内源性序列所编码。

[0556] 在一个实施方式中，所述非人动物的内源性轻链基因座是免疫球蛋白λ轻链基因座。在一个实施方式中，所述非人动物的内源性轻链基因座是免疫球蛋白κ轻链基因座。

[0557] 在一个实施方式中，所述非人动物在内源性轻链基因座上缺乏内源性VL和/或JL基因区段。在一个特定的实施方式中，所述VL和/或JL基因区段是Vκ和/或Jκ基因区段。在一个特定的实施方式中，所述VL和/或JL基因区段是Vλ和/或Jλ基因区段。

[0558] 在一个实施方式中，所述非人动物的VL和JL基因区段被一个或多个人源Vλ和一个或多个人源Jλ基因区段取代。在一个特定的实施方式中，所述非人动物的VL和JL基因区段是κ基因区段。在一个特定的实施方式中，所述非人动物的VL和JL基因区段是λ基因区段。

[0559] 在一个实施方式中，所述一个或多个人源Vλ基因区段来自人源免疫球蛋白λ轻链基因座簇A的片段。在一个特定的实施方式中，所述簇A的片段由人源Vλ3-27延伸至人源Vλ3-1。在一个特定的实施方式中，所述簇A的片段由人源Vλ3-12延伸至人源Jλ1。在一个实施方式中，所述一个或多个人源Vλ基因区段来自人源免疫球蛋白λ轻链基因座簇B的片段。在一个特定的实施方式中，所述簇B的片段由人源Vλ5-52延伸至人源Vλ1-40。在一个特定的实施方式中，所述一个或多个人源Vλ基因区段来自如本申请所描述的人源免疫球蛋白λ轻链基因座的簇A的片段和簇B的片段。

[0560] 在一个实施方式中，所述非人动物包括至少12个人源Vλ基因区段。在一个实施方式中，所述非人动物包括至少28个人源Vλ基因区段。在一个实施方式中，所述非人动物包括至少40个人源Vλ基因区段。

[0561] 在一个实施方式中，所述至少一个人源Jλ基因区段选自下组：Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ7及其组合。

[0562] 在一个方面，本申请提供了一种具有生育能力的非人雄性动物，其中所述具有生育能力的非人动物表达(1)包括人源Vλ结构域或人源Vκ结构域的免疫球蛋白轻链，和(2)包括人源VH结构域的免疫球蛋白重链，其中所述雄性非人动物包括经修饰的重链可变区基因座和在雄性非人动物中具有功能的异位ADAM6基因。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。

[0563] 在一个方面，本申请提供了使用如本申请所描述的非人动物制备抗原结合蛋白的用途。在一个实施方式中，所述抗原结合蛋白是人源的。在一个实施方式中，所述抗原结合蛋白是抗体。在一个实施方式中，所述抗原结合蛋白包括来源于如本申请所描述的非人动物的人源VH结构域和/或人源Vλ结构域。

[0564] 在一个方面，本申请提供了一种来源于如本申请所描述的非人动物的细胞或组织。在一个实施方式中，所述组织来源于脾脏、骨髓或淋巴结。在一个实施方式中，所述细胞是B细胞。在一个实施方式中，所述细胞是胚胎干(ES)细胞。在一个实施方式中，所述细胞是生殖细胞。

[0565] 在一个方面，本申请提供了一种卵母细胞，所述细胞包括如本申请所描述的基因修饰的非人动物的二倍体基因组。

[0566] 免疫球蛋白κ轻链基因座的不育的(sterile)转录本

[0567] 在能够进行这种表达的基因修饰小鼠的各种实施方式反映了在小鼠中表达人源免疫球蛋白λ序列方面的变化。因此，在一些实施方式中，所述基因修饰的小鼠包括某些来自于人源基因座的非编码序列。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠包括在内源性κ轻链基因座上的人源Vλ和Jλ基因区段，并且还包括人源κ轻链基因组片段。在一个特定的实施方式中，所述人源κ轻链基因组片段是天然存在于人源Vκ基因区段和人源Jκ基因区段之间的非编码序列。

[0568] 所述人源和小鼠κ轻链基因座包括编码缺乏起始密码子或开放阅读框架的不育的转录本的序列，并且认为所述序列是调控κ轻链基因座转录的元件。这些不育的转录本由基因间序列产生，所述基因间序列位于最近端Vκ基因区段的下游或3’端和κ轻链内含子增强子(Eκi)的上游或5’端，所述增强子位于κ轻链恒定区基因(Cκ)的上游。所述不育的转录本由所述基因间序列重排产生，以形成同Cκ融合的VκJκ1区段。

[0569] Cκ基因上游的κ轻链基因座的取代将除去编码不育的转录本的基因间区。因此，在各种实施方式中，使用人源λ轻链基因区段取代小鼠Cκ基因上游的小鼠κ轻链序列将产生人源化的小鼠κ轻链基因座，所述小鼠κ轻链基因座含有人源Vλ和Jλ基因区段但不含编码不育的转录本的κ轻链基因间区。

[0570] 如本申请所描述的，使用人源λ轻链基因区段将内源性小鼠κ轻链基因座人源化(其中所述人源化除去基因间区)，使得κ轻链基因座的使用显著降低，并伴有λ轻链的使用显著增加。因此，尽管缺乏所述基因间区的人源化小鼠是有用的，因为所述小鼠能够制备具有人源轻链可变结构域(例如人源λ或κ结构域)的抗体，但是所述基因座的使用减少。

[0571] 本申请还描述了使用与人源κ基因间区的插入偶联的人源Vλ和Jλ基因区段将内源性小鼠κ轻链基因座人源化以形成Vλ基因座，所述Vλ基因座相对于转录方向，在最后一个人源Vλ基因区段和第一个人源Jλ基因区段之间含有κ基因间区；这显示出与缺乏κ基因间区的基因座相比，具有更高表达的B细胞群。这一观察结果与这一假设一致，即基因间区——通过不育的转录本直接地，或间接地——抑制内源性λ轻链基因座的使用。基于这样的假设，包括基因间区将会降低内源性λ轻链基因座的使用，使得小鼠的选择受限只好使用经修饰的(将λ引入κ)基因座以产生抗体。

[0572] 在各种实施方式中，使用人源λ轻链序列取代小鼠Cκ基因上游的小鼠κ轻链序列还包括人源κ轻链基因间区，所述人源κ轻链基因间区在相对于转录方向上，位于3’端Vλ基因区段的3’非翻译区和第一个人源Jλ基因区段的5’端之间。或者，可以通过在内源性λ轻链基因座中进行删除将这种基因间区从取代的内源性κ轻链基因座(小鼠Cκ基因的上游)上除去。同样地，在这种实施方式中，所述小鼠从含有人源λ轻链序列的内源性κ轻链基因座产生抗体。

[0573] 将小鼠工程改造以表达人源Vλ结构域的方法

[0574] 本申请描述了制备基因修饰的小鼠的多种方法，所述小鼠制备含有具有与内源性CL(例如Cκ或Cλ)区融合的人源Vλ结构域的轻链的抗体。将基因修饰描述为，在各种实施方式中，包括一个或两个内源性轻链基因座的缺失。例如，为了从内源性抗体库中去除小鼠λ轻链，可以制备第一Vλ-Jλ-Cλ基因簇的缺失并且通过使用人源Vλ-Jλ基因区段全部或部分取代第二基因簇的Vλ-Jλ基因区段。本申请还提供了用于制备小鼠、小鼠胚胎和细胞的经基因修饰的小鼠胚胎、细胞和靶向构建体。

[0575] 将一个内源性Vλ-Jλ-Cλ基因簇缺失并且使用Vλ-Jλ基因区段取代另一个内源性Vλ-Jλ-Cλ基因簇，对动物中天然抗体恒定区的结合和功能中造成相对最小的破坏，在各种实施方式中，由于内源性Cλ基因保持完好，因此保留了正常的功能和与内源性重链的恒定区结合的能力。因此，在这种实施方式中，对于组装含有两条重链和两条轻链的功能性抗体分子而言，所述修饰不会根据功能性轻链恒定区来影响其他内源性重链恒定区依赖。而且，在各种实施方式中，所述修饰不会影响组装功能性膜结合抗体分子，所述抗体分子含有内源性重链和轻链，例如与小鼠Cλ区连接的hVλ结构域。由于在内源性基因座上保留了至少一个功能性Cλ基因，所以包含使用人源Vλ-Jλ基因区段取代内源性Vλ-Jλ-Cλ基因簇的Vλ-Jλ基因区段的动物，应该能够制备正常的λ轻链，所述λ轻链在免疫应答的过程中能够通过在动物的表达抗体库中存在的人源Vλ-Jλ基因区段来结合抗原。

[0576] 图20中提供了缺失内源性小鼠Vλ-Jλ-Cλ基因簇的示意性说明(未按照比例)。如图所示，小鼠λ轻链基因座被分成两个基因簇，两个基因簇均含有能够重组形成功能性小鼠λ轻链的功能性基因区段。利用在重组位点翼侧具有新霉素表达盒的靶向构建体(靶向载体1)将内源性小鼠Vλ1-Jλ3-Cλ3-Jλ1-Cλ1基因簇缺失。利用在重组位点翼侧具有潮霉素-胸苷激酶表达盒的靶向构建体(靶向载体2)将其他内源性基因簇(Vλ2-Vλ3-Jλ2-Cλ2-Jλ4-Cλ4)部分缺失。在这第二个靶向事件中，Cλ2-Jλ4-Cλ4内源性基因区段被保留。使用与第一个靶向构建体(靶向载体1)中的那些重组位点不同的重组位点来构建第二个靶向构建体(靶向载体2)，以便在成功实现靶向后将选择性表达盒选择性地缺失。因为不能产生内源性λ轻链，所以所得到的双靶向基因座被功能性沉默。
这种经修饰的基因座可以用于插入人源Vλ和Jλ基因区段以形成包括人源Vλ和Jλ基因区段的内源性小鼠λ基因座，从而基于经修饰的基因座的重组，所述动物产生包括与内源性小鼠Cλ基因区段连接的经重排的人源Vλ和Jλ基因区段的λ轻链。

[0577] 基因修饰小鼠使得内源性λ基因区段不具有功能，在各种实施方式中，这造成小鼠显示出在其抗体库中仅具有κ轻链，使得所述小鼠对于评估在免疫应答中λ轻链的作用是有用的，并且对于用于制备包括Vκ结构域但不包括Vλ结构域的抗体库是有用的。

[0578] 可以采用本领域公知的任意方法制备基因修饰的小鼠，所述小鼠表达与已在内源性小鼠λ轻链基因座上重组的小鼠Cλ基因连接的hVλ。图22A中提供了使用人源Vλ和Jλ基因区段取代内源性小鼠Vλ2-Vλ3-Jλ2基因区段的示意性说明(未按照比例)。如图所示，通过包括在重组位点翼侧具有新霉素表达盒的靶向构建体(12/1-λ靶向载体)取代已无功能的内源性小鼠λ轻链基因座。使用含有包括12个hVλ基因区段和单一hJλ基因区段的人源λ序列的基因组片段取代Vλ2-Vλ3-Jλ2基因区段。

[0579] 因此，所述第一种方法将一个或多个hVλ基因区段置于内源性λ轻链基因座中与单一hJλ基因区段邻近的位置(图22A)。

[0580] 可以使用类似技术对经修饰的内源性λ轻链基因座进行进一步的修饰以插入更多hVλ基因区段。例如，图23A中提供了用于累进性插入附加人源hVλ基因区段的两个附加靶向构建体(+16-λ和+12-λ靶向载体)的示意性说明。如图所示，在使用由前述插入的人源λ轻链序列提供同源性的连续步骤中，将含有特定人源hVλ基因区段的附加基因组片段插入经修饰的内源性λ轻链基因座。如图所示基于各靶向构建体重组，以顺序形式，将28个附加hVλ基因区段插入经修饰的内源性λ轻链基因座。这形成了嵌合基因座，所述嵌合基因座产生包括与小鼠Cλ基因连接的人源Vλ-Jλ基因区段的λ轻链蛋白。

[0581] 上述方法在小鼠λ基因座上插入人源λ轻链基因区段，保留了位于Cλ2-Jλ4-Cλ4基因区段下游的增强子(称为Enh 2.4、Enh和Enh 3.1，图22A和图23A)。
这种方法在内源性小鼠λ轻链基因座上产生单一修饰的等位基因(图25A)。

[0582] 本申请提供了制备小鼠的组合物和方法，所述小鼠表达包括与小鼠Cλ基因区段可操作地连接的hVλ和Jλ基因区段的轻链，所述组合物和方法包括用于制备由内源性小鼠λ轻链基因座表达这种基因的小鼠的组合物和方法。所述方法包括选择性地使得一个内源性小鼠Vλ-Jλ-Cλ基因簇不具有功能(例如通过靶向缺失)，并且在内源性小鼠λ轻链基因座上使用hVλ和Jλ基因区段以在小鼠中表达hVλ结构域。

[0583] 或者，在第二种方法中，可以将人源λ轻链基因区段置于内源性κ轻链基因座。所述基因修饰，在各种实施方式中，包括将内源性κ轻链基因座缺失。例如，为了从内源性抗体库中去除小鼠κ轻链，可以制备小鼠Vκ和Jκ基因区段的缺失。本申请还提供了用于制备小鼠、小鼠胚胎和细胞的经基因修饰的小鼠胚胎、细胞和靶向构建体。

[0584] 基于上述原因，小鼠Vκ和Jκ基因区段缺失采用了相对最小的破坏。图21中提供了缺失小鼠Vκ和Jκ基因区段的示意性说明(未按照比例)。通过重组酶介导的小鼠序列缺失来使内源性小鼠Vκ和Jκ基因区段缺失，所述小鼠序列位于各自使用位点特异性重组位点来精确定位的靶向载体之间。在第一个靶向事件中使用第一靶向载体(Jκ靶向载体)以缺失小鼠Jκ基因区段。在第二个顺序的靶向事件中使用第二靶向载体(Vκ靶向载体)以缺失位于最远端小鼠Vκ基因区段的5’端的序列。因此两个靶向载体都含有位点特异性重组位点，使得能够选择性地缺失两个选择性表达盒并且在成功靶向后全部干扰小鼠κ轻链序列。因为不能产生内源性κ轻链，所以所得到的缺失基因座被功能性沉默。该修饰的基因座能够用于插入hVλ和Jλ基因区段以形成包括hVλ和Jλ基因区段的内源性小鼠κ基因座，从而基于经修饰的基因座重组，动物产生包括与内源性小鼠Cκ基因区段可操作地连接的经重排的hVλ和Jλ基因区段的λ轻链。可以将包括人源λ轻链序列的多种靶向载体用于连接该已缺失的小鼠κ基因座，从而形成包含与小鼠Cκ区可操作地连接的人源λ基因区段的杂交轻链基因座。

[0585] 因此，第二种方法将一个或多个人源Vλ基因区段置于小鼠κ轻链基因座中与单一人源Jλ基因区段邻近的位置(12/1-κ靶向载体，图22B)。

[0586] 在各种实施方式中，对该方法进行改进以使得能够加入基因区段和/或调控序列，从而优化来自小鼠抗体库的小鼠κ基因座的人源λ轻链序列的使用。

[0587] 在第三种方法中，将一个或多个hVλ基因区段置于小鼠κ轻链基因座中与四个hJλ基因序列邻近的位置(12/4-κ靶向载体，图22B)。

[0588] 在第三种方法中，将一个或多个hVλ基因区段置于小鼠κ轻链基因座中与人源κ基因间序列和单一hJλ基因序列邻近的位置(12(κ)1-κ靶向载体，图22B)。

[0589] 在第四种方法中，将一个或多个hVλ基因区段置于小鼠κ轻链基因座中与人源κ基因间序列四个hJλ基因序列邻近的位置(12(κ)4-κ靶向载体，图22B)。

[0590] 所有上述方法在小鼠κ基因座上插入人源λ轻链基因区段，同时保持Cκ基因上游的κ内含子增强子元件(称为Eκi，图22B和图23B)和Cκ基因下游的3’κ增强子(称为Eκ3’，图22B和图23B)。所述方法在内源性小鼠κ轻链基因座上产生四个独立的经修饰的等位基因(图25B)。

[0591] 在各种实施方式中，基因修饰的小鼠包括敲除内源性小鼠λ轻链基因座。在一个实施方式中，通过缺失跨距Vλ2至Jλ2区域和跨距Vλ1至Cλ1区域的策略将λ轻链基因座敲除(图20)。使内源性λ轻链基因座表达内源性λ结构域的能力降低或消除的任何策略均适用于本公开中的实施方式。

[0592] 来源于基因修饰小鼠的λ结构域抗体

[0593] 在小鼠κ或λ轻链基因座上包括人源λ序列的小鼠将表达包括与小鼠CL(Cκ或Cλ)区融合的hVλ区的轻链。这些对与下述小鼠繁殖均是有利的：(a)包括功能性沉默的轻链基因座(例如敲除内源性小鼠κ或λ轻链基因座)；(b)包括内源性小鼠λ轻链基因座，所述基因座包括与内源性小鼠Cλ基因可操作地连接的hV和hJ基因区段；(c)包括内源性小鼠κ轻链基因座，所述基因座包括与内源性小鼠Cκ基因可操作地连接的hVκ和hJκ基因区段；以及(d)小鼠的一个κ等位基因包括hVκ和hJκ；另一个κ等位基因包括hVλ和hJλ；一个λ等位基因包括hVλ和hJλ并且一个λ等位基因被沉默或敲除，或者两个λ等位基因均包括hVλ和hJλ；以及两个重链等位基因均包括hVH、hDH和hJH。

[0594] 将包括在Cκ或Cλ背景下表达hVλ结构域的抗体用于制备全人源抗体，所述制备是通过将编码hVλ结构域的核酸克隆至携带编码人源Cλ基因的表达构建体中。将所得到的表达构建体转染至适宜的宿主细胞中，所述细胞用于表达展示与hCλ融合的全hVλ结构域的抗体。实施例

[0595] 本发明提供下述实施例以描述如何制备和使用本发明的方法和组合物，而不是旨在限定发明人所认为的发明的范围。除非另有明示，温度以摄氏度表示，并且压力为处于或接近大气压。

[0596] 实施例1：小鼠免疫球蛋白基因的人源化

[0597] 使用人源和小鼠细菌人工染色体(BAC)以工程改造13个用于将小鼠免疫球蛋白重链和κ轻链基因座人源化的不同的BAC靶向载体(BACvec)。表1和表2分别详细描述了用于构建将小鼠免疫球蛋白重链和κ轻链基因座人源化的所有BACvec的步骤。

[0598] 人源和小鼠BAC的鉴定。通过使用BAC文库的滤膜影印杂交或对小鼠BAC文库DNA混合物进行PCR筛选来鉴定跨距为免疫球蛋白重链和κ轻链基因座5’和3’末端的小鼠BAC。在标准条件下使用对应于目标区域的探针对滤膜进行杂交。使用位于目标靶向区翼侧的独特引物对通过PCR对文库混合物进行筛选。使用相同的引物进行附加的PCR以便将给定的孔进行解卷积并分离相应的目标BAC。BAC滤膜和文库混合物均由129SvJ小鼠ES细胞(因塞特公司(Incyte Genomics)/英杰公司(Invitrogen))产生。对覆盖整个免疫球蛋白重链和κ轻链基因座的人源BAC进行鉴定，所述鉴定是通过使用基于PCR的方法对人源BAC文库混合物(英杰公司的Caltech文库)进行筛选以对BAC文库(研究遗传学/英杰公司(Research Genetics/Invitrogen)的Caltech B、C或D文库和RPCI-11文库)进行滤膜影印杂交或者使用BAC末端序列数据库(Tigr的Caltech D文库)来完成。

[0599] 通过细菌同源重组和连接来构建BACvec。如此前所描述的进行细菌同源重组 (BHR)(Valenzuela 等，2003；Zhang,Y.,Buchholz,F.,Muyrers,J.P. 和 Stewart,A.F.(1998).A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli(大肠杆菌中使用重组对DNA工程改造的新的逻辑).Nat Genet 20,123-128)。在大多数情况下，通过将来源于PCR的同源盒与克隆的表达盒连接、再通过凝胶分离连接产物并将其电穿孔至携带靶向BAC的BHR感受态细菌中，从而产生线形片段。在经过适宜的抗生素培养皿选择后，通过对两个新的连接交叉进行PCR检测，随后在脉冲场凝胶上进行限制性分析(Schwartz,D.C.和Cantor,C.R.(1984).Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis(通过脉冲场梯度凝胶电泳对酵母染色体大小的DNA进行分离)Cell 37,67-75)并且通过使用分布于人源序列的引物的PCR进行抽查来对正确重组的BAC进行鉴定。

[0600] 使用三个顺序BHR步骤构建用于免疫球蛋白重链基因座人源化初始步骤的3hVHBACvec(图4A和表1)。在第一个步骤(步骤1)中，将表达盒引入人源VH1-3基因区段上游的人源母体BAC中，所述表达盒含有与小鼠免疫球蛋白重链基因座(HB1)同源的区域，在细菌中具有卡那霉素抗性和在动物细胞中具有G418抗性(kanR)以及具有位点特异性重组位点(例如loxP)的基因。在第二个步骤(步骤2)中，将第二表达盒引入紧邻最后一个JH区段的下游，所述第二表达盒含有与小鼠免疫球蛋白重链基因座(HB2)同源的第二区域以及在细菌中具有大观霉素抗性的基因(specR)。所述第二步骤包括使JH6和BAC载体氯霉素抗性基因(cmR)下游的人源免疫球蛋白重链基因座序列缺失。在第三个步骤(步骤3)中，然后使用I-CeuI位点将双重修饰的人源BAC(B1)线形化，所述位点已在前两个步骤中加入并且利用通过两个同源区(HB1和HB2)的BHR整合至小鼠BAC(B2)中。将针对第一个(cm/kan)、第二个(spec/kan)和第三(cm/kan)个步骤的药物选择设计为对所需的产品具有特异性。通过使用限制性酶消化后的脉冲场凝胶电泳(PFGE)对经修饰的BAC克隆进行分析以确定适宜的构建(图4B)。

[0601] 以类似的方式，工程改造用于将重链和κ轻链基因座人源化的12个附加的BACvec。在一些例子中，进行BAC连接代替BHR以便将两个较大的BAC连接在一起，所述连接是通过利用BHR和仔细放置选择性标记物向两个母体BACvec引入罕见的限制性位点来实现。这使得经过特定药物标记物组合的选择后保留下来所需的连接产物。在通过BHR获得的那些类似的方式(如上文所述)中，对在使用罕见的限制性酶消化后通过连接获得的重组BAC进行鉴定和筛选。

[0602] 表1

[0603]

[0604]

[0605] 表2

[0606]

[0607]

[0608] 修饰胚胎干(ES)细胞和产生小鼠。使用此前描述的 基因工程改造方法进行ES细胞(F1H4)靶向(Valenzuela等，2003)。本申请描述了来自通过胚泡(Valenzuela等，2003)或8-细胞注射(Poueymirou等，2007)修饰的ES细胞的小鼠衍生物。在基于PCR的检测中，通过使用独特探针和引物集合来筛选来自ES细胞或小鼠的DNA对靶向的ES细胞和小鼠进行确证(图3A、3B和3C)。所有的小鼠研究均已得到瑞恩泽公司(Regeneron)的机构动物管理和使用委员会(IACUC)的监督和批准。

[0609] 染色体核型分析和荧光原位杂交(FISH)。染色体核型分析通过卡瑞尔(Coriell)细胞库(纽约州卡姆登的卡瑞尔医学研究院(Coriell Institute for MedicalResearch))进行。如此前所述对经靶向的ES细胞进行FISH(Valenzuela等，2003)。利用具有橙谱或绿谱(威赛斯公司(Vysis))荧光标记的dUTP核苷酸的切口平移(英杰公司)对与小鼠BAC DNA或人源BAC DNA对应的探针进行标记。

[0610] 免疫球蛋白重链可变基因座。在9个顺序步骤中对重链基因座的可变区进行人源化，所述步骤是使用 基因工程改造技术，通过使用约1Mb含有等价人源基因区段的连续的人源基因组序列来直接取代约3百万个碱基对(Mb)的含有全部VH、DH和JH基因区段的连续的小鼠基因组序列(图1A和表1)(参见例如US专利号6,586,251和
Valenzuela等，2003)。

[0611] 在JH基因区段和恒定区基因之间的内含子(J-C内含子)含有转录增强子(Neuberger,M.S.(1983).Expression and regulation of immunoglobulin heavy chain gene transfected into lymphoid cells(转染进入淋巴样细胞的免疫球蛋白重链基因的表达和调控)，Embo J 2,1373-1378)，后面为在同种型转换过程中重组所需的简单重 复 区 (Kataoka,T.,Kawakami,T.,Takahashi,N. 和 Honjo,T.(1980).Rearrangement of immunoglobulin gamma 1-chain gene and mechanism for heavy-chain class switch(免疫球蛋白γ1链基因的重拍和重链类别转换的机制)Proc Natl Acad Sci U S A
77,919-923)。选择在人源VH-DH-JH区和小鼠CH区之间的连接(近端连接)以维持小鼠重链内含子增强子和转换结构域，从而保持在小鼠中人源化的重链基因座的有效表达和类别转换。通过使用 基因工程改造方法(同上)确定在所有取代中这个和后
面连接的精确的核苷酸位置是可能的，所述方法使用由合成的寡核苷酸驱动的细菌同源重组。因此，近端连接位于最后一个JH基因区段下游约200bp，并且远端连接位于人源基因座
5’端VH基因区段上游几百bp和小鼠VH1-86基因区段(也称为J558.55)下游约9kb。小鼠VH1-86(J558.55)基因区段是最远端的重链可变基因区段，据报道所述基因区段在C57BL/6小鼠中是假基因，尽管具有弱RSS序列，但是所述基因区段在靶向129等位基因中具有潜在的活性。据报道小鼠重链基因座的远末端可能含有控制元件，所述控制元件调控基因座的表达和/或重排(Pawlitzky等，2006)。

[0612] 使用144kb的含有3个VH、全部27个DH和9个JH人源基因区段的人源重链基因座近末端插入小鼠IgH基因座的近末端以实现小鼠中人源免疫球蛋白DNA序列的第一个插入，使用约75kb小鼠同源臂，所述小鼠IgH基因座同时伴有16.6kb小鼠基因组序列的缺失(步骤A，图2A；表1和3，3hVH)。在一个步骤(步骤A)中进行所述较大的144kb插入同时伴随16.6kb缺失的发生频率为0.2％(表3)。通过使用在缺失的小鼠序列中和翼侧以及在插入的人源序列中的探针进行的天然等位基因缺失(LONA)检测对正确靶向的ES细胞进行评分(Valenzuela等，2003)，并且使用跨越整个插入的多重探针来验证较大人源插入的完整性(图3A、3B和3C)。由于预计进行多轮的顺序ES细胞靶向，因此对这个和所有后续步骤的经靶向的ES细胞克隆进行染色体核型分析(同上)，并且仅将在20次传播中的至少17次显示出正常核型的那些克隆用于后续的步骤。

[0613] 使用BACvec对来自步骤A的经靶向的ES细胞进行再次靶向，以产生在重链基因座远末端19kb的缺失(步骤B，图2A)。与步骤A的BACvec含有新霉素抗性基因(neo)不同的是，步骤B的BACvec含有潮霉素抗性基因(hyg)。将来自两个BACvecs的抗性基因设计成基于成功靶向至同一染色体后，翼侧有loxP位点的约3Mb的小鼠重链可变基因座含有除VH1-86以外的全部小鼠VH基因区段和除DQ52以外的全部DH基因区段，以及两个抗性基因；在步骤A中缺失了DQ52和全部小鼠JH链基因区段。在高G418条件下通过将3hVH近端表达盒驱动至纯合性(Mortensen,R.M.等，(1992)Production of homozygous mutant ES cells with a single targeting construct(使用单个靶向构建体来生成纯合的突变ES细胞)Mol Cell Biol 12,2391-2395)并且随后关注远端hyg表达盒的命运来鉴定双靶向至同一染色体上的ES细胞克隆。甚至在缺乏药物选择的条件下通过高效(达≈11％)瞬时表达CRE重组酶也能够在ES细胞中成功缺失达4Mb大小的、翼侧具有loxP位点的方式修饰的小鼠区段(Zheng,B.等，(2000)Engineering mouse chromosomes with Cre-loxP:range,efficiency,and somatic applications(具有Cre-loxP的工程改造的小鼠染色体：范围、效率和体细胞应用)Mol Cell Biol 20,648-655)。以类似的方式，发明人实现了在瞬时CRE表达后在8％的ES细胞克隆中缺失3Mb(步骤C，图2A；表3)。通过使用在缺失的小鼠序列任意一段的探针进行的LONA检测，以及neo和hyg的丢失情况和跨含单一剩余loxP位点的缺失点的PCR产物的表现来对所述缺失进行评分。此外，通过荧光原位杂交对所述缺失进行确证(数据未列出)。

[0614] 使用 基因工程改造方法在一系列的5个步骤中将剩余的人源重链可变区加入到3hVH等位基因(步骤E-H，图2B)，各步骤均涉及精确插入至多210kb人源基因序列。对于各步骤而言，将各个新BACvec的近末端设计为与此前步骤中大部分的远端人源序列重叠，并且各个新BACvec的远末端均含有与步骤A中使用的小鼠同源物相同的远端区。步骤D、F和H的BACvec含有neo选择性表达盒，而步骤E和G中的那些含有hyg选择性表达盒，因此在G418和潮霉素之间交替具有选择性。通过在跨3hVH杂交等位基因的远端loxP位点的独特PCR产物丢失对步骤D中的靶向性进行检测。通过丢失此前的选择性表达盒对步骤E至I的靶向性进行检测。通过前面选择性表达盒的缺失来检测针对步骤E到I的靶向性。在最后一个步骤中(步骤I，图2B)，通过瞬时FLPe表达(Buchholz,F.等，(1998)Improved properties of FLP recombinase evolved by cycling mutagenesis(通过循环诱变进行的FLP重组酶性质的改良)Nat Biotechnol 16,657-662)除去翼侧有Frt位点(McLeod,M.等，(1986)Identification of the crossover site during FLP-mediated recombination in the Saccharomyces cerevisiae plasmid 2microns circle(在酿酒酵母质粒2微米环中FLP介导的重组过程中交叉位点的鉴定)Mol Cell Biol 6,3357-3367)的neo选择性表达盒。步骤D、E和G中BACvec的人源序列均来源于两个母本人源BAC之一，而步骤F和H中的那些来源于单一BAC。使用跨所插入的人源序列的多重探针在每个步骤中确证人源序列的保留情况(如上文所述，例如图3A、3B和3C)。在各个步骤中仅继续使用具有正常核型和生殖细胞系潜能的那些克隆。在9次顺序操作后，来自最后一个步骤的ES细胞仍能够对生殖细胞系起作用(表3)。针对各重链等位基因的小鼠纯合子是可存活的、外观健康的并且已证明基本上具有野生型体液免疫系统(见实施例3)。

[0615] 表3

[0616]

[0617] 免疫球蛋白κ轻链可变基因座。在8个顺序步骤中将κ轻链可变区人源化，所述人源化是通过以对重链类似的方法使用含有近端人源Vκ和Jκ基因区段的约0.5Mb人源序列直接取代含有全部Vκ和Jκ基因区段的约3Mb小鼠序列(图1B；表2和4)。

[0618] 人源κ轻链可变区含有由800kb的间隔物分隔的两个几乎相同的400kb重复(Weichhold,G.M.等，(1993)The human immunoglobulin kappa locus consists of two copies that are organized in opposite polarity(由以相反的极性组织的两个拷贝构成的人源免疫球蛋白κ基因座)Genomics 16,503-511)。由于所述重复非常相似，因此通过使用近端重复在小鼠中能够再现几乎所有的基因座多样性。而且，已报道天然的人源κ轻链基因座等位基因缺少远端重复(Schaible,G.等，(1993)The immunoglobulin kappa locus:polymorphism and haplotypes of Caucasoid and non-Caucasoid
individuals(免疫球蛋白κ基因座：高加索人种和非高加索人种个体的多样性和单体型)Hum Genet 91,261-267)。本发明人使用约0.5Mb的人源κ轻链可变基因序列取代约3Mb的小鼠κ轻链可变基因序列，以有效地使用近端人源Vκ和全部人源Jκ基因区段取代全部小鼠Vκ和Jκ基因区段(图2C和2D；表2和4)。与在实施例1中所描述的针对重链
基因座的方法相反的是，在加入任何人源序列之前，在3个步骤的过程中已将包含全部Vκ和Jκ基因区段的整个小鼠Vκ基因区缺失。首先，在可变区的近末端引入neo表达盒(步骤A，图2C)。接下来，在κ基因座的远末端插入hyg表达盒(步骤B，图2C)。再在各选择性表达盒中再引入LoxP位点，以使得CRE处理诱导了剩余的3Mb小鼠Vκ区和两个抗性基因缺失(步骤C，图2C)。

[0619] 使用在重链中应用的那些类似的方法(见实施例1)，在4个顺序步骤中插入含有整个免疫球蛋白κ轻链可变区的大小约480kb的人源基因组片段(图2D；表2和4)，在一个步骤中插入达150kb的人源免疫球蛋白κ轻链序列。通过瞬时FLPe表达来除去最终的潮霉素抗性基因。与重链相同，在每个步骤后均针对整个人源插入的完整性、正常核型和生殖细胞系潜能对经靶向的ES细胞克隆进行评估。产生了针对各κ轻链等位基因的小鼠纯合子并发现所述小鼠纯合子是健康的且具有正常的表现。

[0620] 表4

[0621]

[0622] 实施例2：通过重组多重人源化的免疫球蛋白等位基因产生全人源化的小鼠[0623] 在几个点上，将携带如实施例1中所描述的部分人源免疫球蛋白重链或κ轻链可变库的ES细胞显微注射，并将所得到的小鼠进行繁殖以形成具有逐步增大的人源生殖细胞系免疫球蛋白库部分的多种版本的 小鼠(表5；图5A和5B)。1(V1)小鼠具有与16个人源Vκ基因区段和全部人源Jκ基因区段
组合的18个人源VH基因区段和全部人源DH和JH基因区段。 2(V2)和
(V3)小鼠具有增加的可变库，所述可变库分别携带总计39个VH和30
个Vκ，以及80个VH和40个Vκ。由于编码小鼠VH、DH和JH基因区段以及Vκ和Jκ基因区段的基因组区已完全被取代，因此由任意版本的 小鼠产生的抗体均含
有与小鼠恒定区连接的人源可变区。小鼠λ轻链基因座在所有版本的
小鼠中仍保持完好，并且作为不同 κ轻链基因座表达有效性的对照
物。

[0624] 针对免疫球蛋白重链和κ轻链人源化的小鼠双纯合子由实施例1中所描述的等位基因亚组产生。在产生双纯合子小鼠的繁殖过程中在所有基因型中均观察到了大致的孟德尔比例。针对各人源重链等位基因的雄性后代纯合子均显示出了降低的生育能力。降低的生育能力由小鼠ADAM6活性的丧失导致。小鼠重链可变基因座含有两个嵌入的功能性ADAM6基因(ADAM6a和ADAM6b)。在将小鼠重链可变基因座人源化过程中，所插入的人源基因组序列含有ADAM6假基因。小鼠ADAM6可能是生育能力所需的，因此在人源化重链可变基因座过程中缺乏小鼠ADAM6基因可能会导致在这些小鼠中尽管存在人源假基因，但是生育能力的降低。实施例7-9中描述了将已缺失的小鼠ADAM6基因的精确取代重新放入人源化的重链可变基因座，并且在具有人源化重链免疫球蛋白基因座的小鼠中将生育能力恢复至野生型水平。

[0625] 表5

[0626]

[0627] 实施例3：在具有人源化免疫球蛋白基因的小鼠中的淋巴细胞群

[0628] 利用流式细胞术评估了在三个不同版本的 小鼠中的成熟B细胞群。

[0629] 简言之，使用标准方法制备来自骨髓、脾脏和胸腺的细胞悬液。根据生产厂商5
的说明书，以5x10 个细胞/mL将细胞重悬于BD Pharmingen FACS染色缓冲液中，使用抗-小鼠CD16/32(BDP公司(BD Pharmingen))封闭，使用适宜的抗体混合物染色并使用TM
BD Cytofix 固定。将最终得到的细胞球团(pellet)重悬于0.5mL染色缓冲液中并使用TM TM
BD FACSCALIBUR 和BD CELLQUEST PRO 软件分析。所有抗体(BDP公司)均以重量稀
5
释度/混合物来制备并且加入的最终浓度为0.5mg/10 个细胞。用于骨髓(A-D)染色的b a
抗体混合物如下：A：抗-小鼠IgM-FITC、抗-小鼠IgM-PE、抗-小鼠CD45R(B220)-APC；
B：抗小鼠CD43(S7)-PE、抗-小鼠CD45R(B220)-APC；C：抗小鼠CD24(HSA)-PE；抗-小鼠CD45R(B220)-APC；D：抗-小鼠BP-1-PE、抗-小鼠CD45R(B220)-APC。用于脾脏和腹股沟b a
淋巴结(E-H)染色的抗体混合物如下：E：抗-小鼠IgM-FITC、抗-小鼠IgM-PE、抗-小鼠CD45R(B220)-APC；F：抗-小鼠Ig、 轻链-FITC、抗-小鼠Igκ轻链-PE、
抗-小鼠CD45R(B220)-APC；G：抗-小鼠Ly6G/C-FITC、抗-小鼠CD49b(DX5)-PE、抗-小鼠CD11b-APC；H：抗-小鼠CD4(L3T4)-FITC、抗-小鼠CD45R(B220)-PE、抗-小鼠CD8a-APC。
结果如图6所示。

[0630] 针对标记物B220和IgM的表面表达情况对从纯合子 小鼠的脾脏或淋巴结分离的淋巴细胞进行染色，并使用流式细胞术进行分析(图6)。在已检测+ +
的所有版本的 小鼠中B220IgM 成熟B细胞群的大小均与野生型小鼠
的那些几乎相等，无论其含有多少VH基因区段。此外，含有纯合杂交的人源化免疫球蛋白重链基因座的小鼠，甚至是仅具有3个VH基因区段但具有正常的小鼠免疫球蛋白κ轻链基因座的小鼠，或者含有纯合杂交的人源化κ轻链基因座且具有正常的小鼠免疫球蛋白+ +
重链基因座的小鼠，在它们外周室中也具有正常数量的B220IgM 细胞(未列出)。这些结果表明具有人源可变基因区段和小鼠恒定区的嵌合基因座能够完全填入成熟的B细胞室。而且，在重链或κ轻链基因座上的可变基因区段的数量，以及理论上的抗体库的多样性，与其产生野生型成熟B细胞群的能力不具有相关性。而相反的是，具有随机整合的全人源免疫球蛋白转基因和失活的小鼠免疫球蛋白基因座的小鼠在这些室中具有数量减少的B细胞，减少的严重程度取决于在所述转基因中包括的可变基因区段的数量(Green,L.L. 和 Jakobovits,A.(1998).Regulation of B cell development by variable gene complexity in mice reconstituted with human immunoglobulin yeast artificial chromosomes(在与人源免疫球蛋白酵母人工染色体重新构建的小鼠中通过可变基因的复杂性调控B细胞发育)J Exp Med 188,483-495)。这表明“原位基因人源化”策略造成了与在“敲除加转基因”方法中实现的随机整合转基因的根本不同的功能性结果。

[0631] 等位基因排斥和基因座的选择。在针对不同版本的人源化免疫球蛋白重链基因座的小鼠杂合子中检测了维持等位基因排斥的能力。

[0632] 在从129S6/SvEvTac和C57BL/6NTac杂合胚胎来源的F1ES系(F1H4(Valenzuela等，2003))中实现了免疫球蛋白基因座的人源化。将人源重链生殖细胞系可变基因序列靶a向至129S6等位基因，所述等位基因携带IgM 单倍型，而未经修饰的小鼠C576BL/6N等位b a b
基因携带IgM 单倍型。可以通过使用对在IgM 或IgM 等位基因中发现的多态性具有特异性的抗体进行的流式细胞术来区分这些IgM的等位基因形式。如图6(最下面一行)所示，在针对各版本的人源化重链基因座的小鼠杂合子中鉴定的B细胞仅表达单一等位基因，a b
IgM(人源化的等位基因)或IgM(野生型等位基因)。这表明在 小鼠
a
中涉及等位基因排斥的机制是完好的。此外，针对人源化等位基因(IgM)阳性的B细胞的相对数量大致与所存在的VH基因区段的数量成比例。在 1杂合子小鼠
中约30％的B细胞表达人源化的免疫球蛋白基因座，所述基因座具有18个人源VH基因区段，以及在 2和3(未列出)杂合子小鼠中在50％的B细胞表达人源
化的免疫球蛋白基因座，所述基因座分别具有39个和80个人源VH基因区段。值得注意的是，表达人源化与野生型小鼠等位基因的细胞之比( 1小鼠为0.5和
2小鼠为0.9)高于人源化与野生型基因座中所含的可变基因区段的
数量之比( 1小鼠为0.2和 2小鼠为0.4)。这可
能表明等基因的选择概率介于一个或另一个染色体的随机选择与任意特定V区段RSS的随机选择之间。而且，可能有一部分B细胞而不是全部B细胞中，一个等位基因变为可进行重组，在其他等位基因可进行重组前，完成这一过程并关闭重组。此外，具有来源于杂交人源化重链基因座或野生型小鼠重链基因座的表面IgM(sIgM)的细胞的均匀分布也是杂交基因座在正常水平操纵的证据。而相反的是，随机整合的人源免疫球蛋白转基因与野生型小鼠免疫球蛋白基因座的竞争较差(Bruggemann,M.等，(1989)A repertoire of monoclonal antibodies with human heavy chains from transgenic mice(来自转基因小鼠的
具有人源重链的单克隆抗体库)PNAS 86,6709-6713；Green等，1994；Tuaillon,N.等，(1993)Human immunoglobulin heavy-chain minilocus recombination in transgenic mice:gene-segment use in mu and gamma transcripts(转基因小鼠中人源免疫球蛋白重链小位点重组：在μ和γ转录体中基因区段的使用)Proc Natl Acad Sci U S A
90,3720-3724)。这进一步表明由 小鼠产生的免疫球蛋白在功能上不
同于在由“敲除加转基因”方法制备的小鼠中通过随机整合的转基因产生的那些。

[0633] 在129S6或C57BL/6N中不能利用Cκ区的多态性来检测人源化对比非人源化κ轻链基因座的等位基因排除情况。然而， 小鼠均具有野生型小鼠λ轻链基因座，因此可以观察人源化κ轻链基因座的重排和表达是否会阻止小鼠λ轻链的表达。与野生型小鼠相比，在 小鼠中表达人源化κ轻链的细胞的数量与
表达小鼠λ轻链的细胞的数量之比相对没有变化，无论在κ轻链基因座中插入多少人源Vκ基因区段(图6，上数第三行)。此外，双阳性(κ加λ)细胞的数量未增加，表明在杂交的κ轻链基因座上的多产的重组会适当抑制小鼠λ轻链基因座的重组。而相反的是，含有随机整合的κ轻链转基因和失活的小鼠κ轻链基因座——但具有野生型小鼠λ轻链基因座——的小鼠显示出显著增加的λ/κ比率(Jakobovits,1998)，这表明所引入的κ轻链转基因在这种小鼠中不具有良好的功能。这进一步表明与由“敲除加转基因”小鼠制备的那些相比，在由 小鼠制备的免疫球蛋白中观察到了不同的功能
性结果。

[0634] B细胞发育。由于在 小鼠中的成熟B细胞群类似于野生型小鼠中的那些(如上文所述)，因此可能通过扩大成熟B细胞群来补偿在早期B细胞分化中的缺陷。通过使用流式细胞术对B细胞群进行分析来检测B细胞分化的不同阶段。表6显示了与野生型窝仔相比，在由使用特异性的表面标记物的FACS所定义的 小
鼠的各B细胞系中细胞成分的比率。

[0635] 早期的B细胞发育出现在骨髓中，通过细胞表面标记物表达类型和量的变化对B细胞分化的不同阶段进行表征。表面表达的这些差异与细胞内部免疫球蛋白基因座中出现的分子变化具有相关性。原-B细胞向前-B细胞的转化需要功能性重链蛋白的成功的重排和表达，而前-B细胞向成熟B细胞阶段的转化受κ或λ轻链正确的重排和表达的支配。因此，可以通过给定阶段相对B细胞群的变化来检测B细胞分化阶段之间不充分的转化。

[0636] 表6

[0637]

[0638] 在任何 小鼠的B细胞分化中均未观察到重大缺陷。在小鼠中，引入人源重链基因区段不会影响原-B细胞向前-B细胞的转
化，并且引入人源κ轻链基因区段不会影响前-B细胞向B细胞的转化。这表明在B细胞信号和辅助受体分子背景下，具有人源可变区和小鼠恒定区的“反向嵌合”免疫球蛋白分子具有正常的功能，在小鼠环境中驱动适宜的B细胞分化。而相反的是，在含有随机整合的免疫球蛋白转基因和失活的内源性重链或κ轻链基因座的小鼠中，B细胞分化过程中不同群之间的平衡被不同程度地破坏(Green和Jakobovits,1998)。实施例4：在人源化免疫球蛋白小鼠中的可变基因库

[0639] 通过对来源于包括脾细胞和杂交瘤细胞的多种来源的人源可变区进行逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)对在 小鼠的人源化抗体库中的人源可变基因区段的使用进行分析。确定了可变区序列、基因区段的使用、体细胞高频突变和经重排的可变区基因区段的连接多样性。

[0640] 简言之，总RNA使用TRIZOLTM(英杰公司)或Qiagen RNEASYTM小试剂盒(Mini Kit)7 7 4 5
(凯杰公司(Qiagen))从1x10-2x10 个脾细胞或约10-10 个杂交瘤细胞中提取，并使用TM
以小鼠恒定区特异性引物作为引物进行SUPERSCRIPT III一步RT-PCR系统(英杰公司)。
各样品均使用2-5μL RNA，使用前述的与分别针对重链和κ轻链的各人源可变区家族的混合前导引物匹配的3’恒定特异性引物来进行反应。试剂和引物的体积，以及RT-PCR/PCR条件均参照生产厂商的说明书。引物序列基于多种来源(Wang,X.和Stollar,B.D.(2000)Human immunoglobulin variable region gene analysis by single cell RT-PCR(通过单个细胞RT-PCR的人源免疫球蛋白可变区基因分析)JImmunol Methods 244:217-225；
Novagen公司的Ig引物组)。在适当情况下，使用混合的家族特异性框架引物和与第一次反应中使用的相同的小鼠3’免疫球蛋白恒定特异性引物进行巢式二次PCR反应。通过琼TM
脂糖电泳对各反应的分装物(5μL)进行分析，并使用MONTAGE 凝胶提取试剂盒(密理博TM
公司(Millipore))从琼脂糖中纯化反应产物。使用TOPO TA克隆系统(英杰公司)来克隆经纯化的产物，并通过电穿孔将其转化至DH10β大肠杆菌细胞。从各转化反应中选择单个克隆，并在2mL使用抗生素选择的LB肉汤培养基中在37℃下培养过夜。通过基于试剂盒的方法(凯杰公司)从细菌培养物中纯化质粒DNA。

[0641] 免疫球蛋白可变基因的使用。使用T7或M13反向引物在ABI 3100基因分析仪(应用生物系统公司(Applied Biosystems))上对重链和κ轻链克隆的质粒DNA进
TM
行测序。将原始序列数据导入SQUENCHER (v4.5,基因编码公司(Gene Codes))。将
各序列组装成重叠群，并使用IMGT V-Quest检索功能来与人源免疫球蛋白序列进行比对 (Brochet,X.,Lefranc,M.P. 和 Giudicelli,V.(2008).IMGT/V-QUEST:the highly customized and integrated system for IG and TR standardized V-J and V-D-J sequence analysis(IMGT/V-QUEST:对于IG和TR标准化的V-J和V-D-J序列分析的高度定制和整合的系统)Nucleic Acids Res 36,W503-508)以鉴定人源VH、DH、JH和Vκ、Jκ区段的使用。将序列与生殖细胞系序列进行比较以进行体细胞高频突变和重组连接分析。

[0642] 通 过 RAG 补 足 (Chen,J. 等，(1993)RAG-2-deficient blastocystcomplementation:an assay of gene function in lymphocyte development(RAG-2缺陷囊胚的补足：淋巴细胞发育中基因功能的分析)Proc Natl Acad Sci U S A 90,4528-4532)由含有初始重链修饰(3hVH-CRE杂交等位基因，图2A下部)的ES细胞产生小鼠，并且从脾细胞的RNA中制备cDNA。使用对预测的嵌合重链mRNA具有特异性的引物组(如上文所述)来扩增cDNA，所述嵌合重链mRNA将由在所插入的人源基因区段中通过V(D)J重组并且随后拼接至小鼠IgM或IgG恒定结构域产生。来源于这些cDNA克隆(未列出)的序列证明
了适宜的V(D)J重组出现在人源可变基因序列中，所述重排的人源V(D)J基因区段正确地在框架中与小鼠恒定结构域拼接并且发生类别转换重组。对后续杂交免疫球蛋白基因座的mRNA产物进行进一步的序列分析。

[0643] 在类似的实验中，根据B220和IgM或IgG的表面表达通过流式细胞术来分离来自+ + + +未经免疫的野生型和 小鼠的B细胞。将B220IgM 或表面IgG(sIgG)
细胞混合，并在进行RT-PCR扩增和克隆之后(如上文所述)，获得VH和Vκ序列。记录了未经免疫的 1小鼠(表7)和 3小鼠(表8)在RT-PCR
扩增的cDNA集合中的代表性基因使用(*缺陷的RSS；丢失或假基因)。

[0644] 表7

[0645]

[0646]

[0647] 表8

[0648]

[0649]

[0650] 如表7和8所示，几乎所有的功能性人源VH、DH、JH、Vκ和Jκ基因区段均被利用。在已描述的但在本实验的 小鼠中未检测到的功能性可变基因区段中，有几个已报道具有缺陷的重组信号序列(RSS)，因此将无法预期其表达(Feeney,A.J.(2000)Factors that influence formation of B cell repertoire(影响B细胞库的信息的因子)Immunol Res 21,195-202)。对来自不同 小鼠的几个其他免
疫球蛋白序列集合(分离自天然和经免疫的库)进行的分析显示了这些基因区段的使用，尽管频率较低(数据未列出)。汇总的基因使用数据显示了在 小鼠中
含有的所有功能性人源VH、DH、JH、Vκ和Jκ基因区段均已在多种天然的和经免疫的库中被观察到(数据未列出)。尽管在对人源重链基因座序列的分析中已经鉴定了人源VH7-81基因区段(Matsuda,F.等，(1998)The complete nucleotide sequence of the human immunoglobulin heavy chain variable region locus(人源免疫球蛋白重链可变区基因座的全核苷酸测序)J Exp Med 188,2151-2162)，但是根据对整个 3小
鼠基因组的重新测序结果确证了所述人源VH7-81基因区段在 小鼠中
不存在。

[0651] 已知抗体的重链和轻链序列具有特殊的变异性，特别是在重排的可变结构域中的短多肽区段中。称为高变区或互补决定区(CDR)的这些区域形成抗体分子结构中的抗原结合位点。介于其中的多肽序列被称为框架区(FR)。在重链和轻链中均有3个CDR(CDR1、CDR2、CDR3)和4个FR(FR1、FR2、FR3、FR4)。一个CDR，CDR3是独特的，因为该CDR是通过VH、DH和JH以及Vκ和Jκ基因区段的重组形成并且在遇到抗原之前产生显著量的库多样性。这种连接是不精确的，因为通过外切酶活性将核苷酸缺失和通过末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)进行非模板编码的加入，因此在重组过程中允许产生新序列。尽管由于可变区作为一个整体的高突变性使得FR能够显示出大量的体细胞突变，但是变异性在可变区并不是均匀分布的。CDR集中并且位于抗体分子表面能够与抗原结合的高变区。来自小鼠的选定抗体的重链和轻链序列围绕着CDR3连接显示出的连接多样性分别见图7A和7B。

[0652] 如图7A所示，在来自 小鼠的抗体的VH-DH和DH-JH连接中均观察到了非模板编码的核苷酸加入(N-加入)，这表明TdT与人源区段的正确功能。VH、DH和JH区段的相对于其生殖细胞系对应基因的末端表明了也存在外切酶活性。与重链基因座不同，人源κ轻链重排显示出在CDR3具有很少的TdT加入或没有TdT加入，其由Vκ和Jκ区段的重组形成(图7B)。这是在意料之内的，因为在前-B向B细胞转化时在轻链重排过程中在小鼠中缺乏TdT的表达。在重组事件中，在重排的人源Vκ区的CDR3中观察到的多样性主要是通过外切酶的活性引入。

[0653] 体细胞高频突变。在生发中心反应(germinal center reaction)过程中通过称为体细胞高频突变的过程将附加的多样性加入到重排的免疫球蛋白基因的可变区中。表达体细胞突变的可变区的B细胞与其他B细胞就与滤泡树突状细胞呈递抗原的接近产生竞争。与抗原具有更高亲和性的那些B细胞将进一步扩大并且在排出到外周之前经过类别转换。
因此，表达已转换的同种型的B细胞通常已接触过抗原并经过了生发中心反应，并且所述B细胞相对于天然的B细胞具有数量增加的突变。而且，与已经过抗原选择的来自sIgG+B细胞的可变序列相比，主要来自天然sIgM+B细胞的可变区序列将预计具有相对较少的突变。

[0654] 将来自未经免疫的 小鼠的sIgM+或sIgG+B细胞或来自经过免+
疫的小鼠的sIgGB细胞的随机VH或Vκ克隆的序列与其生殖细胞系可变基因区段进行比较，并且标注了相对于生殖细胞系序列的变化量。将所得到的核苷酸序列在计算机模拟(in silico)中翻译并且标注了导致的氨基酸改变的突变。收集所有可变区的数据并计算给定位置的变化百分率(图8)。
+

[0655] 如图8所示，来源于未经免疫的 小鼠的sIgGB细胞的人源重+
链可变区相对于来源于相同脾细胞库的sIgMB细胞显示出多很多的核苷酸，并且来源于经过免疫的小鼠的重链可变区显示出甚至更多的改变。与框架区相比在互补决定区(CDR)中改变的数量增加，这表明抗原具有选择性。在对IgG与IgM进行比较时，来自人源重链可变区的相应氨基酸序列也显示出显著更高的突变数，并且在经过免疫的IgG中甚至更高。与框架序列相比，这些突变在CDR中也似乎具有更高的频率，这表明所述抗体在体内具有抗+
原选择性。在来源于经过免疫的小鼠的IgGB细胞的Vκ序列中也可见核苷酸和氨基酸突变的数量出现类似的增加。

[0656] 在 小鼠中观察到的基因使用和体细胞高频突变表明在这些小鼠中存在的基本上所有基因区段均能够重排以形成完全功能性反向嵌合抗体。而且，抗体完全参与了小鼠的免疫系统以经过亲和性选择和成熟来形成能
够有效地中和其靶向抗原的完全成熟的人源抗体。 小鼠能够激发针对
多种类型抗原的强免疫应答，这造成了广泛使用具有较高亲和性并且适用于治疗用途的人源抗体(数据未列出)。

[0657] 实施例5：淋巴结构和血清同种型分析

[0658] 利用光学显微镜检测经H&E染色的来源于野生型或 小鼠的脾脏、腹股沟淋巴结、派伊尔淋巴集结(Peyer's patch)和胸腺组织样品的大体结构。使用TM
LUMINEX 技术分析从野生型和 小鼠收集的血清中免疫球蛋白同种型
的水平。

[0659] 淋巴器官结构。淋巴组织的结构和功能部分取决于造血细胞适宜的发育情况。B细胞发育或功能方面的缺陷可能表现为淋巴组织结构的改变。对染色的组织切片进行分析后，经鉴定在野生型和 小鼠之间二级淋巴器官的外观无显著差异(数据未列出)。

[0660] 血清免疫球蛋白水平。在野生型和 小鼠中各同种型的表达水平相似(图9A、9B和9C)。这表明将可变基因区段人源化不会对类别转换或免疫球蛋白的表达和分泌造成显著的不良影响，因此显然保留了实现这些功能所必须的所有内源性小鼠序列。

[0661] 实施例6：在人源化免疫球蛋白小鼠中的人源化和抗体的产生

[0662] 使用抗原对不同版本的 小鼠进行免疫以检测针对外来抗原攻击的体液应答情况。

[0663] 免疫和杂交瘤的研发。可以使用蛋白、DNA、DNA和蛋白组合形式的抗原，或表达抗原的细胞对 和野生型小鼠进行免疫。通常每3周对动物加强免疫一次，共进行2至3次。各次抗原加强免疫后，从各只动物中收集血清样品并通过血清效价检测对抗原特异性抗体应答进行分析。融合前，根据需要，通过腹腔内和/或静脉内注射，给予小鼠5μg蛋白或DNA的最终的融合前加强免疫。收集脾细胞并且根据生产厂商建议的方案(马里兰格伦伯尼的细胞脉冲科学公司(Cyto Pulse Sciences Inc.))在电融合室中将脾细胞与Ag8.653骨髓瘤细胞融合。培养10天后，使用ELISA检测对杂交瘤进行抗原特异性筛选(Harlow,E.和Lane,D.(1988)Antibodies:A Laboratory Manual(抗体：实验室手册)，纽约冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press))。或者，直接从经过免疫的小鼠中分离抗原特异性B细胞并且使用标准技术(包括在本申请中描
述的那些)筛选，以获得对目标抗原具有特异性的人源抗体。

[0664] 血清效价测定。为监测动物针对抗原的血清应答，在各次加强免疫约10天后收集血清样品，并且使用抗原特异性ELISA来测定效价。简言之，使用2μg/mL抗原将NUNC TMMAXISORP 96孔板在4℃下包被过夜，并且使用牛血清白蛋白(密苏里州圣路易斯的西格玛公司)封闭。将以3倍比例系列稀释的血清样品在室温下与板结合1小时。然后使用含有0.05％吐温-20的PBS洗板并检测结合的IgG，分别使用HRP-偶联的山羊抗-小
鼠Fc(宾夕法尼亚州西格罗夫的杰克逊免疫研究实验室公司(Jackson Immuno Research Laboratories,Inc.))检测总IgG效价，或者使用生物素标记的同种型特异性或轻链特异性多克隆抗体(SBA公司(SouthernBiotech Inc.))检测同种型特异性效价。对于生物素标记的抗体而言，洗板后，加入HRP-偶联的抗生物素蛋白链菌素(伊利诺伊州洛克福特皮TM
尔斯公司(Pierce))。使用比色底物如BD OPTEIA (加利福尼亚州圣地亚哥的BD生物科学公司(BD Biosciences Pharmingen))对所有板进行显色。在使用1M磷酸终止反应后，TM
记录450nm处的吸光度并使用来自Graph Pad的PRISM 软件进行数据分析。将获得两倍的背景信号所需的稀释度定义为效价。

[0665] 在一项实验中，使用人白介素-6受体(hIL-6R)免疫 小鼠。针对使用hIL-6R免疫的 和野生型小鼠的代表性血清效价集合见图10A和
10B。

[0666] 和野生型小鼠针对IL-6R产生具有相似效价范围的较强应答(图10A)。在单次抗原增强免疫后， 和野生型队列中的若干小鼠均达到
了最大的应答。这些结果表明在 和野生型小鼠中针对该抗原具有相似
的免疫应答强度和动力学。对这些抗原特异性抗体应答进行了进一步分析以检测在血清中发现的特定抗原特异性抗体的同种型。 和野生型组均显著激发了IgG1
应答(图10B)，这表明在各类型小鼠中在体液免疫应答过程中的类别转换是相似的。

[0667] 在溶液中抗体与抗原结合的亲和性测定。通常设计基于ELISA的溶液的竞争检测来确定针对抗原的抗体结合亲和性。

[0668] 简言之，将在条件培养基中的抗体与范围为0至10mg/mL的系列稀释的抗原蛋白预混合。然后将抗体与抗原混合物的溶液在室温下孵育2至4小时以达到结合平衡。然后使用定量夹心ELISA来测定混合物中游离抗体的量。使用在PBS溶液中的1μg/mL抗原蛋TM白将96孔MAXISORB 板(宾夕法尼亚州西彻斯特VWR公司)在4℃下包被过夜，随后使用BSA进行非特异性封闭。然后将抗体-抗原混合物溶液转移至这些板中，随后孵育1小时。
然后使用洗涤缓冲液洗板，并且使用HRP-偶联的山羊抗-小鼠IgG多克隆抗体试剂(杰克TM
逊免疫研究实验室公司)检测与板结合的抗体并使用比色底物如BD OPTEIA (加利福尼亚州圣地亚哥的BD生物科学公司)显色。在使用1M磷酸终止反应后，记录450nm处的吸光TM
度并使用来自Graph Pad的PRISM 软件进行数据分析。使用4-参数拟合分析来检测信号与溶液中抗原浓度的相关性并以IC50报告，所述IC50是使在溶液中不存在抗原时来自抗体样品的信号减小50％所需要的抗原浓度。

[0669] 在一项实验中，使用hIL-6R对 小鼠进行免疫(如上文所述)。图11A和11B显示了对来自 和野生型小鼠的抗-hIL6R抗体进行亲和性
检测的代表性集合。

[0670] 在已免疫的小鼠进行第三次抗原加强免疫后，通过ELISA测定血清效价。脾细胞从选定的野生型和 小鼠队列中分离，并与Ag8.653骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤并在选择条件下生长(如上文所述)。在所产生的共计671个抗-IL-6R杂交瘤中，发现有236个表达抗原特异性抗体。通过溶液竞争ELISA使用从抗原阳性孔中收集的培养基来确定抗体与抗原结合的亲和性。来源于 小鼠的抗体在与溶
液中抗原的结合中显示出了广泛的亲和性(图11A)。而且，在体外生物检测中发现在236个抗-IL-6R杂交瘤中有49个阻断IL-6与其受体的结合(数据未列出)。另外，这49个
抗-IL-6R阻断抗体显示出较高的溶液亲和性范围，所述亲和性与来源于平行免疫的野生型小鼠阻断抗体的亲和性相似(图11B)。

[0671] 实施例7：小鼠ADAM6靶向载体的构建

[0672] 使用 基因工程技术(同上)修饰从Fred Alt博士(哈佛大学)处获得的细菌人工染色体(BAC)929d24以构建用于将小鼠ADAM6a和ADAM6b基因插入人源化重链基因座的靶向载体。将929d24BAC DNA工程改造以含有包含小鼠ADAM6a和ADAM6b基因的基因组片段以及用于经靶向缺失的人源ADAM6假基因(hADAM6Ψ)的潮霉素表达盒，所述假基因位于人源化重链基因座的人源VH1-2和VH6-1基因区段之间(图12)。

[0673] 首先，从929d24BAC克隆中亚克隆含有小鼠ADAM6b基因、序列(5’)上游～800bp和序列(3’)下游～4800bp的基因组片段。从929d24BAC克隆中独立地亚克隆含有小鼠ADAM6a基因、序列(5’)上游～300bp和序列(3’)下游～3400bp的第二个基因组片段。将含有小鼠ADAM6b和ADAM6a基因的两个基因组片段连接至翼侧有Frt重组位点的潮霉素表达盒以形成靶向载体(小鼠ADAM6靶向载体，图20；SEQ ID NO:3)。将不同的限制性酶位点工程改造至小鼠ADAM6b基因的靶向载体的5’末端和小鼠ADAM6a基因的3’末端(图
12的下部)以用于连接至人源化的重链基因座。

[0674] 对含有使用人源重链基因座取代小鼠重链基因座的BAC克隆进行独立的修饰，包括位于人源化基因座人源VH1-2和VH6-1基因区段之间的人源ADAM6假基因，以用于随后与小鼠ADAM6靶向载体的连接(图13)。

[0675] 简言之，将翼侧有loxP重组位点的新霉素表达盒进行工程改造以含有同源臂，所述同源臂含有在人源VH1-2基因区段3’位置(相对于hADAM6Ψ的5’)和人源VH6-1基因区段5’(相对于hADAM6Ψ的3’，见图13中部)的人源基因组序列。在该靶向构建体中插入位点的位置在人源ADAM6假基因5’端约1.3kb和3’端～350bp。靶向构建体还包括与小鼠ADAM6靶向载体相同的限制性位点，以便随后在含有人源ADAM6假基因缺失的经修饰的BAC克隆和小鼠ADAM6靶向载体之间进行BAC连接。

[0676] 在消化来源于两个构建体的BAC DNA之后，将所述基因组片段连接在一起以构建工程改造的BAC克隆，所述BAC克隆含有人源化的重链基因座，所述基因座包含含有小鼠ADAM6a和ADAM6b核苷酸序列的异位基因组序列。最终的靶向构建体用于在ES细胞的人源化重链基因座中缺失人源ADAM6基因并且插入小鼠ADAM6a和ADAM6b序列，所述靶向构建体从5’至3’含有：含有人源VH1-2基因区段3’端～13kb人源基因组序列的5’基因组片段、小鼠ADAM6b基因下游～800bp小鼠基因组序列、小鼠ADAM6b基因、小鼠ADAM6b基因上游～4800bp基因组序列、5’Frt位点、潮霉素表达盒、3’Frt位点、小鼠ADAM6a基因下游～300bp小鼠基因组序列、小鼠ADAM6a基因、小鼠ADAM6a基因上游～3400bp小鼠基因组序列和人源VH6-1基因区段5’端含有～30kb人源基因组序列的3’端基因组片段(图13下部)。

[0677] 将工程改造的BAC克隆(如上文所述)电穿孔至含有人源化重链基因座的小鼠ES细胞以形成经修饰的ES细胞，所述经修饰的ES细胞包括在人源化重链基因座异位的、TM包含小鼠ADAM6a和ADAM6b序列的小鼠基因组序列。通过使用TAQMAN 探针的定量PCR
检测对在人源化重链基因座内含有异位小鼠基因组片段的阳性ES细胞进行鉴定(Lie,Y.S.和Petropoulos,C.J.(1998)Advances in quantitative PCR technology:5’nuclease assays(定量PCR技术的发展：5’核酸酶试验)Curr Opin Biotechnol 9(1):43-48)。通过使用位于经修饰区内的引物和探针的PCR对人源化重链基因座的经修饰部分外侧的上游和下游区进行确证，以确证在人源化重链基因座中存在异位小鼠基因组序列以及潮霉素表达盒。跨插入点上游的核苷酸序列包括下述序列，所述序列显示了插入点上游的人源重链基因组序列和与插入点存在的小鼠基因组序列连续连接的I-Ceu I限制性位点(包含在下面的括号中)：(CCAGCTTCATTAGTAATCGT TCATCTGTGG TAAAAAGGCA GGATTTGAAG CGATGGAAGATGGGAGTACG GGGCGTTGGA AGACAAAGTG CCACACAGCG CAGCCTTCGTCTAGACCCCC GGGCTAACTA TAACGGTCCT AAGGTAGCGA G)GGGATGACAGATTCTCTGTT CAGTGCACTC AGGGTCTGCC TCCACGAGAA TCACCATGCCCTTTCTCAAG ACTGTGTTCT GTGCAGTGCC CTGTCAGTGG(SEQ ID NO:4)。
跨经靶向区3’端的插入点下游的核苷酸序列包括下述序列，所述序列显示了小鼠基因组序列和与插入点下游的人源重链基因组序列邻近连接的PI-Sce I限制性位点(包
含在下面的括号中)：(AGGGGTCGAG GGGGAATTTT ACAAAGAACA AAGAAGCGGGCATCTGCTGA CATGAGGGCC GAAGTCAGGC TCCAGGCAGC GGGAGCTCCACCGCGGTGGC GCCATTTCAT TACCTCTTTC TCCGCACCCGACATAGATAAAGCTT)ATCCCCCACC AAGCAAATCC CCCTACCTGGGGCCGAGCTT
CCCGTATGTG GGAAAATGAA TCCCTGAGGT CGATTGCTGCATGCAATGAA ATTCAACTAG(SEQ ID NO:5)。

[0678] 将上文所描述的经靶向的ES细胞作为供体ES细胞并通过小鼠工程改造方法引入8-细胞阶段的小鼠胚胎(参见例如美国专利号7,6598,442、
7,576,259、7,294,754)。通过使用改良的等位基因试验(Valenzuela等，2003)进行基因分型来鉴定携带人源化重链基因座的小鼠，所述基因座含有包括小鼠ADAM6a和ADAM6b序列的异位小鼠基因组序列，所述等位基因试验检测在人源化重链基因座中存在的小鼠ADAM6a和ADAM6b基因。

[0679] 可以将携带含有小鼠ADAM6a和ADAM6b基因的人源化重链基因座的小鼠与FLPe缺失小鼠品系(参见例如Rodríguez,C.I.等，(2000)High-efficiency deleter mice show that FLPe is an alternative to Cre-loxP(高效率缺失小鼠显示了FLPe可以替代Cre-loxP)Nature Genetics 25:139-140)繁殖，从而除去通过靶向载体引入的并且例如在ES细胞阶段或在胚胎中未被除去的任何Frt化的潮霉素表达盒。在小鼠中可任选地保留潮霉素表达盒。

[0680] 对胎仔进行基因分型，并选择针对人源化重链基因座的胎仔杂合子以用于鉴定小鼠ADAM6基因的表达和生育能力，所述基因座含有包括小鼠ADAM6a和ADAM6b序列的异位小鼠基因组片段。

[0681] 实施例8：ADAM6挽救小鼠的表征

[0682] 流式细胞术。将3只25周龄的针对人源重链和人源κ轻链可变基因座(H/κ)的小鼠纯合子和3只18-20周龄的针对具有在两个人源重链基因座的等位基因(H/κ-A6)中编码小鼠ADAM6a和ADAM6b基因的异位小鼠基因组片段的人源重链和人源κ轻链的小鼠纯合子处死，用于在BD LSR II系统(BD生物科学公司(BD Bioscience))上利用FACs鉴定和分析淋巴细胞群。针对特定细胞谱系对淋巴细胞进行门控，并通过不同的B细胞发育阶段对进展进行分析。从动物中收集的组织包括血液、脾脏和骨髓。将血液收集至含有EDTA的BD微量采血管(microtainer)中(BD生物科学公司)。通过使用补充了胎牛血清、丙酮酸钠、HEPES、2-巯基乙醇、非必需氨基酸和庆大霉素的完全RPMI培养基对股骨进行冲洗来收集骨髓。使用基于氯化铵的裂解缓冲液(例如ACK裂解缓冲液)对来自血液、脾脏和骨髓制备物的红细胞进行裂解，随后使用完全RPMI培养基洗涤。

[0683] 对于细胞群染色而言，将来自不同组织来源的1x106个细胞与抗-小鼠CD16/CD32(2.4G2,BD生物科学公司)在冰上孵育10分钟，随后使用下述抗体混合物中的一种或其组合在冰上标记30分钟。

[0684] 骨髓：抗-小鼠FITC-CD43(1B11,BL公司(BioLegend))、PE-ckit(2B8,BL公司)、PeCy7-IgM(II/41,e生物科学公司(eBioscience))、PerCP-Cy5.5-IgD(11-26c.2a,BL公司)、APC-eFluor780-B220(RA3-6B2,e生物科学公司)、A700-CD19(1D3,BD生物科学公司)。

[0685] 外周血和脾脏：抗-小鼠FITC-κ(187.1,BD生物科学公司)、PE-λ(RML-42,BL公司)、PeCy7-IgM(II/41,e生物科学公司)、PerCP-Cy5.5-IgD(11-26c.2a,BL公司)、APC-CD3(145-2C11,BD)、A700-CD19(1D3,BD)、APC-eFluor780-B220(RA3-6B2,e生物科学公司)。在使用标记抗体孵育后，洗涤细胞并使用2％甲醛固定。在LSRII流式细胞仪上进行数据采集并使用FlowJo进行分析。代表性H/κ和H/κ-A6小鼠的结果如图14-18所示。

[0686] 结果显示H/κ-A6小鼠的B细胞在B细胞发育阶段中的进展与H/κ小鼠骨髓和外周室中的方式类似，并且一旦其进入外周则显示出正常的成熟类型。与H/κ小鼠相比，int +H/κ-A6小鼠显示出增加的CD43 CD19 细胞群(图16B)。这可能表明在H/κ-A6小鼠中含有具有小鼠ADAM6a和ADAM6b序列的异位小鼠基因组片段的人源化重链基因座具有加速的IgM表达。在外周，H/κ-A6小鼠的B和T细胞群是正常的并且与H/κ小鼠相似。

[0687] 睾丸形态和精子表征。为确定在具有人源化免疫球蛋白重链可变基因座的小鼠中缺乏生育能力是否是由于睾丸和/或精子产生缺陷导致的，检测了睾丸形态和附睾的精子含量。

[0688] 简言之，从两组(第1组：针对人源重链和κ轻链可变基因座的小鼠纯合子，-/-mADAM6 ；第2组：针对人源重链可变基因座的小鼠杂合子和针对κ轻链可变基因座的纯+/-
合子，mADAM6 )每组5只小鼠中切下带有完好附睾的睾丸并称重。然后将标本固定，用石蜡包埋，切片并使用苏木素和伊红(HE)染色。针对形态缺陷和精子产生的证据对睾丸切片(每只小鼠2个睾丸，共计20个)进行检测，而针对精子的存在情况对附睾切片进行检测。

[0689] 在这项实验中，睾丸的重量或形态在mADAM6-/-小鼠和mADAM6+/-小鼠之间未观察到差异。在所有基因型中在睾丸和附睾中均观察到了精子。这些结果确定了缺乏小鼠ADAM6a和ADAM6b基因不会导致睾丸形态出现可检测的改变，并且在存在和缺乏这两种基-/-因的小鼠中均能够产生精子。因此，雄性ADAM6 小鼠的生育能力缺陷不可能是由于精子产生减少导致的。

[0690] 精子活力和迁移。因为在精子活力或迁移方面存在缺陷，缺乏其他ADAM基因家族成员的小鼠是不育的。将精子迁移定义为精子由子宫进入输卵管的能力，并且精子迁移通常是小鼠受精所必须的。为确定缺失小鼠ADAM6a和ADAM6b是否影响这一过程，在-/-mADAM6 小鼠中评估了精子迁移。也检测了精子活力。

[0691] 简言之，从下述小鼠的睾丸获得精子：(1)针对人源重链可变基因座是杂合子并+/-且针对人源κ轻链可变基因座是纯合子的小鼠(ADAM6 )；(2)针对人源重链可变基因座-/-
是纯合子并且针对人源κ轻链可变基因座是纯合子的小鼠(ADAM6 )；(3)针对人源重链-/-
可变基因座是纯合子和针对野生型κ轻链是纯合子的小鼠(ADAM6 mκ)；和(4)野生型C57BL/6小鼠(WT)。在通过检测的精子计数或总精子活力中未观察到明显的异常。对于所有小鼠而言，均观察到卵丘(cumulus)扩散，这表明在体外各精子样品均能够穿过卵丘细-/-
胞并与透明带结合。这些结果确定了ADAM6 小鼠具有能够穿过卵丘并与透明带结合的精子。

[0692] 通过使用来自上文所描述的小鼠的精子完成体外小鼠卵细胞的受精(IVF)。IVF-/-次日ADAM6 中存在的分裂胚胎的数量略有降低，以及与卵子结合的精子的数量降低。这-/-
些结果确定了来源于ADAM6 小鼠的精子一旦与卵细胞接触就能够穿过卵丘并与透明带结合。

[0693] 在另一项实验中，在精子迁移试验中确定了来自ADAM6-/-小鼠的精子由子宫迁移并且通过输卵管的能力。

[0694] 简言之，将第一组五只超排卵的雌性小鼠提供给五只ADAM6-/-雄性。将第二组五+/-只超排卵的雌性小鼠提供给五只ADAM6 雄性。观察交配配对情况，交配后5至6小时，从所有雌性中取出子宫及其附带的输卵管并且冲洗以供分析。检查冲洗溶液中的卵子以确认排卵并获得精子计数。采用两种不同的方法评估精子迁移。第一种，从子宫上取下两个输卵管，使用盐水冲洗，并且计数所有发现的精子。存在的卵子作为排卵的证据。第二种，保持将输卵管与子宫连接并且将两个组织均固定，石蜡包埋，切片并染色(如上文所述)。在子宫和两个输卵管中，针对精子的存在情况对切片进行检测。

[0695] 对于与五只ADAM6-/-雄性交配的五只雌性而言，在来自输卵管的冲洗溶液中仅发+/-现极少的精子。在来自与五只ADAM6 雄性交配的五只雌性的输卵管的冲洗溶液中，所显示-/-
出的精子水平约比来自与五只ADAM6 雄性交配的五只雌性的输卵管的冲洗溶液高25至
30倍(平均值，n＝10个输卵管)。

[0696] 制备子宫和输卵管的组织切片。针对子宫和输卵管(输卵管丘(colliculus tubarius))中精子的存在情况对切片进行检测。对输卵管和子宫的组织切片的检查发现-/-在与ADAM6 雄性交配的雌性小鼠中，在子宫中发现了精子而在输卵管中未发现。而且，来-/-
自与ADAM6 小鼠交配的雌性的切片显示在子宫输卵管连接(UTJ)未发现精子。在来自与+/-
ADAM6 小鼠交配的雌性的切片中，在UTJ中和在输卵管中均鉴定到了精子。

[0697] 这些结果确认了缺乏ADAM6a和ADAM6b基因的小鼠产生的精子显示出体内迁移缺陷。在所有的情况下，在子宫中均观察到了精子，这表明交配和精子释放显然是正常发生的，但是根据精子计数或组织学观察的检测，交配后在输卵管中仅观察到了很少量精子或未观察到精子。这些结果确认了缺乏ADAM6a和ADAM6b基因的小鼠产生的精子显示出不能由子宫迁移至输卵管。该缺陷显然会导致不具有生育能力，因为精子无法穿过子宫-输卵管连接而进入卵子受精的场所输卵管。总而言之，集中所有这些结果支持假设小鼠ADAM6基因有助于具有正常活力的精子直接迁移出子宫，通过子宫输卵管连接和输卵管，因此接近卵子来完成受精事件。该机制通过ADAM6实现，这可能直接通过作用于ADAM6蛋白，或者通过与如下文所述的精子细胞中的其他蛋白(例如其他ADAM蛋白)共同表达。

[0698] ADAM基因家族的表达。已知ADAM蛋白的复合物作为正在成熟的精子表面的复合物而存在。缺乏其他ADAM基因家族成员的小鼠随着精子的成熟而丢失该复合物，并且在成熟精子中显示出多种ADAM蛋白的减少。为确定是否缺乏ADAM6a和ADAM6b基因以类似方式影响其他ADAM蛋白，对来自睾丸(未成熟的精子)和附睾(正在成熟的精子)的蛋白提取物进行Western印迹分析以确定其他ADAM基因家族成员的表达水平。

[0699] 在这项实验中，分析来自四只ADAM6-/-和四只ADAM6+/-小鼠的蛋白提取物。结果显示在睾丸提取物中ADAM2和ADAM3的表达未受到影响。然而，在附睾提取物中ADAM2和-/-ADAM3都显著减少。这表明随着精子的成熟在ADAM6 小鼠的精子中缺乏ADAM6a和ADAM6b可能对其他ADAM蛋白(例如ADAM2和ADAM3)的表达和可能的功能具有直接影响。这表明ADAM6a和ADAM6b是精子表面ADAM蛋白复合物的一部分，这可能对正确的精子迁移至关重要。

[0700] 实施例9：在ADAM6挽救小鼠中人源重链可变基因的利用

[0701] 通过使用TAQMANTM探针的定量PCR试验(如上文所述)测定针对人源重链和κ轻链可变基因座是纯合子的小鼠而选定的人源重链可变基因的使用情况，所述基因座缺乏-/-小鼠ADAM6a和ADAM6b基因(mADAM6 )或者含有编码小鼠ADAM6a和ADAM6b基因的异位
+/+
基因组片段(ADAM6 ；参见实施例1)。

[0702] 简言之，使用小鼠CD19微珠(美天旎公司(Miltenyi Biotec))从mADAM6-/-和+/+ + TMADAM6 小鼠的脾脏中纯化CD19B细胞，并且使用RNEASY 微量试剂盒(凯杰公司
(Qiagen))纯化总RNA。使用无RNA酶的DNA酶柱上处理(凯杰公司)除去基因组RNA。
使用第一链cDNA合成试剂盒(英杰公司)将约200ng mRNA逆转录为cDNA，然后使用ABI TM
7900序列检测系统(应用生物系统公司(Applied Biosystems))利用TAQMAN 通用PCR混合(Universal PCR Master Mix)(应用生物系统公司)扩增。将各基因的相对表达标准化TM
至小鼠κ恒定(mCκ)。表9列出了在该实验中使用的正义/反义/TAQMAN MGB探针的
组合。

[0703] 表9

[0704]

[0705] 在这项实验中，在分析的样品中观察到了全部四种人源VH基因的表达。而且，-/- +/+在mADAM6 和ADAM6 小鼠中的表达水平相似。这些结果表明远离修饰位点(VH3-23和
VH1-69)和接近修饰位点(VH1-2和VH6-1)的人源VH基因均能够重组以形成功能性表达的人源重链。这些结果表明将包括小鼠ADAM6a和ADAM6b序列的异位基因组片段插入人源重链基因组序列不会影响在该基因座中人源重链基因区段的V(D)J重组，并且这些小鼠能够以正常形式重组人源重链基因区段以产生功能性重链免疫球蛋白。

[0706] 实施例10：小鼠免疫球蛋白轻链基因座的缺失

[0707] 使用 技术(参见例如美国专利号6,586,251和Valenzuela等，(2003)High-throughput engineering of the mouse genome coupled with
high-resolution expression analysis(与高分辨率表达分析偶联的小鼠基因组的高通量工程改造),Nature Biotech.21(6):652-659)修饰小鼠基因组细菌人工染色体(BAC)文库以制备多种靶向构建体以便将小鼠κ和λ轻链基因座失活。

[0708] 小鼠λ轻链基因座的缺失。通过同源重组修饰来自小鼠BAC克隆RP23-135k15(Invitrogen)的DNA以便通过经靶向的Vλ-Jλ-Cλ基因簇缺失将内源性小鼠λ轻链基因座失活(图20)。

[0709] 简言之，在使用靶向载体的单一靶向事件中将包括Vλ1-Jλ3-Cλ3-Jλ1-Cλ1基因区段的整个近端簇缺失，所述靶向载体包括位于翼侧有loxP位点的新霉素表达盒，以及包括Vλ1基因区段5’序列的5’小鼠同源臂和包括Cλ1基因区段3’序列的3’小鼠同源臂(图20，靶向载体1)。

[0710] 制备第二个靶向构建体以精确缺失含有Vλ2-Jλ2-Cλ2-Jλ4-Cλ4的远端内源性小鼠λ基因簇，除了所述靶向构建体含有包含Vλ2基因区段5’序列的5’小鼠同源臂和包含内源性Cλ2基因区段5’序列的3’小鼠同源臂以外(图20，靶向载体2)。因此，所述第二个靶向构建体精确地缺失Vλ2-Jλ2，同时在内源性小鼠λ基因座完好保留了Cλ2-Jλ4-Cλ4。通过本领域公知的染色体分型和筛选方法(例如 )来确证含有无活性内源性λ基因座的ES细胞(如本申请所述)。然后从经修饰的ES细胞中分离
DNA，并且使用CRE重组酶处理以介导含有新霉素标记物基因的近端靶向表达盒的缺失，仅在缺失点保留单一loxP位点(图20，下部)。

[0711] 小鼠κ轻链基因座的缺失。使用上文所描述的类似方法制备若干靶向构建体以便通过同源重组来修饰来自小鼠BAC克隆RP23-302g12和RP23-254m04(英杰公司)的DNA以便在两步过程中使小鼠κ轻链基因座失活(图21)。

[0712] 简言之，在使用靶向载体的单一靶向事件中缺失内源性小鼠κ轻链基因座的Jκ基因区段(1-5)，所述靶向载体包括潮霉素-胸苷激酶(hyg-TK)表达盒，在hyg-TK表达盒的3’含有单一的loxP位点(图21，Jκ靶向载体)。用于制备该靶向载体的同源臂含有内源性小鼠Jκ基因区段5’和3’的小鼠基因组序列。在第二个靶向事件中，制备第二个靶向载体以缺失最远端内源性小鼠Vκ基因区段上游(5’)的一部分小鼠基因组序列(图21，Vκ靶向载体)。该靶向载体含有插入的lox511位点、loxP位点和新霉素表达盒。用于制备该靶向载体的同源臂含有最远端小鼠Vκ基因区段上游的小鼠基因组序列。以顺序形式(即先Jκ然后Vκ)使用该靶向载体以便在ES细胞中靶向DNA。通过本领域公知的TM
染色体分型和筛选方法(例如TAQMAN )来确证携带经双靶向的染色体(即使用两个靶向载体靶向的单一内源性小鼠κ基因座)的ES。然后从经修饰的ES细胞中分离DNA并使用Cre重组酶处理，从而介导内源性小鼠Vκ基因区段和两个选择性表达盒的缺失，但保留彼此间方向相反的两个并列的DNA lox位点(图21，下部；SEQ ID NO:59)。

[0713] 这样，使用下文所述的靶向载体以精确的方式形成含有完好增强子和恒定区的两个经修饰的内源性轻链基因座(κ和λ)以逐步插入未经重排的人源λ生殖细胞系基因区段。

[0714] 实施例11：使用人源λ轻链微型基因座取代小鼠轻链基因座

[0715] 使用如上文所描述的类似方法工程改造多重靶向载体以逐步将人源λ基因区段插入内源性小鼠κ和λ轻链基因座。在内源性轻链基因座上制备多个独立起始的修饰，各产生嵌合轻链基因座，所述基因座含有与小鼠轻链恒定基因和增强子可操作地连接的hVλ和Jλ基因区段。

[0716] 含有12个人源Vλ和1个人源Jλ基因区段的人源λ微型基因座。使用称为RP11-729g4的人源BAC克隆(英杰公司)将一系列初始靶向载体工程改造以含有簇A的
前12个连续的人源Vλ基因区段和1个hJλ1基因区段或4个hJλ基因区段。图22A和
22B分别显示了被构建以制备在小鼠λ和κ轻链基因座上初始插入人源λ轻链基因区段的靶向载体。

[0717] 对于第一个初始靶向载体集合而言，将来自含有12个hVλ基因区段和1个hJλ1基因区段的729g4BAC克隆的124,125bp DNA片段工程改造以包含在hJλ1基因区段下游(3’)996bp的用于与3’小鼠同源臂连接的PI-SceI位点。使用两个不同的同源臂集合与该人源片段连接；一个同源臂集合含有来自135k15BAC克隆的内源性小鼠λ序列(图22A)和另一个集合含有分别来自小鼠BAC克隆RP23-302g12和RP23-254m04的小鼠Vκ和Jκ基因区段的5’和3’的内源性κ序列(图22B)。

[0718] 对于12/1-λ靶向载体(图22A)而言，将PI-SceI位点工程改造至27,847bpDNA片段的5’端，所述DNA片段含有实施例10所描述的经修饰的小鼠λ基因座的小鼠Cλ2-Jλ4-Cλ4和增强子2.4。通过与～124kb人源λ片段连接来使用～28kb小鼠片段作为3’端同源臂，这形成了3’连接，所述连接从5’至3’含有：hJλ1基因区段、hJλ1基因区段3’的996bp的人源λ序列、小鼠Cλ2基因5’的1229bp的小鼠λ序列、小鼠Cλ2基因和～28kb小鼠片段的剩余部分。人源Vλ3-12基因区段上游(5’)是在5’小鼠同源臂起始前的附加的1456bp人源λ序列，其含有与内源性小鼠λ基因座的5’序列对应的
23,792bp的小鼠基因组DNA。在5’同源臂和人源λ序列起始之间是翼侧为Frt位点的新霉素表达盒。

[0719] 因此，12/1-λ靶向载体从5’至3’包括：含有内源性λ基因座5’的～24kb的小鼠λ基因组序列的5’同源臂、5’Frt位点、新霉素表达盒、3’Frt位点、含有前12个连续的hVλ基因区段和1个hJλ1基因区段的～123kb的人源基因组λ序列、PI-SceI位点、和含有～28kb小鼠基因组序列的3’同源臂，所述～28kb小鼠基因组序列包括内源性Cλ2-Jλ4-Cλ4基因区段、小鼠增强子2.4序列和增强子2.4下游(3’)其他的小鼠基因组序列(图22A)。

[0720] 以类似的方式，使用12/1-κ靶向载体(图22B)以使得通过同源重组能够实现靶向至内源性κ基因座，所述12/1-κ靶向载体除了小鼠同源臂含有小鼠κ序列以外使用相同的～124人源λ片段的。因此，所述12/1-κ靶向载体从5’至3’包括：含有内源性κ基因座5’的～23kb小鼠基因组序列的5’同源臂、I-CeuI位点、5’Frt位点、新霉素表达盒、3’Frt位点、含有前12个连续的hVλ基因区段和1个hJλ1基因区段的～124kb的人源基因组λ序列、PI-SceI位点、和含有～28kb小鼠基因组序列的3’同源臂，所述～28kb小鼠基因组序列包括内源性小鼠Cκ基因、Eκi和Eκ3’以及Eκ3’下游(3’)其他的小鼠基因组序列(图22B，12/1-κ靶向载体)。

[0721] 与这两个初始靶向载体之一同源重组形成经修饰的小鼠轻链基因座(κ或λ)，所述基因座含有与内源性小鼠轻链恒定基因和增强子基因(Cκ或Cλ2和Eκi/Eκ3’或Enh2.4/Enh 3.1)可操作地连接的12个hVλ基因区段和1个hJλ1基因区段，其通过重组导致形成嵌合的λ轻链。

[0722] 具有12个人源Vλ和4个人源Jλ基因区段的人源λ微型基因座。在另一种增加嵌合λ轻链基因座的多样性的方式中，对第三个初始靶向载体进行工程改造以便将来自簇A的前12个连续的人源Vλ基因区段和hJλ1、2、3和7基因区段插入小鼠κ轻链基因座(图22B，12/4-κ靶向载体)。通过从头DNA合成(集成DNA技术公司(Integrated DNA Technologies))来制备含有hJλ1、Jλ2、Jλ3和Jλ7基因区段的DNA区段，所述区段包括各Jλ基因区段和紧邻各Jλ基因区段的5’和3’区的～100bp的人源基因组序列。将PI-SceI位点工程改造至该～1kb DNA片段的3’端并且与氯霉素表达盒连接。由相对于人源BAC克隆729g4的hJλ1基因区段5’和3’位置的人源λ序列来PCR扩增同源臂。在经过修饰的729g4BAC克隆上使用该中间靶向载体进行同源重组，所述克隆此前已靶向至具有翼侧为Frt位点的新霉素表达盒的人源Vλ3-12基因区段的上游(5’)，所述克隆还含有在5’Frt位点5’的I-CeuI位点。所述经双重靶向的729g4BAC克隆从5’至3’包括：I-CeuI位点、5’Frt位点、新霉素表达盒、3’Frt位点、含有前12个hVλ基因区段的～
123kb片段、含有人源Jλ1、2、3和7基因区段的～1kb片段、PI-SceI位点以及氯霉素表达盒。同时使用I-CeuI和PI-SceI消化该中间靶向载体并且随后连接至经修饰的小鼠BAC克隆(如上文所述)以形成第三个靶向载体。

[0723] 该连接产生了用于将人源λ序列插入内源性κ轻链基因座的第三个靶向载体，所述靶向载体从5’至3’包括：含有内源性小鼠κ基因座5’的～23kb基因组序列的5’小鼠同源臂、I-CeuI位点、5’Frt位点、新霉素表达盒、3’Frt位点、含有前12个hVλ基因区段的～123kb片段、含有hJλ1、2、3和7基因区段的～1kb片段、PI-SceI位点、和含有～28kb小鼠基因组序列的3’同源臂，所述～28kb小鼠基因组序列包括内源性小鼠Cκ基因、Eκi和Eκ3’以及Eκ3’下游(3’)其他的小鼠基因组序列(图22B，12/4-κ靶向载体)。使用该第三个靶向载体同源重组以形成经修饰的小鼠κ轻链基因座，所述基因座含有与内源性小鼠Cκ基因可操作地连接的12个hVλ基因区段和4个hJλ基因区段，其通过同源重组导致形成嵌合的人源λ/小鼠κ轻链。

[0724] 具有整合的人源κ轻链序列的人源λ微型基因座。以类似的方式，将与工程改造以制备将人源λ基因区段初始插入内源性κ轻链基因座的那些载体(图22B，12/1-κ和12/4-κ靶向载体)类似的两个附加靶向载体工程改造，从而使用含有连续的人源λ和κ基因组序列的独特构建的靶向载体逐步插入人源λ轻链基因区段。将这些靶向载体构建成包括天然地位于人源Vκ4-1和Jκ1基因区段之间的～23kb人源κ基因组序列。该人源κ基因组序列特别地位于这两个附加的靶向载体中的人源Vλ和人源Jλ基因区段之间(图22B，12(κ)1-κ和12(κ)4-κ靶向载体)。

[0725] 使用如上文所描述的经修饰的RP11-729g4BAC克隆来制备含有人源κ基因组序列的两个靶向载体(图24)。使用翼侧为NotI和AsiSI限制性位点的大观霉素选择性表达盒将该经修饰的BAC克隆靶向(图24，左上)。使用大观霉素表达盒进行同源重组结果产生经双重靶向的729g4BAC克隆，所述克隆从5’至3’包括：I-CeuI位点、5’Frt位点、新霉素表达盒、3’Frt位点、含有前12个hVλ基因区段的～123kb片段、在hVλ3-1基因区段的九聚体序列上下游(3’)约200bp的NotI位点、大观霉素表达盒和AsiSI位点。两次独立地靶向含有人源κ序列的单独的人源BAC克隆(CTD-2366j12)，从而工程改造位于hVκ4-1和hJκ1基因区段之间的限制性位点以使得随后克隆～23kb片段用于与经双重靶向修饰的729g4BAC克隆中所含的hVλ基因区段连接(图24，右上)。

[0726] 简言之，2366j12BAC克隆的尺寸为约132kb并且含有hVκ基因区段1-6、1-5、2-4、7-3、5-2、4-1，Vκ基因区段下游的人源κ基因组序列，hJκ基因区段1-5，hCκ以及人源κ基因座约20kb的附加基因组序列。首先使用靶向载体将该克隆靶向，所述靶向载体含有翼侧为Frt位点的潮霉素表达盒和3’Frt位点下游(3’)的NotI位点。在BAC克隆中该靶向载体的同源臂含有Vκ基因区段5’和3’的人源基因组序列，以使得通过使用该靶向载体的同源重组，所述Vκ基因区段缺失且NotI位点被工程改造至hVκ4-1基因区段下游～133bp(图24，右上)。独立地使用两个靶向载体将该经修饰的2366j12BAC克隆在3’的靶向，以缺失具有氯霉素表达盒的hJκ基因区段，所述缺失的区段还含有hJλ1基因区段、PI-SceI位点和AsiSI位点或者包含4个hJλ基因区段的人源λ基因组片段(同上)、PI-SceI位点和AsiSI位点(图24，右上)。这两个类似靶向载体的同源臂含有hJκ基因区段的5’和3’序列。将这些第二靶向载体与经修饰的2366j12BAC克隆同源重组以产生经双重靶向的2366j12克隆，所述2366j12克隆从5’至3’包括：5’Frt位点、潮霉素表达盒、3’Frt位点、NotI位点、含有在Vκ4-1和Jκ1基因区段之间的基因间区的人源κ基因座的22,800bp基因片段、hJλ1基因区段或者含有hJλ1、Jλ2、Jλ3和Jλ7的人源λ基因组片段、PI-SceI位点和氯霉素表达盒(图24，右上)。通过使用经双重靶向的729g4和2366j12克隆利用两个连接步骤获得两个最终的靶向载体以制备两个附加修饰。

[0727] 使用NotI和AsiSI将经双重靶向的729g4和2366j12克隆消化以产生含有新霉素表达盒和hVλ基因区段的一个片段以及含有人源κ基因座～23kb基因组片段的另一个片段，所述～23kb基因组片段分别含有Vκ4-1and Jκ1基因区段之间的基因间区、hJλ1基因区段或者含有hJλ1、Jλ2、Jλ3和Jλ7基因区段的基因组片段、PI-SceI位点和氯霉素表达盒。将这些片段连接产生两个独特的BAC克隆，所述克隆从5’至3’包括：hVλ基因区段、Vκ4-1和Jκ1基因区段之间的人源κ基因组序列、hJλ1基因区段或者含有hJλ1、Jλ2、Jλ3和Jλ7基因区段的基因组序列、PI-SceI位点和氯霉素表达盒(图24，下部)。然后使用I-CeuI和PI-SceI将这些新的BAC克隆消化以释放独特的片段，所述片段含有上游新霉素表达盒以及连续的人源λ和κ序列，并且将其连接至经修饰的小鼠BAC克隆302g12，所述克隆从5’至3’包括：内源性κ基因座的5’小鼠基因组序列、I-CeuI位点、5’Frt位点、新霉素表达盒、3’Frt位点、hVλ基因区段(3-12至3-1)、Vλ3-1下游～200bp的NotI位点、在人源Vκ4-1和Jκ1基因区段之间天然存在的～23kb人源κ序列、hJλ1基因区段或者含有hJλ1、Jλ2、Jλ3和Jλ7基因区段的基因组片段、小鼠Eκi、小鼠Cκ基因和Eκ3’(图22，12hVλ-VκJκ-hJλ1和12hVλ-VκJκ-4hJλ靶向载体)。
将这两个靶向载体均同源重组以形成两个独立地经修饰的小鼠κ轻链基因座，所述基因座含有与内源性小鼠Cκ基因可操作地连接的12个hVλ基因区段、人源κ基因组序列和
1个或4个hJλ基因区段，其通过重组导致形成嵌合的人源λ/小鼠κ轻链。实施例12：
将附加的人源Vλ基因区段工程改造至人源Vλ轻链微型基因座

[0728] 使用类似的靶向载体和方法将附加的hVλ基因区段独立地加入至实施例11中所描述的各初始修饰(图23A，+16-λ靶向载体和图23B，+16-κ靶向载体)。

[0729] 引入16个附加的人源Vλ基因区段。在构建靶向载体中使用了上游(5’)同源臂，所述靶向载体用于将16个附加的hVλ基因区段加入实施例11中所描述的经修饰的轻链基因座，所述基因座含有内源性κ或λ轻链基因座5’的小鼠基因组序列。所有靶向载体的3’同源臂均是相同的并且所述3’同源臂含有与实施例11中所描述的修饰的人源λ序列5’端重叠的人源基因组序列。

[0730] 简言之，将两个靶向载体工程改造以便将16个附加的hVλ基因区段引入实施例11中所描述的经修饰的小鼠轻链基因座(图23A和5B，+16-λ或+16-κ靶向载体)。将来自人源BAC克隆RP11-761l13(英杰公司)的、含有来自簇A的21个连续的hVλ基因区段的～172kb DNA片段工程改造，以具有含有内源性κ或λ轻链基因座5’小鼠基因组序列的5’同源臂和含有人源基因组λ序列的3’同源臂。在这些靶向构建体中使用的5’小鼠κ或λ同源臂与实施例11中所描述的5’同源臂相同(图23A和23B)。3’同源臂包
括人源基因组λ序列的53,057bp重叠，所述重叠对应于实施例11中所描述的人源基因组λ序列～123kb片段等效的5’端。这两个靶向载体从5’至3’包括：含有内源性小鼠κ轻链基因座5’的～23kb的基因组序列或内源性λ轻链基因座5’的～24kb的小鼠基因组序列的5’小鼠同源臂、5’Frt位点、潮霉素表达盒、3’Frt位点和含有21个连续的hVλ基因区段的171,457bp的人源基因组λ序列，所述人源基因组λ序列中的～53kb与实施例12中所描述的人源λ序列的5’末端重叠并作为该靶向构建体的3’同源臂(图23A和
23B，+16-λ或+16-κ靶向载体)。将这些靶向载体同源重组以形成独立地修饰的小鼠κ和λ轻链基因座，所述基因座各自含有与内源性小鼠恒定基因(Cκ或Cλ2)可操作地连接的28个hVλ基因区段和1个hJλ1基因区段，其通过重组导致形成嵌合的轻链。

[0731] 以类似方式，亦使用+16-κ靶向载体将16个附加的hVλ基因区段引入实施例11中所描述的其他初始修饰，这引入了具有或不具有整合的人源κ序列的多个hJλ基因区段(图22B)。使用该靶向载体在含有其他初始修饰的内源性小鼠κ基因座上同源重组以形成含有与内源性小鼠Cκ基因可操作地连接的28个hVλ基因区段和具有或不具有人源Vκ-Jκ基因组序列的hJλ1、2、3和7基因区段的小鼠κ轻链基因座，其通过重组导致形成嵌合的λ-κ轻链。

[0732] 引入12个附加的人源Vλ基因区段。使用类似的靶向载体和方法将附加的hVλ基因区段独立地加入到上文所描述的各修饰。由含有附加的hVλ基因区段的靶向载体同源重组产生的最终的基因座结构见图25A和25B。

[0733] 简言之，将靶向载体工程改造以便将12个附加的hVλ基因区段引入如上文所描述的经修饰的小鼠κ和λ轻链基因座(图23A和23B，+12-λ或12-κ靶向载体)。将来自人源BAC克隆RP11-22I18(英杰公司)的、含有来自簇B的12个连续的hVλ基因区段的93,674bp DNA片段工程改造，以具有含有内源性κ或λ轻链基因座5’的小鼠基因组序列的5’同源臂和含有人源基因组λ序列的3’同源臂。在该靶向构建体中使用的5’同源臂与用于上文所描述的用于加入16个hVλ基因区段的5’同源臂相同(图23A和23B)。3’同源臂由将PI-SceI位点工程改造至人源Vλ3-29P基因区段5’的～3431bp来制备，所述基因区段包含在来自BAC克隆RP11-761I13的人源λ序列的27,468bp基因组区段中。将该PI-SceI位点作为连接点以便将附加的人源λ序列的～94kb片段与人源λ序列的～
27kb片段连接，所述人源λ序列与在使用+16-λ或+16-κ靶向载体的前述修饰中的人源λ序列的5’末端重叠(图23A和23B)。这两个靶向载体从5’至3’包括：含有内源性小鼠κ轻链基因座5’的～23kb的小鼠基因组序列或内源性λ轻链基因座5’的～24kb的小鼠基因组序列的5’同源臂、5’Frt位点、新霉素表达盒、3’Frt位点和含有16个hVλ基因区段和PI-SceI位点的121,188bp的人源基因组λ序列，所述人源基因组λ序列的～
27kb与16个附加hVλ基因区段插入的人源λ序列的5’端重叠并作为该靶向构建体的
3’同源臂(图23A和23B，+12-λ或12-κ靶向载体)。将这些靶向载体同源重组以独立地形成经修饰的小鼠κ和λ轻链基因座，所述基因座含有与内源性小鼠恒定基因(Cκ或Cλ2)可操作地连接的40个hVλ基因区段和1个人源Jλ1，其通过重组导致形成嵌合的轻链(图23A和23B的底部)。

[0734] 以类似方式，亦使用+12-κ靶向载体将12个附加的hVλ基因区段引入到其他初始修饰，这引入了具有或不具有整合的人源κ序列的多个hJλ基因区段(图22B)。使用该靶向载体在含有其他修饰的内源性小鼠κ基因座上同源重组以形成含有与内源性小鼠Cκ基因可操作地连接的40个hVλ基因区段和具有或不具有人源Vκ-Jκ基因组序列的hJλ1、2、3和7基因区段的小鼠κ轻链基因座，其通过重组导致形成嵌合的λ-κ轻链。

[0735] 实施例13：携带人源λ轻链基因区段的经靶向的ES细胞的鉴定

[0736] 将根据前述实施例制备的经靶向的BAC DNA电穿孔至小鼠ES细胞以形成经修饰的ES细胞，以用于产生表达人源λ轻链基因区段的嵌合的小鼠。通过定量 检测鉴定含有未经重排的人源λ轻链基因区段插入的ES细胞。设计用于插入人源λ序列和相关的选择性表达盒(获得等位基因，GOA)、丢失内源性小鼠序列和任意选择性表达盒(丢失等位基因，LOA)以及保留翼侧小鼠序列(等位基因保留，AR)的特异性引物集合和探针。对于各附加的人源λ序列插入而言，使用附加的引物集合和探针以确证附加的人源λ序列的存在情况，以及使用前述的引物集合和探针以确证前述经靶向的人源序列的保留情况。表10中列出了在定量PCR检测中使用的引物和相关探针。表11列出了用于确证在ES细胞克隆中插入各部分人源λ轻链基因区段的组合。

[0737] 任选地使用表达FLP的构建体来转染携带人源λ轻链基因区段的ES细胞，从而除去Frt化的新霉素表达盒，所述表达盒通过插入含有人源Vλ5-52–Vλ1-40基因区段的靶向构建体来引入(图23A和23B)。可以任选地通过与表达FLP重组酶的小鼠繁殖来除去新霉素表达盒(例如US 6,774,279)。在小鼠中可任选地保留新霉素表达盒。

[0738] 表10

[0739]

[0740] 表11

[0741]

[0742]

[0743] 实施例14：产生由内源性轻链基因座表达人源λ轻链的小鼠

[0744] 通过 方法使用上文所描述的靶向ES细胞作为供体ES细胞并将其引入8-细胞阶段的小鼠胚胎(参见例如美国专利号7,294,754和Poueymirou
等，(2007)F0generation mice that are essentially fully derived from the
donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses( 基
本完全来源于供体基因靶向的ES细胞的F0代小鼠可以立即进行表型分析)Nature
Biotech.25(1):91-99)。通过基因分型方法鉴定了 (F0小鼠完全来源于
供体ES细胞)独立地携带人源λ基因区段，所述基因分型使用检测独特的人源λ基因区段存在情况(同上)的改良的等位基因检测(Valenzuela等，同上)。

[0745] 携带人源λ轻链基因区段小鼠的κ:λ轻链使用情况。使用流式细胞术针对脾细胞中κ和λ轻链的表达情况，对针对具有单一hJλ基因区段的hVλ基因区段的三个连续插入之一的小鼠纯合子(图23B)以及针对具有包括人源Vκ-Jκ基因组序列的单一hJλ基因区段或四个人源Jλ基因区段的hVλ基因区段的第一个插入的小鼠纯合子(图22B)进行分析。

[0746] 简言之，从小鼠的组(范围为每组3至7只动物)中收集脾脏并使用载玻片研磨。在使用ACK裂解缓冲液(龙沙沃克斯维尔公司(Lonza Walkersville))裂解红细胞(RBC)后，使用针对下述具有特异性并与抗体偶联的荧光染料对脾细胞染色：小鼠CD19(克隆1D3；BD生物科学公司)、小鼠CD3(17A2；BL公司)、小鼠Igκ(187.1；BD生物科学公司)TM
和小鼠Igλ(RML-42；BL公司)。使用BD LSR II流式细胞仪(BD生物科学公司)采集数TM
据并使用FLOWJO 软件(TS公司(Tree Star,Inc.))分析。表12列出了在来自携带各基+ + + –
因修饰的动物组的脾细胞中所观察到的B细胞(CD19)、κ轻链(CD19IgκIgλ )和λ
+ – +
轻链(CD19Igκ Igλ)表达情况的平均百分率值。

[0747] 在一项类似的实验中，使用流式细胞术(如上文所述)针对Igκ和Igλ表达情况，对针对来自包括了与小鼠Cκ基因可操作地连接的人源Vκ-Jκ基因组序列的12个hVλ和4个hJλ基因区段的第一个插入的小鼠纯合子(图22B的下部)以及针对40个hVλ和1个hJλ基因区段的小鼠纯合子(图23B的下部或图25B的上部)的脾脏室的B
+
细胞内容物进行分析。图26A显示了各组中代表性小鼠CD19B细胞中的Igλ和Igκ的
+
表达情况。还针对各只小鼠记录了每个脾脏中CD19B细胞的数量(图26B)。

[0748] 在另一项实验中，通过使用多种细胞表面标记物的流式细胞术针对B细胞发育的进展情况，对针对来自包括与小鼠Cκ基因可操作地连接的人源Vκ-Jκ基因组序列的40个hVλ和4个hJλ基因区段的小鼠纯合子(图26B的底部)的脾脏和骨髓室的B细胞内容物进行了分析。

[0749] 简言之，将两组(均为N＝3，9-12周龄，雄性和雌性)野生型以及针对包括与小鼠Cκ基因可操作地连接的人源Vκ-Jκ基因组序列的40个hVλ和4个hJλ基因区段的小鼠纯合子处死，并收集脾脏和骨髓。通过使用完全RPMI培养基(补充了胎牛血清、丙酮酸钠、Hepes、2-巯基乙醇、非必需氨基酸和庆大霉素的RPMI培养基)冲洗从股骨中收集骨髓。使用ACK裂解缓冲液(龙沙沃克斯维尔公司)裂解来自脾脏和骨髓制备物的RBC，随
6
后使用完全RPMI培养基洗涤。将1x10 个细胞与抗-小鼠CD16/CD32(2.4G2,BD生物科学公司)在冰上孵育10分钟，随后使用所选择的抗体组在冰上标记30min。

[0750] 骨 髓 组：抗 - 小 鼠FITC-CD43(1B11,BL 公 司 )、PE-ckit(2B8,BL 公 司 )、PeCy7-IgM(II/41,e 生 物 科 学 公 司 )、PerCP-Cy5.5-IgD(11-26c.2a,BL 公 司 )、APC-B220(RA3-6B2,e生物科学公司)、APC-H7-CD19(ID3,BD)和Pacific Blue-CD3(17A2,BL公司)。

[0751] 骨髓和脾脏组：抗-小鼠FITC-Igκ(187.1,BD)、PE-Igλ(RML-42,BL公司)、PeCy7-IgM(II/41,e生物科学公司)、PerCP-Cy5.5-IgD(11-26c.2a,BL公司)、Pacific Blue-CD3(17A2,BL公司)、APC-B220(RA3-6B2,e生物科学公司)、APC-H7-CD19(ID3,BD)。

[0752] 染色后，洗涤细胞并使用2％的甲醛固定。使用FACSCANTOLLIITM流式细胞仪(BDTM生物科学公司)采集数据并使用FLOWJO 软件(TS公司)分析。图27A-27D显示了各组中
1只代表性小鼠的脾脏室的结果。图28A-28E显示了各组中1只代表性小鼠的骨髓室的结+
果。表13列出了在来自携带各种基因修饰的动物组的脾细胞中观察到的B细胞(CD19)、+ + – + – +
κ轻链(CD19IgκIgλ )和λ轻链(CD19Igκ Igλ)表达情况的平均百分率值。表
14列出了在野生型以及针对包括与小鼠Cκ基因可操作地连接的人源Vκ-Jκ基因组序+
列的40个hVλ和4个hJλ基因区段的小鼠纯合子的骨髓中观察到的B细胞(CD19)、成
hi + int +
熟的B细胞(B220 IgM)、未成熟的B细胞(B220 IgM)、表达κ轻链的未成熟的B细胞
int + + int + +
(B220 IgMIgκ)和表达λ轻链的未成熟的B细胞(B220 IgMIgλ)的平均百分率值。
使用附加的上文所描述的小鼠的组来重复该实验并且显示出了类似的结果(数据未列出)[0753] 表12

[0754]

[0755] 表13

[0756]

[0757] 表14

[0758]

[0759] 在携带人源λ轻链基因区段的小鼠中人源Vλ基因的使用情况。使用从脾细胞中分离的RNA通过逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)针对人源λ轻链基因的使用情况，对针对人源λ序列的第一个插入的小鼠纯合子(hVλ3-12–hVλ3-1和hJλ1，图23B)和针对人源λ序列的第三个插入的纯合子(hVλ5-52–hVλ3-1和hJλ1，图23B)进行分析。

[0760] 简言之，收集脾脏并在一次性无菌袋中使用10mL含5％HI-FBS的RPMI-1640(西TM格玛公司)进行灌流。各个袋中均含有一个脾脏，并且将袋置于STOMACHER (舒沃公司)中并中档匀浆处理30秒。使用0.7μm细胞筛过滤已匀浆处理的脾脏，然后离心(1000rpm持TM
续10分钟)形成球团，并且使用BD PPHAR LYSE (BD生物科学公司)将RBC裂解3分钟。
使用RPMI-1640稀释脾细胞并再次离心，随后将其重悬于1mL PBS(欧文科学公司(Irvine Scientific))中。使用本领域公知的标准技术从形成球团的脾细胞中分离RNA。

[0761] 使用对人源hVλ基因区段和小鼠Cκ基因具有特异性的引物对脾细胞RNA进行RT-PCR(表15)。对PCR产物进行凝胶纯化、克隆至pCR2.1-TOPO TA载体(英杰公司)并使用位于在载体中克隆位点翼侧位置的M13正向引物(GTAAAACGAC GGCCAG；SEQ ID NO:113)和M13反向引物(CAGGAAACAG CTATGAC；SEQ ID NO:114)扩增。将来源于人源λ序列的第一个和第三个插入的84个总克隆测序以确定hVλ基因的使用情况(表16)。选定的RT-PCT克隆的hVλ-hJλ1-mCκ连接的核苷酸序列见图29。

[0762] 以类似方式，使用分离自脾细胞的RNA通过RT-PCR(如上文所述)针对人源λ轻链基因的使用情况，对针对与内源性小鼠Cκ基因可操作地连接的人源λ轻链基因序列(即包括人源Vκ-Jκ基因组序列的40个hVλ基因区段和4个hJλ基因区段，图25B的下部)的第三个插入的小鼠纯合子进行分析。针对26个选定的RT-PCR克隆的人源λ轻链基因区段的使用情况见表17。选定的RT-PCR克隆的hVλ-hJλ-mCκ连接的核苷酸序列见图30。

[0763] 以类似方式，使用分离自脾细胞的RNA通过RT-PCR(如上文所述)针对人源λ轻链基因的使用情况，对针对与内源性小鼠Cλ2基因可操作地连接的人源λ轻链基因区段(12个hVλ基因区段和hJλ1，图22A和图23A)的第一个插入的小鼠纯合子进行分析。将hVλ基因区段的特异性引物(表15)与小鼠Cλ2基因；Cλ2-1(SEQ ID NO:162)或
Cλ2-2(SEQ ID NO:163)的两个特异性引物之一配对。

[0764] 从在内源性小鼠λ轻链基因座上携带人源λ轻链基因区段的小鼠的RT-PCR克隆中观察到多个hVλ基因区段重排至hλ1。选定的RT-PCT克隆的hVλ-hJλ-mCλ2连接的核苷酸序列见图31。

[0765] 表15

[0766]

[0767]

[0768] 表16 表17

[0769]

[0770]

[0771] 图29显示了携带具有单一hJλ基因区段的hVλ基因区段的第一个和第三个插入的小鼠的RT-PCR克隆的hVλ-hJλ1-mCκ连接的序列。图29中显示的序列显示了涉及与小鼠Cκ基因结合的、具有hJλ1的不同hVλ基因区段的独特的重排。携带包括12个hVλ基因区段和hJλ1的单一经修饰的内源性κ基因座的杂合子小鼠以及携带包括40个hVλ基因区段和hJλ1的两个经修饰的内源性κ基因座的纯合子小鼠均能够产生与小鼠Cκ基因可操作地连接的人源λ基因区段并且产生表达人源λ轻链的B细胞。这些重排表明在这些小鼠多个独立的B细胞中所述嵌合基因座能够独立地重排人源λ基因区段。而且，观察到16个不同的hVλ基因区段与hJλ1重排的证据表明，对内源性κ轻链基因座的这些修饰不会导致任何hVλ基因区段不可用或阻止所述嵌合基因座在B细胞发育过程中重组多个hVλ和hJλ(Jλ1)基因区段(表16)。而且，这些小鼠制备功能性抗体，所述抗体包含作为内源性免疫球蛋白轻链库的一部分的、与小鼠Cκ基因可操作地连接的经重排的人源Vλ-Jλ基因区段。

[0772] 图30显示了来自针对包括人源Vκ-Jκ基因组序列的40个hVλ和4个hJλ基因区段的小鼠纯合子的选定的RT-PCR克隆的hVλ-hJλ-mCκ连接的序列。图30中显示的序列表明附加的独特重排涉及多个不同的hVλ基因区段，跨整个嵌合基因座，具有多个不同的经重排的并且与小鼠Cκ基因可操作地连接的hJλ基因区段。携带含有40个hVλ和4个hJλ基因区段的经修饰的内源性κ基因座的纯合小鼠还能够产生与小鼠Cκ基因可操作地连接的人源λ基因区段并且产生表达人源λ轻链的B细胞。这些重排进一步表明所有阶段的嵌合基因座均能够在这些小鼠的多个独立的B细胞中独立地重排人源λ基因区段。而且，在26个选定的RT-PCR克隆中观察到12个不同的hVλ基因区段与全部4个hJλ基因区段重排的证据表明，对内源性κ轻链基因座的这些附加的修饰表明对人源λ基因区段的各个插入均不会导致任何hVλ和/或Jλ基因区段不可用或阻止所述嵌合基因座在B细胞发育过程中重组hVλ和hJλ基因区段(表17)。而且，这些小鼠也制备功能性抗体，所述抗体包含作为内源性免疫球蛋白轻链库一部分的、与小鼠Cκ区可操作地连接的人源Vλ-Jλ基因区段。

[0773] 图31显示了来自针对12个hVλ基因区段和hJλ1的小鼠纯合子的三个单独的RT-PCR克隆的hVλ-hJλ-mCλ2连接的序列。图31中显示的序列表明附加的独特重排涉及不同的hVλ基因区段、跨第一个插入的长度、具有经重排的和与小鼠Cλ2基因可操作地连接的hJλ1(2D1＝Vλ2-8Jλ1；2D9＝Vλ3-10Jλ1；3E15＝Vλ3-1Jλ1)。一个克隆表明由于在hVλ-hJλ连接的N加入导致了非产生性(nonproductive)的重排(2D1，图31)。这在V(D)J重组中并不是不常见的，因为在重组过程中基因区段的连接已显示出是不精确的。尽管该克隆表示在这些小鼠的轻链库中存在非产生性的重组，但是这表明对抗体基因间的连接多样性起作用的这种遗传机制在这些小鼠中操作正常并且产生了含有多样性更高的轻链的抗体库。

[0774] 携带含有12个hVλ基因区段和hJλ1的经修饰的内源性λ基因座的纯合小鼠能够产生与内源性小鼠Cλ基因可操作地连接的人源λ基因区段并且产生表达反向嵌合λ轻链的B细胞，所述λ轻链含有与小鼠Cλ区连接的hVλ区。这些重排进一步表明位于其他轻链基因座(即λ基因座)的人源λ轻链基因区段能够在这些小鼠多个独立的B细胞中独立地重排人源λ基因区段。而且，对内源性λ轻链基因座的修饰表明人源λ基因区段的插入不会导致任何hVλ和/或hJλ1基因区段不可用或阻止所述嵌合基因座在B细胞发育过程中重组hVλ和hJλ1基因区段。而且，这些小鼠也制备功能性抗体，所述抗体包含作为内源性免疫球蛋白轻链库一部分的、与小鼠Cλ区可操作地连接的人源Vλ-Jλ基因区段。

[0775] 如该实施例所示，在内源性κ和λ轻链基因座携带人源λ轻链基因区段的小鼠能够重排人源λ轻链基因区段并且在小鼠Cκ和/或Cλ区背景下表达这些基因区段以作为小鼠正常抗体库的一部分，因为在脾脏和骨髓的B细胞发育中的各个检验点均需要功能性的轻链。而且，与野生型窝仔相比，在这些小鼠中B细胞的早期亚集合(例如前B细胞、原B细胞和过渡期B细胞)显示了正常的表型(图27D、28A和28B)。在骨髓和外周B细胞群中观察到了小的缺陷，这可能是由于自身反应性未成熟B细胞亚集合的缺失和/或人源λ轻链与小鼠重链的非最佳结合导致的。然而，在这些小鼠中所观察到的Igκ/Igλ的使用情况表明与在小鼠中所观察到的相比，这一情况更加类似人源轻链的表达情况。

[0776] 实施例15：表达来自内源性轻链基因座的人源λ轻链的小鼠的繁殖

[0777] 为了优化人源λ基因区段在内源性小鼠轻链基因座的使用情况，将携带未经重排的人源λ基因区段的小鼠与另一只在反向内源性轻链基因座(κ或λ)含有缺失的小鼠繁殖。例如，位于内源性κ基因座的人源λ基因区段将是小鼠中存在的唯一的功能性轻链基因区段，所述小鼠在内源性λ轻链基因座还携带缺失。以这种方式，所获得的后代将仅表达如前述实施例中所描述的人源λ轻链。采用本领域公知的标准技术或者委托商业公司例如杰克逊实验室公司进行繁殖。针对存在独特的反向嵌合(人源-小鼠)λ轻链和缺乏内源性小鼠λ轻链，对在内源性κ基因座携带人源λ轻链基因区段并且缺失内源性λ轻链基因座的小鼠品系进行筛选。

[0778] 还将携带未经重排的人源λ轻链基因座的小鼠与含有内源性小鼠重链可变基因座被人源重链可变基因座取代的小鼠繁殖(参见US 6,596,541，瑞恩泽制药公司(Regeneron Pharmaceuticals)， 基因工程小鼠)。
小鼠部分地包括，具有包括与内源性小鼠恒定区基因座可操作地连接的人源重链可变区的基因组，以使得所述小鼠针对抗原刺激而产生包括人源重链可变区和小鼠重链恒定区的抗体。可以将编码抗体重链可变区的DNA分离并且与编码人源重链恒定区的DNA可操作地连接。然后在能够表达抗体的全人源重链的细胞中表达所述DNA。根据适宜的繁殖方案，获得携带内源性小鼠重链基因座被人源重链基因座取代以及在内源性κ轻链基因座具有未经重排的人源λ轻链基因座的小鼠。在使用目标抗原免疫后，能够分离含有体细胞突变的人源重链可变区和人源λ轻链可变区的抗体。

[0779] 实施例16：从表达人源重链和人源λ轻链的小鼠中产生抗体

[0780] 在将含有未经重排的人源λ轻链基因座的小鼠繁殖成含有其他内源性Ig基因座修饰和缺失的各种所需的品系后(如上文所述)，使用目标抗原免疫选定的小鼠。

[0781] 在通常情况下，使用抗原攻击含有一个单一的重排的人源生殖细胞系轻链区的小鼠，并且从动物的血清中回收淋巴细胞(如B-细胞)。可以将淋巴细胞与骨髓瘤细胞系融合以制备永生化的杂交瘤细胞系，并且对这种杂交瘤细胞系进行筛选和选择以鉴定产生抗体的杂交瘤细胞系，所述抗体含有对用于免疫的抗原具有特异性的人源重链和人源λ轻链。可以分离编码重链和λ轻链的可变区的DNA，并将所述DNA与所需同种型的重链和轻链的恒定区连接。由于与内源性小鼠λ基因座相比存在附加的hVλ基因区段，因而轻链库的多样性显著增加并且在免疫后使抗原特异性库具有更高的多样性。
随后可以在细胞如CHO细胞中产生所得到的克隆抗体序列。或者，可以直接从抗原特异性淋巴细胞(例如B细胞)中分离编码抗原特异性嵌合抗体或者轻链和重链的可变结构域的DNA。

[0782] 首先，分离具有人源可变区和小鼠恒定区的高亲和性嵌合抗体。如上文所描述的，对抗体进行鉴定并针对所需的特性对抗体进行选择，所述特性包括亲和性、选择性、表位等。使用所需的人源恒定区取代小鼠恒定区以产生全人源抗体，所述抗体含有从本发明的未经重排的人源λ轻链基因座来源的体细胞突变的人源重链和人源λ轻链。适宜的人源恒定区包括例如野生型或经修饰的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

[0783] 实施例17：ADAM6小鼠和人源λ可变小鼠的繁殖

[0784] 将本申请所描述的任意小鼠(所述小鼠包括内源性ADAM6基因或者其直系同源物或同源物的修饰并且还包括赋予小鼠ADAM6功能的基因)与包括含有与人源或小鼠λ或κ恒定基因可操作地连接的人源λ可变区段(例如V和J区段)的修饰的小鼠交配。包括人源λ可变区段的小鼠能够具有在经修饰的内源性λ或κ基因座或转基因上存在的可变区段。将所述小鼠繁殖并且如有需要将后代之间进一步繁殖，并且针对显示出ADAM6功能并且在人源或小鼠λ或κ恒定区背景下(具体视情况而定)亦表达人源λ序列的
具有生育能力的小鼠来筛选后代。

[0785] 将包括人源化重链可变基因座(使用人源V、D和J区段取代全部或基本上全部的小鼠V、D和J区段)并且还包括异位ADAM6序列(或者赋予小鼠ADAM6功能的ADAM6直系同源物或同源物的序列)的小鼠与包括在小鼠λ基因座和/或小鼠κ基因座的全部或基本上全部轻链V和J区段被人源λ轻链V和J区段取代的小鼠交配。根据需要对子代进
行进一步繁殖，并且鉴定表达抗体的小鼠，所述抗体包括与重链恒定序列融合的人源VH和与λ或κ轻链恒定序列融合的同源人源λVL。

[0786] 将所述小鼠与目标抗原接触并且使小鼠产生免疫应答。鉴定对目标抗原具有特异性的抗体，鉴定人源VH序列和人源λ可变序列(包括与小鼠κ恒定区连接的人源λ可变序列)，并且通过工程改造可变结构域序列并与人源恒定区基因组合的方法使用所述人源VH序列和人源λ可变序列来制备人源抗体。

[0787] 在一个例子中，通过繁殖制备小鼠，所述小鼠包括在内源性小鼠重链基因座全部或基本上全部的小鼠重链V、D和J区段被人源V、D和J区段取代，并且包括在与λ恒定序列可操作地连接的内源性小鼠λ基因座上全部或基本上全部的λ轻链可变序列被一个或多个人源λ可变序列取代，以及包括轻链等位基因，所述等位基因包括在内源性κ基因座上全部或基本上全部的κ轻链可变序列被一个或多个人源λ可变序列取代。将所述动物与目标抗原接触并使动物激发免疫应答。鉴定与目标抗原结合的抗体，所述抗体包括与在小鼠λ或小鼠κ恒定区上的人源λ可变结构域同源的人源重链可变结构域。使用编码所述可变结构域的核酸序列以通过工程改造可变序列并与人源恒定区序列组合的方法来制备全人源抗体。

[0788] 本实施例中描述的小鼠包括在本申请的正文和附图中描述的一个或多个Vκ-Jκ基因间区。