一种藤蕹组织培养的方法

摘要

本发明提供了一种藤蕹组织培养的方法，包括：A)获得茎段至少带有1个未萌发腋芽的藤蕹藤条；B)初代培养，初代培养基为MS培养基+2.0-3.0mg/L6-苄氨基腺嘌呤+0.1-0.3mg/L萘乙酸+30g/L碳源+6g/L的琼脂粉，pH值为5.5-5.8；C)继代培养基为MS培养基+0.5-1.5mg/L6-苄氨基腺嘌呤+0.3-0.7mg/L赤霉素+30g/L碳源+6g/L琼脂粉，pH值为5.5-5.8；D)生根培养，生根培养基为1/2MS培养基+0.3-0.6mg/L萘乙酸+15g/L碳源+6g/L琼脂粉，pH值为5.5-5.8；E)将已生根的组培苗进行炼苗。

权利要求

1.一种藤蕹组织培养的方法，其特征在于，包括如下步骤：

A)预处理：获得藤蕹藤条，流水下冲洗干净，将其剪成3-4cm的茎段，所述茎段中至少带有1个未萌发的腋芽，并对所述茎段表面消毒；

B)初代培养：接种于初代培养基中培养，所述初代培养基为MS培养基+2.0-3.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+0.1-0.3mg/L的萘乙酸+30g/L的碳源+6g/L的琼脂粉，pH值范围为

5.5-5.8；

C)继代培养：选择初代培养后苗高在4cm以上，且具有3-5个腋芽的外植体，剪成带有

1-2个腋芽的茎段，接种于继代培养基中培养，待外植体产生的丛生芽长有3-5个腋芽时，分离所述丛生芽，转接至初代培养基中使腋芽伸长，苗高4cm以上后再转接至继代培养基中继续增殖；所述继代培养基为MS培养基+0.5-1.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+0.3-0.7mg/L的赤霉素+30g/L的碳源+6g/L的琼脂粉，pH值范围为5.5-5.8；

D)生根培养：选择苗高4cm以上，具有3-5个腋芽的外植体，接种于生根培养基中培养，所述生根培养基为1/2MS培养基+0.3-0.6mg/L的萘乙酸+15g/L的碳源+6g/L的琼脂粉，pH值范围为5.5-5.8；

E)选择已生根且根系发达的组培苗进行炼苗。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A)中的消毒液为添加吐温20的

5％次氯酸钠溶液或添加吐温20的0.1％的升汞溶液，且每100mL消毒液中滴入50μL吐温

20，消毒时间为5-8分钟。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述初代培养基中还包括0.3-1.0g/L的核糖核酸酵母。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述初代培养基中包括0.5g/L的核糖核酸酵母。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述继代培养基中还包括0.02g/L的特丁基对苯二酚、0.05g/L的硝酸银、0.05g/L的Vc和0.1g/L的柠檬酸中的一种。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述继代培养基中包括0.02g/L的特丁基对苯二酚。

7.根据权利要求1-6任意一项所述的方法，其特征在于，所述继代培养基中还包括

0.1-0.5g/L的L-羟基脯氨酸、0.3-0.7g/L的L-丝氨酸和0.1-0.5g/L的L-盐酸半胱氨酸中的一种或多种。

8.根据权利要求1-6任意一项所述的方法，其特征在于，所述继代培养基中还包括

15％的藤蕹伤流液。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述继代培养基中MS培养基为改良的MS培养基，其中，所述改良的MS培养基为2475mg/L的硝酸铵、1900mg/L的硝酸钾、440mg/L的二水氯化钙、370mg/L的七水硫酸镁、225mg/L的磷酸二氢钾、70mg/L的氯化钾、0.83mg/L的碘化钾、6.2mg/L的硼酸、22.3mg/L的四水硫酸锰、8.6mg/L的七水硫酸锌、0.25mg/L的二水钼酸钠、0.025mg/L的五水硫酸铜、0.025mg/L的六水氯化钴、100mg/L的肌醇、0.5mg/L的烟酸、0.5mg/L的盐酸吡哆醇、0.1mg/L的盐酸硫胺素、2.0mg/L的甘氨酸、0.3mg/L的泛酸钙、

139.0mg/L的七水硫酸亚铁和186.5mg/L的乙二胺四乙酸二钠。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤B)中的培养的条件为：所述未萌发的腋芽伸长至1cm之前的温度为30.0±0.5℃；所述腋芽伸长至1cm之后的温度为

25.0±0.5℃，光照强度为2000lx，光照时间为16小时/天；

和/或在所述步骤C)中的培养的条件均为：光照时温度为28.0±0.5℃，黑暗时温度为18.0±0.5℃，光照强度为3000lx，光照时间为16小时/天；

和/或在所述步骤D)中的培养的条件均为：光照时温度为28.0±0.5℃，黑暗时温度为18.0±0.5℃，光照强度为3000lx，光照时间为16小时/天；

和/或在所述步骤E)中，所述炼苗时温度为25.0±0.5℃，光照强度为2000lx，光照时间为16小时/天，湿度控制在85％以上。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括藤蕹脱毒培养的步骤i)，所述步骤i)在所述步骤B)之后且在步骤C)之前，取初代培养后腋芽伸长至3cm以上的外植体的顶芽，或直接获取生长于室外的藤蕹主藤上顶芽，剥取长度为0.8-1.2mm顶芽茎尖后，将所述顶芽茎尖接种至启动培养基中进行脱毒培养，所述生长于室外的藤蕹主藤上顶芽需要消毒，消毒方法同所述步骤A)的预处理中的消毒方法；所述启动培养基为MS培养基+0.1-0.3mg/L的萘乙酸+0.05-0.20mg/L的赤霉素+30g/L的碳源+6g/L的琼脂粉+1.5g/L的活性炭。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述藤蕹选自长沙藤蕹。

说明书

一种藤蕹组织培养的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及植物组织培养领域，特别涉及一种藤蕹组织培养的方法。

背景技术

[0002] 蕹菜(Lpomoea aquatica)属旋花科(Convolvulaceae)甘薯属(Lpomoea)的一年生或多年生草本植物，又名竹叶菜、空心菜、通心菜等，原产于我国热带多雨地区，具有生长速度快、产量高、采收期长、耐高温高湿、抗性强、病虫害较少等优点，在我国长江流域及以南地区普遍栽培，为夏秋季重要叶类蔬菜之一，既有很高的营养价值，又有清热解毒、利尿除湿、降低血糖等药用价值。蕹菜分籽蕹和藤蕹两种，藤蕹品质较子蕹更佳，特别是长沙藤蕹，茎蔓生、节间短中空、茎秆粗壮、耐热性好、质地更为柔嫩，生长期更长，产量更高，更深得人们的喜爱。

[0003] 近年来，虽然藤蕹作为春夏季主要叶菜类蔬菜，具有一定的种植规模，也取得了较好的经济效益，但由于藤蕹在长江流域不开花，难结籽，为无性繁殖的植物，目前生产上主要采取茎蔓扦插繁殖的方法繁育母苗。该方法有不少弊端，严重制约了生产的发展。主要体现在如下几方面：第一，藤蕹无法获得种子，传统留种方式只能选择老茎秆，立秋前重新进行扦插培育组织充实健壮的藤蔓做种蔓，再于初霜前挖取茎蔓贮存于地窖中留种，留种过程需保持10-15℃的低温和75％的空气湿度，翌年春气温达15℃才能取出种蔓育苗，采用此方法费时费力，对生长环境要求严格，种蔓成活率低于80％。第二，扦插繁殖使藤蕹繁殖速度变慢，通常1根蕹条只能繁殖1株植株，且缓苗时间较长，田间管理较为复杂。第三，无性繁殖的作物都易受到一种或多种病原菌的周身侵染，病原菌的侵染不一定都会造成植株的死亡，很多病毒甚至可能不表现出任何症状，但病毒的存在在会减少作物产量和品质。藤蕹在扦插繁殖过程中同样易造成病毒的积累，导致种质退化，严重影响藤蕹产量、品质和抗性等性状。通过调查，目前藤蕹的病害主要有轮斑病、褐斑病和花叶病毒病等病毒，人们在栽培过程中通常采用药物控制，而忽略更新母苗，既污染环境，又埋下了食品安全隐患。

发明内容

[0004] 本发明利用植物组织培养技术，提供一种藤蕹组织培养的方法，在短时间内大量生产优质种苗的同时，还能减少病原危害，对推动湖南省这种传统特色蔬菜产业的发展，解决蔬菜淡季供应不足等问题有着十分重要的意义。

[0005] 具体地，本发明提供了一种藤蕹组织培养的方法，所述方法包括如下步骤：

[0006] A)预处理：获得藤蕹藤条，流水下冲洗干净，将其剪成3-4cm的茎段，并保证所述茎段中至少带有1个未萌发的腋芽，并对所述茎段表面消毒，例如可以用70％的酒精表面消毒，用无菌水冲洗多次，再用消毒溶液消毒，然后再次用无菌水冲洗多次；

[0007] B)初代培养：接种于初代培养基中培养，所述初代培养基为MS培养基+2.0-3.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+0.1-0.3mg/L的萘乙酸+30g/L的碳源+6g/L的琼脂粉，pH值范围为5.5-5.8；

[0008] C)继代培养：选择初代培养后苗高4cm以上，且具有3-5个腋芽的外植体，剪成带有1-2个腋芽的茎段，接种于继代培养基中培养，待外植体产生的丛生芽长有3-5个腋芽时，分离所述丛生芽，转接至初代培养基中使腋芽伸长，苗高4cm以上后再转接至继代培养基中继续增殖，所述继代培养基为MS培养基+0.5-1.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+0.3-0.7mg/L的赤霉素+30g/L的碳源+6g/L的琼脂粉，pH值范围为5.5-5.8；

[0009] D)生根培养：选择苗高4cm以上，具有3-5个腋芽的外植体，接种于生根培养基中培养，所述生根培养基为1/2MS培养基+0.3-0.6mg/L的萘乙酸+15g/L的碳源+6g/L的琼脂粉，pH值范围为5.5-5.8；

[0010] E)选择根据所述步骤D)的苗高4cm以上，具有3-5个腋芽的组培苗，已生根且根系发达的组培苗进行炼苗。

[0011] 经实验证实，与侧藤藤条相比，组培时选择主藤藤条做为实验材料，其外植体更易耐受消毒液的侵蚀，生长势更强，因此，在一个优选的实施方式中，藤蕹藤条选自主藤藤条。

[0012] 本文中所述的顶芽指生长在植株主干或侧枝顶端的芽。腋芽通常是指着生在叶腋处的芽。在本发明中的腋芽除非特别指出，否则的话，腋芽可以包括顶芽。丛生芽指由植物器官和愈伤组织发育而来的群体丛生芽苗，在本发明中指藤蕹茎段基部愈伤化后由愈伤组织分化而形成的簇生状不定芽。外植体是指从活植物体上切取下来进行组织培养的那部分组织或器官，具体为含腋芽的藤蕹茎段。

[0013] 在一个具体的实施方式中，所述步骤A)中的消毒液为添加吐温20的5％的次氯酸钠溶液或添加吐温20的0.1％的升汞溶液，且每100mL消毒液中滴入50μL即1滴吐温20，消毒时间为5-8分钟。

[0014] 在一个具体的实施方式中，所述初代培养基中还包括0.3-1.0g/L的核糖核酸酵母。添加核糖核酸酵母的有益效果主要为核糖核酸酵母能使藤蕹外植体茎秆黄化率显著降低，腋芽生长速度相对较快，植株生长势更为旺盛。

[0015] 在一个优选的实施方式中，所述初代培养基中还包括0.5g/L的核糖核酸酵母。

[0016] 在一个具体的实施方式中，所述继代培养基中还包括0.02g/L的特丁基对苯二酚、0.05g/L的硝酸银、0.05g/L的Vc和0.1g/L的柠檬酸中的一种。从效果上来看，抗氧化剂特丁基对苯二酚能够显著降低茎秆基部愈伤组织的褐化率，并且效果优于0.05g/L的硝酸银、0.05g/L的Vc和0.1的g/L柠檬酸，因此优选0.02g/L的特丁基对苯二酚。

[0017] 在一个具体的实施方式中，所述继代培养基中还包括0.1-0.5g/L的L-羟基脯氨酸、0.3-0.7g/L L-丝氨酸和0.1-0.5g/L的L-盐酸半胱氨酸中的一种或多种。所述氨基酸的混合使用大大提高丛生芽繁殖系数，更有利于组培苗的继代培养。

[0018] 在一个具体的实施方式中，所述继代培养基中还包括15％的藤蕹伤流液。15％的藤蕹伤流液对提高丛生芽的繁殖的效果与所述抗氧化剂和氨基酸的以最佳浓度的混合使用具有等同的效果。

[0019] 在一个具体的实施方式中，所述继代培养基中MS培养基为改良的MS培养基，其中，所述改良的MS培养基具体为2475mg/L的硝酸铵、1900mg/L的硝酸钾、440mg/L的二水氯化钙、370mg/L的七水硫酸镁、225mg/L的磷酸二氢钾、70mg/L的氯化钾、0.83mg/L的碘化钾、6.2mg/L的硼酸、22.3mg/L的四水硫酸锰、8.6mg/L的七水硫酸锌、0.25mg/L的二水钼酸钠、0.025mg/L的五水硫酸铜、0.025mg/L的六水氯化钴、100mg/L的肌醇、0.5mg/L的烟酸、0.5mg/L的盐酸吡哆醇、0.1mg/L的盐酸硫胺素、2.0mg/L的甘氨酸、0.3mg/L的泛酸钙、139.0mg/L的七水硫酸亚铁和186.5mg/L的乙二胺四乙酸二钠。

[0020] 在一个具体的实施方式中，在所述步骤B)中的培养的条件为：所述未萌发腋芽伸长至1cm之前的温度为30.0±0.5℃；所述腋芽伸长至1cm之后的温度为25.0±0.5℃，光照强度为2000lx，光照时间为16小时/天；

[0021] 和/或在所述步骤C)中的培养的条件均为：光照时的温度为28.0±0.5℃，黑暗时的温度为18.0±0.5℃，光照强度为3000lx，光照时间为16小时/天；

[0022] 和/或在所述步骤D)中的培养的条件均为：光照时的温度为28.0±0.5℃，黑暗时的温度为18.0±0.5℃，光照强度为3000lx，光照时间为16小时/天；

[0023] 和/或在所述步骤E)中，所述炼苗时温度为25.0±0.5℃，光照强度为2000lx，光照时间为16小时/天，湿度控制在85％以上。

[0024] 在一个具体的实施方式中，所述步骤B)中的培养时间在7-10天；和/或所述步骤C)中的继代1次培养时间12-16天；和/或所述步骤D)中的培养时间8-12天；和/或所述步骤E)中的炼苗时间为10-14天。

[0025] 在一个优选的实施方式中，所述步骤B)中的培养时间在7天；和/或所述步骤C)中的继代1次培养时间12天；和/或所述步骤D)中的培养时间8天；和/或所述步骤E)中的炼苗时间为10天。

[0026] 在一个具体的实施方式中，所述碳源选自葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖和白糖中的一种或多种，优选白糖。

[0027] 在一个具体的实施方式中，还包括藤蕹脱毒培养的步骤i)，所述步骤i)在所述步骤B)之后且在步骤C)之前，取初代培养后腋芽伸长至3cm以上的外植体的顶芽，或直接获取生长于室外的藤蕹主藤上顶芽，剥取长度为0.8-1.2mm茎尖后，将所述顶芽茎尖接种至启动培养基中进行脱毒培养，所述生长于室外的藤蕹主藤上顶芽需要消毒，消毒方法同所述步骤A)的预处理中的所述消毒方法；所述启动培养基为MS培养基+0.1-0.3mg/L的萘乙酸+0.05-0.20mg/L的赤霉素+30g/L的碳源+6g/L的琼脂粉+1.5g/L的活性炭；和/或所述步骤i)中的脱毒培养时间为14-18天，优选为14天。对于受到病原菌侵染的母株，通过茎尖脱毒获得的组培苗，相对于未经脱毒的母苗，其抗病性、抗逆性、适应性均大大增强，生长期更短，产量更高，农药、化肥的施用量减少，既降低了生产成本，又减轻了对环境造成的污染，生产出来的安全无公害蔬菜具有良好的经济效益和生态效益。此外，藤蕹脱毒1次后，可直接在实验室或室外进行营养快繁，无需再次进行脱毒；对于未受病毒侵染的母株，无需考虑脱毒步骤，直接进行快速繁殖，可以在较短的时间和较少的空间内，由1个个体繁殖出大量植株。

[0028] 在一个具体的实施方式中，所述藤蕹选自长沙藤蕹。

[0029] 与传统育苗方式相比，本发明的有益效果：

[0030] (1)本发明提供的方法不受季节限制，每个月份均可出苗。如果1月份开始进行藤蕹组织培养，3月份即可出苗，3月底就有藤蕹可以上市。与传统的藤蕹埋地窖越冬保存母苗相比，本发明提供的方法可以使上市时间将近提早1个月。而且，对于优化的实施方案来说，整个培养过程所需要的时间比未优化的实施方案能够提早半个月的时间，这更有利于藤蕹提早上市。

[0031] (2)本发明提供的方法短时间内能获得大量植株。从外植体接种到大田繁苗仅需55天，组培苗出瓶到移入大田仅需10天，诱导成活率高达97.59％。与传统扦插繁殖相比较，本发明提供的方法带1个腋芽藤条茎段通过组织培养技术可繁殖140株藤蕹组培植株，短时间内获得的植株数量大。

[0032] (3)本发明提供的方法节约场地。整个培养过程在控温控光的光照培养室中进行，1个培养瓶可以培养6株组培苗，1层培养架(规格为长1250mm×宽500mm×高360mm)即可培养672株组培苗，与扦插繁殖相比较，占用场地面积小。

[0033] (4)本发明提供的方法可以节约劳动成本。在藤蕹整个培养过程中无需整地、盖膜、浇灌肥水，无需配备专门管理的人员，与传统扦插繁殖相比较，要节约大量劳动力和成本。

附图说明

[0034] 图1炼苗的藤蕹组培苗。

具体实施方式

[0035] 下面结合具体实施例对本发明做详细说明，但本发明的范围并不限于此。

[0036] 所用的MS培养基为Murashige and Skoog，配方见表1，1/2MS培养基的配方见表2。其中，FeSO4·7H2O可使用FeSO4·7H2O与Na2·EDTA·2H2O进行配制，形成Fe·EDTA螯合形式，其原因为二价铁只有在pH5.2左右时才能被组织所利用，而以螯合形式提供的铁直到培养基在培养过程中pH上升至7.6-8.0时仍可以被植物组织所利用。

[0037] 表1 MS培养基成分(单位：mg/L)

[0038]大量元素 含量 微量元素 含量 有机物质 含量 铁盐 含量
NH4NO3 1650 KI 0.83 肌醇 100 FeSO4·7H2O 27.8
KNO3 1900 H3BO3 6.2 烟酸 0.5 Na2·EDTA·2H2O 37.3
CaCl2·2H2O 440 MnSO4·4H2O 22.3 盐酸吡哆醇 0.5
MgSO4·7H2O 370 ZnSO4·7H2O 8.6 盐酸硫胺素 0.1
KH2PO4 170 Na2MoO4·2H2O 0.25 甘氨酸 2.0
CuSO4·5H2O 0.025
CoCl2·6H2O 0.025

[0039] 表2 1/2MS培养基成分(单位：mg/L)

[0040]大量元素 含量 微量元素 含量 有机物质 含量 铁盐 含量
NH4NO3 825 KI 0.83 肌醇 100 FeSO4·7H2O 27.8
KNO3 950 H3BO3 6.2 烟酸 0.5 Na2·EDTA·2H2O 37.3
CaCl2·2H2O 220 MnSO4·4H2O 22.3 盐酸吡哆醇 0.5
MgSO4·7H2O 185 ZnSO4·7H2O 8.6 盐酸硫胺素 0.1
KH2PO4 85 Na2MoO4·2H2O 0.25 甘氨酸 2.0
CuSO4·5H2O 0.025
CoCl2·6H2O 0.025

[0041] 实施例1

[0042] (1)取材：以长沙藤蕹为实验材料，早上7:00-8:00于大田中取藤蕹主藤藤条，用经70％酒精擦拭过的剪刀去掉藤蕹叶片和叶柄，流水下冲洗约5min，将藤蕹藤茎剪成3-4cm长的茎段，并保证每个茎段中至少带有1个未萌发的腋芽。

[0043] (2)外植体消毒：将茎段装入尼龙网袋中，放入三角瓶中，在超净工作台上，先用70％酒精消毒30秒，弃去酒精，无菌水冲洗1次，再用添加吐温20的5％次氯酸钠溶液或添加吐温20的0.1％的升汞溶液(每100mL消毒液中滴入50μL吐温20)灭菌6分钟，弃次氯酸钠溶液或升汞溶液，无菌水冲洗3-5次。用无菌镊子夹出消毒后的外植体，放入已灭菌的垫有滤纸的培养皿中，吸干茎段表面水分，备用。

[0044] (3)外植体接种与初代培养：用消毒后的解剖刀切去茎段端部少许并使腋芽处于离茎段基部的2/3位置处，用消毒后的镊子将茎段接种至初代培养基中(配方为MS培养基(见表1)+2.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+0.2mg/L的萘乙酸+30g/L的蔗糖+6g/L的琼脂粉，pH值范围为5.5-5.8)进行培养。培养条件：未萌发的腋芽伸长至1cm时，温度为30.0±0.5℃，之后温度为25.0±0.5℃，光照强度为2000lx，光照时间为16小时/天，培养时间为15天。

[0045] (4)外植体继代培养：用消毒后的解剖刀将初代培养基中的苗高4cm以上，且具有3-5个腋芽的外植体，剪成带有1-2个腋芽的茎段，并用消毒后的镊子将茎段转接到继代培养基(即MS培养基(见表1)+1.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+0.5mg/L的赤霉素+30g/L的蔗糖+6g/L的琼脂粉，pH值范围为5.5-5.8)中进行增殖培养，待外植体产生的丛生芽长有3-5个腋芽时，分离所述丛生芽，转接至初代培养基中使腋芽伸长，苗高4cm以上后再转接至继代培养基中继续增殖，可如此循环培养10-15次，培养条件：光照时温度为28.0±0.5℃，黑暗时温度为18.0±0.5℃，光照强度为3000lx，光照时间为16小时/天，培养时间为15天。

[0046] (5)外植体生根培养：用消毒后的解剖刀和镊子将外植体丛生芽分开，选择苗高4cm以上，带有3-5腋芽的外植体，转接至生根培养基(配方为1/2MS培养基+1.0mg/L的萘乙酸+15g/L的蔗糖+6g/L的琼脂粉，pH值范围为5.5-5.8)中进行生根培养。培养条件：
光照时温度为28.0±0.5℃，黑暗时温度为18.0±0.5℃，光照强度为3000lx，光照时间为
16小时/天，培养时间为10天。

[0047] (6)组培苗炼苗和移栽：将已生根且根系发达的组培苗在光照培养室开瓶2天后取出，流水下小心洗净组培苗根部培养基，再移至装有由草炭、蛭石和珍珠岩(体积比为3:1:2)混合基质组成的营养钵中，浇足清水，25℃下炼苗8天，光照强度为2000lx，光照时间为16小时/天，湿度应控制在85％以上。待小植株生长势变旺可移入大田中。

[0048] 实施例2-5

[0049] 实施例2-5将消毒后的藤蕹外植体分别接种于分别添加0.1、0.3、0.5、0.7g/L浓度的核糖核酸酵母的初代培养基中，其他操作及条件同实施例1。培养7天后观察外植体生长情况，结果见表3。由表3可知添加核糖核酸酵母的有益效果主要为核糖核酸酵母能使藤蕹外植体茎秆黄化率显著降低，腋芽生长速度相对较快，植株生长势更为旺盛。核糖核酸酵母浓度大于等于0.5g/L时外植体生长效果无显著差异，考虑到生产成本，选择往培养基中添加0.5g/L核糖核酸酵母。

[0050] 表3 在初代培养基中添加不同浓度的核糖核酸酵母后观察外植体生长情况的结果(培养时间为7天后观察得到的结果)

[0051]

[0052] *黄化指在组织培养过程中，由于培养基成分、外界环境因素的影响使得外植体整株或部分器官失绿，最终干枯死亡的现象。

[0053] 实施例6-16

[0054] 表4 在继代培养基中添加抗氧化剂、氨基酸混合物以及藤蕹伤流液后观察外植体生长情况的结果(培养时间为10天后观察得到的结果)

[0055]

[0056] 1--褐化：植物组织培养过程中外植体自身组织从表面表面向培养基释放褐色物质以致培养基逐渐变成褐色，外植体也随之进一步变褐的现象，本发明中是指茎秆基部愈伤组织变褐的现象。

[0057] 2--15％藤蕹伤流液：将藤蕹主茎离地面15-20cm处切断，将截口倒插入塑料瓶，伤流液即自然从伤口流出，收集到的液体用蒸馏水稀释至原溶液的15％，再过0.22μm滤膜即可使用。

[0058] 3--丛生芽繁殖系数指由1个茎段基部愈伤化后由愈伤组织分化而形成的簇生状不定芽的个数。此处出现小数点是因为计算的平均值。

[0059] 将初代培养后的外植体剪成带有1-2个腋芽的茎段，分别接种至添加了抗氧化剂(0.05g/L的硝酸银、0.05g/L的Vc、0.1g/L的柠檬酸和0.02g/L的特丁基对苯二酚)的继代培养基中，其他操作及条件同实施例1。

[0060] 培养10天后观察外植体生长情况，结果见表4。由表4可知，与实施例1相比，在培养基中添加抗氧化剂能明显降低茎秆基部愈伤组织褐化率，但丛生芽繁殖系数并没有得到提高，4种抗氧化剂中，0.02g/L的特丁基对苯二酚较其余3种常用的抗氧化剂使用量小，且效果更佳。而在培养基中添加抗氧化剂特丁基对苯二酚的同时还添加L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸和L-盐酸半胱氨酸的氨基酸混合成分，既能降低茎秆基部愈伤组织褐化率，又能大大提高丛生芽繁殖系数，更有利于组培苗的继代培养。此外，在培养基中添加15％的藤蕹伤流液其效果与添加0.02g/L的特丁基对苯二酚、0.5g/L的L-羟基脯氨酸、0.05g/L的L-丝氨酸和0.1g/L的L-盐酸半胱氨酸可视为等同。

[0061] 实施例17

[0062] 表5 改良MS培养基成分(单位：mg/L)

[0063]大量元素 含量 微量元素 含量 有机物质 含量 铁盐 含量
NH4NO3 2475 KI 0.83 肌醇 100 FeSO4·7H2O 139
KNO3 1900 H3BO3 6.2 烟酸 0.5 Na2·EDTA·2H2O 186.5
CaCl2·2H2O 440 MnSO4·4H2O 22.3 盐酸吡哆醇 0.5
MgSO4·7H2O 370 ZnSO4·7H2O 8.6 盐酸硫胺素 0.1
KH2PO4 255 Na2MoO42H2O 0.25 甘氨酸 2.0
KCl 70 CuSO4·5H2O 0.025 泛酸钙 0.3
CoCl2·6H2O 0.025

[0064] 将继代培养后的外植体剪成带有1-2个腋芽的茎段，接种至改良过的MS培养基(见表5)中，其他操作及条件同实施例1。培养10天后观察外植体生长情况，结果见表6。由表6可知，采用改良后的MS培养基有益效果主要为能使外植体叶片增大，叶色更深，茎秆更健壮，腋芽肥大，生长势更好，生长速度更快。

[0065] 表6 MS和改良MS培养基中外植体生长情况的结果(培养时间为10天后观察得到的结果)

[0066]

[0067] 实施例18

[0068] 将初代培养基、继代培养基和生根培养基中蔗糖均用白糖代替，其他操作及条件同实施例1。结果表明，与实施例1相比，采用白糖作为碳源并没有减缓藤蕹外植体的生长速度、丛生芽繁殖系数以及降低植株健壮程度。而白糖比蔗糖在价格上更占有优势，完全可以使用白糖来降低组培成本。

[0069] 实施例19

[0070] 藤蕹脱毒培养的步骤i)，所述步骤i)在所述步骤3)之后且在步骤4)之前，取初代培养后腋芽伸长至3cm以上的外植体顶芽或直接获取生长于室外的藤蕹主藤上顶芽，在解剖显微镜下剥取长度为1.0mm的顶芽茎尖，接种至启动培养基中进行脱毒培养，所述启动培养基为MS培养基+0.1-0.3mg/L的萘乙酸+0.05-0.20mg/L的赤霉素+30g/L的碳源+6g/L的琼脂粉+1.5g/L的活性炭；脱毒培养时间为14-18天。其他操作及条件同实施例1。

[0071] 将炼苗后的藤蕹脱毒组培苗和地窖留种的藤蕹藤茎同时移栽于大棚中，田间管理一致，生长1个月后对其进行田间农艺性状和病虫害调查，结果见表7。由表7可知，与常规扦插未脱毒苗相比，主藤平均长度增幅为15.28％，主藤平均茎粗增幅为22.56％，每根主藤萌发侧枝数平均增多3根，平均叶面积增幅为14.26％，脱毒苗优势主要表现为脱毒苗生长速度快，生长势旺，无病害发生。

[0072] 表7 脱毒苗和常规扦插苗田间农艺性状和病害调查(生长1个月后观察得到的结果)

[0073]