用于生产L-半胱氨酸的方法

摘要

通过开发用于改善细菌L-半胱氨酸生产能力的新技术而提供用于生产L-半胱氨酸及其类似物的方法。通过在含有硫代硫酸的培养基中培养属于肠杆菌科、增强了参与亚硫酸还原的基因的表达、并具有L-半胱氨酸生产能力的细菌，并收集在培养基中蓄积的L-半胱氨酸、L-半胱氨酸的相关物质、或其混合物，来生产这些化合物。

权利要求

1.一种用于生产L-半胱氨酸、L-半胱氨酸的相关物质、或它们的混合物的方法，该方法包括：在含有硫代硫酸的培养基中培养属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的细菌，所述细菌具有L-半胱氨酸生产能力并经过修饰而提高了参与亚硫酸还原的基因的表达；以及收集所述培养基中蓄积的L-半胱氨酸、L-半胱氨酸的相关物质、或它们的混合物。

2.根据权利要求1的方法，其中所述参与亚硫酸还原的基因是选自cysG基因、cysJ基因和cysI基因的基因。

3.根据权利要求2的方法，其中至少提高了cysG基因的表达。

4.根据权利要求3的方法，其中提高了cysG基因、cysJ基因和cysI基因的表达。

5.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述参与亚硫酸还原的基因的表达是通过提高所述参与亚硫酸还原的基因的拷贝数或修饰所述基因的表达控制序列而提高的。

6.根据权利要求1-5中任一项的方法，其中所述细菌是属于泛菌属(Pantoea)的细菌。

7.根据权利要求6的方法，其中所述细菌是Pantoea ananatis。

8.根据权利要求1-5中任一项的方法，其中所述细菌是属于埃希氏菌属(Escherichia)的细菌。

9.根据权利要求8的方法，其中所述细菌是大肠杆菌(Escherichia coli)。

10.根据权利要求1-9中任一项的方法，其中所述细菌还具有选自下列特征(1)和(2)的特征：(1)增强了L-半胱氨酸的生物合成系统，

(2)增强了L-半胱氨酸的分泌系统。

11.根据权利要求1-10中任一项的方法，其中所述相关物质是L-胱氨酸或噻唑烷衍生物。

说明书

用于生产L-半胱氨酸的方法

发明领域

[0001] 本发明涉及用于产生L-半胱氨酸或其相关物质的方法。L-半胱氨酸和其相关物质应用于药物、美容和食物的领域。

背景技术

[0002] 常规上L-半胱氨酸是通过从包含角蛋白的物质如毛发、角、和羽毛提取，或使用微生物酶转化作为前体的DL-2-氨基噻唑啉-4-羧酸(DL-2-aminothiazoline-4-carboxylic acid)而获得的。也有人计划使用新的酶通过固定化酶方法大规模生产L-半胱氨酸。而且，有人还尝试使用微生物通过发酵生产L-半胱氨酸。

[0003] 可以通过增强L-半胱氨酸生物合成途径的酶的活性、或增强参与该途径的底物(如L-丝氨酸)的生成的酶的活性，来改善微生物的L-半胱氨酸生产能力。作为具有生产L-半胱氨酸能力的微生物，已知，例如，提高了胞内丝氨酸乙酰转移酶的活性的棒状杆菌型细菌(专利文献1)。还已知通过组入减弱了L-半胱氨酸反馈抑制的突变型丝氨酸乙酰基转移酶而提高L-半胱氨酸生产能力的技术(专利文献2-4)。还已知编码弱化了丝氨酸反馈抑制的突变型3-磷酸甘油酸脱氢酶(3-phosphoglycerate dehydrogenase)的突变型serA基因，并且已经提示了其在大肠杆菌(Escherichia coli)生产L-半胱氨酸中的用途(专利文献5和6)。

[0004] 此外，还可以通过阻遏L-半胱氨酸分解系统而改善微生物的L-半胱氨酸生产能力。作为通过阻遏L-半胱氨酸分解系统而增强了L-半胱氨酸生产能力的微生物，已知弱化或缺失了其胱硫醚β-裂解酶(专利文献2)、色氨酸酶(专利文献7)、或O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶B(专利文献8)的活性的棒状杆菌型细菌(coryneform bacteria)或大肠杆菌。

[0005] 而且，还可以通过增强L-半胱氨酸分泌能力来改善微生物的L-半胱氨酸生产能力。例如，已知通过增强ydeD基因(非专利文献1),yfiK基因(非专利文献9),或yeaS基因(非专利文献10)的表达而增强L-半胱氨酸生产能力的技术，所述基因编码参与L-半胱氨酸的分泌的蛋白质。而且，还已知通过增强mar基因座、emr基因座、acr基因座、cmr基因座、mex基因、bmr基因或qacA基因(专利文献11)、或emrAB、emrKY、yojIH、acrEF、bcr或cusA基因(专利文献12)而增强L-半胱氨酸生产能力的技术，所述基因座或基因编码适于从细胞分泌显示细胞毒性的物质的蛋白质。

[0006] L-半胱氨酸是一种含硫的氨基酸，硫源的代谢参与L-半胱氨酸的生产。图1中显示了使用葡萄糖作为碳源、硫酸根离子或硫代硫酸根离子作为硫源时的生物合成途径的概略，以及参与该途径的基因的例子。

[0007] 亚硫酸还原酶是在硫酸根离子(SO42-)转化为硫离子(S2-)的硫酸还原途径中(非2- 2-
专利文件2)，催化作为最终步骤的亚硫酸根离子(SO3 )还原成硫离子(S )的反应的酶。
经由硫酸还原途径从硫酸根离子生成的硫离子与O-乙酰丝氨酸(O-acetylserine)反应生成L-半胱氨酸。也就是说，当使用硫酸根离子作为硫源生产L-半胱氨酸时，亚硫酸还原酶被认为是一种参与L-半胱氨酸生物合成的酶。已知大肠杆菌的亚硫酸还原酶具有α8β4复合物结构，其包含由cysJ基因所编码的α亚基和由cysI基因所编码的β亚基。此外，cysG基因编码亚硫酸还原酶β亚基的辅因子西罗血红素(siroheme)的生物合成酶。cysJ基因和cysI基因存在于同一操纵子中，而cysG基因存在于基因组上的不同位点。cysJ基因、cysI基因以及由这些基因所编码的蛋白质的细节在非专利文件3-7中描述。此外，cysG基因和由该基因所编码的蛋白质的细节在非专利文件8-11中描述。

[0008] 虽然没有直接的增强cysG基因、cysJ基因、或cysI基因的表达对L-半胱氨酸的生产的有用性的指示，已知由cysB基因所编码的蛋白质的活性增强的大肠杆菌是生产L-半胱氨酸的细菌(专利文件13)。因为cysB基因编码的蛋白质正调控含有编码亚硫酸还原酶的cysJ基因和cysI基因的cysJIH操纵子的表达，所以在该大肠杆菌中cysJ基因和cysI基因的表达可能提高了。另一方面，cysG基因不受cysB基因编码的蛋白质调控，所以cysG基因的增强的表达对于L-半胱氨酸产生的影响是未知的。

[0009] 此外，有人已经提示了cysG基因、cysJ基因或cysI基因的表达增强对除了L-半胱氨酸之外的氨基酸的有效性。例如，在涉及L-苏氨酸或L-赖氨酸(专利文件14)的生产、L-苏氨酸的生产(专利文件15)和L-甲硫氨酸的生产(专利文件16和17)的文件中提及了包括cysG基因、cysJ基因和cysI基因在内的cys基因群的表达的增强。此外有人提及了在L-甲硫氨酸的生产中包括cysJ基因和cysI基因在内的cys基因群的表达的增强(专利文件18-21)。此外，还有人提及了在L-甲硫氨酸生产中，包括cysJ基因和cysI基因在内的cysJIH操纵子的表达的增强(专利文件22)。而且，已知有通过增强cysG基因的表达而提高L-精氨酸生产的技术(专利文件23)。

[0010] 另一方面，硫代硫酸在不同于硫酸还原途径(sulfate reduction pathway)(图1)的途径中代谢，且不知道亚硫酸还原酶参与硫代硫酸的代谢。此外，所有上述的涉及氨基酸生产的发现都未提示cysG基因、cysJ基因或cysI基因的表达的增强对使用硫代硫酸作为硫源的氨基酸产生是有效的。如上所述的，使用硫代硫酸盐作为硫源时的L-半胱氨酸等氨基酸的生产与cysG基因、cysJ基因或cysI基因之间的关系是未知的。

[0011] 现有技术文件

[0012] 专利文件

[0013] 专利文件1:日本特开2002-233384

[0014] 专利文件2:日本特开平11-155571

[0015] 专利文件3:美国专利申请公开号20050112731

[0016] 专利文件4:美国专利号6,218,168

[0017] 专利文件5:美国专利号5,856,148

[0018] 专利文件6:美国专利申请公开号20050009162

[0019] 专利文件7:日本特开2003-169668

[0020] 专利文件8:日本特开2005-245311

[0021] 专利文件9:日本特开2004-49237

[0022] 专利文件10:欧洲专利公开号1016710

[0023] 专利文件11:美国专利号5,972,663

[0024] 专利文件12:日本特开2005-287333

[0025] 专利文件13:国际专利公开WO01/27307

[0026] 专利文件14:美国专利号7,759,094

[0027] 专利文件15:国际专利公开WO03/006666

[0028] 专利文件16:美国专利申请公开号No.2009298136

[0029] 专利文件17:国际专利公开WO2008/127240

[0030] 专利文件18:国际专利公开WO2009/043372

[0031] 专利文件19:国际专利公开WO2005/108561

[0032] 专利文件20:国际专利公开WO2007/077041

[0033] 专利文件21:国际专利公开WO2006/082254

[0034] 专利文件22:美国专利申请公开号No.20100047879

[0035] 专利文件23:美国专利申请公开号No.20050069994

[0036] 非专利文件

[0037] 非专利文件1:Dassler et al.,Mol.Microbiol.,36,1101-1112(2000)[0038] 非 专 利 文 件 2:Frederich C.,Neidhardt et al.,Escherichia Coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology,2nd Edition,Vol.1,ASM Press,514-527[0039] 非专利文件3:Ostrowski et al.,Journal of Biological Chemistry,264(27):15796-15808(1989)

[0040] 非专利文件4:Li et al.,Gene,53(2-3):227-234(1987)

[0041] 非专利文件5:Gaudu and Fontecave,European Journal of Biochemistry,226(2):459-463(1994)

[0042] 非专利文件6:Eschenbrenner et al.,Journal of Biological Chemistry,270(35):20550-20555(1995)

[0043] 非专利文件7:Ostrowski et al.,Journal of Biological Chemistry,264(26):15726-15737(1989)

[0044] 非专利文件8:Peakman et al.,European Journal of Biochemistry,191(2):315-323(1990)

[0045] 非 专 利 文 件 9:Macdonald and Cole,Molecular and General Genetics,200(2):328-334(1985)

[0046] 非专利文件10:Warren et al.,Biochemical Journal,265(3):725-729(1990)[0047] 非专利文件11:Spencer et al.,FEBS Letters335(1):57-60(1993)[0048] 发明概述

[0049] 本发明的一个目的是通过开发的用于改进细菌的L-半胱氨酸生产能力的新技术，来提供用于生产L-半胱氨酸、L-半胱氨酸的相关物质、或其混合物的方法。

[0050] 本发明的发明人为达成前述的目标进行了广泛研究，结果发现，通过修饰细菌使参与亚硫酸还原的基因的表达提高，可以改善用硫代硫酸作为硫源时所述细菌的L-半胱氨酸生产能力，从而完成了本发明。

[0051] 即，本发明可由以下而实施：

[0052] 一种用于生产L-半胱氨酸、L-半胱氨酸的相关物质、或它们的混合物的方法，该方法包括：

[0053] 在含有硫代硫酸的培养基中培养属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的细菌，所述细菌具有L-半胱氨酸生产能力并经过修饰而提高了参与亚硫酸还原的基因的表达；以及

[0054] 收集所述培养基中蓄积的L-半胱氨酸、L-半胱氨酸的相关物质、或它们的混合物。

[0055] 根据上述的方法，其中所述参与亚硫酸还原的基因是选自cysG基因、cysJ基因和cysI基因的基因。

[0056] 根据上述的方法，其中至少提高了cysG基因的表达。

[0057] 根据上述的方法，其中提高了cysG基因、cysJ基因和cysI基因的表达。

[0058] 根据上述的方法，其中所述参与亚硫酸还原的基因的表达是通过提高所述参与亚硫酸还原的基因的拷贝数或修饰所述基因的表达控制序列而提高的。

[0059] 根据上述的方法，其中所述细菌是属于泛菌属(Pantoea)的细菌。

[0060] 根据上述的方法，其中所述细菌是Pantoea ananatis。

[0061] 根据上述的方法，其中所述细菌是属于埃希氏菌属(Escherichia)的细菌。

[0062] 根据上述的方法，其中所述细菌是大肠杆菌(Escherichia coli)。

[0063] 根据上述的方法，其中所述细菌还具有选自下列特征(1)和(2)的特征：

[0064] (1)增强了L-半胱氨酸的生物合成系统，

[0065] (2)增强了L-半胱氨酸的分泌系统。

[0066] 根据上述的方法，其中所述相关物质是L-胱氨酸或噻唑烷(thiazolidine)衍生物。

[0067] 附图简述

[0068] 图1.显示了对于使用葡萄糖作为碳源和硫酸根离子或硫代硫酸根离子作为硫源的L-半胱氨酸的生物合成途径的概略，以及所参与的基因的例子。

[0069] 图2.显示了nlpD基因的野生型启动子Pnlp0的连接位点和连接于其下游的基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:73)，以及nlpD基因的突变型启动子Pnlp8的连接位点和连接于其下游的基因的核苷酸序列。

[0070] 图3.显示了cysEX基因片段的产生中的引物的配置。

[0071] 图4.显示了质粒pACYC-DES的结构。

[0072] 图5.显示了在Pantoea ananatis SC17(0)中d0191基因破坏的概略。

[0073] 发明详述

[0074] 对优选的实施方案的详细描述

[0075] <1>用于本发明的方法的细菌

[0076] 本发明的方法所使用的细菌(后面也称为本发明的细菌)是属于肠杆菌科、具有L-半胱氨酸生产能力且经过修饰而提高了参与亚硫酸还原的基因的表达的细菌。

[0077] 在本发明中，L-半胱氨酸可以是游离形态的L-半胱氨酸、L-半胱氨酸的盐或其混合物。所述盐的例子包括，例如，硫酸盐、氯化物、碳酸盐、铵盐、钠盐、和钾盐。

[0078] 在本发明中，所谓L-半胱氨酸生产能力，是指细菌产生L-半胱氨酸、L-半胱氨酸相关物质、或其混合物，并在培养基中或细菌细胞中蓄积它们到能够从所述培养基中或细菌中回收的程度的能力。所谓具有L-半胱氨酸生产能力的细菌，是可以在培养基中以比野生型菌株或亲本菌株更大的量产生和蓄积L-半胱氨酸、L-半胱氨酸相关物质、或其混合物的细菌。具有L-半胱氨酸生产能力的细菌优选的含义是可以在培养基中以0.05g/L或更多、更加优选0.1g/L或更多、甚至更优选0.2g/L或更多、特别优选0.4g/L或更多的量产生和蓄积L-半胱氨酸、L-半胱氨酸相关物质、或其混合物的细菌。

[0079] 由细菌所产生的L-半胱氨酸的一部分可以通过形成二硫键而在培养基中转化成为L-胱氨酸。此外，通过培养基中的L-半胱氨酸和硫代硫酸的反应可以产生S-磺酸半胱氨酸(S-sulfocysteine)(Szczepkowski T.W.,Nature,vol.182(1958))。此外，在细菌细胞中产生的L-半胱氨酸可以与在细胞中存在的酮或醛，例如丙酮酸缩合，通过作为中间体的硫代半缩醛(hemithioketal)产生噻唑烷衍生物(参考日本专利号2992010)。这些噻唑烷衍生物和硫代半缩醛可以以平衡的混合物的形式存在。

[0080] 此外，L-半胱氨酸用于γ-谷氨酰半胱氨酸(γ-glutamylcysteine)、谷胱甘肽(glutathione)、胱硫醚(cystathionine)、高半胱氨酸(homocysteine)、L-甲硫氨酸、S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine)、以及其它的生物合成的起始材料。因此，通过使用除了产生L-半胱氨酸的能力外还有产生这些经由L-半胱氨酸而产生的化合物的能力的细菌，可以产生这些化合物。

[0081] 因此，在本发明中，L-半胱氨酸生产能力并不限于在培养基中或细胞中仅蓄积L-半胱氨酸的能力，还包括在培养基中或在细胞中蓄积L-半胱氨酸、L-胱氨酸、如上所述的L-半胱氨酸的这类衍生物(例如S-磺酸半胱氨酸、噻唑烷衍生物、和硫代半缩醛)、如上所述的经由L-半胱氨酸产生的化合物(例如γ-谷氨酰半胱氨酸、谷胱甘肽、胱硫醚、高半胱氨酸、L-甲硫氨酸、S-腺苷甲硫氨酸)、或它们的混合物的能力。在本发明中，将L-胱氨酸、如上所述的L-半胱氨酸的这类衍生物、和如上所述的经由L-半胱氨酸而产生的这类化合物统称为L-半胱氨酸的相关物质。

[0082] 具有L-半胱氨酸生产能力的细菌可以是固有地具有L-半胱氨酸生产能力的细菌，或者可以是通过突变或重组DNA技术对下述微生物进行修饰使其获得L-半胱氨酸生产能力而得到的微生物。

[0083] 本发明所使用的细菌并无特别的限制，只要细菌属于肠杆菌科，如埃希氏菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Enterobacter)、泛菌属(Pantoea)、克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙门氏杆菌属(Salmonella)、和摩根氏菌属(Morganella)，且具有L-半胱氨酸生产能力就可以加以选用。具体地，可以使用那些根据NCBI(美国国家生物技术信息中心National Center for Biotechnology Information)数据库 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id91347)所使用的生物分类法而分类为肠杆菌科的细菌。作为用于修饰的肠杆菌科的亲本菌株，使用埃希氏菌属、肠杆菌属、泛菌属、欧文氏菌属、肠杆菌属、或克雷伯氏杆菌属的细菌是尤其理想的。

[0084] 虽然埃希氏菌属细菌并无特别的限制，但是具体地，可以使用那些在Neidhardt 等 人 的 文 章 (Backmann B.J.,1996,Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12,p.2460-2488,Table1,In F.D.Neidhardt(ed.),Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition,American Society for Microbiology Press,Washington,D.C.)中所描述的细菌。埃希氏菌属细菌的例子包括，例如，大肠杆菌。大肠杆菌的具体的例子包括大肠杆菌W3110菌株(ATCC27325)、大肠杆菌MG1655菌株(ATCC47076)及其它从原型野生型菌株K12菌株所衍生的菌株。

[0085] 这些菌株可以从，例如，美国典型菌种保藏中心(地址:12301Parklawn Drive,Rockville,Maryland20852,P.O.Box1549,Manassas,VA20108,美国)获得。具体地说，每个菌株都有注册号，可以通过使用这些注册号订购菌株(参考http://www.atcc.org/)。菌株的注册号在美国典型菌种保藏中心的目录中列出。

[0086] 肠杆菌属细菌的例子包括，例如成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)。肠杆菌属的典型菌株的例子包括成团肠杆菌ATCC12287菌株。此外，具体地，可以使用在欧洲专利公开号952221中所例示的菌株。

[0087] 泛菌属细菌的例子包括，例如，Pantoea ananatis、斯氏泛菌(Pantoea stewartii)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、和柠檬泛菌(Pantoea citrea)。

[0088] Pantoea ananatis的具体例子包括Pantoea ananatis AJ13355菌株(FERM BP-6614)和SC17菌株(FERM BP-11091)。AJ13355菌株是从日本静冈县磐田市(Iwata-shi,Shizuoka-ken,Japan)的土壤中分离的菌株，其可以在含有L-谷氨酸和碳源的低pH培养基中增值。SC17菌株是从AJ13355菌株(美国专利号6,596,517)作为低粘液产生(low phlegm-producing)突变菌株而选择的。Pantoea ananatis AJ13355菌株在1998年2月19日保藏于日本通产省工业技术院生命工学工业技术研究所(National Institute of Bioscience and Human-Technology,Agency of Industrial Science and Technology,Ministry of International Trade and Industry)(现名日本产业技术综合研究所专利生物保藏中心National Institute of Advanced Industrial Science and Technology,International Patent Organism Depositary,地址:Tsukuba Central6,1-1,Higashi 1-Chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken,305-8566,日本)并被分派保藏号为FERM P-16644，于1999年1月11日转为基于布达佩斯条约的国际保藏并分派了保藏号FERM BP-6614。Pantoea ananatis SC17菌株在2009年2月4日保藏于日本产业技术综合研究所专利生物保藏中心(地址:Tsukuba Central6,1-1,Higashi 1-Chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken,305-8566,日本)并被分派保藏号FERM BP-11091。当Pantoea ananatis AJ13355菌株分离之时曾被鉴定为成团肠杆菌，并以成团肠杆菌AJ13355菌株保藏。然而，其近来根据16S rRNA的核苷酸序列分析等被重新分类为Pantoea ananatis。

[0089] 欧文氏菌属细菌的例子包括解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)和胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)，克雷伯氏杆菌属细菌的例子包括植物克雷伯氏杆菌(Klebsiella planticola)。

[0090] 特别地，泛菌属细菌、欧文氏菌属细菌和肠杆菌属细菌是分类为γ-变形菌的细菌，在分类学上彼此非常近缘(J.Gen.Appl.Microbiol.,1997,43,355-361;International Journal of Systematic Bacteriology,Oct.1997,pp.1061-1067)。所以，一些属于肠杆菌属的细菌曾基于DNA-DNA杂交实验等被分类到成团肠杆菌、分散泛菌(Pantoea dispersa)等(International Journal of Systematic Bacteriology,July1989,39(3),pp.337-345)。例如，成团肠杆菌的一些菌株曾基于16S rRNA的核苷酸序列分析而被分类到成团肠杆菌、Pantoea ananatis、或斯氏泛菌。而且，一些属于欧文氏菌属的细菌曾被分类进Pantoea ananatis(Pantoea ananas)或斯氏泛菌(参考International Journal of Systematic Bacteriology,Jan1993;43(1),pp.162-173)。在本发明中，属于肠杆菌属、泛菌属、欧文氏菌属等的任意一属的细菌都可以使用，只要其是分类到肠杆菌科中的细菌。

[0091] 下面描述用于赋予属于肠杆菌科的细菌L-半胱氨酸生产能力的方法或用于增强这类细菌的L-半胱氨酸生产能力的方法。

[0092] 为了赋予细菌L-半胱氨酸生产能力，可以使用常规使用的选育棒状杆菌型细菌、埃希氏菌属细菌等的方法。这类方法包括获取营养缺陷型突变菌株、类似物抗性菌株(an analogue resistant strain)、代谢调控突变菌株，或者构建增强了L-半胱氨酸生物合成系统酶的重组菌株，等等(见"Amino Acid Fermentation",Gakkai Shuppan Center(Ltd.),1st Edition,published May30,1986,pp.77-100)。在L-半胱氨酸生产细菌的选育中，可以赋予以上描述的属性如营养缺陷型、类似物抗性、和代谢调控突变中的一种或两种或更多种。而且，可以增强一种或两种或更多种L-半胱氨酸生物合成系统酶。此外，营养缺陷型、类似物抗性和代谢调控突变等性质的赋予可以与生物合成的增强酶组合。

[0093] 具有L-半胱氨酸生产能力的营养缺陷型突变菌株、L-半胱氨酸类似物抗性菌株或代谢调控突变菌株可以通过下述方式获得：对亲本菌株或野生型菌株进行常规诱变，如暴露与X光或UV照射或以例如N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG)或甲基磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate，EMS)的诱变剂处理，然后从获得的突变菌株中选择呈现营养缺陷型、类似物抗性或代谢调控突变并具有L-半胱氨酸生产能力的菌株。

[0094] 下面，具体地例示用于向属于肠杆菌科的细菌赋予L-半胱氨酸生产能力的方法，或增强这类细菌的L-半胱氨酸生产能力的方法，以及具有L-半胱氨酸生产能力的细菌。

[0095] <赋予或增强L-半胱氨酸生产能力，以及L-半胱氨酸生产细菌>

[0096] 细菌的L-半胱氨酸生产能力可以通过增强L-半胱氨酸的生物合成系统而赋予或增强。“增强L-半胱氨酸的生物合成系统”意指，例如，增强参与在L-半胱氨酸的生物合成中的酶的活性。参与L-半胱氨酸的生物合成的酶的例子包括L-半胱氨酸生物合成途径的酶，以及参与在L-半胱氨酸生物合成途径中作为底物的化合物(如L-丝氨酸)的合成的酶，具体的例子包括丝氨酸乙酰转移酶(serine acetyltransferase，SAT)和3-磷酸甘油酸脱氢酶(3-phosphoglycerate dehydrogenase，PGD)。增强酶活性可以通过如下文描述地增强编码目标酶的基因的表达，或通过增强目标酶的特异性活性而达到。由于丝氨酸乙酰转移酶受L-半胱氨酸的反馈抑制，具体地，可以通过将编码弱化或消除了反馈抑制的突变型丝氨酸乙酰转移酶的cysE基因组入细菌而增强该酶的酶活性。此外，由于3-磷酸甘油酸脱氢酶受到丝氨酸的反馈抑制，具体地，可以通过掺入编码弱化或消除了反馈抑制的突变型3-磷酸甘油酸脱氢酶的serA基因而增强该酶的酶活性。

[0097] 作为从大肠杆菌衍生的有反馈抑制抗性的SAT突变体，具体已知的有：256位的甲硫氨酸由谷氨酸残基所替换的突变体SAT(日本特开平11-155571)；256位的甲硫氨酸由异亮氨酸残基所替换的突变体SAT(Denk,D.and Boeck,A.,J.General Microbiol.,133,515-525(1987))；从97位的氨基酸残基到在227位的氨基酸残基的区域中有突变、或从227位的氨基酸残基开始的C末端区域缺失的突变体SAT(国际专利公开WO97/15673,美国专利号6,218,168)；对应于野生型SAT的89位到96位的氨基酸序列中含有一个或多个突变，并且对L-半胱氨酸所致的反馈抑制脱敏的突变体SAT(美国专利申请公开号20050112731(A1))；野生型SAT的95位和96位的Val残基和Asp残基分别由Arg残基和Pro残基所替换的突变型SAT(突变基因的名称:cysE5,美国专利申请公开号20050112731(A1))；等等。

[0098] 编码SAT的基因并不限于大肠杆菌的基因，可以使用任意编码具有SAT活性的蛋白质的基因。例如，已知对L-半胱氨酸的反馈抑制脱敏的拟南芥(Arabidopsis thaliana)的SAT 同 工 酶，且 编 码 该 SAT的 基 因 也 可 使 用 (FEMS Microbiol.Lett.,179,453-459(1999))。

[0099] 此外，作为编码对由丝氨酸的反馈抑制有抗性的突变型PGD的基因，已知serA5基因(美国专利第6,180,373号)。

[0100] 此外，细菌的L-半胱氨酸生产能力还可以通过增强L-半胱氨酸分泌系统而增强。L-半胱氨酸的分泌系统可以通过增强编码参与L-半胱氨酸的分泌的蛋白质的基因而增强。参与L-半胱氨酸的分泌的蛋白质的例子包括由ydeD基因所编码的YdeD蛋白质、由yfiK基因所编码的YfiK蛋白质、以及由yeaS基因所编码的YeaS蛋白质。因此，通过增强ydeD基因(Dassler et al.,Mol.Microbiol.,36,1101-1112(2000)),yfiK基因(日本特开2004-49237)或yeaS基因(欧洲专利公开号1016710)的表达，可以提高L-半胱氨酸生产能力。此外，通过向YeaS蛋白的28位的苏氨酸残基、137位的苯丙氨酸残基、和/或188位的亮氨酸残基引入突变，也可以增强L-半胱氨酸分泌系统，并且提高L-半胱氨酸生产能力(欧洲专利公开号2218729)。具体地，优选将YeaS蛋白质的28位的苏氨酸残基替换为精氨酸残基的突变，将137位的苯丙氨酸残基替换为丝氨酸、谷酰胺、丙氨酸、组氨酸、半胱氨酸或甘氨酸残基的突变，和/或将188位的亮氨酸残基替换为谷氨酸的突变(欧洲专利公开号2218729)。

[0101] 此外，适于分泌显示出细胞毒性的物质的蛋白质包括那些参与L-半胱氨酸的分泌的蛋白质。因此，通过增强编码它们中任意一个的基因的表达，可以增强L-半胱氨酸的表达系统。例如，通过提高编码适于分泌显示细胞毒性的物质的mar基因座、emr基因座、acr基因座、cmr基因座、mex基因、bmr基因或qacA基因(美国专利号5,972,663)、或emrAB、emrKY、yojIH、acrEF、bcr或cusA基因(特开2005-287333)的表达，可以增强L-半胱氨酸生产能力。

[0102] 此外，也可以通过增强硫酸盐/硫代硫酸盐运输系统来改善L-半胱氨酸生产能力。硫酸盐/硫代硫酸盐运输系统蛋白质是由cysPTWAM簇基因所编码的(日本特开2005-137369,欧洲1528108号说明书)。

[0103] 此外，可以通过降低对L-半胱氨酸的分解有贡献的半胱氨酸脱巯基酶的活性而改进细菌的L-半胱氨酸生产能力。作为大肠杆菌的具有半胱氨酸脱巯基酶活性的蛋白质，已知由metC基因所编码的胱硫醚β-裂解酶(日本特开平11-155571,Chandra等人,Biochemistry,21,3064-3069(1982))、由tnaA所编码的色氨酸酶(日本特开2003-169668,Austin Newton等 人,J.Biol.Chem.,240,1211-1218(1965))、由 cysM 基因所编码的O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶B(O-acetylserine sulfhydrylase B)(日本特开
2005-245311)、和由malY基因所编码的MalY(日本特开2005-245311)。此外，已知Pantoea ananatis的d0191基因作为编码具有半胱氨酸脱巯基酶活性的蛋白质的基因(日本特开
2009-232844)。酶活性可以通过后面描述的方法而降低。

[0104] L-半胱氨酸生产细菌可以具有前述的改进L-半胱氨酸生产能力的性质中的一种，或两种或更多种的任意组合。例如，在L-半胱氨酸生产细菌中，优选L-半胱氨酸的生物合成系统或L-半胱氨酸的分泌系统增强，且更优选两者都增强。

[0105] L-半胱氨酸生产细菌的具体的例子包括但不限于：以编码对反馈抑制有抗性的丝氨酸乙酰转移酶(SAT)的多种cysE基因的等位基因转化的大肠杆菌JM15菌株(美国专利6,218,168)；编码适于分泌细胞毒性物质的蛋白的基因过表达的大肠杆菌W3110菌株(美国专利号5,972,663)；半胱氨酸脱巯基酶活性降低的大肠杆菌(日本特开平11-155571)；以及由cysB所编码的半胱氨酸调节子的正转录调控因子的活性提高的大肠杆菌W3110菌株(WO01/27307)等埃希氏菌属细菌；具有包含ydeD基因、突变的cysE基因、和突变的serA5基因的质粒pACYC-DES(日本特开2005-137369(美国专利申请公开号
20050124049(A1),欧洲专利公开号1528108(A1)))的大肠杆菌；等等。pACYC-DES是通过将上述三种基因插入pACYC184而获得的质粒，且每个基因的表达都受PompA启动子调控。

[0106] 对于可以以L-半胱氨酸作为起始材料通过生物合成产生的化合物，如γ-谷氨酰半胱氨酸、谷胱甘肽、胱硫醚、高半胱氨酸、L-甲硫氨酸、和S-腺苷甲硫氨酸，也可以通过增强目标化合物的生物合成系统的酶的活性、或通过降低从目标化合物的生物合成系统分叉的途径的酶或分解目标化合物的酶的活性，来赋予或增强这些化合物的生产能力。

[0107] 例如，可以通过增强γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性、和/或降低谷胱甘肽合成酶活性，来增强γ-谷氨酰半胱氨酸生产能力。此外，可以通过增强γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性和/或谷胱甘肽合成酶活性，来赋予或增强谷胱甘肽生产能力。此外，可以通过使用对谷胱甘肽的反馈抑制有抗性的突变体γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶来增强γ-谷氨酰半胱氨酸或谷胱甘肽的生产能力。谷胱甘肽的生产在Li等人的综述(Yin Li,Gongyuan Wei,Jian Chen,Appl.Microbiol.Biotechnol.,66:233-242(2004))中有详细描述。

[0108] 可以通过赋予L-苏氨酸营养缺陷型或正亮氨酸(norleucine)抗性而赋予或增强L-甲硫氨酸生产能力(日本特开2000-139471)。在大肠杆菌中，参与L-苏氨酸的生物合成中酶以苏氨酸操纵子(thrABC)的形式存在，例如，通过删除thrBC部分，可以获得丢失L-高丝氨酸以下的化合物的生物合成能力的L-苏氨酸营养缺陷型菌株。在正亮氨酸抗性菌株中，弱化了S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性，而赋予了或增强了L-甲硫氨酸生产能力。在大肠杆菌中，S-腺苷甲硫氨酸合成酶是由metK基因所编码的。可以通过删除甲硫氨酸阻遏物或增强参与L-甲硫氨酸生物合成的酶，如高丝氨酸转琥珀酰基酶(homoserine transsuccinylase)、胱硫醚γ-合酶(cystathionineγ-synthase)、和天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶II(aspartokinase-homoserine dehydrogenase II)的活性，来赋予或增强L-甲硫氨酸生产能力(日本特开2000-139471)。在大肠杆菌中，甲硫氨酸阻遏物是由metJ基因所编码的；高丝氨酸转琥珀酰基酶是由metA基因所编码的；胱硫醚γ-合酶是由metB基因所编码的；而天冬氨酸-高丝氨酸脱氢酶II是由metL基因所编码的。此外，通过使用对L-甲硫氨酸所致的反馈抑制有抗性的突变型高丝氨酸转琥珀酰基酶，也可以赋予或增强L-甲硫氨酸生产能力(日本特开2000-139471,美国专利申请公开号20090029424)。因为L-甲硫氨酸是经由作为中间体的L-半胱氨酸而生物合成的，所以也可以通过改进L-半胱氨酸生产能力而改进L-甲硫氨酸生产能力(日本特开2000-139471，美国专利申请公开号20080311632)。因此，赋予或增强L-半胱氨酸生产能力对于赋予或增强L-甲硫氨酸生产能力也是有效的。

[0109] L-甲硫氨酸生成细菌的具体实例包括大肠杆菌菌株如AJ11539(NRRL B-12399)；AJ11540(NRRL B-12400)；AJ11541(NRRL B-12401)；AJ11542(NRRL B-12402)(英国专利号
2075055)；对L-甲硫氨酸的类似物正亮氨酸有抗性的218菌株(VKPM B-8125,俄罗斯专利号2209248)以及73菌株(VKPM B-8126,俄罗斯专利号2215782)。

[0110] 此外，作为L-甲硫氨酸产生细菌，也可以使用衍生自大肠杆菌W3110的AJ13425(FERM P-16808,日本特开2000-139471)。AJ13425是L-苏氨酸营养缺陷型菌株，其中缺失了甲硫氨酸阻遏物，弱化了S-腺苷甲硫氨酸合酶活性，且胞内高丝氨酸转琥珀酰基酶活性、胱硫醚γ-合酶活性、以及天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶II活性增强了。AJ13425与1998年5月14日保藏于日本通产省工业技术院生命工学工业技术研究所(现名日本产业技术综合研究所专利生物保藏中心，地址:Tsukuba Central6,1-1,Higashi1-Chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken,305-8566,日本)，并分派保藏号FERM P-16808。

[0111] 由于胱硫醚和高半胱氨酸是L-甲硫氨酸生物合成途径的中间体，为了增强产生这些物质的能力，部分地使用前述的增强L-甲硫氨酸生产能力的方法是有效的。作为用于增强胱硫醚生产能力的具体方法，已知有使用甲硫氨酸营养缺陷型突变型菌株的方法(日本特愿2003-010654)以及向发酵培养基添加半胱氨酸(或半胱氨酸的生物合成的原材料)和/或高丝氨酸(或高丝氨酸的生物合成的原材料)的方法(日本特开2005-168422)。由于高半胱氨酸是通过使用作为前体的胱硫醚而产生的，前述的用于增强胱硫醚-生产能力的方法对于增强高半胱氨酸生产能力也是有效的。

[0112] 此外，通过使用L-甲硫氨酸作为起始材料而生物合成的化合物(如S-腺苷甲硫氨酸)的生产能力，也可以通过增强目标化合物的生物合成系统的酶的活性，或降低从目标化合物的生物合成途径分支的途径的酶或分解目标化合物的酶的活性而赋予或增强。例如，S-腺苷甲硫氨酸生产能力可以通过增强甲硫氨酸腺苷转移酶活性(欧洲专利申请号0647712和1457569)或增强由mdfA基因所编码的分泌因子MdfA(美国专利号7,410,789)而赋予或增强。

[0113] 提高SAT等的酶活性和降低半胱氨酸脱巯基酶等的酶活性的方法在下面例示。

[0114] <提高酶活性的方法>

[0115] 在本发明中，表述“提高了酶活性”意指目标酶活性相较于非修饰菌株，例如野生型菌株或亲本菌株的活性提高了。虽然酶活性提高的程度不特别受限，只要酶活性相较于非修饰菌株提高了即可，但是酶活性相较于非修饰菌株优选提高了1.5倍或更多、更优选2倍或更多、更优选3倍或更多。此外，“提高了酶活性”的情况不止包括酶活性在天然具有目标酶活性的菌株中提高的情况，还包括将目标酶活性赋予天然不具有该目标酶活性的的菌株中的情况。而且，只要结果是提高了目标酶活性，可以将细菌天然拥有的酶弱化或删除，然后在引入合适的酶。

[0116] 用于提高酶活性的修饰可以通过，例如，之前编码目酶的基因的表达而达成。在本发明中，表述“基因的表达的增强”与“基因的表达的提高”含义相同。

[0117] 基因的表达的增强可以通过，例如，提高该基因的拷贝数而达成。

[0118] 可以通过将目标基因引入染色体而增加基因的拷贝数。可以通过，例如，使用同源重组将基因引入染色体。例如，可以通过将在染色体上以大拷贝数存在的序列作为靶标进行同源重组，将大量拷贝数的基因引入染色体中。在染色体上以大拷贝数存在的序列的例子包括但不限于，重复性DNA和在转座子的两端存在的反向重复序列。可以将目标基因连接于在染色体上串联编码目标酶的基因的旁边，或还可以将其重复地组入染色体上非必需基因之上。这样的基因引入可以通过使用温度敏感型载体或通过使用整合载体而达成。另选地，如美国专利号5,595,889中所公开的，还可能将目标基因组入转座子中，并让其转移至染色体DNA以引入该基因的多个拷贝。作为所述转座子可以使用，例如，Mu、Tn10和Tn5。目标基因是否已经引入例如染色体可以使用作为探针的部分目标基因通过Southern印迹法而确认。

[0119] 此外，目标基因的拷贝数还可以通过将含有该基因的载体引入宿主细菌中而提高。例如，目标基因的拷贝数可以通过将含有目标基因的DNA片段与在宿主细菌中有功能的载体连接以构建该目标基因的表达载体，并以该表达载体转化宿主细菌来提高。关于载体，可以使用在宿主细菌的细胞内自主复制的载体。所述载体优选是多拷贝载体。此外，为了选择转化体，载体优选具有标记，如抗生素抗性基因。在大肠杆菌细胞中自主复制的载体的实例包括pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pACYC184、pBR322、pSTV29(都可于Takara Bio获得)、pMW219(NIPPON GENE)、pTrc99A(Pharmacia)、pPROK系列载体(Clontech)、pKK233-2(Clontech)、pET系列载体(Novagen)、pQE系列载体(QIAGEN)、广宿主谱载体、等等。

[0120] 此外，可以通过改进基因的转录效率而增强基因的表达。基因的转录效率可以通过，例如，将染色体上的基因的启动子替换为更强的启动子而改进。“更强的启动子”意指提供相较于天然存在的野生型启动子改善的基因转录的启动子。作为更强的启动子，可以使用，例如已知高表达启动子，如T7启动子、trp启动子、lac启动子、tac启动子、和PL启动子。此外，作为更强的启动子，可以通过使用多种报道基因而获得通常启动子的高活性种类。例如，通过使得启动子区域中的-35和-10区域与共有序列更接近，可以增强启动子的活性(国际专利公开WO00/18935)。用于评估启动子强度的方法以及强启动子的实例在Goldstein等人的文献(Prokaryotic Promoters in Biotechnology,Biotechnol.Annu.Rev.,1,105-128(1995))中，以及其它文献中有描述。

[0121] 此外，可以通过改善基因的翻译效率而增强基因的表达。基因的翻译效率可以通过，例如，将染色体上的SD序列(也叫做核糖体结合位点(RBS))替换为更强的SD序列而改善。“更强的SD序列”意指提供相较于天然存在的SD序列改善的miRNA翻译的SD序列。更强的SD序列的例子包括，例如，从噬菌体T7衍生而来的基因10的RBS(Olins P.O.et al,Gene,1988,73,227-235)。而且，已知在RBS和起始密码子之间的间隔区域，特别是在起始密码子的直接上游的序列(5’-UTR)的几个核苷酸的取代、插入或缺失显著地影响mRNA的稳定性和翻译效率，且基因的翻译效率也可以通过修饰它们而改善。

[0122] 在本发明中，影响基因表达的位点，如启动子、SD序列和RBS和起始密码子之间的间隔区域也一般地称为“表达控制区域”或“表达控制序列”。表达控制区域可以通过使用启动子搜寻载体或基因分析软件如GENETYX而测定。这类表达控制区域可以通过，例如，使用温度敏感性载体的方法或Red驱动整合方法而修饰(WO2005/010175)。

[0123] 此外，目标基因的表达还可以通过扩增提高基因表达的调控子，或删除或弱化降低基因的表达的调控子而增强。调控子的实例包括，例如，属于LysR家族的那些等等，以及那些可以通过使用数据库，如EcoCyc(http://ecocyc.org/)等发现的。可以以监测目标基因的转录量的提高或目标蛋白质的量的提高作为指标来修饰调控子。

[0124] 如上述的这类用于增强基因表达的方法可以单独地使用或以任意的组合而使用。

[0125] 此外，提高酶活性的修饰还可以通过，例如，增强目标酶的特异性活性来达成。可以通过，例如，搜寻多种细菌而获得显示出增强的特异性活性的酶。此外，通常酶的高活性种类可以通过将突变引入所述通常酶中而获得。特异性活性的增强可以独立地使用，或可以与上述的这类用于增强基因表达的方法任意的组合而使用。

[0126] 转化的方法并不特别地受限，且可以使用常规已知方法。可以使用，例如，已经对于大肠杆菌K-12菌株报道(Mandel,M.and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53:159-162(1970))的以氯化钙处理受体细胞以提高其对于DNA的渗透性的方法，以及已经对于枯草芽孢杆菌而报道(Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E.,Gene,1,153(1977))的从在生长期的细胞制备感受态细胞，然后以DNA转化的方法。或者，还可以使用将DNA-受体细胞制成原生质体(protoplasts)或原生质球(spheroplasts)的方法，所述原生质体或原生质球可以容易地吸收重组DNA，之后将重组DNA引入细胞中，已知其对枯草芽孢杆菌、放线菌和酵母是可适用的(Chang,S.and Choen,S.N.,1979,Molec.Gen.Genet.,168:111(1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature,274,398(1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,1929(1978))。

[0127] 可以通过测量酶活性而确认目标酶活性的提高。

[0128] 目标基因的转录的量的提高可以通过比较从基因转录的mRNA的量与从野生型菌株或非修饰菌株的基因转录的mRNA的量而确认。评估mRNA的量的方法的实例包括Northern杂交法、RT-PCR等等(Molecular Cloning,Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor(USA),2001)。

[0129] 目标蛋白质的量的提高可以通过Western印迹法使用抗体而确认(Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor(USA),2001)。

[0130] <用于降低酶活性的方法>

[0131] 在本发明中，表述“酶活性降低了”意指酶活性相较于非修饰菌株如野生型菌株或亲本菌株降低了，且包括活性完全消失的情况。虽然酶活性降低的测定并不特别地受限，只要活性相较于非修饰菌株降低了即可，但是优选其降低至，例如，相较于非修饰菌株的75%或更少、50%或更少、25%或更少、或者10%或更少，并且活性的完全消失是特别地优选的。取决于酶的种类，还可以优选不完全消除酶活性。

[0132] 用于降低酶活性的修饰可以通过，例如，降低编码目标酶的基因的表达而达成。可以通过，例如，修饰表达控制序列，例如基因的启动子和SD序列而降低基因的表达。当修饰表达控制序列时，修饰表达控制序列的一个或多个核苷酸、更优选两个或更多个核苷酸、特别优选三个或更多个核苷酸。此外，可以删除表达控制序列的部分或全部。此外，可以通过表达反义RNA而降低基因的表达。

[0133] 此外，用于降低酶活性的修饰还可以通过，例如，删除在染色体上编码目标酶的基因的编码区域的部分或全部而达成。此外，可以删除包括基因上游和下游序列的整个基因。要删除的区域可以是N-末端区域、内部区域、或C-末端区域，只要酶活性可以降低。缺失的区域越长，一般可以越确定地灭活基因。而且，优选要删除的区域的上游和下游的读框不相同。

[0134] 此外，用于降低酶活性的修饰还可以通过引入用于氨基酸取代(错义突变)的突变、终止密码子(无义突变)、或将一个或两个核苷酸从在染色体上编码目标酶的基因的编码区域添加或的删除移码突变而达成(Journal of Biological Chemistry,272:8611-8617(1997);Proceedings of the National Academy of Sciences,USA,955511-5515(1998);
Journal of Biological Chemistry,266,20833-20839(1991))。

[0135] 此外，用于降低酶活性的修饰还可以通过将另一个序列插入在染色体上编码目标酶的基因的编码区域中而达成。可以将这类序列插入基因的任意区域，且更长序列的插入可以更加确定地灭活目标基因。优选插入位点的上游和下游的读框不同。其它序列并不特别受限，只要挑选的是使编码的蛋白质的功能降低或缺失的序列，其的实例包括标记基因，如抗生素抗性基因、对L-半胱氨酸产生有用的基因、等等。

[0136] 如上所述的对染色体上的基因的修饰可以通过，例如，制备该基因的缺失型基因，其中该基因的部分缺失使得该缺失型基因不产生有正常功能的基因，之后以含有缺失型基因的包含缺失型基因的重组DNA转化细菌以导致缺失型基因和染色体上的天然基因之间的同源重组，导致缺失型基因对在染色体上的基因的置换来实现。以上的操作可以通过向重组DNA中引入营养缺陷型等特征而简化。由缺失型基因所编码的蛋白质，即使产生，也具有与野生型蛋白质不同的构象，因此其功能降低或缺失。这类基于使用同源重组的基因取代的基因破坏已经确立，实例包括称为Red-驱动整合的方法(Datsenko,K.A.,and Wanner,B.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97:6640-6645(2000))、使用如Red驱动整合的方法的线性DNA与衍生自λ噬菌体的切除系统(excision system)组合的方法(Cho,E.H.,Gumport,R.I.,Gardner,J.F.,J.Bacteriol.,184:5200-5203(2002))( 参 考WO2005/010175)、使用含有温度敏感性复制起点的质粒的方法、使用能够结合转移的质粒的方法、在宿主中利用不带复制起点的自杀载体的方法(美国专利号6,303,383,日本专利早期公开号05-007491)、等等。

[0137] 此外，降低酶活性的修饰还可以通过，例如，诱变来实现。诱变的实例包括暴露于UV辐射或以用于普通诱变的诱变剂如N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、甲基磺酸乙酯(EMS)、和甲基磺酸甲酯(MMS)处理。

[0138] 可以通过测量酶活性而确认酶活性的降低。半胱氨酸脱巯基酶活性可以通过在日本特开2002-233384中所描述的方法而测量。

[0139] 目标基因的转录量的降低可以通过比较自基因转录的mRNA的量与自非修饰菌株的基因转录的mRNA的量来确认。用于评估mRNA的量的方法的实例包括Northern杂交法、RT-PCR、等等(Molecular Cloning,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,USA,2001)。

[0140] 目标蛋白质的量的降低可以通过Western印迹法使用抗体来确认(Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,USA,2001)。

[0141] <参与亚硫酸还原的基因的表达的增强>

[0142] 本发明的细菌已经过修饰，从而提高了参与亚硫酸还原的一种或多种基因的表达。本发明的细菌可以通过修饰如上文所述的属于肠杆菌科并具有L-半胱氨酸生产能力的细菌，使得其参与亚硫酸还原的基因的表达提高来获得。本发明的细菌还可以通过修饰属于肠杆菌科的细菌，使得其参与亚硫酸还原的基因的表达提高，然后赋予或增强L-半胱氨酸生产能力而获得。

[0143] 参与亚硫酸还原的基因的实例包括编码亚硫酸还原酶的基因。在本发明中，亚硫酸还原酶是指具有亚硫酸还原活性的蛋白质。在本发明中，亚硫酸还原活性，是指催化还2- 2-
原性亚硫酸根离子(SO3 )变为硫离子(S )的反应的活性。编码亚硫酸还原酶的基因的实例包括cysJ基因和cysI基因。大肠杆菌的亚硫酸还原酶是NADPH依赖性亚硫酸还原酶(EC1.8.1.2)，且其具有α8β4复合体结构，该结构包含由cysJ基因所编码的α亚基和由cysI基因所编码的β亚基。因此，蛋白显示亚硫酸还原活性的表述，不仅包括由基因所编码的蛋白质自身显示出亚硫酸还原活性的情况，还包括包括作为亚基的蛋白质的复合体显示出亚硫酸还原活性的情况。

[0144] 此外，参与亚硫酸还原的基因的实例包括参与亚硫酸还原酶的辅因子的生物合成的基因。亚硫酸还原酶的辅因子的实例包括用作修复基团(prosthetic group)的西罗血红素(siroheme)、以及用作辅酶的NADPH和黄素。在这些中，优选西罗血红素。参与西罗血红素的生物合成的基因的实例包括编码西罗血红素合成酶的cysG基因。由cysG基因所编码的蛋白质具有催化作为中间体的尿卟啉原III(Uro'gen III)至西罗血红素的转化的活性。由cysJ基因、cysI基因、和cysG基因所编码的蛋白质也分别称为CysJ蛋白质、CysI蛋白质、和CysG蛋白质。

[0145] 大肠杆菌K12MG1655菌株的cysJ基因对应于在NCBI数据库以GenBank登录号NC_000913注册的基因组序列中的2888121位至2889920位的互补序列(VERSION NC_000913.2GI:49175990)。大肠杆菌K12MG1655菌株的cysJ基因与ECK2759和JW2734同义。此外，大肠杆菌K12MG1655菌株的CysJ蛋白质注册为GenBank登录号NP_417244(版本NP_417244.1GI:16130671,locus_tag="b2764")。

[0146] 此外，大肠杆菌K12MG1655菌株的cysI基因对应于基因组序列的2886049位至2888121位的序列。大肠杆菌K12MG1655菌株的cysI基因与ECK2758和JW2733同义。
此外，大肠杆菌K12MG1655菌株的CysI蛋白质以GenBank登录号NP_417827注册(版本NP_417243.1GI:16130670,locus_tag="b2763")。

[0147] 此外，大肠杆菌K12MG1655菌株的cysG基因对应于基因组序列的3495850位至3497223位的序列。大肠杆菌K12MG1655菌株的cysG基因与ECK3356和JW3331同义。
此外，大肠杆菌K12MG1655菌株的CysG蛋白质以GenBank登录号NP_417827注册(版本NP_417827.1GI:16131246,locus_tag="b3368")。

[0148] MG1655菌株的cysJ基因、cysI基因、和cysG基因的核苷酸序列分别显示为SEQ ID NO:61、65、和69。此外，由这些基因所编码的蛋白质的序列分别显示为SEQ ID NO:62、66、和70。此外，Pantoea ananatis SC17菌株的cysJ基因、cysI基因、和cysG基因的核苷酸序列分别显示为SEQ ID NO:63、67、和71。此外，由这些基因所编码的蛋白质的序列分别显示为SEQ ID NO:64、68、和72。

[0149] 由于cysJ基因的核苷酸序列可以取决于细菌所属于的菌属、菌种或菌株而不同，表达提高的cysJ基因可以是如SEQ ID NO:61或63所示的的核苷酸序列的变体，只要其编码具有亚硫酸还原活性的蛋白质。可以通过使用BLAST(http://blast.genome.jp/)等对于SEQ ID NO:61或63的核苷酸序列而搜索。此外，cysJ基因的变体包括基因的同源物，如可以通过使用模板和合成寡核苷酸以PCR扩增的基因，所述模板是如属于肠杆菌科和棒状杆菌的细菌的微生物的染色体，并且所述合成寡核苷酸是基于SEQ ID NO:61或63的核苷酸序列而制备的。

[0150] cysJ基因可以是编码以下蛋白质的基因：具有如上所描述的CysJ蛋白质的氨基酸序列的蛋白质，如SEQ ID NO:62或64所示的氨基酸序列，但包括一个或几个氨基酸残基在一个或几个位置的取代、缺失、插入、添加等，只要其编码具有亚硫酸还原活性的蛋白质。虽然由术语“一个或多个”所意指的数目可以取决于在蛋白质三维结构中的位置或氨基酸的种类而不同，具体地，优选1至20个、更加优选1至10个、更优选1至5个。以上的一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加是保守的突变，其维持蛋白质的正常功能。保守的突变通常是保守的取代。保守的取代是如下的突变：如果取代位点是芳香族氨基酸，则取代发生在Phe、Trp和Tyr之间；如果是疏水性氨基酸，则Leu、Ile和Val之间；如果是具有羟基基团的氨基酸，则Ser和Thr之间。保守取代的具体例子包括：用Ser或Thr取代Ala；
用Gln、His或Lys取代Arg；用Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn；用Asn、Glu或Gln取代Asp；用Ser或Ala取代Cys；用Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln；用Gly、Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu；用Pro取代Gly；用Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His；用Leu、Met、Val或Phe取代Ile；用Ile、Met、Val或Phe取代Leu；用Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys；用Ile、Leu、Val或Phe取代Met；用Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe；用Thr或Ala取代Ser；用Ser或Ala取代Thr；用Phe或Tyr取代Trp；用His、Phe或Trp取代Tyr；以及用Met、Ile或Leu取代Val。上述的氨基酸取代、删除、插入、添加、倒位等可以是基于所来源的细菌的个体差异、物种差异等造成的天然出现的突变的结果(突变体或变体)。

[0151] 而且，具有如上所述的这类保守突变的基因可以是编码显示出与CysJ蛋白质，如SEQ ID NO:62或64的氨基酸序列的总序列，80%或更多、优选90%或更多、更优选95%或更多、依然更优选97%或更多、尤其优选99%或更多的同源性的蛋白质，且其具有亚硫酸还原活性。在本说明书中，“同源性”可以意指“一致性(identity)”。

[0152] 此外，cysJ可以是DNA，其能够与探针杂交，所述探针可以从意指基因序列，例如，与SEQ ID NO:61或63的核苷酸序列的部分或全部互补的序列，在严格条件下杂交，且编码具有亚硫酸还原活性的蛋白质。“严格条件”指在其之下形成所谓的特异性杂交体，且不形成非特异性杂交体的条件。严格条件的例子包括这样的条件，在该条件下高度同源性的DNA彼此杂交，例如，不低于80%同源性、优选不低于90%同源性、更加优选不低于95%同源性、还更优选不低于97%同源性、特别优选不低于99%同源性的DNA彼此杂交，且比上述同源性更低的DNA不彼此杂交；或者普遍的Southern杂交法的清洗条件，即，在对应于在60℃的1x SSC、0.1%SDS，优选在60℃的0.1x SSC、0.1%SDS，更优选在68℃的0.1x SSC、0.1%SDS的盐浓度和温度清洗一次、优选2或3次的条件。

[0153] 用于上述杂交法的探针可以是于如上所描述的基因的部分所互补的序列。这类探针可以通过使用作为引物的寡核苷酸和作为模板的DNA片段的PCR所制备，其中所述寡核苷酸基于已知的基因序列，并且其中所述DNA片段含有所述核苷酸序列。例如，当将具有大约300bp的长度的DNA片段用作探针时，杂交的清洗条件可以是，例如，50℃、2x SSC和0.1%SDS。

[0154] 类似地，由于cysI可以取决于细菌所述的菌属、菌种、或菌株而不同，表达提高的cysI基因可以是SEQ ID NO:65或67的核苷酸序列的变体，只要其编码具有亚硫酸还原活性的蛋白质。以上对于cysJ基因和CysJ蛋白质的变体的解释也相似地适用于cysI基因的变体。

[0155] 类似地，由于cysG可以取决于细菌所述的菌属、菌种、或菌株而不同，表达提高的cysG基因可以是SEQ ID NO:69或71的核苷酸序列的变体，只要其编码具有催化尿卟啉原III(Uro'gen III)至西罗血红素转化活性的蛋白质。以上对于cysJ基因和CysJ蛋白质的变体的解释也相似地适用于cysG基因的变体。

[0156] 上述的对基因和蛋白质的变体的解释也相似地对任意的蛋白质，以及编码该蛋白质的基因有效，所述蛋白质包括例如丝氨酸酰基转移酶和3-磷酸甘油酸脱氢酶的酶、以及如YdeD蛋白质的运输蛋白。

[0157] 表述“提高了参与亚硫酸还原的基因的表达”意指参与亚硫酸还原的基因的表达量相较于非修饰菌株如野生型或亲本菌株中的基因的表达量提高了。虽然参与亚硫酸还原的具有的表达的量的提高的程度并不特别地受限，只要其相较于非修饰的菌株提高了，但是优选其相较于非修饰菌株提高了1.5倍或更多、更优选2倍或更多、依然更优选3倍或更多。此外，“提高了参与亚硫酸还原的基因的表达”的情况不仅包含了在菌株内天然表达的参与亚硫酸还原的基因的表达的情况，还包括提高了在菌株内不天然表达的参与亚硫酸还原的基因表达的情况。即，以上的表述所意指的情况包括，例如，将参与亚硫酸还原的基因引入不具有该参与亚硫酸还原的基因的菌株，使得该参与亚硫酸还原的基因在菌株中表达的情况。此外，只要从结果上看参与亚硫酸还原的基因的表达的是提高的，可以弱化或删除细菌所天然拥有的参与亚硫酸还原的基因的表达，并且然后可以引入合适的亚硫酸还原酶。

[0158] 本发明的细菌是优选经过修饰，使得至少一种编码西罗血红素合成酶的基因的表达提高。此外，本发明的细菌是优选经过修饰使得编码西罗血红素合成酶的基因的表达提高，且编码亚硫酸还原酶的基因的表达提高。

[0159] 用于提高参与亚硫酸还原的基因的表达的修饰可以通过在上述的<用于提高酶活性的方法>一节中所例示的用于增强基因的表达的方法而达成。

[0160] 此外，如上所描述，用于提高基因的表达的修饰可以通过扩增提高目标基因的表达的调控子而达成。提高编码亚硫酸还原酶的基因的表达的调控子的实例包括由cysB基因所编码的蛋白质(CysB)。已知CysB正调控编码亚硫酸还原酶的含有cysJ基因和cysI基因的cysJIH操纵子的表达，因此，可以通过增强cysB基因的表达而增强参与亚硫酸还原的基因的表达。

[0161] 可以通过，例如，通过如上所描述的Northern杂交法或RT-PCR确认基因的转录量的提高、或者通过Western印迹法通过确认蛋白质量的提高来确认基因的表达的提高。此外，参与亚硫酸还原的基因的表达的提高还可以通过测量由参与亚硫酸还原的基因所编码的蛋白质的活性而确认。亚硫酸还原酶的活性可以通过已知的方法测量(Covbs J.et al.,J.Biol.Chem.,268,18604-18609(1993))。此外，可以通过已知的方法测量西罗血红素合成酶的活性(Spencer J.B.et al.,FEBS Lett.,335(1):57-60,Nov.29,1993)。

[0162] <2>用于产生本发明的L-半胱氨酸、L-半胱氨酸的相关物质、或其混合物的方法[0163] 通过在含有硫代硫酸盐的培养基中培养如上所描述的本发明的细菌并收集L-半胱氨酸、L-半胱氨酸的相关物质、或其混合物，可以产生这些化合物。L-半胱氨酸的相关的物质的例子包括上述的L-胱氨酸、S-磺酸半胱氨酸、噻唑烷衍生物、对应于噻唑烷衍生物的硫代半缩醛、L-甲硫氨酸、S-腺苷甲硫氨酸、等等。

[0164] 对于培养基，只要其包含硫代硫酸，可以使用含有碳源、氮源、硫源、无机离子、和其他所需的有机成分的普通的培养基。

[0165] 对于碳源，可以使用糖类如葡萄糖、果糖、蔗糖、蜜糖和淀粉水解产物，以及有机酸如富马酸(fumaric acid)、柠檬酸和琥珀酸。

[0166] 对于氮源，可以使用无机铵盐如硫酸铵、氯化铵和磷酸铵，有机氮如大豆水解产物、氨气、氨水，等等。

[0167] 对于硫源，培养基可以仅含有硫代硫酸，或培养基可以除硫代硫酸外再含有另一种含硫化合物。除硫代硫酸外的另一种含硫化合物的例子包括无机硫化合物如磷酸盐、亚硫酸、次硫酸盐和硫化物。虽然培养基中所含的硫代硫酸根和其他硫化合物的重量比值并不特别受限，例如，硫代硫酸：其他硫化合物的重量比值通常是5:95至100:0，但是优选20:80至100:0、更优选50:50至100:0、特别优选80:20至100:0。

[0168] 培养基中的硫代硫酸含量是，例如，通常0.1g/L或更高，优选0.3g/L或更高。虽然硫代硫酸最大含量并不特别受限，可以是例如100g/L或更低，或10g/L更低。硫代硫酸可以是游离酸或硫代硫酸盐，或可以是它们的任意的混合物。硫代硫酸盐的种类并不特别受限，其例子包括钠盐、钙盐、铵盐、等等。

[0169] 硫代硫酸可以在整个培养的期间包含于培养基中，或仅在部分的培养期间包含于培养基中。例如，如果本发明的方法包括使L-半胱氨酸生产细菌增殖的阶段，以及产生和蓄积L-半胱氨酸的阶段，则至少在产生和蓄积L-半胱氨酸的阶段培养基中包含硫代硫酸就足够了，而在使L-半胱氨酸生产细菌增殖的阶段培养基中可能或可能不包含硫代硫酸。此外，硫代硫酸根可以在产生和蓄积L-半胱氨酸的整个或部分期间包含在培养基中。例如，硫代硫酸含量不需要在产生和蓄积L-半胱氨酸的阶段的整个期间都处于上述的范围中，在该阶段的早期，培养基中可以包含上述范围的含量的硫代硫酸，但是硫代硫酸含量可以随培养时间的流逝而降低。此外，可以连续地或间歇地补充性添加硫代硫酸。此外，在培养期间除硫代硫酸外的其他培养基组份的含量也可以变化，且其可以在培养期间补充性地添加。

[0170] 对于有机微量营养物，合意的添加所需的物质如合适量的维生素B1、酵母提取物等等。除这些外，根据需要少量添加氯化钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等等。

[0171] 培养优选在有氧条件下进行30到90小时。在培养期间培养温度优选控制在25℃到37℃，pH优选控制在5到8。pH的调整可以使用无机或有机酸性或碱性物质、氨气等等。

[0172] 可以 通 过离 子 交换 树 脂法 (Nagai,H.et al.,Separation Science and Technology,39(16),3691-3710)、膜分离法(日本特开平9-164323和9-173792)、结晶方法(WO2008/078448,WO2008/078646)、和其他常规已知方法的组合从培养液收集L-半胱氨酸、L-半胱氨酸相关物质、或其混合物。

[0173] 根据本发明收集的L-半胱氨酸、L-半胱氨酸相关物质、或其混合物除目标化合物外还可以含有微生物细胞、培养基成分、水分、微生物的代谢副产物、等等。

[0174] 如上所描述而获得的L-半胱氨酸可以用于产生L-半胱氨酸衍生物。L-半胱氨酸衍生物包括甲基半胱氨酸、乙基半胱氨酸、羧甲基半胱氨酸(carbocisteine)、磺酸半胱氨酸、乙酰半胱氨酸、等等。

[0175] 此外，当L-半胱氨酸的噻唑烷衍生物在培养基中蓄积时，可以通过从培养基收集噻唑烷衍生物，使得噻唑烷衍生物和L-半胱氨酸的反应平衡向L-半胱氨酸一侧移动，来产生L-半胱氨酸。此外，当S-磺酸半胱氨酸在培养基中蓄积时，可以使用还原剂如二硫苏糖醇通过还原将其转化为L-半胱氨酸。实施例

[0176] 此后，将以对实施例的参考而更加具体地解释本发明。在下面的实施例中，半胱氨酸意指L-半胱氨酸。

[0177] 实施例1：使用硫代硫酸作为硫源，通过过表达cysG基因或cysGJI基因的大肠杆菌产生半胱氨酸

[0178] (1)参与亚硫酸还原的基因的表达质粒的构建

[0179] 有关参与亚硫酸还原的基因，使用了Pantoea ananatis SC17菌株的cysG基因、Pantoea ananatis SC17菌株的cysGJI基因、大肠杆菌M1655菌株的cysG基因、和大肠杆菌MG1655菌株的cysGJI基因。将这些基因每个克隆到表达载体中以构建该基因的表达质粒。步骤在(1-1)至(1-7)中描述。

[0180] (1-1)表达载体的构建

[0181] 表达载体使用构建自pMIV-5JS的pMIV-Pnlp23-ter(日本特开2008-99668)。该载体具有强启动子nlp23启动子(Pnlp23)和rrnB终止子，并且在Pnlp23和rrnB终止子之间具有SalI和XbaI位点。通过使用设计有SalI(或XhoI)和XbaI位点的引物扩增目标基因，并将扩增的基因插入载体的Pnlp23和rrnB终止子之间的位置，构建目标基因的表达质粒。“Pnlp23”是以“Pnlp0”(其是衍生自大肠杆菌K12菌株野生型nlpD基因的启动子)为基础，以控制表达强度为目的构建的突变型启动子。

[0182] 此外，作为表达载体，还使用了以pMIV-5JS(日本特开2008-99668)为基础构建的pMIV-Pnlp8-YeaS7。该载体具有强启动子nlp8启动子(Pnlp8)和rrnB终止子，其进一步地具有利用SalI和XbaI位点被克隆于Pnlp8和rrnB终止子之间的位置的大肠杆菌K12菌株的yeaS基因。通过使用设计有SalI(或XhoI)和XbaI位点扩增目标基因，并将扩增的基因插入载体，可以构建将载体的yeaS基因片段用目标片段替换的表达质粒。“Pnlp8”是以“Pnlp0”(其是衍生自大肠杆菌K12菌株野生型nlpD基因的启动子)为基础，以控制表达强度为目的构建的突变型启动子。

[0183] 将构建这些表达载体的细节在下面描述。

[0184] 首先，通过使用作为模板的大肠杆菌MG1655菌株的染色体DNA以及作为引物的引物P1(agctgagtcgacccccagga aaaattggttaataac,SEQ ID NO:13)和P2(agctgagcatgcttccaactgcgctaatgacgc,SEQ ID NO:14)的PCR，获得了含有nlpD基因的启动子区域(此后将野生型nlpD基因启动子称为“Pnlp0”)的大约300bp的DNA片段。分别在上述的引物的5’端设计了限制性酶SalI和PaeI的位点。PCR循环如下：95℃3分钟；然后2个循环的
95℃60秒、50℃30秒、和72℃40秒；25个循环的94℃20秒、55℃20秒、和72℃15秒；以及作为最终循环的72℃5分钟。将获得的片段以SalI和PaeI处理，并插入pMIV-5JS(日本特开2008-99668)的SalI-PaeI位点以获得质粒pMIV-Pnlp0。插入的含有Pnlp0启动子的PaeI-SalI片段的核苷酸序列在SEQ ID NO:1中显示。

[0185] 然后，通过使用MG1655菌株的染色体DNA作为模板以及引物P3(agctgatcta gaaaacagaa tttgcctggc ggc,SEQ ID NO:15) 和 引 物 P4(agctgaggat ccaggaagag tttgtagaaa cgc,SEQ ID NO:16)作为引物进行的PCR，获得了含有大约300bp的rrnB基因的终止子区域的DNA片段。分别在上述的引物的5’端设计了限制性酶XbaI和BamHI的位点。PCR循环如下：95℃3分钟；然后2个循环的95℃60秒、50℃30秒、和72℃40秒；25个循环的94℃20秒、59℃20秒、和72℃15秒；以及作为最终循环的72℃5分钟。将获得的片段以XbaI和BamHI处理并插入pMIV-Pnlp0的XbaI-BamHI位点以获得质粒pMIV-Pnlp0-ter。

[0186] 然后，通过使用MG1655菌株的染色体DNA作为模板以及引物P5(agctgagtcg acgtgttcgc tgaatacggg gt,SEQ ID NO:17) 和 引 物 P6(agctgatcta gagaaagcat caggattgca gc,SEQ ID NO:18)作为引物进行PCR，获得了大约700bp的含有yeaS基因的DNA片段。分别在上述的引物的5’端设计了限制性酶SalI和XbaI的位点。PCR循环如下：95℃3分钟；然后2个循环的95℃60秒、50℃30秒、和72℃40秒；25个循环的94℃20秒、55℃20秒、和72℃15秒；以及作为最终循环的72℃5分钟。将获得的片段以SalI和XbaI处理并插入pMIV-Pnlp0-ter的SalI-XbaI位点以获得质粒pMIV-Pnlp0-YeaS3。如上所述，yeaS表达单位含有nlpD启动子、yeaS基因、以及rrnB终止子，将其以该顺序连接至pMIV-5JS载体。

[0187] 为了将nlpD启动子的-10区域修饰以使其成为更强的启动子，通过以下方法随机化-10区域。nlpD启动子区域含有两个推测功能为启动子的区域(图2)，在图中将其分别示为pnlp1和pnlp2。通过使用作为模板的pMIV-Pnlp0质粒以及作为引物的引物P1和P7(atcgtgaaga tcttttccag tgttnannag ggtgccttgc acggtnatna ngtcactgg("n"意指对应的残基可以是a、t、g、c中的任一种),SEQ ID NO:19)进行PCR，获得了包含在nlpD启动子的3’端的-10区域(-10(Pnlp1),图2)被随机化了的DNA片段。PCR循环如下：95℃3分钟；然后2个循环的95℃60秒、50℃30秒、和72℃40秒；25个循环的94℃20秒、60℃20秒、和72℃15秒；以及作为最终循环的72℃5分钟。

[0188] 同样地，通过使用作为模板的pMIV-Pnlp0质粒以及作为引物的引物P2和P8(tggaaaagat cttcannnnn cgctgacctg cg("n"意指对应的残基可以是a、t、g、c中的任一种),SEQ ID NO:20)进行PCR，获得了包含在nlpD启动子的5’端的-10区域(-10(Pnlp2),图2)被随机化了的DNA片段。PCR循环如下：95℃3分钟；然后2个循环的95℃60秒、50℃30秒、和72℃40秒；25个循环的94℃20秒、60℃20秒、和72℃15秒；以及作为最终循环的72℃5分钟。

[0189] 将获得的3’和5’端侧片段利用设计在引物P7和P8中的BglII位点连接，构建了含有两个-10区域被随机化的全长nlpD启动子的片段。使用的该片段作为模板以及P1和P2作为引物进行PCR，获得了含有全长的突变型nlpD启动子的DNA片段。PCR循环如下：95℃3分钟；然后2个循环的95℃60秒、50℃30秒、和72℃40秒；12个循环的94℃20秒、60℃20秒、和72℃15秒；以及作为最终循环的72℃5分钟

[0190] 将获得的含有突变型Pnlp的DNA片段以限制性酶SalI和PaeI(它们被设计在引物的5’端)处理，并插入类似地用SalI和PaeI处理过的pMIV-Pnlp0-YeaS3质粒，以用突变型Pnlp替换质粒上的野生型nlpD启动子区域(Pnlp0)。从产物中选择具有图2中显示的启动子序列(Pnlp8)的产物，并命名为pMIV-Pnlp8-YeaS7。将插入该质粒的Pnlp8启动子的PaeI-SalI片段的核苷酸序列显示在SEQ ID NO:21中。

[0191] 以相同的方式，将含有突变型Pnlp的DNA片段插入以SalI和PaeI处理的pMIV-Pnlp0-ter质粒中，以用突变型Pnlp替换在质粒上的nlpD启动子(Pnlp0的区域)。将其中一个产物称为pMIV-Pnlp23-ter。将插入该质粒的Pnlp23启动子的PaeI-SalI片段的核苷酸序列在SEQ ID NO:2中显示。

[0192] (1-2)构建大肠杆菌MG1655菌株cysG基因的过表达质粒

[0193] 通过使用大肠杆菌MG1655菌株(ATCC No.47076)的染色体DNA作为模板，以及 引 物SalI-cysG(Ec)Fw(ACGCGTCGACATGGATCATTTGCCTATATT,SEQ ID NO:8) 和 引 物XbaI-cysG(Ec)Rv(GCTCTAGATTAATGGTTGGAGAACCAGTTC,SEQ ID NO:9)作为引物进行PCR，将cysG基因片段扩增。在这些引物的5’端设计用于限制性酶SalI和XbaI的位点。PCR使用PrimeSTAR聚合酶(TaKaRa)和在所附的规程中所描述的步骤反应混合物组合物，按照由以下组成的PCR循环进行：94℃5分钟；之后30个循环的98℃5秒、55℃10秒、和72℃2分钟；最终保持在4℃。将所获得的片段以SalI和XbaI处理，并插入以同样的限制性酶处理的pMIV-Pnlp23-ter中以获得质粒pMIV-Pnlp23-cysG(Ec)，其中克隆有大肠杆菌MG1655菌株的cysG基因。

[0194] (1-3)克隆大肠杆菌MG1655菌株的cysJI基因

[0195] 通过使用大肠杆菌MG1655菌株的染色体DNA作为模板，以及引物SalI-cysJ(Ec)Fw(ACGCGTCGACATGACGACACAGGTCCCACC,SEQ ID NO:10)和引物 XbaI-cysI(Ec)Rv(GCTCTAGATTAATCCCACAAATCACGCGCC,SEQ ID NO:11)作为引物进行PCR，将cysJI基因的片段扩增。在这些引物的5’端设计在限制性酶SalI和XbaI的位点。PCR使用PrimeSTAR聚合酶(TaKaRa)和在所附的规程中所描述的标准反应混合物组成，按照由以下组成的PCR循环进行：94℃5分钟；之后30个循环的98℃5秒、55℃10秒、和72℃2分钟；最后保持在4℃。将所获得的片段以SalI和XbaI处理，并插入以同样的限制性酶处理的pMIV-Pnlp23-ter中以获得质粒pMIV-Pnlp23-cysJI(Ec)，其中克隆有大肠杆菌MG1655菌株的cysJI基因。

[0196] (1-4)构建大肠杆菌MG1655菌株的cysG基因和cysJI基因的共表达质粒[0197] 通过使用大肠杆菌MG1655菌株的染色体DNA作为模板，以及引物SalI-cysG(Ec)Fw(SEQ ID NO:8)和引物cysG-JI(Ec)Rv(CAACGCGGAAGGTGGGACCTGTGTCGTCATGCGTCGTTATGTTCCAGT TTAATGGTTGGAGAACCAGTTCAGTTTATC,SEQ ID NO:12)作为引物进行PCR。PCR使用PrimeSTAR聚合酶(TaKaRa)和在所附的规程中所描述的标准反应混合物组成，按照由以下组成的PCR循环进行：94℃5分钟；之后30个循环的98℃5秒、55℃10秒、和72℃2分钟；最后保持在4℃。通过该PCR，获得了在cysG基因下游添加有18bp的含有cysJ基因起始密码子序列的基因片段。从含有获得的片段的反应混合物除去盐、聚合酶、和引物，将所得的产物用作之后的PCR的引物。

[0198] 使用在(1-3)中构建的pMIV-Pnlp23-cysJI(Ec)的质粒DNA作为模板，以及前述基因片段和引物XbaI-cysI(Ec)Rv(SEQ ID NO:11)作为引物进行PCR。PCR使用PrimeSTAR聚合酶(TaKaRa)和在所附的规程中所描述的标准反应混合物组成，按照由以下组成的PCR循环进行：98℃10秒；之后30个循环的98℃10秒、58℃15秒、和68℃2分钟；最后保持在4℃。通过该PCR，获得了包含cysG基因及连接至cysG基因序列下游的cysJI基因序列的片段。引物的5’端分别设计有SalI和XbaI位点。将获得的片段用SalI和XbaI处理，并插入以同样限制性酶处理过的pMIV-Pnlp23-ter中以获得pMIV-Pnlp23-cysGJI(Ec)质粒，其中克隆有大肠杆菌MG1655菌株的cysGJI基因。

[0199] (1-5)构建Pantoea ananatis SC17菌株的cysG基因的过表达质粒[0200] 通过使用Pantoea ananatis SC17菌株(FERM BP-11091)的染色体DNA作为模板，以及引物CysG Fw(XhoI)(ACGCCTCGAGATGGATTATTTGCCTCTTTT,SEQ ID NO:3)和引物CysG Rv(XbaI)(GCTCTAGATCAAGCCAGATTGACAACGG,SEQ ID NO:4)作为引物进行PCR，扩增了cysG基因片段。PCR使用PrimeSTAR聚合酶(TaKaRa)和在所附的规程中所描述的标准反应混合物组成，按照由以下组成的PCR循环进行：94℃5分钟；之后30个循环的98℃5秒、58℃10秒、和72℃2分钟；最后保持在4℃。虽然Pantoea ananatis的染色体DNA上的cysG基因的起始密码子是GTG，但是通过将引物的起始密码子附着位点的序列的GTG改为ATG，PCR所获得的DNA片段中所含的cysG基因的起始密码子被修饰为ATG。此外，前述引物的5’端分别设计有XhoI和XbaI位点。Pantoea ananatis的cysG基因的ORF中存在SalI的限制性位点，所以用XhoI代替SalI。将获得的片段以XhoI和XbaI处理，并插入以SalI和XbaI处理的pMIV-Pnlp8-YeaS7中以获得质粒pMIV-Pnlp8-cysG(Pa)，其中克隆有Pantoea ananatis SC17菌株的cysG基因。pMIV-Pnlp8-cysG(Pa)具有这样的结构：pMIV-Pnlp8-YeaS7上的yeaS基因片段被替换为Pantoea ananatis SC17菌株的cysG基因片段。

[0201] 类似地，以XhoI和XbaI处理获得的片段，并插入以SalI和XbaI处理的过pMIV-Pnlp23-ter中，以获得质粒pMIV-Pnlp23-cysG(Pa)，其中克隆有Pantoea ananatis SC17菌株的cysG基因。

[0202] (1-6)克隆Pantoea ananatis SC17菌株的cysJI基因

[0203] 使用Pantoea ananatis SC17菌株(FERM BP-11091)的染色体DNA作为模板，以及引物CysJ Fw(SalI)(ACGCGTCGACATGACGACTCAGGCACCAGG,SEQ ID NO:5)和引物CysI Rv(XbaI)(GCTCTAGATCATTTTGCCTCCTGCCAGA,SEQ ID NO:6)作为引物进行PCR，扩增了cysJI基因片段。前述引物的5’端分别设计有限制性酶SalI和XbaI的位点。PCR使用PrimeSTAR聚合酶(TaKaRa)和在所附的规程中所描述的标准反应混合物组成，按照由以下组成的PCR循环进行：94℃5分钟；之后30个循环的98℃5秒、55℃10秒、和72℃2分钟；最后保持在4℃。将获得的片段以SalI和XbaI处理，并插入以同样限制性酶处理的pMIV-Pnlp23-ter中以获得质粒pMIV-Pnlp23-cysJI(Pa)，其中克隆有Pantoea ananatis SC17菌株的cysJI基因。

[0204] (1-7)构建Pantoea ananatis SC17菌株的cysG基因和cysJI基因的共表达质粒[0205] 使用Pantoea ananatis SC17菌株(FERM BP-11091)的染色体DNA作为模板，以及引物CysG Fw(XhoI)(SEQ ID NO:3)和引物CysG-JI Rv(CTGGTGCCTGAGTCGTCATCGTTTTTCCTCTCAAGCCAGATTGACAAC GGCGGACTCGCG,SEQ ID NO:7)作为引物进行PCR。PCR使用PrimeSTAR聚合酶(TaKaRa)和在所附的规程中所描述的标准反应混合物组成，按照由以下组成的PCR循环进行：94℃5分钟；之后30个循环的98℃5秒、55℃10秒、和72℃2分钟；最后保持在4℃。通过该PCR，获得了包含cysG基因和添加在cysG基因下游的含有cysJ基因的起始密码子的11bp的序列的基因片段。从含有所获得的片段的反应混合物中除去盐、聚合酶、和引物，将产物用作接下来的PCR的引物。

[0206] 使用在(1-6)中构建的pMIV-Pnlp23-cysJI(Pa)的质粒DNA作为模板，以及前述基因片段和引物CysI Rv(XbaI)(SEQ ID NO:6)作为引物进行PCR。PCR使用PrimeSTAR聚合酶(TaKaRa)和在所附的规程中所描述的标准反应混合物组成，按照由以下组成的PCR循环进行：98℃10秒；之后30个循环的98℃5秒、58℃15秒、和68℃2分钟；最后保持在4℃。通过该PCR，获得了包含cysG基因和连接至cysG基因序列下游的cysJL基因序列的基因片段。虽然Pantoea ananatis的染色体DNA上的cysG基因的起始密码子是GTG，但是通过将引物的起始密码子附着位点的序列的GTG改为ATG，在PCR所获得的DNA片段中所含有的cysG基因的起始密码子被修饰为了ATG。此外，引物的5’端分别设计有XhoI和XbaI位点。
Pantoea ananatis的cysG基因的ORF中存在有SalI的限制性位点，所以用XhoI代替SalI。
将获得的片段以XhoI和XbaI处理，并插入以SalI和XbaI处理的pMIV-Pnlp23-ter中以获得质粒pMIV-Pnlp23-cysGJI(Pa)，其中克隆有Pantoea ananatis SC17菌株的cysGJI基因。

[0207] (2)构建产生半胱氨酸的大肠杆菌

[0208] 作为产生半胱氨酸的大肠杆菌，构建了MG1655int-4M/pACYC-DES菌株，该菌株携带具有ydeD基因、cysEX基因、和serA5基因的pACYC-DES质粒，且染色体中导入了cysM基因。构建步骤将在(2-1)和(2-2)中描述。

[0209] (2-1)构建具有ydeD基因、cysEX基因、和serA5基因的pACYC-DES质粒[0210] 将ydeD基因、cysEX基因、和serA5基因克隆进入pACYC184质粒以构建pACYC-DES质粒。ydeD基因是编码参与在半胱氨酸途径的代谢产物的分泌中的跨膜蛋白，已经报道其对半胱氨酸产生有用(美国专利号5,972,663)。cysEX基因是cysE的突变型基因，编码对由半胱氨酸的反馈抑制脱敏的突变型丝氨酸酰基转移酶(SAT)(美国专利号6,218,168)。serA5基因是serA基因的突变型基因，编码突变型3-磷酸甘油酸脱氢酶(PGD)，所述突变型3-磷酸甘油酸脱氢酶缺乏来源于大肠杆菌的野生型3-磷酸甘油酸脱氢酶的C-末端酪氨酸残基，对由L-色氨酸所致的反馈抑制脱敏(美国专利号6,180,373)。将构建步骤在下面显示。

[0211] 通 过 使 用 大 肠 杆 菌MG1655的 染 色 体DNA 作 为 模 板，以 及 引 物ydeD299F(agctgagtcg acatgtcgcg aaaagatggg gtg,SEQ ID NO:22) 和 引 物ydeD299R(agctgatcta gagtttgttc tggccccgac atc,SEQ ID NO:23)作为引物进行PCR，扩增了大肠杆菌的ydeD基因片段。

[0212] 进一步，如图3中所示，制备了cysEX基因片段。具体地，首先，通过使用大肠杆菌MG1655菌株的染色体DNA作为模板，以及引物cysEF(agctgagtcg acatgtcgtg tgaagaactg gaa,SEQ ID NO:24)和引物cysEX-1(atcaccgccg cttcaccaac g,SEQ ID NO:25)作为引物进行PCR，扩增了cysEX基因的上游侧片段。然后，通过使用大肠杆菌MG1655菌株的染色体DNA作为模板，以及引物cysEX-2(cgttggtgaa gcggcggtga t,SEQ ID NO:26)和引物cysER(agctgatcta gaatagatga ttacatcgca tcc,SEQ ID NO:27)作为引物进行PCR，扩增了cysEX基因的下游侧片段。将该两种PCR产物通过电泳分开，并从凝胶中洗脱。接下来，使用该两种PCR产物再次进行PCR，使该两种PCR产物借助重叠部分退火，以产生含有全长cysEX基因的DNA片段。

[0213] 此外，使用 大 肠杆 菌MG1655菌 株的 染色 体DNA作 为模 板，以 及 引物 serA5F(agctgagtcg acatggcaaa ggtatcgctg gag,SEQ ID NO:28) 和 引 物serA5R(agctgatcta gattacagca gacgggcgcg aatgg,SEQ ID NO:29)作为引物进行PCR，扩增了serA5基因片段。

[0214] 此外，使用大肠杆菌MG1655菌株的染色体DNA作为模板，以及引物PrOMPAF(agctgagtcg accgcctcgt tatcatccaa aatc,SEQ ID NO:30) 和 引 物PrOMPAR(agctgagcat gcactaattt tccttgcgga ggc,SEQ ID NO:31)作为引物进行PCR，扩增了启动子PompA片段。

[0215] 在引物PrOMPAF，和用于基因片段扩增的引物ydeD299F、cysEF、和serA5F的5’端均设计有SalI位点。将扩增的PompA片段和每种扩增的基因片段以SalI处理并连接，获得各种基因连接于PompA的下游的三种包含PompA的DNA片段。

[0216] 此外，在引物PrOMPAR的5’端设计有PaeI位点。在用于基因片段扩增的引物ydeD299R、cysER、和serA5R的的5’端设计有用于组入载体的限制性位点。使用这些限制性位点，将各基因连接在PompA的下游的三种包含PompA的DNA片段引入了质粒pACYC184。将pACYC-DES的结构在图4中显示。

[0217] (2-2)将O-乙酰基-L-丝氨酸硫化氢解酶B基因(cysM)引入大肠杆菌MG1655菌株

[0218] 将O-乙酰基-L-丝氨酸硫化氢解酶B基因(cysM)引入大肠杆菌MG1655菌株的染色体以构建MG1655int-4M菌株。进一步，将质粒pACYC-DES引入MG1655int-4M菌株以构建MG1655int-4M/pACYC-DES菌株。为了表达引入大肠杆菌MG1655菌株的cysM基因，使用了Pantoea ananatis SC17菌株的野生型nlpD的启动子，“Pnlp4”。下面说明构建步骤。

[0219] 首先，为了用合适强度的启动子表达cysM基因，通过以下步骤获得了新启动子Pnlp4。

[0220] 首先，使用Pantoea ananatis SC17菌株的基因组作为模板，通过PCR获得了含有nlpD基因的启动子区域的大约180bp的DNA片段。将如上所述扩增的源自Pantoea ananatis SC17菌株的野生型nlpD基因的启动子称为“Pnlp4”。使用的引物是引物P9(agctgaaagc ttgcatgcac gcgtggcgat ctggcctgac tgc,SEQ ID NO:32)和引物P10(agctgagtcg accccgtggt ggcaaccttt aaaaaactg,SEQ ID NO:33)，在这些引物的5’端分别设计有用于限制性酶SalI和PaeI的位点。PCR循环如下：95℃5分钟；其后27个循环的94℃20秒、59℃20秒、和72℃20秒；最后72℃5分钟。将获得的DNA片段以SalI和PaeI处理，并插入以SalI和PaeI相似处理的pMIV-Pnlp0-ter以获得质粒pMIV-Pnlp4-ter，其对应于Pnlp0被Pnlp4所替换的pMIV-Pnlp0-ter。将pMIV-Pnlp4-ter中插入的Pnlp4的PaeI-SalI片段的核苷酸序列在SEQ ID NO:34中显示。

[0221] 将自大肠杆菌MG1655菌株克隆的cysM基因整合到(2-2)中获得的质粒pMIV-Pnlp4-ter中。具体地，使用大肠杆菌MG1655菌株的基因组DNA作为模板，以及引物P11(agctgagtcg acgtgagtacattagaacaa acaat,SEQ ID NO:37)和引物P12(agctgatcta gaagtctccg atgctattaa tcc,SEQ ID NO:38)作为引物进行PCR(98℃5分钟；之后30个循环的98℃5秒、50℃10秒、和72℃60秒；以及最后72℃2分钟)，扩增了cysM基因片段。将由此获得的DNA片段以SalI和XbaI处理，并插入以同样酶处理的pMIV-Pnlp4-CysM质粒中，以制备质粒pMIV-Pnlp4-CysM，其中克隆有大肠杆菌MG1655的cysM基因。大肠杆菌MG1655的cysM基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:35所示，由该基因所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示。

[0222] pMIV-Pnlp4-CysM具有源自pMIV-5JS的Mu噬菌体的附着位点。因此，通过允许pMIV-Pnlp4-CysM与具有Mu转座酶基因的辅助质粒pMH10(Zimenkov D.等人,Biotechnologiya(俄语))在宿主细胞中共存，可以将Pnlp4-CysM-rrnB终止子盒插入宿主的染色体中，所述Pnlp4-CysM-rrnB终止子盒含有存在于pMIV-Pnlp4-CysM上的Mu噬菌体附着位点之间的氯霉素抗性基因。而且，由pMIV-Pnlp4-CysM质粒所携带的氯霉素抗性基因存在于λ噬菌体的两个附着位点(λattR和λattL)之间，且可以通过之后描述的方法切割和除去。

[0223] 首先将辅助质粒pMH10通过电穿孔引入MG1655菌株，并将菌株在含有20mg/L卡那霉素的LB琼脂培养基上在30℃过夜培养，以挑选引入了pMH10的菌株。将获得的转化体在30℃培养，并进一步将pMIV-Pnlp4-CysM通过电穿孔引入该菌株。对这种被pMH10和pMIV-Pnlp4-CysM二者转化的菌株进行条件为42℃20分钟的热激，然后在含有20mg/L的氯霉素的LB琼脂培养基上在39℃培养以选择氯霉素抗性菌株的菌落。将50个如上获得的氯霉素抗性菌株的克隆在LB琼脂培养基在39℃培养48小时以消除pMH10和pMIV-Pnlp4-CysM。然后，获得了具有以下特性的菌株：作为含有氯霉素抗性基因的盒插入染色体的结果，显示氯霉素抗性；以及作为两种质粒的消除的结果，显示卡那霉素和氨苄霉素敏感性。此外，还使用该菌株的染色体DNA作为模板和引物P1和P6作为引物进行PCR，确认了目标盒插入了染色体。将如上所描述的制备的菌株命名为MG1655int-4M(CmR)。

[0224] 将引入MG1655int-4M(CmR)菌株的氯霉素抗性基因借助衍生自λ噬菌体的切割系统除去。具体地，用携带λ噬菌体的Int-Xis基因的pMT-Int-Xis2(WO2005/010175)转化MG1655int-4M(CmR)菌株，从获得的转化产物获得显示氯霉素敏感性的MG1655int-4M菌株。

[0225] 然后，将pACYC-DES质粒引入MG1655int-4M以获得MG1655int-4M/pACYC-DES菌株。

[0226] (3)使用硫代硫酸作为硫源，通过过表达cysG基因或cysGJI基因的大肠杆菌产生半胱氨酸

[0227] 将cysG过表达质粒pMIV-Pnlp23-cysG(Ec)和pMIV-Pnlp8-cysG(Pa)、cysG和cysJI过表达质粒pMIV-Pnlp23-cysGJI(Ec)和pMIV-Pnlp23-cysGJI(Pa)、以及作为对照的pMIV-5JS分别引入以上获得的大肠杆菌半胱氨酸生产细菌，MG1655int-4M/pACYC-DES中。以这些菌株进行了半胱氨酸生产培养，并对比了半胱氨酸产量。对于半胱氨酸生产培养，使用了具有含有葡萄糖作为碳源和硫代硫酸作为硫源的半胱氨酸生产培养基，其具有以下组份。

[0228] [半胱氨酸生产培养基](成分的浓度是指最终浓度)

[0229] 组份1：

[0230]

[0231] 组份2：

[0232]

[0233] 组份3：

[0234] 胰蛋白胨 0.6g/L

[0235] 酵母提取物 0.3g/L

[0236] NaCl 0.6g/L

[0237] 组份4：

[0238] 碳酸钙 20g/L

[0239] 组份5：

[0240] 一水合L-组氨酸盐酸盐 135mg/L

[0241] 组份6：

[0242] 硫代硫酸钠 0.6g/L

[0243] 组份7：

[0244] 盐酸吡哆醇 2mg/L

[0245] 组份8：

[0246] 葡萄糖 20g/L

[0247] 这些组份是用以下的储备溶液制备的：10倍浓度(组份1)、1000倍浓度(组份2)、100/6倍浓度(组份3)、100倍浓度(组份5)、1750/3倍浓度(组份6)、1000倍浓度(组份7)、和20倍浓度(组份8)；在使用时将它们混合，并且以灭菌水获得确定的体积以达成最终浓度。灭菌是通过以下进行的：在110℃高压30分钟(组份1、2、3、5、和8)、在180℃干热灭菌5小时或更久(组份4)、或过滤灭菌(组份6和7)。L-半胱氨酸生产培养如下进行。将L-半胱氨酸生产菌株涂布在LB琼脂培养基上在34℃过夜进行预培养，然后以10μl大小的接种环(NUNC Blue Loop)从板上刮取相当于大约7cm的菌体，并接种到装于大试管(内径：23mm，长度：20cm)中的2mL L-半胱氨酸生产培养基中，以使得在培养开始时细胞的量基本上相同。在37℃震荡培养，并在当培养基中所含的葡萄糖完全耗尽(21到24小时)之时终止。在培养基中产生的L-半胱氨酸通过Gaitonde,M.K.所描述的方法(Biochem.J.,104(2):627-33,Aug.1967)定量。为了使菌株保持质粒，在整个培养期间添加了氯霉素(25mg/L)。对于每个菌株都进行了四次重复实验，将蓄积的半胱氨酸的浓度(g/L)的平均值和标准差在表1中显示。该表揭示了，通过增强编码西罗血红素(其是亚硫酸还原酶的辅因子)的合成酶的cysG基因的表达，以及除了cysG基因外进一步增强编码亚硫酸还原酶的亚基的cysJI基因的表达，可以提高在大肠杆菌中使用硫代硫酸作为硫源时的半胱氨酸发酵生产。

[0248] 表1：在大肠杆菌半胱氨酸生产细菌MG1655int-4M/pACYC-DES中增强参与亚硫酸还原的基因的表达的效果

[0249]菌株 L-半胱氨酸(g/L)
MG1655int-4M/pACYC-DES/5JS 0.28±0.04
MG1655int-4M/pACYC-DES/pMIV-Pnlp23-cysG(Ec) 0.60±0.01
MG1655int-4M/pACYC-DES/pMIV-Pnlp23-cysGJI(Ec) 0.51±0.05
MG1655int-4M/pACYC-DES/pMIV-Pnlp8-cysG(Pa) 0.57±0.05

[0250]MG1655int-4M/pACYC-DES/pMIV-Pnlp23-cysGJI(Pa) 0.58±0.01

[0251] 实施例2：使用硫代硫酸盐作为硫源通过过表达cysG基因或cysGJI基因的Pantoea ananatis产生半胱氨酸

[0252] (1)构建Pantoea ananatis半胱氨酸产生菌株

[0253] 关于Pantoea ananatis半胱氨酸产生菌株，构建了EYPSint-1MΔd0191(S)菌株，其中将cysE5基因、yeaS基因、serA348基因、和cysM基因引入了染色体，所述菌株中cysPTWA基因的表达增强了，且d0191基因缺失。将构建步骤在(1-1)to(1-5)中显示。

[0254] (1-1)将cysE5基因和yeaS基因引入Pantoea ananatis SC17菌株[0255] 将cysE5基因和yeaS基因引入Pantoea ananatis SC17菌株的染色体中以构建EY19(s)菌株。cysE5基因是cysE基因的突变型基因，其编码突变型丝氨酸酰基转移酶(SAT)，其中大肠杆菌的野生型酶在95和96位的Val残基和Asp残基分别替换为Arg残基和Pro残基，所以其对由半胱氨酸的反馈抑制脱敏(美国专利申请公开号20050112731(A1))。yeaS基因是编码半胱氨酸切割系统的基因。将构建步骤在下面显示。

[0256] 首先，从质粒pMW-Pomp-cysE5(WO2005/007841)以PaeI和SacI切割Pomp-cysE5盒部分，并将其插入pMIV-5JS的同样的限制性位点以构建质粒pMIV-Pomp-CysE5。pMW-Pomp-cysE5是通过将编码与ompC基因启动子连接的突变型SAT的cysE5基因插入pMW118而获得的质粒。从质粒pACYC184(GenBank/EMBL登录号X06403，可从NIPPON GENE获得)以XbaI和Eco88I切割四环素抗性基因，并将该基因片段以Klenow片段处理，并插入pMIV-Pomp-CysE5的PvuI位点以构建质粒pMT-Pomp-CysE5。然后，将在实施例1，(1-1)中构建的pMIV-Pnlp8-YeaS7以HindIII消化、以Klenow片段平端化，然后以NcoI消化以切割含有Pnlp8-YeaS-rrnB终止子和氯霉素抗性基因的盒的片段。将该片段与相似地从pMIV-5JS衍生的pMT-Pomp-CysE5的SmaI和NcoI消化片段连接以构建质粒pMT-EY2。
pMT-EY2具有在同一个质粒上的Pnlp8-YeaS-rrnB终止子和以及Pomp-CysE5盒。

[0257] pMT-EY2具有源自pMIV-5JS的Mu噬菌体的附着位点。因此，通过允许pMT-EY2与具有Mu转座酶基因的辅助质粒pMH10(Zimenkov D.等人,Biotechnologiya(俄语),6,1-22(2004))在宿主细胞中共存，可以将PompC-cysE5-Pnlp8-YeaS-rrnB终止子的盒插入所述细胞的染色体，所述PompC-cysE5-Pnlp8-YeaS-rrnB终止子的盒含有存在与Mu噬菌体附着位点之间存在于pMT-EY2上的氯霉素抗性基因。此外，由pMT-EY2质粒所携带的氯霉素抗性基因存在于两个λ噬菌体的附着位点(λattR和λattL)之间，且可以通过之后描述的方法切割和除去。

[0258] 首先，将辅助质粒pMH10通过电穿孔引入Pantoea ananatis SC17菌株中，并将菌株在含有20mg/L卡那霉素的LB琼脂培养基上在30℃过夜培养以选择引入pMH10的转化体菌株。将获得的转化体在30℃培养，并进一步将pMT-E2通过电穿孔引入该菌株。使该转化以pMH10和pMT-EY2的菌株受到20分钟的42℃热激条件，然后在39℃在含有20mg/L的氯霉素的LB琼脂培养基上培养以挑选氯霉素抗性菌株的菌落。将50个如上所获得的氯霉素抗性的菌株的克隆在LB琼脂培养基在39℃培养48小时以消除pMH10和pMT-EY2。然后，获得了具有以下特性的菌株：显示作为含有氯霉素抗性基因的PompC-cysE5-Pnlp8-YeaS-rrnB终止子盒插入染色体的结果的氯霉素抗性，以及作为两种质粒的消除的结果的卡那霉素和氨苄霉素敏感性。此外，通过使用作为模板的该菌株的染色体DNA和作为引物的引物P1和P6的PCR确认目标盒插入了染色体。将如上所描述的所有克隆分别命名为EY01至EY50。通过使用EY01至EY50菌株进行了L-半胱氨酸产生，并选择了产生L-半胱氨酸量最大的EY19菌株。

[0259] 将引入EY19菌株的氯霉素抗性基因以衍生自λ噬菌体的切割系统除去。具体地，将EY19以携带λ噬菌体的Int-Xis基因的pMT-Int-Xis2(WO2005/010175)转化，从获得的转化体获得显示氯霉素敏感性的EY19菌株。

[0260] 半胱氨酸产生培养可以通过使用以下例示的培养基和培养方法进行。

[0261] [半胱氨酸产生培养基](组份的浓度是指最终浓度)

[0262] 组份1：

[0263]

[0264] 组份2：

[0265]

[0266] 组份3：

[0267] 胰蛋白胨 0.6g/L

[0268] 酵母提取物 0.3g/L

[0269] NaCl 0.6g/L

[0270] 组份4：

[0271] 碳酸钙 20g/L

[0272] 组份5：

[0273] 一水盐酸L-组氨酸 135mg/L

[0274] 组份6：

[0275] 硫代硫酸钠 4g/L

[0276] 组份7：

[0277] 盐酸吡哆醇 2mg/L

[0278] 组份8：

[0279] 葡萄糖 40g/L

[0280] 这些组份是以以下的储备溶液制备的：10倍浓度(组份1)、1000倍浓度(组份2)、100/6倍浓度(组份3)、100倍浓度(组份5)、1750/3倍浓度(组份6)、1000倍浓度(组份
7)、和20倍浓度(组份8)；在使用的时间将它们混合，并且以灭菌水获得确定的体积以达成最终浓度。灭菌是通过以下进行的：在110℃高压30分钟(组份1、2、3、5、和8)、在180℃干热灭菌5小时或更久(组份4)、或过滤灭菌(组份6和7)。L-半胱氨酸产生培养如下进行。将L-半胱氨酸产生菌株铺在LB琼脂培养基上以在34℃过夜进行预培养，然后将板上对应于大约7cm的细菌细胞以10μl大小的接种环(NUNC Blue Loop)刮下，并接种进装于大试管(内径：23mm，长度：20cm)中的2mL L-半胱氨酸产生培养基中，以使得在培养开始的时间细胞的量基本上相同。以震荡在32℃进行培养，并在当培养基中所含的葡萄糖完全消耗(21到24小时)之时终止。在培养基中产生的L-半胱氨酸通过由Gaitonde,M.K.所描述的方法(Biochem.J.,104(2):627-33,Aug.1967)定量。

[0281] (1-2)构建EY19菌株的cysPTWA基因表达增强的菌株

[0282] 然后，将EY19菌株在染色体上位于cysPTWA基因簇上游的启动子以前述的强启动子Pnlp8替换以构建EYP197菌株，其cysPTWA的表达增强了。cysPTWA基因是编码磷酸根/硫代硫酸根运输系统蛋白质的基因。将构建步骤在下面显示。

[0283] 首先，通过使用作为模板的pMIV-Pnlp8-YeaS7以及引物P1和P2的PCR获得含有nlp8启动子区域的大约300bp的DNA片段。PCR循环如下：95℃3分钟；然后2个循环的95℃60秒、50℃30秒、和72℃40秒；20个循环的94℃20秒、59℃20秒、和72℃15秒；以及作为最终循环的72℃5分钟。

[0284] 将扩增的含有nlp8启动子的DNA片段以Klenow片段处理，然后插入以XbaI消化并然后以Klenow处理的质粒pMW118-(λattL-KmR-λattR)(WO2006/093322A2)中，由此获得质粒pMW-Km-Pnlp8。通过使用作为模板的pMW-Km-Pnlp8以及引物P13(tccgctcacg atttttttca tcgctggtaa ggtcatttat cccccaggaa aaattggtta,SEQ ID NO:39)和引物P14(tttcacaccg ctcaaccgca gggcataacc ggcccttgaa gcctgctttt ttatactaag ttg,SEQ ID NO:40)，扩增了含有Km-Pnlp8盒的大约1.6kb的DNA片段。该扩增的PCR循环如下：95℃3分钟；然后2个循环的95℃60秒、50℃30秒、和72℃40秒；30个循环的94℃20秒、54℃20秒、和72℃90秒；以及作为最终循环的72℃5分钟。在每个引物上，设计了在染色体上作为用于通过λ-依赖性整合(该方法称为"Red-驱动整合(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,vol.97,No.12,pp.6640-6645))将目标片段插入的靶物(在该情况下，是靠近cysPTWA启动子的序列)。因此，如果获得的DNA片段通过λ-依赖性整合插入了目标菌株，则形成了以下结构：Km-Pnlp8插入了在染色体上的cysPTWA基因的直接上游，且cysPTWA基因与nlp8启动子连接。将cysPTWA基因簇的核苷酸序列在SEQ ID NO:41中显示，并将由cysP、cysT、和cysW基因所编码的氨基酸序列分别在SEQ ID NOS:42至44中显示。cysA基因的核苷酸序列以及由该基因所编码的氨基酸序列分别在SEQ ID NOS:45和
46中显示。cysT基因与cysU基因同义。

[0285] 关于λ-依赖性整合的宿主菌株，使用了Pantoea ananatis SC17(0)/RSF-Red-TER菌株。Pantoea ananatis SC17(0)/RSF-Red-TER菌株是用于有效地进行λ-依赖性整合的宿主菌株，且其是通过将辅助质粒RSF-Red-TER引入SC17(0)菌株而获得的，所述辅助质粒RSF-Red-TER表达λ噬菌体的gam、bet、和exo基因(此后成为“λRed基因”)，并且所述SC17(0)菌株是对λ噬菌体Red基因产物有抗性的Pantoea ananatis菌株(WO2008/075483)。SC17(0)菌株于2005年9月1日保藏于俄罗斯国家工业微生物菌种保藏中心(VKPM)，GNII Genetika(地址：俄罗斯,117545Moscow,1Dorozhny proezd.1)，保藏号为VKPM B-9246。用于构建RSF-Red-TER质粒的方法在WO2008/075483中详细公开。

[0286] 将前述的SC17(0)/RSF-Red-TER菌株培养，其中添加了用于诱导λRed基因表达的IPTG以准备细胞用于电穿孔。通过电穿孔将前述的含有Km-Pnlp8盒的DNA片段引入，并通过使用作为标记的卡那霉素获得重组菌株，在所述重组菌株中通过λ-依赖性整合将nlp8启动子插入cysPTWA基因的上游。通过使用作为模板的获得的菌株的染色体DNA，以及作为引物的引物P15(ctttgtccct ttagtgaagg,SEQ ID NO:47)和引物P16(agctgatcta gaagctgact cgagttaatg gcctcccaga cgac,SEQ ID NO:48)的PCR，确认形成了目标结构，Km-Pnlp8-cysPTWA，并将该菌株命名为SC17(0)-Pnlp8-PTWA菌株。

[0287] 然后，纯化了SC17(0)-Pnlp8-PTWA菌株的染色体DNA，并将10μg的该染色体DNA通过电穿孔引入EY19菌株以获得卡那霉素抗性菌株。通过使用作为模板的所获得的菌株的染色体DNA，以及作为引物的P15和P16的PCR进行了扩增以确认Km-Pnlp8-cysPTWA的结构已经引入了EY19的染色体。将如上所描述的而获得的菌株命名为EYP197菌株。而且，通过使用如上所描述的pMT-Int-Xis2将卡那霉素抗性基因从染色体去除，并将成为卡那霉素敏感性的菌株命名为EYP197菌株。

[0288] (1-3)将突变型3-磷酸甘油酸脱氢酶基因(serA348)引入EYP197菌株[0289] 将serA348基因引入EYP197菌株的染色体以构建EYPS1976菌株。serA348基因是serA的突变型基因，且其编码3-磷酸甘油酸脱氢酶，在所述3-磷酸甘油酸脱氢酶中Pantoea ananatis的野生型3-磷酸甘油酸脱氢酶在348位的精氨酸残基替换为了丙氨酸残基，使得该酶对丝氨酸的反馈抑制脱敏(J.Biol.Chem.,1996,271(38):23235-8)。将构建步骤在下面显示。

[0290] 将衍生自Pantoea ananatis的野生型serA基因的核苷酸序列在SEQ ID NO:49中显示，并将由该基因所编码的氨基酸序列在SEQ ID NO:50中显示。为了获得引入了前述突变(N348A)的serA基因的3’端侧DNA片段，通过使用作为模板的SC17菌株的染色体DNA以及作为引物的的引物P17(agctgagtcg acatggcaaa ggtatcactg gaa,SEQ ID NO:51)和引物P18(gagaacgccc gggcgggctt cgtgaatatg cagc,SEQ ID NO:52)进行PCR(95℃3分钟；然后2个循环的95℃60秒、50℃30秒、和72℃40秒；25个循环的94℃20秒、60℃20秒、和72℃60秒；以及作为最终循环的72℃5分钟)。相似地，为了获得引入了前述突变(N348A)的5’端侧DNA片段，通过使用作为模板的SC17菌株的染色体DNA以及作为引物的引物P19(agctgatcta gacgtgggat cagtaaagca gg,SEQ ID NO:53)和引物P20(aaaaccgccc gggcgttctc ac,SEQ ID NO:54)进行PCR(95℃3分钟；然后2个循环的95℃60秒、50℃30秒、以及72℃40秒；20个循环的94℃20秒、60℃20秒、和72℃20秒；以及作为最终循环的72℃5分钟)。将获得的PCR片段以限制性酶SmaI处理，并使用DNA连接酶连接至所获得的对应于全长突变型serA基因的DNA片段，所述突变型serA基因包括目标突变(N348A)。
通过使用该DNA片段作为模板以及作为引物的引物P17和P19进行PCR(95℃3分钟；然后
2个循环的95℃60秒、50℃30秒、以及72℃40秒；15个循环的94℃20秒、60℃20秒、和
72℃75秒；以及作为最终循环的72℃5分钟)。分别在引物P17和P19的5’端设计SalI和XbaI位点。将所获得的片段以SalI和XbaI处理，然后插入相似地以SalI和XbaI处理的pMIV-Pnlp8-ter中，由此制备pMIV-Pnlp8-serA348，其中克隆了serA348基因。

[0291] 构建的pMIV-Pnlp8-serA348携带源自Mu噬菌体的附着位点。因此，如上所描述的，通过使用具有Mu转座酶基因的辅助质粒pMH10，可以将Pnlp8-serA348-rrnB终止子盒插入宿主的染色体中，所述Pnlp8-serA348-rrnB终止子盒含有存在于pMIV-Pnlp8-serA348上Mu噬菌体附着位点之间的氯霉素抗性基因。

[0292] 以如将(1-1)中所用的PompC-cysE5-Pnlp8-YeaS-rrnB终止子盒引入的同样方式将pMIV-Pnlp8-serA348和pMH10引入SC17(0)中以获得菌株，所述菌株中Pnlp8-serA348-rrnB终止子盒插入染色体中。通过使用引物P1和P19的PCR，确认了目标盒插入了所获得的菌株的染色体中。测量了所获得的50个克隆的细胞提取物中的3-磷酸甘油酸脱氢酶活性。然后，将10μg SC17int-serA348菌株的染色体DNA通过电穿孔引入EYP197菌株中以获得氯霉素抗性菌株，并通过使用引物P1和P19的PCR，确认了Pnlp8-serA348结构已经与氯霉素抗性基因一起引入了EYP197菌株的染色体中。将如上所描述而获得的菌株命名为EYPS1976菌株。通过前述的使用pMT-Int-Xis2去除标记的方法，从染色体除去了氯霉素抗性基因，并将成为氯霉素敏感性淀粉菌株命名为EYPS1976菌株。

[0293] (1-4)将O-酰基-L-丝氨酸硫化氢解酶B基因(cysM)引入EYPS1976菌株中[0294] 将O-酰基-L-丝氨酸硫化氢解酶B基因(cysM)引入EYPS1976菌株的染色体中以构建EYPSint-1M菌株。将构建步骤在下面显示。

[0295] 首先，通过使用作为模板的在实施例1，(2-2)中构建的质粒pMIV-Pnlp4-ter，以及作为引物的引物P9(agctgaaagc ttgcatgcac gcgtggcgat ctggcctgac tgc,SEQ ID NO:32)和引物P21(agctgagtcg acnnngtggt ggcaaccttt aaaaaactg(“n”意指对应的残基可以是a、t、g和c的任意种),SEQ ID NO:55)的PCR(95℃5分钟；然后27个循环的94℃20、59℃20秒、和72℃20秒；以及作为最终循环的72℃5分钟)，获得了其中包含在nlpD启动子的5’端中的-7到-9区域随机化了的DNA片段。“-7到-9区域”意指从nlpD启动子的转录起始位点的5’侧上的第7个到第9个核苷酸。将每个所获得的片段以SalI和PaeI处理，并插入以同样酶处理的pMIV-Pnlp0-ter中以获得质粒，其中每种质粒中的pMIV-Pnlp0-ter的Pnlp0都以突变型Pnlp取代。将这些质粒中的一种用作pMIV-Pnlp1-ter。插入该质粒的Pnlp1启动子的PaeI-SalI片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:56中所示。

[0296] 将克隆自大肠杆菌MG1655菌株的cysM基因并入pMIV-Pnlp1-ter。具体地，通过使用作为模板的MG1655菌株的基因组以及作为引物的引物P22(agctgagtcg acgtgagtac attagaacaa acaat,SEQ ID NO:57)和 引 物 P23(agctgatcta gaagtctccg atgctattaa tcc,SEQ ID NO:58)的PCR(95℃5分钟；然后30个循环的98℃5秒、50℃10秒、和72℃60秒；以及作为最终循环的72℃2分钟)，扩增了cysM基因片段。将如上所描述的DNA片段以SalI和XbaI处理，并插入以相同酶处理的pMIV-Pnlp1-ter中以制备质粒pMIV-Pnlp1-CysM，其中克隆了大肠杆菌MG1655菌株的cysM基因。将大肠杆菌MG1655的cysM基因的核苷酸序列在SEQ ID NO:35中显示，并将由该基因所编码的氨基酸序列在SEQ ID NO:36中显示。

[0297] 通过使用如上所描述而构建的pMIV-Pnlp1-CysM，根据前述的使用辅助质粒pMH10的方法获得了Pantoea ananatisSC17菌株，并命名为SC17int-1M，所述菌株中包含cysM基因的盒插入染色体。将染色体DNA从SC17int-1M提取。将10μg的量的染色体DNA通过电穿孔引入EYP1976菌株，并将所获得的菌株命名为EYPSint-1M。此外，通过前述的使用pMT-Int-Xis2消除标记的方法从染色体除去了氯霉素抗性基因，并将成为氯霉素敏感性的菌株命名为EYPSint-1M菌株。

[0298] (1-5)从EYPSint-1M菌株构建缺乏半胱氨酸分解系统基因d0191的菌株[0299] 将编码具有半胱氨酸脱巯基酶活性的蛋白质的d0191基因从EYPSint-1M菌株中删除以构建EYPSint-1MΔd0191菌株。将构建步骤在下面显示。

[0300] d0191基因是通过在(1-2)中描述的λ-依赖性整合而删除的。其的大纲在图5中显示。通过PCR获得了具有以下结构的DNA片段：卡那霉素抗性基因存在于d0191基因的两端同源性序列之间(用于基因破坏的PCR片段，图5)。关于引物，使用了引物Dd0191-FW(CCGTGTCTGAAGCCTATTTTGCCCGCCTGCTGGGCTTGCCTTTTATTGC CTGAAGCCTGCTTTTTTATACTAAGTTGGCA,SEQ ID NO:59)、和引物Dd0191-RV

[0301] (CTAGCCCAGTTCGCGCTGCCAGGGCGTAATATCGCCAATGTGCTCGGC AACGCTCAAGTTAGTATAAAAAAGCTGAACGA,SEQ ID NO:60)，关于模板，使用了引物pMW118-(λattL-Kmr-λattR)。通过在规程中描述的，在标准反应混合组合物中使用LA-Taq聚合酶(Takara)，以PCR循环94℃5分钟，此后30个循环的98℃5秒、55℃5秒、和72℃2分30秒进行了PCR。将获得的DNA片段通过电穿孔引入Pantoea ananatis SC17(0)/RSF-Red-TER菌株以获得卡那霉素抗性菌株。确认了所获得的卡那霉素抗性菌株是d0191基因破坏菌株，其中d0191基因被卡那霉素盒通过存在于DNA片段两端的d0191基因区域的同源序列而替换(SC17(0)d0191::Kmr菌株，图5)。

[0302] 将染色体DNA从SC17(0)d0191::Kmr菌株提取。将10μg的量的染色体DNA通过电穿孔引入EYPSint-1M菌株中以获得卡那霉素抗性菌株，并将获得的菌株命名为EYPSint-1MΔd0191。此外，将卡那霉素抗性基因通过前述的用于使用pMT-Int-Xis2除去标记的方法除去，并将成为卡那霉素敏感性的菌株命名为EYPSint-1MΔd0191菌株。将该菌株在下面的实验中作为Pantoea ananatis半胱氨酸生产细菌而使用。

[0303] (2)使用作为硫源的硫代硫酸根通过过表达cysG基因或cysGJI基因的Pantoea ananatis产生半胱氨酸。

[0304] 将过表达cysG的质粒pMIV-Pnlp23-cysG(Pa)和pMIV-Pnlp23-cysG(Ec)、过表达cysG和cysJI基因的质粒 pMIV-Pnlp23-cysGJI(Pa)和pMIV-Pnlp23-cysGJI(Ec)、以及作为对照的pMIV-5JS分别引入以上获得的Pantoea ananatis半胱氨酸生产细菌，EYPSint-1MΔd0191，的构建菌株。以这些菌株进行半胱氨酸产生培养，并比较半胱氨酸产量。对于半胱氨酸产生培养，使用了具有以下含有作为碳源的葡萄糖和作为硫源的硫代硫酸根的组份的培养基。

[0305] [半胱氨酸产生培养基](组份的浓度是最终浓度)

[0306] 组份1：

[0307]

[0308] 组份2：

[0309]

[0310] 组份3：

[0311] 胰蛋白胨 0.6g/L

[0312] 酵母提取物 0.3g/L

[0313] NaCl 0.6g/L

[0314] 组份4：

[0315] 碳酸钙 20g/L

[0316] 组份5：

[0317] 一水盐酸L-组氨酸 135mg/L

[0318] 组份6：

[0319] 硫代硫酸钠 0.6g/L

[0320] 组份7：

[0321] 盐酸吡哆醇 2mg/L

[0322] 组份8：

[0323] 葡萄糖 20g/L

[0324] 这些组份是以以下的储备溶液制备的：10倍浓度(组份1)、1000倍浓度(组份2)、100/6倍浓度(组份3)、100倍浓度(组份5)、1750/3倍浓度(组份6)、1000倍浓度(组份
7)、和20倍浓度(组份8)；在使用的时间将它们混合，并且以灭菌水获得确定的体积以达成最终浓度。灭菌是通过以下进行的：在110℃高压30分钟(组份1、2、3、5、和8)、在180℃干热灭菌5小时或更久(组份4)、或过滤灭菌(组份6和7)。L-半胱氨酸产生培养如下进行。将L-半胱氨酸产生菌株铺在LB琼脂培养基上以在34℃过夜进行预培养，然后将板上对应于大约7cm的细菌以10μl大小的接种环(NUNC Blue Loop)刮下，并接种进装于大试管(内径：23mm，长度：20cm)中的2mL L-半胱氨酸产生培养基中，以使得在培养开始的时间细胞的量基本上相同。以震荡在32℃进行培养，并在当培养基中所含的葡萄糖完全消耗(21到24小时)之时终止。在培养基中产生的L-半胱氨酸通过由Gaitonde,M.K.所描述的方法(Biochem.J.,104(2):627-33,Aug.1967)定量。为了允许菌株含有质粒，在整个培养期间添加了氯霉素(25mg/L)。对于每个菌株都进行了重复四次的实验，将蓄积的半胱氨酸的浓度(g/L)的平均值和标准差在表2中显示。

[0325] 该表揭示了，通过增强用于编码西罗血红素-其是亚硫酸还原酶的辅因子-的合成酶的cysG基因的表达，以及进一步通过增强除了cysG基因外编码亚硫酸还原酶的亚基的cysJI基因的表达，使用硫代硫酸盐作为硫源通过在Pantoea ananatis中的发酵的半胱氨酸的产生可以改进。

[0326] [表2]

[0327] 表2：在Pantoea ananatis半胱氨酸生产细菌，EYPSint-1MΔd0191中增强参与亚硫酸还原的基因的表达的效果

[0328]菌株 L-半胱氨酸(g/L)
EYPSint-1MΔd0191(s)/pMIV-5JS 0.26±0.01
EYPSint-1MΔd0191(s)/pMIV-cysG(Pa) 0.49±0.01
EYPSint-1MΔd0191(s)/pMIV-cysGJI(Pa) 0.54±0.03

[0329]EYPSint-1MΔd0191(s)/pMIV-cysG(EC) 0.49±0.05
EYPSint-1MΔd0191(s)/pMIV-cysGJI(EC) 0.48±0.03

[0330] 工业应用性

[0331] 根据本发明，当将硫代硫酸盐用作硫源时细菌的L-半胱氨酸生产能力可以改进。此外，根据本发明，当将硫代硫酸盐用作硫源时，L-半胱氨酸、L-半胱氨酸相关物质、或其混合物可以有效地产生。

[0332] 对序列表的解释

[0333] SEQ ID NO:1:Pnlp0的核苷酸序列

[0334] SEQ ID NO:2:Pnlp23的核苷酸序列

[0335] SEQ ID NO:3和4:用于扩增Pantoea ananatis cysG基因的引物

[0336] SEQ ID NO:5和6:用于扩增Pantoea ananatis cysJI基因的引物[0337] SEQ ID NO:7:用于扩增Pantoea ananatis cysGJI基因的引物

[0338] SEQ ID NO:8和9:用于扩增大肠杆菌cysG基因的引物

[0339] SEQ ID NO:10和11:用于扩增大肠杆菌cysJI基因的引物

[0340] SEQ ID NO:12:用于扩增大肠杆菌cysGJI基因的引物

[0341] SEQ ID NO:13至20:引物P1至P8

[0342] SEQ ID NO:21:Pnlp8的核苷酸序列

[0343] SEQ ID NO:22和23:用于扩增大肠杆菌ydeD基因的引物

[0344] SEQ ID NO:24至27:用于扩增cysEX基因的引物

[0345] SEQ ID NO:28和29:用于扩增serA5基因的引物

[0346] SEQ ID NO:30和31:用于扩增PompA启动子的引物

[0347] SEQ ID NO:32和33:引物P9和P10

[0348] SEQ ID NO:34:Pnlp4的核苷酸序列

[0349] SEQ ID NO:35:大肠杆菌cysM基因的核苷酸序列

[0350] SEQ ID NO:36:大肠杆菌CysM蛋白质的氨基酸序列

[0351] SEQ ID NO:37至40:引物P11至P14

[0352] SEQ ID NO:41:大肠杆菌cysPTWA基因簇的核苷酸序列

[0353] SEQ ID NO:42:大肠杆菌CysP蛋白质的氨基酸序列

[0354] SEQ ID NO:43:大肠杆菌CysT蛋白质的氨基酸序列

[0355] SEQ ID NO:44:大肠杆菌CysW蛋白质的氨基酸序列

[0356] SEQ ID NO:45:大肠杆菌cysA基因的核苷酸序列

[0357] SEQ ID NO:46:大肠杆菌CysA蛋白质的氨基酸序列

[0358] SEQ ID NO:47和48:引物P15和P16

[0359] SEQ ID NO:49:Pantoea ananatis serA基因的核苷酸序列

[0360] SEQ ID NO:50:Pantoea ananatis SerA蛋白质的氨基酸序列

[0361] SEQ ID NO:51至55:引物P17至P21

[0362] SEQ ID NO:56:Pnlp1的核苷酸序列

[0363] SEQ ID NO:57和58:引物P22和P23

[0364] SEQ ID NO:59和60:用于扩增Pantoea ananatis d0191基因的引物[0365] SEQ ID NO:61:大肠杆菌cysJ基因的核苷酸序列

[0366] SEQ ID NO:62:大肠杆菌CysJ蛋白质的氨基酸序列

[0367] SEQ ID NO:63:Pantoea ananatis cysJ基因的核苷酸序列

[0368] SEQ ID NO:64:Pantoea ananatis CysJ蛋白质的氨基酸序列

[0369] SEQ ID NO:65:大肠杆菌cysI基因的核苷酸序列

[0370] SEQ ID NO:66:大肠杆菌CysI蛋白质的氨基酸序列

[0371] SEQ ID NO:67:Pantoea ananatis cysI基因的核苷酸序列

[0372] SEQ ID NO:68:Pantoea ananatis CysI蛋白质的氨基酸序列

[0373] SEQ ID NO:69:大肠杆菌cysG基因的核苷酸序列

[0374] SEQ ID NO:70:大肠杆菌CysG蛋白质的氨基酸序列

[0375] SEQ ID NO:71:Pantoea ananatis cysG基因的核苷酸序列

[0376] SEQ ID NO:72:Pantoea ananatis CysG蛋白质的氨基酸序列

[0377] SEQ ID NO:73:包括用于下游基因的链接位点的Pnlp0的核苷酸序列[0378] SEQ ID NO:74:包括用于下游基因的链接位点的Pnlp8的核苷酸序列