用于治疗MRSA感染的脂质体万古霉素转让专利
申请号 : CN201280022336.7
文献号 : CN104159571A
文献日 : 2014-11-19
发明人 : G·Y·刘 , A·欧姆瑞
申请人 : 席德-西奈医疗中心
摘要 :
本发明公开了在治疗细菌感染尤其是MRSA感染中高度有效的脂质体万古霉素制剂。本发明还教导了使用本文所公开的制剂治疗细菌感染的方法。发明人确定了本文所公开的某些制剂可能产生比通常与万古霉素治疗相关的更低的毒性。
权利要求 :
1.一种组合物，其包含万古霉素、DCP脂质体和/或DMPG脂质体。
2.根据权利要求1所述的组合物，其包含万古霉素、DSPC、DCP和胆固醇。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述DSPC、DCP和胆固醇的摩尔比为7:2:1。
4.根据权利要求1所述的组合物，其包含万古霉素、DSPC、DMPG和胆固醇。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述DSPC、DMPG和胆固醇的摩尔比为7:2:1。
6.一种治疗个体中的感染的方法，其包括：
提供包含万古霉素、DCP脂质体和/或DMPG脂质体的组合物；以及向所述个体施用治疗有效量的所述组合物以便治疗所述感染。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述组合物包含万古霉素、DSPC、DCP和胆固醇。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述DSPC、DCP和胆固醇的摩尔比为7:2:1。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述组合物包含DSPC、DMPG和胆固醇。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述DSPC、DMPG和胆固醇的摩尔比为7:2:1。
11.根据权利要求6所述的方法，其中所述感染是由选自以下的微生物导致的细菌感染：金黄色葡萄球菌(S.aureus)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、万古霉素中介金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、粪肠球菌(E.faecalis)、屎肠球菌(E.faecium)、凝固酶阴性葡萄球菌及其组合。
12.根据权利要求6所述的方法，其中所述感染由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌导致。
13.一种用于治疗细菌感染的试剂盒，其包括：
包含万古霉素、DCP脂质体和/或DMPG脂质体的组合物；以及其在治疗个体中的细菌感染的使用说明。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述组合物包含万古霉素、DSPC、DCP和胆固醇。
15.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述DSPC、DCP和胆固醇的摩尔比为7:2:1。
16.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述组合物包含万古霉素、DSPC、DMPG和胆固醇。
17.根据权利要求16所述的试剂盒，其中所述DSPC、DMPG和胆固醇的摩尔比为7:2:1。
18.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述细菌感染由选自以下的微生物导致：金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、万古霉素中介金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、凝固酶阴性葡萄球菌及其组合。
19.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述感染由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌导致。
说明书 :
用于治疗MRSA感染的脂质体万古霉素
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2011年4月26日提交的美国临时专利申请No.61/479,305的优先权，该临时专利申请以引用方式整体并入本文。发明领域
[0003] 本文所公开的发明整体涉及对细菌感染的治疗。
[0004] 背景
[0005] 本文的所有出版物均以引用方式并入本文，达到如同各个出版物或专利申请具体且单独地表明以引用方式并入的相同程度。以下说明包括可用于理解本发明的信息。并非承认本文提供的任何信息都是现有技术的，或与受权利要求书保护的本发明有关，或具体地或隐含地提及的任何专利公开都是现有技术的。
[0006] 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌在全世界范围内对公众健康造成了重大问题。具有增强的万古霉素耐药性的MRSA菌株导致与更高发病率相关的感染并威胁到这种曾经为金标准的抗葡萄球菌药物的使用。本领域需要对细菌感染尤其是对耐传统抗生素的那些感染的改进治疗措施。
[0007] 发明概述
[0008] 在一些实施方案中，本发明教导了一种包含万古霉素、DCP脂质体和/或DMPG脂质体的组合物。在一些实施方案中，该组合物包含万古霉素、DSPC、DCP和胆固醇。在一些实施方案中，DSPC、DCP和胆固醇的摩尔比为7:2:1。在一些实施方案中，该组合物包含万古霉素、DSPC、DMPG和胆固醇。在某些实施方案中，DSPC、DMPG和胆固醇的摩尔比为7:2:1。
[0009] 在某些实施方案中，本发明教导了一种治疗个体中的感染的方法，其包括：提供包含万古霉素、DCP脂质体和/或DMPG脂质体的组合物；以及将治疗有效量的该组合物施用给个体以便治疗感染。
[0010] 在一些实施方案中，该组合物包含万古霉素、DSPC、DCP和胆固醇。在一些实施方案中，DSPC、DCP和胆固醇的摩尔比为7:2:1。在一些实施方案中，该组合物包含DSPC、DMPG和胆固醇。在一些实施方案中，DSPC、DMPG和胆固醇的摩尔比为7:2:1。在一些实施方案中，该感染是由选自以下的微生物导致的细菌感染：金黄色葡萄球菌(S.aureus)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、万古霉素中介金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、粪肠球菌(E.faecalis)、屎肠球菌(E.faecium)、凝固酶阴性葡萄球菌及其组合。在一些实施方案中，该感染由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌导致。
[0011] 在某些实施方案中，本发明教导了一种用于治疗细菌感染的试剂盒，其包括：包含万古霉素、DCP脂质体和/或DMPG脂质体的组合物；以及其在治疗个体中的细菌感染的使用说明。在一些实施方案中，该组合物包含万古霉素、DSPC、DCP和胆固醇。在一些实施方案中，DSPC、DCP和胆固醇的摩尔比为7:2:1。在一些实施方案中，该组合物包含万古霉素、DSPC、DMPG和胆固醇。在一些实施方案中，DSPC、DMPG和胆固醇的摩尔比为7:2:1。在一些实施方案中，该感染是由选自以下的微生物导致的细菌感染：金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、万古霉素中介金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、凝固酶阴性葡萄球菌及其组合。在一些实施方案中，该感染由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌导致。
附图说明
[0012] 示例性实施方案在参考附图中示出。本文所公开的实施方案和附图旨在被视为示例性的而非限制性的。
[0013] 图1根据本发明的实施方案示出了MRSA的时间杀菌试验。将LAC或NRS-35通过游离的万古霉素或DCP脂质体万古霉素孵育。图中显示了在选定时间点的存活CFU，(a)LAC：对于3小时时间点，游离与DCP VAN组相比较的p值对于0.3mg/L和1.25mg/L的浓度<0.005，对于0.6mg/L的浓度<0.01。对于6小时时间点，游离与DCPVAN相比较的p值在0.6mg/L下为0.02。(b)NRS-35：游离与DCPVAN组相比较的p值对于1.25mg/L的浓度<0.005（3小时）和<0.05（6小时）。结果是三个实验的平均值。
[0014] 图2根据本发明的实施方案显示了游离的万古霉素和DCP脂质体万古霉素在治疗6
MRSA全身性感染中的功效。将CD1小鼠通过4×10CFU的MRSA(LAC)在腹膜内进行感染。
一小时后，将小鼠通过PBS、DCP脂质体万古霉素或游离的万古霉素处理。A.24小时时的脾脏细菌负荷，PBS与DCP VAN相比较的p值为0.001，而DCP VAN与游离VAN相比较的p值为0.07。B.24小时后的肾脏细菌负荷，PBS与DCP VAN相比较的p值<0.001，PBS与游离VAN相比较的p值为0.03，而DCP VAN与游离VAN相比较的p值为0.015。线表示中值。
MRSA全身性感染中的功效。将CD1小鼠通过4×10CFU的MRSA(LAC)在腹膜内进行感染。
一小时后，将小鼠通过PBS、DCP脂质体万古霉素或游离的万古霉素处理。A.24小时时的脾脏细菌负荷，PBS与DCP VAN相比较的p值为0.001，而DCP VAN与游离VAN相比较的p值为0.07。B.24小时后的肾脏细菌负荷，PBS与DCP VAN相比较的p值<0.001，PBS与游离VAN相比较的p值为0.03，而DCP VAN与游离VAN相比较的p值为0.015。线表示中值。
[0015] 发明描述
[0016] 本文列出的所有参考文献整体以引用方式并入，如同完整阐述一样。除非另外定义，否则本文使用的技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。Singleton等，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology第 3 版 ,J.Wiley&Sons(New York,NY2001)；March,Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure第5版,J.Wiley&Sons(New York,NY2001)以及Sambrook and Russel,Molecular Cloning:A Laboratory Manual第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor,NY2001)为本领域的技术人员提供用在本专利申请中的许多术语的一般性指导。
[0017] 本领域的技术人员将认识到可用于本发明实践的与本文所述的那些方法和材料相似或等效的许多方法和材料。实际上，本发明绝不限于所述的方法和材料。为了本发明，下文定义以下术语。
[0018] 如本文所用：
[0019] 首字母缩略词“MRSA”意指耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(S.aureus)。
[0020] 首字母缩略词“MIC”意指最低抑制浓度。
[0021] 首字母缩略词“MBC”意指最低杀菌浓度。
[0022] 首字母缩略词“DSPC”意指1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱。
[0023] 首字母缩略词“DMPG”意指二肉豆蔻酰磷脂酰甘油。
[0024] 首字母缩略词“DCP”意指磷酸二鲸蜡酯。
[0025] 缩写“CHOL”意指胆固醇。
[0026] 如本文所用，“有益结果”可包括但绝不限于降低或缓解疾病病症的严重性、防止疾病病症恶化、治愈疾病病症、防止疾病病症发展、减小受试者出现疾病病症的机会以及延长受试者的生命或预期寿命。
[0027] 如本文所用的“病症”和“疾病病症”可包括但绝不限于细菌感染、与之相关的病症及其组合。
[0028] 如本文所用的“哺乳动物”是指任何哺乳动物类，包括但不限于人类和非人灵长类，诸如黑猩猩和其它猿和猴物种；农场动物，诸如牛、绵羊、猪、山羊和马；家庭哺乳动物，诸如狗和猫；实验室动物，包括啮齿类，诸如小鼠、大鼠和豚鼠，等等。该术语不指定特定的年龄或性别。因此，成年和新生受试者以及胎儿无论是雄性还是雌性都旨在包括在该术语的范围内。
[0029] 如本文所用的“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防治性措施，其中目标是减缓（减轻）目标病理病症、防止病理病症、追求或获得有益结果、或减小个体出现病症的机会，即使治疗最终不成功。需要治疗的那些包括已患有病症的那些以及易于罹患病症的那些或需要预防病症的那些。
[0030] 在一些实施方案中，用于对本申请的某些实施方案进行描述和提出权利要求的表示成分的量、诸如分子量的性质、反应条件等的数字应被视为在一些情况下通过术语“约”来修饰。因此，在一些实施方案中，在书面说明和所附权利要求书中所述的数字参数为近似值，其可根据特定实施方案力图获得的所需特性而变化。在一些实施方案中，数字参数应按照所报告的有效数位并通过应用惯常的四舍五入法而加以解释。尽管本申请的一些实施方案以宽范围示出的数字范围和参数为近似值，但是在具体实例中所示的数值尽可能可行地精确报告。
[0031] 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染属于对公众健康造成灾害的最具挑战性的感染。在过去十年中，社区相关性MRSA(CA-MRSA)尤其是USA300的出现已大大加重了感1-2
染造成的负担 。治疗MRSA的金标准是万古霉素，它是一种抑制细菌表面上的肽聚糖合成的大糖肽类抗生素。然而，许多临床研究已表明，万古霉素MIC高于1.5的金黄色葡萄球菌菌株与更高的发病率和治疗失败相关，因为它们可使得在特定的宿主组织内MRSA更难以被杀死。
染造成的负担 。治疗MRSA的金标准是万古霉素，它是一种抑制细菌表面上的肽聚糖合成的大糖肽类抗生素。然而，许多临床研究已表明，万古霉素MIC高于1.5的金黄色葡萄球菌菌株与更高的发病率和治疗失败相关，因为它们可使得在特定的宿主组织内MRSA更难以被杀死。
[0032] 增强抗微生物试剂的抗微生物功效的一个策略是将试剂包封在脂质体内，以增强3
药物向某些宿主组织的递送 。已证实脂质体可改善抗生素对吞噬细胞所吞噬的细菌的杀灭，但是取决于它们的组成，它们也能够增强抗生素向细菌细胞质的递送以直接增强它们
4
的抗微生物功效 。另外，脂质体包载通常降低与药物相关的毒性，并因此已用作允许更高的药物剂量的方法。为了靶向金黄色葡萄球菌，已证实哌拉西林的脂质体包封可改善金黄
5
色葡萄球菌的生长抑制 。在之前的研究中，在不同的脂质体制备物内包载万古霉素增强了
6-7
巨噬细胞吞噬的MRSA的消除 ，但是基本上没有在体外改善细胞外金黄色葡萄球菌的杀
7
灭 。如本文所公开，发明人展示万古霉素的两种脂质体制剂针对游离的MRSA的抗葡萄球菌活性。
药物向某些宿主组织的递送 。已证实脂质体可改善抗生素对吞噬细胞所吞噬的细菌的杀灭，但是取决于它们的组成，它们也能够增强抗生素向细菌细胞质的递送以直接增强它们
4
的抗微生物功效 。另外，脂质体包载通常降低与药物相关的毒性，并因此已用作允许更高的药物剂量的方法。为了靶向金黄色葡萄球菌，已证实哌拉西林的脂质体包封可改善金黄
5
色葡萄球菌的生长抑制 。在之前的研究中，在不同的脂质体制备物内包载万古霉素增强了
6-7
巨噬细胞吞噬的MRSA的消除 ，但是基本上没有在体外改善细胞外金黄色葡萄球菌的杀
7
灭 。如本文所公开，发明人展示万古霉素的两种脂质体制剂针对游离的MRSA的抗葡萄球菌活性。
[0033] 在一些实施方案中，本发明教导了一种包含万古霉素、DCP脂质体和/或DMPG脂质体的脂质体万古霉素组合物。在一些实施方案中，该脂质体万古霉素包含万古霉素、DSPC、DCP和胆固醇。在一些实施方案中，DSPC、DCP和胆固醇的摩尔比为7:2:1。在其它实施方案中，该脂质体万古霉素包含万古霉素、DSPC、DMPG和胆固醇。在一些实施方案中，DSPC、DMPG和胆固醇的摩尔比为7:2:1。
[0034] 在一些实施方案中，本发明教导了一种治疗个体中的感染的方法，其包括：提供包含万古霉素和DCP脂质体和/或DMPG脂质体的组合物；以及将治疗剂量的该组合物施用给个体。在一些实施方案中，该脂质体万古霉素包含万古霉素、DSPC、DCP和胆固醇。在一些实施方案中，DSPC、DCP和胆固醇的摩尔比为7:2:1。在一些实施方案中，该脂质体万古霉素包含万古霉素、DSPC、DMPG和胆固醇。在一些实施方案中，DSPC、DMPG和胆固醇的摩尔比为7:2:1。在一些实施方案中，通过本文所公开的脂质体万古霉素的一种或多种治疗的感染是由选自以下的微生物导致的感染：金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、万古霉素中介金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、凝固酶阴性葡萄球菌及其组合。在一些实施方案中，该感染由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌导致。在一些实施方案中，该感染由革兰氏阳性菌导致。在一些实施方案中，所治疗的个体是哺乳动物。在一些实施方案中，所治疗的个体是人。在某些实施方案中，所治疗的个体是免疫低下的。在一些实施方案中，所治疗的个体具有一种或多种由一种或多种另外的病原体导致的继发感染。
[0035] 根据本发明方法和试剂盒的药物组合物可配制成通过任何给药途径递送。“给药途径”可指本领域已知的任何给药途径，包括但不限于气溶胶、鼻腔、口腔、经粘膜、透皮或肠胃外。“透皮”给药可使用局部用乳霜或油膏或通过透皮贴片而实现。“肠胃外”是指通常与注射相关的给药途径，包括眶内、输注、动脉内、囊内、心内、真皮内、肌内、腹膜内、肺内、脊柱内、胸骨内、鞘内、子宫内、静脉内、蛛网膜下、囊下、皮下、经粘膜或经气管。通过肠胃外途径，组合物可以是输注或注射用溶液剂或混悬剂的形式。通过肠道途径，药物组合物可以是片剂、凝胶胶囊、糖衣片、糖浆剂、混悬剂、溶液剂等的形式。通过局部途径，基于根据本发明化合物的药物组合物可配制成治疗皮肤和粘膜，并为油膏、乳霜、乳剂、药膏、散剂、浸渍垫、溶液剂、凝胶剂、喷雾剂、洗剂或混悬剂的形式。通过眼睛途径，它们可以为滴眼液的形式。
[0036] 根据本发明的方法和试剂盒的药物组合物还可以包含任何药学上可接受的载体。如本文所用的“药学上可接受的载体”是指在所关注的化合物从一个组织、器官或身体部分携带到或转运到另一组织、器官或身体部分时涉及到的药学上可接受的材料、组合物或媒介物。例如，载体可以是液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料或它们的组合。载体的每种组分必须是“药学上可接受的”，因为它必须与制剂的其它成分相容。它还必须适用于与其可接触的任何组织或器官发生接触，也就是说，它不得带有毒性、刺激、变应性反应、免疫原性或过分超出其治疗性有益效果的任何其它并发症风险。
[0037] 根据本发明方法和试剂盒的药物组合物还可以用胶囊包封、压片、或以乳液或糖浆的形式制备以供口服。可添加药学上可接受的固体或液体载体，以增强或稳定组合物，或有利于组合物的制备。液体载体包括糖浆、花生油、橄榄油、甘油、盐水、醇和水。固体载体包括淀粉、乳糖、硫酸钙二水合物、石膏粉、硬脂酸镁或硬脂酸、滑石、果胶、阿拉伯树胶、琼脂或明胶。载体还可以包括持续释放材料，诸如单独的或与蜡一起的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
[0038] 药物制剂物根据药剂学常规技术制备，这些技术涉及对于片剂而言的必要时的碾磨、混合、造粒和压片；或对于硬明胶胶囊剂而言的碾磨、混合和充填。当使用液体载体时，制备物将为糖浆、酏剂、乳剂或水性或非水性混悬剂的形式。这样的液体制剂可直接口服或充填到软明胶胶囊中。
[0039] 根据本发明方法和试剂盒的药物组合物可按治疗有效量递送。精确的治疗有效量是将在给定受试者中就治疗功效而言产生最有效结果的组合物的量。该量将根据许多因素而变化，包括但不限于治疗性化合物的特性（包括活性、药代动力学、药效动力学和生物利用率）、受试者的生理状况（包括年龄、性别、疾病类型和阶段、一般性身体状况、对给定剂量的反应和药物类型）、在制剂中药学上可接受的一种或多种载体的性质以及给药途径。临床和药理学领域的技术人员将能够通过常规实验确定治疗有效量，例如通过监测受试者对化合物施用的反应并相应地调整剂量。对于另外的指导，参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy(Gennaro编，第20版,Williams&Wilkins PA,USA)(2000)。
[0040] 典型的剂量可在制造商推荐的范围内（如果使用已知的治疗性化合物），而对技术人员而言则可通过体外反应或动物模型中的反应表明。此类剂量在浓度或量上通常可降低最多约一个数量级而不丧失相关生物活性。因此，实际的剂量将取决于医生的判断、患者的病症，以及基于例如体外响应或在合适动物模型中观察到的反应的治疗方法有效性。
[0041] 在一些实施方案中，本发明还涉及治疗细菌感染的试剂盒。在一些实施方案中，该试剂盒可用于治疗个体中的MRSA感染。试剂盒是材料或组成部分（包括本文所述的组合物的一种或多种）的组装。因此，在一些实施方案中，试剂盒包含含有万古霉素、DCP脂质体和/或DMPG脂质体的组合物。在一些实施方案中，该脂质体万古霉素包含万古霉素、DSPC、DCP和胆固醇。在一些实施方案中，DSPC、DCP和胆固醇的摩尔比为7:2:1。在其它实施方案中，该脂质体万古霉素包含万古霉素、DSPC、DMPG和胆固醇。在一些实施方案中，DSPC、DMPG和胆固醇的摩尔比为7:2:1。
[0042] 在本发明试剂盒中构造的组成部分的确切性质取决于其预期目的。例如，将一些实施方案构造成用于治疗细菌感染的目的。在一些实施方案中，该细菌感染由选自以下的微生物导致：金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、万古霉素中介金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、凝固酶阴性葡萄球菌及其组合。在一个实施方案中，该感染由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌导致。在一些实施方案中，该试剂盒被构造成尤其用于治疗哺乳动物受试者的目的。在其它实施方案中，该试剂盒被构造成尤其用于治疗人类受试者的目的。在另外的实施方案中，该试剂盒被构造成用于兽医应用，从而治疗诸如但不限于农场动物、家庭动物和实验室动物的受试者。
[0043] 使用说明可包括在试剂盒内。“使用说明”通常包括描述在使用试剂盒的组成部分实现所需的结果诸如治疗细菌感染时将采用的技术的有形表达。任选地，试剂盒还包含其它有用的组成部分，诸如稀释剂、缓冲剂、药学上可接受的载体、注射器、导管、涂药器、移液或测量工具、绷带材料或本领域技术人员将容易地认识到的其它有用器具。
[0044] 以保证可操作性和实用性的任何便利和合适方式储存的在试剂盒中组装的材料或组成部分可提供给从业者。例如，组分可以为溶解、水合或冻干的形式；它们可在室温、冷藏或冷冻温度下提供。组成部分通常容纳在合适的包装材料中。如本文所采用，短语“包装材料”是指用于容纳试剂盒内容物（诸如本文所公开的本发明的组合物等）的一种或多种物理结构。包装材料通过熟知的方法构造，优选地提供无菌、无污染的环境。试剂盒中采用的包装材料是通常用于治疗细菌感染的那些。如本文所用，术语“包装”是指能够容纳各个试剂盒组成部分的合适固体基质或材料，诸如玻璃、塑料、纸张、箔等。因此，例如，包装可以是用于容纳适量的用于治疗细菌感染的本发明组合物的玻璃小瓶。包装材料通常具有外部标签，它指明试剂盒的内容物和/或目的和/或其组成部分。
[0045] 提供以下非限制性实施例以进一步阐述本文所公开的本发明的实施方案。本领域的技术人员应当认识到，以下实施例中公开的技术代表在实践本发明时发现的能够很好地发挥作用的方法并因此可视为构成其实践模式的实施例。然而，本领域的技术人员根据本公开应当认识到，在不脱离本发明精神和范围的情况下，在所公开的具体实施方案中可作出许多改变并仍能获得相同或相似的结果。实施例
[0046] 实施例1
[0047] 细菌菌株、小鼠和化学品
[0048] 用于本研究的MRSA菌株为：NRS-35（得自NARSA的医院相关性MRSA）、LAC（脉冲型(pulsotype)USA300的CA-MRSA菌株）、ATCC29213、ATCC433000和得自Cedars-Sinai临床实验室的六个另外的MRSA分离株(Cedars-Sinai IRB exemption Pro0022541)。十周龄的CD1雄性小鼠购自Charles River。1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DSPC)和胆固醇得自Northern Lipids Inc.(Burnaby,BC,Canada)。磷酸二鲸蜡酯(DCP)和二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)。万古霉素购自Gold Biotechnology(St.Louis,MO,USA)。
[0049] 实施例2
[0050] 脂质体制备
[0051] 将7:2:1摩尔比的DSPC:DMPG:CHOL（DSPC71.5mg、DMPG17.8mg和胆固醇5mg）或7:2:1摩尔比的DSPC:DCP:CHOL（DSPC71.5mg、DCP14.1mg和胆固醇5mg）的脂质混合物在圆底锥形瓶中溶于1mL氯仿/甲醇（2:1v/v比）。将有机溶剂在真空和55℃下使用旋转蒸发仪(Buchi-Rotavapor R205,Brinkmann,Toronto,ON,Canada)除去。该过程产生了干燥的脂质薄膜。
[0052] 将1ml万古霉素水溶液(50mg/mL)加到干燥的脂质薄膜，用手在55℃的水浴中摇晃1分钟。然后将脂质悬浮液在浸入冰浴的情况下超声处理5分钟(Sonic Dismembrator Model500,Fischer Scientific,USA)。超声仪在任何时候均不直接接触脂质体悬浮液。将悬浮液冻干过夜以便保存(Labconco model77540,USA)。
[0053] 脂质体的平均直径采用在23℃运行的NICOMP270亚微米粒度分析仪(Santa Barbara,CA,USA)通过光子相关光谱法测定。脂质体的大小为527.6nm±58.2nm。将50mg/ml的万古霉素用于制备脂质体万古霉素。这些脂质体的包封效率（定义为留在脂质体内的活性化合物的量与引入的万古霉素初始量的比率）通过在具有金黄色葡萄球菌ATCC29213菌苔的Mueller-Hinton琼脂(Becton Dickinson)中切割的孔中的径向扩散以及由标准曲线计算的万古霉素浓度确定。效率对于DCP为9%，对于DMPG为20%。对于脂质体的再水合，将磷酸盐缓冲溶液(PBS)加入、涡旋并在44℃的水浴中加热30分钟，然后以12000rpm离心20分钟。将上清液丢弃，将沉淀用PBS复溶，并在两天内使用。
[0054] 实施例3
[0055] MRSA杀灭动力学测定
[0056] 使MRSA菌株在Todd Hewitt肉汤(THB)中在37℃和振荡下生长过夜。第二天，将5
细菌在PBS中洗涤两次，添加到含或不含抗生素的THB中，达到约2×10CFU/ml的最终浓度，然后在37℃和振荡下孵育。在0、3和6小时时，将细菌铺到琼脂上以对存活的CFU计数。
细菌在PBS中洗涤两次，添加到含或不含抗生素的THB中，达到约2×10CFU/ml的最终浓度，然后在37℃和振荡下孵育。在0、3和6小时时，将细菌铺到琼脂上以对存活的CFU计数。
[0057] 实施例4
[0058] 全身性MRSA感染的治疗
[0059] 将过夜MRSA培养物在THB中稀释，在37℃和振荡下生长到0.6的OD600，离心，然6
后在PBS中洗涤两次。将十周龄CD-1雄性小鼠通过3.9×10CFU的MRSA在腹膜内进行感染。感染后一小时，将小鼠经腹膜内注射PBS、50mg/kg的DCP脂质体万古霉素或50mg/kg的游离万古霉素。24小时后，将小鼠处死，采集脾脏和肾脏，匀化，然后铺到琼脂上以对CFU计数。动物感染实验得到了Cedars-Sinai Committee on the Use and Care of Animals的批准并使用公认的兽医标准进行。
后在PBS中洗涤两次。将十周龄CD-1雄性小鼠通过3.9×10CFU的MRSA在腹膜内进行感染。感染后一小时，将小鼠经腹膜内注射PBS、50mg/kg的DCP脂质体万古霉素或50mg/kg的游离万古霉素。24小时后，将小鼠处死，采集脾脏和肾脏，匀化，然后铺到琼脂上以对CFU计数。动物感染实验得到了Cedars-Sinai Committee on the Use and Care of Animals的批准并使用公认的兽医标准进行。
[0060] 实施例5
[0061] 统计分析
[0062] 对于时间杀菌试验，使用未配对斯氏t检验进行了比较。对于鼠类研究，计算了对组的平均值的方差分析(ANOVA)，并将<0.05的p值视为具有统计显著性。
[0063] 实施例6
[0064] 脂质体万古霉素制剂的MIC和MBC
[0065] 在研究中评价了两个脂质体万古霉素制剂，基于它们包含在相应脂质体制备物中而指定为DCP和DMPG。如表1所示，DCP和DMPG万古霉素均显示出与游离万古霉素相比针对HA-MRSA菌株NRS-35和CA-MRSA菌株LAC的低2至4倍的MIC。对于脂质体抗生素而言，与游离万古霉素相比，MBC约低4倍（表2）。进一步针对一组共7个MRSA菌株评估了DCP万古霉素，与游离万古霉素相比，其表现出大约低2倍的MIC（表1）。无抗生素的对照脂质体未抑制MRSA菌株的生长（数据未示出）。
[0066] 实施例7
[0067] 脂质体万古霉素在清除MRSA中的功效
[0068] 接下来，在时间杀菌试验中调查了DCP万古霉素的抗微生物活性。为游离和脂质体万古霉素选择的浓度包括了1/2×MIC、1×MIC和2×MIC。如图1a所示，在3小时后在所有3种浓度下，DCP万古霉素与常规万古霉素相比均展示出增强的MRSA(LAC)杀灭。DCP与游离万古霉素组之间的差异对于0.6mg/L的剂量在6小时时仍然具有显著性，但对于其它两个剂量而言则无。在1.25mg/L的剂量下，在3h和6h时，DCP万古霉素杀灭NRS-35也均比游离万古霉素有效（图1b）。在其它药物浓度下未观察到杀灭的显著差异。
[0069] 实施例8
[0070] DCP脂质体万古霉素在全身性MRSA感染模型中的功效
[0071] 为了在体内评价DCP的功效，将10-12只小鼠为一组用MRSA(LAC)进行腹膜内接种。一小时后，向小鼠施用PBS、50mg/kg的游离万古霉素或50mg/kg的DCP万古霉素。在感染后24小时，对肾脏和脾脏中的CFU负荷计数（图2）。总体而言，DCP万古霉素与PBS组相比将脾脏和肾脏中的细菌负荷降低了2至3个数量级(p<=0.001)。与游离万古霉素治疗相比，DCP万古霉素治疗将肾脏和脾脏中的细菌负荷均降低了一个数量级。这对于肾脏CFU是明显的，但对于脾脏CFU不明显。
[0072] 实施例9
[0073] MIC和MBC的测定
[0074] 通过肉汤稀释技术测定了所有菌株的游离和脂质体抗生素的MIC。简而言之，制备了从20至0.3μg/ml的游离或脂质体包封抗生素的序列稀释样。对于细菌悬液，将MRSA的冷冻储液划线接种到绵羊血琼脂板上。将单个集落接种到新鲜培养基中，在37℃下振荡5
20小时。将过夜细菌稀释，然后加到96孔板(Becton Dickinson)中以实现大约1×10 的浓度。将接种物通过铺到琼脂上进行了确认。然后将96孔板在振荡或不振荡的情况下在
37℃进行孵育，在24小时后确定了抑制细菌可见生长的抗生素制剂的最低浓度(MIC)。将孔板在振荡下(200rpm)孵育增加了脂质体制剂的MIC测量的一致性。对于MBC的测定，将用于MIC测定的肉汤铺到琼脂上，然后确定原始接种物99.9%被杀灭时的第一个稀释度。所有MIC和MBC测定均进行了至少三次。
20小时。将过夜细菌稀释，然后加到96孔板(Becton Dickinson)中以实现大约1×10 的浓度。将接种物通过铺到琼脂上进行了确认。然后将96孔板在振荡或不振荡的情况下在
37℃进行孵育，在24小时后确定了抑制细菌可见生长的抗生素制剂的最低浓度(MIC)。将孔板在振荡下(200rpm)孵育增加了脂质体制剂的MIC测量的一致性。对于MBC的测定，将用于MIC测定的肉汤铺到琼脂上，然后确定原始接种物99.9%被杀灭时的第一个稀释度。所有MIC和MBC测定均进行了至少三次。
[0075] 实施例10
[0076] 表
[0077] 表1-MRSA菌株的万古霉素MIC
[0078]
[0079] DNT-未测试。
[0080] 表2-MRSA菌株的万古霉素MBC
[0081]
[0082] 上述各种方法和技术提供了实践本发明的多种方式。当然，应当理解的是，根绝本文所述的任何特定实施方案，未必所述的所有目标或优点都能实现。因此，例如，本领域的技术人员将认识到，这些方法可按实现或优化如本文教导的一种优点或一组优点而不必实现如本文教导或建议的其它目标或优点的方式进行。本文提及了多种替代方式。应当理解的是，一些优选的实施方案具体包括一种、另一种或若干种特征，而其它的实施方案具体地排除一种、另一种或若干种特征，还有其它实施方案通过包括一种、另一种或若干种有利特征而缓和特定特征。
[0083] 此外，技术人员将认识到不同实施方案中各种特征的适用性。相似地，上述各种要素、特征和步骤以及各个此类要素、特征或步骤的其它已知等同形式可由本领域的普通技术人员按各种组合使用，以根据本文所述的原理执行方法。在各种要素、特征和步骤之中，一些将具体地包括在内而其它的则具体地排除在各种不同的实施方案之外。
[0084] 虽然本申请已在某些实施方案和实施例的背景下进行了公开，但是本领域的技术人员将会理解的是，本申请的实施方案在具体公开的实施方案之外延伸到其它替代性实施方案和/或用途及其修改形式和等同形式。
[0085] 在一些实施方案中，在描述本专利申请特定实施方案的背景下（尤其是在以下某些权利要求书的背景下）使用的术语“一”、“一个/种”、“该/所述”和类似的提法可被理解为涵盖单数和复数。本文对值的范围的列举仅仅是为了用作单独提及落在该范围内的每个单独数值的快捷方法。除非本文另外指明，否则每个单独的值均包括在本说明书中，就像在本文中单独列举一样。除非本文另外指明或上下文明显冲突，否则本文所述的所有方法可以按任何合适的顺序执行。相对于本文的某些实施方案提供的任何和所有实例或示例性语言（例如，“诸如”）的使用仅是为了更好地阐述本申请并且不对本申请的范围加以限制，而本申请的范围由权利要求书限定。本说明书中的语言不应理解为是表示实践本申请所必需的任何不受权利要求书保护的要素。
[0086] 本申请的优选实施方案在本文中有所描述，包括发明人已知的实施本申请的最佳模式。这些优选实施方案的变型形式在本领域的普通技术人员阅读上述说明时将变得显而易见。预期，技术人员可在适当时采用此类变型形式，并且本申请可按本文具体描述之外的方式加以实践。因此，本申请的许多实施方案包括在所附权利要求书中列出的主题的所有受适用法律允许的修改形式和等同形式。此外，本申请涵盖上述要素在其所有可能的变型形式中的任何组合，除非在本文中另外指明，或换句话讲与上下文明显冲突。
[0087] 本文参考的所有专利、专利申请、专利申请公开以及其它材料（诸如文章、书籍、说明书、出版物、文档、物品和/或等等）据此整体以引用并入本文用于所有目的，除了与本申请的文件不一致或相矛盾的相关任何申请历史文件或任何对本发明目前的权利要求书或以后的权利要求书的最宽的范围造成限制性影响的相关任何申请历史文件。以举例的方式，如果在与任何并入的材料相关的以及与本文相关的术语的说明、定义和/或用途之间存在不一致或冲突，则以本文中的术语说明、定义和/或用途为准。
[0088] 最后，应当理解的是，本文所公开的专利申请的实施方案是对本申请实施方案原理的示例。可采用的其它修改形式可在本申请的范围内。因此，以举例而非限制的方式，本申请实施方案的可供选择的构造可根据本文的教导内容而使用。因此，本申请的实施方案不限于精确地如所示和所述的那些。
[0089] 参考文献
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