一种金包覆氧化铁星形核壳结构纳米颗粒的制备及其成像和热疗的应用

摘要

本发明涉及一种金包覆氧化铁星形核壳结构纳米颗粒的制备及其成像和热疗的应用，包括：PEI包覆的银纳米种子的制备；“一步”水热法合成带有银种子的氧化铁纳米颗粒；在金生长溶液中制备星形复合纳米颗粒；星形复合纳米颗粒的表面进行聚乙烯亚胺(PEI)和透明质酸(HA)修饰。本发明反应条件温和，工艺简单，易于操作；制备的金包覆氧化铁星形核壳结构纳米颗粒具有很好的分子影像学性能和热疗抗肿瘤效果，在体内肿瘤成像诊断和光热治疗领域具有潜在的应用价值。

权利要求

1.一种金包覆氧化铁星形核壳结构纳米颗粒的制备方法，包括：

(1)称PEI溶于水中，加入AgNO3溶液，搅拌，然后加入冰浴处理的NaBH4水溶液，搅拌，透析，得到PEI-Ag纳米颗粒；

(2)将FeCl2·4H2O溶解于超纯水中，加入NH3·H2O并于空气气氛下搅拌，然后将混合溶液转移到高压反应釜中，并将(1)中制备的PEI-Ag水溶液也加入到高压反应釜中，搅拌混合均匀后，反应；反应结束后，自然冷却至室温，将沉淀磁分离洗涤纯化后，即得带有银种子的四氧化三铁纳米颗粒Fe3O4-PEI-Ag；

(3)称十六烷基三甲基溴化铵CTAB溶解于水中，加入HAuCl4溶液，搅拌后加入AgNO3，再搅拌后加入抗坏血酸AA，待溶液变成无色时加入稀释10倍的(2)中制备的Fe3O4-PEI-Ag水溶液；反应结束后，离心洗涤除去CTAB，即得到星形复合纳米颗粒Fe3O4/Au NSs；

(4)称PEI溶于水中并向其中加入巯基乙酸甲酯反应，产物在水中透析三天即得到部分巯基化的PEI PEI-SH；

(5)向步骤(3)制备的Fe3O4/Au NSs水溶液中加入(4)中制备的PEI-SH水溶液，超声后搅拌反应，得到PEI包裹的Fe3O4/Au NSs Fe3O4/Au-PEI NSs；

(6)称透明质酸HA溶于水中，并用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基丁二酰亚胺NHS活化，然后将活化的HA溶液加入到(5)制备的Fe3O4/Au-PEI NSs水溶液中，搅拌反应，产物离心洗涤后即得到终产物HA修饰的星形复合纳米颗粒Fe3O4/Au-HA NSs。

2.如权利要求1所述的一种金包覆氧化铁星形核壳结构纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤(1)中PEI和AgNO3的摩尔比为1:20；AgNO3和NaBH4的摩尔比为1:5；PEI和水的比例为1g:20ml；加入AgNO3溶液后搅拌30-60min；加入NaBH4水溶液后搅拌2-4h。

3.如权利要求1所述的一种金包覆氧化铁星形核壳结构纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤(1)中透析为用截留分子量14000的透析袋透析2-5天。

4.如权利要求1所述的一种金包覆氧化铁星形核壳结构纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤(2)中FeCl2·4H2O与超纯水的比例为1g:6-7ml；FeCl2·4H2O与NH3·H2O的摩尔比为1:5；反应温度为130-140℃；FeCl2·4H2O与PEI-Ag的质量比为2.5:1；搅拌时间均为5-

15min；反应3-4h。

5.如权利要求1所述的一种金包覆氧化铁星形核壳结构纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤(3)中CTAB、HAuCl4、AgNO3和AA的质量比为381:17.4:1.1:12；十六烷基三甲基溴化铵和水的比例为30-40mg:1ml；HAuCl4溶液的浓度为30mg/ml；十六烷基三甲基溴化铵和Fe3O4-PEI-Ag水溶液的比例为3000-4000mg:1ml。

6.如权利要求1所述的一种金包覆氧化铁星形核壳结构纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤(4)中PEI和水的比例为1g:10ml；PEI和巯基乙酸甲酯的摩尔比为1:30；反应温度为60-80℃；反应时间为1-3天。

7.如权利要求1所述的一种金包覆氧化铁星形核壳结构纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤(5)中Fe3O4/Au NSs水溶液和PEI-SH水溶液的比例为100-200ml：1g。

8.如权利要求1所述的一种金包覆氧化铁星形核壳结构纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤(5)中超声时间为10-60min；反应时间为10-30h。

9.如权利要求1所述的一种金包覆氧化铁星形核壳结构纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤(6)中HA的分子量是31200；HA、EDC和NHS的摩尔比为1:10:10；活化时间为1-5h；

反应时间为1-5天。

10.如权利要求1所述的一种金包覆氧化铁星形核壳结构纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤(1)和步骤(4)中PEI的分子量为25000。

说明书

一种金包覆氧化铁星形核壳结构纳米颗粒的制备及其成像和

热疗的应用

技术领域

[0001] 本发明属于诊疗剂的制备领域，特别涉及一种金包覆氧化铁星形核壳结构纳米颗粒的制备及其成像和热疗的应用。

背景技术

[0002] 长期以来，恶性肿瘤一直都是危害人类生命的头号杀手，其具有死亡率高、难治疗以及恶化迅速等特点。因此，肿瘤的早期诊断和治疗显得尤为重要。目前，肿瘤的检测手段各种各样，主要有：超声成像、CT成像、核医学PET成像以及核磁共振成像(MRI)。随着核磁共振技术(MR)和计算机断层扫描技术(CT)的发展，他们对病灶的扫描时间逐渐缩短，分辨率逐渐提高，检测也更加准确，这也使得MRI和CT成为近几年疾病检测的主要手段。同时，为了提高诊断的灵敏度和准确度，有必要发展多功能的成像模式。

[0003] 超顺磁性四氧化三铁纳米颗粒近年来在生物医学领域有着越来越广泛的应用，特别是用作核磁共振成像(MRI)的造影剂。本课题组在前期的工作中，通过简易的水热合成法制备的四氧化三铁纳米颗粒具有很高的弛豫率，并表现出良好的T2MR成像性能(Cai et al.，ACS Appl.Mater.Interfaces2013，5，1722-1731；专利公开号201210277624.9)。此外，我们通过修改后的水热法制备了同时含有四氧化三铁纳米颗粒和金纳颗粒的Fe3O4/Au复合纳米颗粒，该复合纳米颗粒可以成功用于MR/CT双模态成像的造影剂(Li et al.，ACS Appl.Mater.Interfaces2013，5，10357-10366；专利公开号201310072165.5)。

[0004] 随着“诊疗一体化”理念的提出，我们尝试制备具有肿瘤光热治疗效应的纳米颗粒。在此过程中，我们发现在CTAB存在的情况下，金纳米颗粒会在四氧化三铁纳米颗粒表面长成星型结构，而且这种独特的结构使得该纳米颗粒在近红外区域有较强的吸收峰，从而有望将光能转化为热能，并达到杀死肿瘤细胞的目的。

[0005] 为了让金包覆氧化铁星形核壳结构纳米颗粒能有效地应用到生物体内肿瘤部位的成像检测和治疗，我们依次在其表面修饰聚乙烯亚胺(polyethyleneimine，PEI)和透明质酸(hyaluronic acid，HA)。我们前期的工作已经证明HA对具有高表达CD44受体的癌细胞(如HeLa细胞)具有很好的靶向作用(Li et al.，Biomaterials2014，35，3666-3677)。因此，此策略不仅有效地提高了纳米颗粒的水溶性、稳定性和生物相容性，而且还赋予该复合纳米颗粒对特定细胞的靶向作用。我们以HeLa细胞(一种人宫颈瘤癌细胞)为模型细胞和肿瘤模型对制备的多功能纳米探针的性质进行一一评价。本研究制备的金包覆氧化铁星形核壳结构纳米颗粒具备的良好特性，如较高的R2弛豫率，良好的CT增强效果，特定癌细胞的靶向性，快速升温杀死肿瘤细胞的能力等，有望实现对不同疾病系统的准确灵敏的诊断和治疗，为“诊疗一体化”造影剂的制备提供一个良好的平台。

[0006] 检索国内外文献，尚没有发现关于金包覆氧化铁星形核壳结构纳米颗粒的制备及其用于MR/CT双模态成像和光热治疗的相关报道。

发明内容

[0007] 本发明所要解决的技术问题是提供一种金包覆氧化铁星形核壳结构纳米颗粒的制备方法，该方法工艺简单，反应条件温和，易于操作，成本较低。制备的复合型星形核壳结构纳米颗粒具有良好的水溶性、胶体稳定性和特异靶向性。所用的合成原料为廉价和环境友好材料，具有产业化实施的前景。

[0008] 本发明的一种金包覆氧化铁星形核壳结构纳米颗粒的制备方法，包括：

[0009] (1)称PEI溶于水中，加入AgNO3溶液，搅拌，然后加入冰浴处理的NaBH4水溶液，搅拌，透析，得到PEI-Ag纳米颗粒；

[0010] (2)将FeCl2·4H2O溶解于超纯水中，加入NH3·H2O并于空气气氛下搅拌，然后将混合溶液转移到高压反应釜中，并将(1)中制备的PEI-Ag水溶液也加入到高压反应釜中，搅拌混合均匀后，反应。反应结束后，自然冷却至室温，将沉淀磁分离洗涤纯化后，即得带有银种子的四氧化三铁纳米颗粒Fe3O4-PEI-Ag；

[0011] (3)称十六烷基三甲基溴化铵CTAB溶解于水中，加入HAuCl4溶液，搅拌后加入AgNO3，再搅拌后加入抗坏血酸AA，待溶液变成无色时加入稀释10倍的(2)中制备的Fe3O4-PEI-Ag水溶液。反应结束后，离心洗涤除去CTAB，即得到星形复合纳米颗粒Fe3O4/Au NSs；

[0012] (4)称PEI溶于水中并向其中加入巯基乙酸甲酯反应，产物在水中透析三天即得到部分巯基化的PEI PEI-SH；

[0013] (5)向步骤(3)制备的Fe3O4/Au NSs水溶液中加入(4)中制备的PEI-SH水溶液，超声后搅拌反应，得到PEI包裹的Fe3O4/Au NSs Fe3O4/Au-PEI NSs；

[0014] (6)称透明质酸HA溶于水中，并用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基丁二酰亚胺NHS活化，然后将活化的HA溶液加入到(5)制备的Fe3O4/Au-PEINSs水溶液中，搅拌反应，产物离心洗涤后即得到终产物HA修饰的星形复合纳米颗粒Fe3O4/Au-HA NSs。

[0015] 步骤(1)中PEI和AgNO3的摩尔比为1∶20；AgNO3和NaBH4的摩尔比为1∶5；PEI和水的比例为1g∶20ml；加入AgNO3溶液后搅拌30-60min；加入NaBH4水溶液后搅拌2-4h。

[0016] 步骤(1)中透析为用截留分子量14000的透析袋对蒸馏水透析2-5天。

[0017] 步骤(2)中FeCl2·4H2O与超纯水的比例为1g∶6-7ml；FeCl2·4H2O与NH3·H2O的摩尔比为1∶5；反应温度130-140℃；FeCl2·4H2O与PEI-Ag的质量比为2.5∶1；搅拌时间为5-15min；反应3-4h。

[0018] 步骤(3)中CTAB、HAuCl4、AgNO3和AA的质量比为381∶17.4∶1.1∶12；十六烷基三甲基溴化铵和水的比例为30-40mg∶1ml；HAuCl4溶液的浓度为30mg/ml；十六烷基三甲基溴化铵和Fe3O4-PEI-Ag水溶液的比例为3000-4000mg∶1ml。

[0019] 步骤(4)中PEI和水的比例为1g∶10ml；PEI和巯基乙酸甲酯的摩尔比为1∶30；反应温度为60-80℃。反应时间1-3天。

[0020] 巯基乙酸甲酯规格为95％，Mw＝106.14，ρ＝1.187。

[0021] 步骤(5)中Fe3O4-PEI-Ag水溶液和PEI-SH水溶液的比例为100-200ml∶1g。

[0022] 步骤(5)中超声时间为10-60min；反应时间为10-30h。

[0023] 步骤(6)中HA的分子量是31200；HA、EDC和NHS的摩尔比为1∶10∶10。活化时间为1-5h；反应时间为1-5天。

[0024] 步骤(1)和步骤(4)中超支化聚乙烯亚胺PEI的分子量为25000。

[0025] 一种金包覆氧化铁星形核壳结构纳米颗粒在成像的应用。

[0026] 一种金包覆氧化铁星形核壳结构纳米颗粒在热疗的应用。

[0027] 本发明先利用“一步”水热法合成带有银种子的氧化铁纳米颗粒；再在金生长溶液中制备星形复合纳米颗粒；然后对制备的星形复合纳米颗粒的进行表面PEI和HA修饰。

[0028] 本发明操作简便易行，原材料成本低。制备的复合型纳米颗粒具有良好的水溶性、胶体稳定性、生物相容性和特异靶向性。体外和动物体内实验结果显示该星形复合纳米颗粒不仅具有很好的MR/CT成像效果，同时具有光热治疗杀死癌细胞的效果。该方法制备的金包覆氧化铁星形核壳结构纳米颗粒在MR/CT双模态成像诊断和癌症的光热治疗领域有着潜在的应用。

[0029] 本发明使用傅氏转换红外光谱分析(FTIR)、紫外可见吸收光谱(UV-Vis)、电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-OES)、Zeta电势及动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)等方法表征制备的星形核壳结构纳米颗粒，并通过MR成像仪和CT成像仪测定纳米颗粒的T2弛豫性能和X射线衰减系数，并评价了纳米颗粒作为热疗试剂在近红外激光照射下的升温效率。然后利用MTT法评价纳米颗粒的细胞毒性及其对癌细胞的杀死效果，最后通过负荷肿瘤的裸鼠为模型，对纳米颗粒的成像和治疗性能进行评价。

[0030] 有益效果

[0031] (1)本发明先利用“一步”水热法合成带有银种子的氧化铁纳米颗粒；再在金生长溶液中制备星形复合纳米颗粒；然后对制备的星形复合纳米颗粒进行表面PEI和HA修饰；此法操作工艺简单，反应条件温和，易于操作纯化，所用均为廉价的和环境友好的材料；

[0032] (2)本发明制备的复合型纳米颗粒具有良好的水溶性、胶体稳定性、生物相容性和特定细胞的靶向性。体外细胞和动物体内实验结果显示该星形复合纳米颗粒不仅具有很好的MR/CT成像效果，同时能对癌细胞和肿瘤达到光热治疗的效果。该方法制备的金包覆氧化铁星形核壳结构纳米颗粒在MR/CT双模态成像诊断和癌症的光热治疗领域有着潜在的应用。

附图说明

[0033] 图1是实施例1的PEI-SH和PEI红外光谱图；

[0034] 图2是实施例1的Fe3O4/Au-PEI NSs和Fe3O4/Au-HA NSs的电势(a)和水动力粒径(b)；

[0035] 图3是实施例1的Fe3O4/Ag种子和Fe3O4/Au-HA NSs的紫外吸收图谱；

[0036] 图4是实施例1的Fe3O4/Au-HA NSs的透射电镜图片：(a，b)低倍电镜图片，(c)高倍电镜图片；

[0037] 图5是实施例1的Fe3O4/Au-HA NSs在不同Fe浓度下的T2加权成像(a)和T2弛豫时间倒数与Fe浓度的线性关系图(b)；

[0038] 图6是实施例1的Fe3O4/Au-HA NSs在不同Au浓度下的CT成像图片(a)和CT值随金浓度变化的线性关系图(b)；

[0039] 图7是实施例1的Fe3O4/Au-HA NSs在不同Au浓度下经过激光照射后的升温曲线；

[0040] 图8是MTT法测试的HeLa细胞经过PBS缓冲液(对照)和本发明制备的Fe3O4/Au-HA NSs(Au的浓度范围在0.2-2.0mM)处理24小时后的细胞活力；

[0041] 图9是HeLa细胞和U87MG细胞经过PBS缓冲液或本发明制备的Fe3O4/Au-HA NSs处理6小时后的细胞T2MR成像图片(a)、相应的MRI信号值变化(b)、CT成像(c)和相应的CT信号值变化(d)；

[0042] 图10是MTT法测试的HeLa细胞在与本发明制备的Fe3O4/Au-HA NSs(Au浓度0.1-0.4mM)共培养6小时后经过不同时间的激光照射后细胞的存活率；

[0043] 图11是瘤内注射本发明制备的Fe3O4/Au-HA NSs到小鼠肿瘤部位后的MR(a)和CT(c)成像以及相应的MR(b)和CT(d)信号强度的变化；

[0044] 图12是瘤内注射本发明制备的Fe3O4/Au-HA NSs(区域11)和PBS(区域12)到小鼠肿瘤部位后的肿瘤部位的热敏成像图片(a)和温度变化曲线(b)；

[0045] 图13是经过不同方式处理后裸鼠肿瘤的HE染色图片，(a)瘤内注射PBS但不经过激光照射，(b)瘤内注射PBS且经过激光照射，(c)瘤内注射本发明制备的Fe3O4/Au-HA NSs但不经过激光照射，(d)瘤内注射本发明制备的Fe3O4/Au-HA NSs且经过激光照射。

[0046] 图14是经过不同方式处理后裸鼠肿瘤相对体积随着时间的变化曲线。

具体实施方式

[0047] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

[0048] 实施例1

[0049] (1)称0.5g PEI溶于10mL水中，加入AgNO3溶液(68mg)，搅拌30-60min，然后加入冰浴处理的NaBH4水溶液(75.66mg)，搅拌2-4h，透析3天，得到PEI-Ag纳米颗粒。储存于4℃下备用。

[0050] (2)将1.25g FeCl2·4H2O溶解于7.75mL超纯水中，加入6.25mLNH3·H2O并于空气气氛下搅拌10分钟，然后将混合溶液转移到高压反应釜中，并将(1)中制备的PEI-Ag水溶液也加入到高压反应釜中，搅拌混合均匀后，于134℃反应3小时。反应结束后，自然冷却至室温，将沉淀磁分离洗涤纯化后，即得带有银种子的四氧化三铁纳米颗粒Fe3O4-PEI-Ag。储存于4℃下备用。

[0051] (3)称381mg十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶解于10mL水中，加入580μL HAuCl4溶液(30mg/mL)，搅拌10分钟后加入1.1mg AgNO3，再搅拌10分钟后加入12mg抗坏血酸(AA)，待溶液变成无色时加入稀释10倍的(2)中制备的Fe3O4-PEI-Ag水溶液(0.1mL)。反应结束后，离心洗涤除去CTAB，即得到星形复合纳米颗粒(Fe3O4/Au NSs)。储存于4℃下备用。

[0052] (4)称1.0g PEI溶于10mL水中并向其中加入108μL巯基乙酸甲酯(Methyl thioglycolate，95％，Mw＝106.14，ρ＝1.187)在60～80℃水浴反应2天，在水中透析三天即得到部分巯基化的PEI(PEI-SH)。冻干后储存于-20℃下备用。分别取2mg冻干的PEI和PEI-SH，经过溴化钾压片后用于红外光谱分析。通过对比PEI和PEI-SH的红外谱图(见附图1)，发现PEI-SH在1640cm-1处比PEI多了一个明显的吸收峰，该峰是由PEI上的氨基和巯基乙酸甲酯发生水解后形成的酰胺键导致的，从而说明PEI成功巯基化修饰。

[0053] (5)向(3)制备的Fe3O4/Au NSs水溶液中加入(4)中制备的PEI-SH水溶液(0.1g)，超声30分钟后搅拌反应1天，得到PEI包裹的Fe3O4/Au NSs(Fe3O4/Au-PEI NSs)。储存于4℃下备用。

[0054] (6)称520mg透明质酸(Mw＝31200)溶于水中，并用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，128mg)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS，80mg)活化3h，然后将活化的HA溶液加入到制备的Fe3O4/Au-PEI NSs水溶液中，搅拌反应3天，产物离心洗涤后即得到终产物HA修饰的复合星形纳米颗粒(Fe3O4/Au-HA NSs)。储存于4℃下备用。取0.1mL(5)制备的Fe3O4/Au-PEI NSs和(6)制备的Fe3O4/Au-HA NSs用超纯水分别配制成1.5mL的水溶液用于测表面电势和水动力直径(见附图2)。表面电势测试结果显示PEI修饰后星形核壳结构性纳米颗粒的表面电势是+32.7mV，而经过HA修饰后电势降低到-27.7mV。水动力粒径测试结果显示Fe3O4/Au-PEI NSs的水动力粒径是298.8nm，而HA修饰后得到的Fe3O4/Au-HA NSs的水动力粒径是339.4nm。分别取25μLFe3O4-PEI-Ag(2)和Fe3O4/Au-HA NSs(6)的水溶液于2mL离心管中，再向其中加700μL超纯水，超声均匀，测紫外吸收(见附图3)。紫外结果表明：Fe3O4/Au-HA NSs在700到1100nm范围内有一个很宽的紫外吸收峰，而Fe3O4/Ag种子在该波段没有明显的紫外吸收峰。

[0055] 实施例2

[0056] 取实施例1制备的Fe3O4/Au-HA NSs纳米颗粒水溶液5μL，然后用超纯水配制成100μL的纳米颗粒悬浮液。并将纳米颗粒悬浮液5μL滴在铜网表面，在空气中晾干后用于TEM测试(见附图4)。TEM结果显示Fe3O4/Au-HA NSs的形貌均为星形，粒径大小在120nm左右，高分辨TEM显示纳米颗粒的表面包覆一层有机层。

[0057] 实施例3

[0058] 将实施例1的Fe3O4/Au-HA NSs通过ICP-OES测试法测定溶液中Fe元素的浓度，然后在EP管中用超纯水配制Fe浓度依次为0.005、0.01、0.02、0.04和0.08mM的水溶液2mL，通过磁共振成像测定材料在不同的Fe浓度下的成像效果和T2弛豫效应(见附图5)。T2加权成像结果表明本发明制备的Fe3O4/Au-HA NSs随着铁浓度的增加，MR信号强度随之减弱。弛豫率测试结果表明Fe3O4/Au-HA NSs的弛豫时间倒数随着铁浓度的增加(在0.0025-0.04mM浓度范围内)具有很好的线性关系。并且通过计算可得本发明制备的Fe3O4/Au-HA NSs的r2弛豫率是144.39mM-1s-1。因此，本发明所制备的Fe3O4/Au-HA NSs可作为MRI分子影像学诊断中的优良T2信号衰减造影剂。

[0059] 实施例4

[0060] 将实施例1制备的Fe3O4/Au-HA NSs通过ICP-OES测试法测定溶液中Au元素的浓度，然后在EP管中用超纯水配制Au浓度依次为0.01、0.02、0.04、0.06和0.08mM的水溶液2mL用于评价其CT成像效应(见附图6)。结果表明随着金浓度的增加，纳米颗粒的CT信号强度也随之增加。并且从CT值随金浓度变化的线性拟合图可以看出复合纳米颗粒的CT值随着金浓度的变化具有很好的线性关系。说明了本发明的Fe3O4/Au-HA NSs有望用作CT成像的造影剂。

[0061] 实施例5

[0062] 依据实施例4测得的Au元素的浓度，在EP管中用超纯水配制Au浓度依次为0.32、0.8、1.6、3.2、16和24mM的水溶液0.2mL，以等体积的水和Fe3O4/Ag种子水溶液为对照，用
915nm激光照射，观察温度变化情况(见附图7)。结果表明水和Fe3O4/Ag种子在照射后5分钟，温度仅稍微的升高。而对于Fe3O4/Au-HA NSs，随着照射时间的延长，纳米颗粒水溶液的温度明显增加。而且随着Au浓度的增加，温度的增加更加明显。

[0063] 实施例6

[0064] 以HeLa细胞为模型细胞评价本发明制备的Fe3O4/Au-HA NSs对细胞增殖的影响。用无菌PBS配置不同浓度的Fe3O4/Au-HA NSs的PBS溶液。HeLa细胞种植于96孔板后与Fe3O4/Au-HA NSs纳米颗粒(Au浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.5和2.0mM)在37℃下共培养24小时。然后，向培养板孔中加入20μL MTT，继续在37℃下培养4小时后，弃去培养液，并加入200μLDMSO，振荡15分钟后在570nm处测量吸光值，并根据此值计算细胞的活力(见附图8)。不同浓度的材料对细胞增殖的影响以缓冲液PBS为对照进行比较。与PBS对照组相比，Fe3O4/Au-HA NSs在Au的实验浓度为0到1.5mM范围内对HeLa细胞的存活率的影响没有显著性差异，即使Au的实验浓度达到2.0mM，才显示出较低的细胞毒性。这充分说明合成的Fe3O4/Au-HA NSs具有良好的生物相容性。

[0065] 实施例7

[0066] 我们通过体外细胞MR和CT成像实验来验证Fe3O4/Au-HA NSs对Hela细胞的特异靶向性以及评价本发明制备的纳米颗粒的细胞MR和CT成像效果。U87MG细胞或Hela细胞以2×106/孔种植于6孔板，培养过夜后，分别与PBS、Fe3O4/Au-HA NSs纳米颗粒的无菌PBS悬浮液(Fe浓度为0-0.2，Au浓度为0-5.0)在37℃下共培养6小时，在培养结束后细胞用PBS清洗3次，再胰酶消化、离心、过滤，最后分散在1mL PBS(含0.5％琼脂糖)中。然后对细胞样品进行MR成像和CT成像。如图9所示，在T2加权MR成像中，当Fe的浓度相同时，HeLa细胞的信号强度明显低于U87MG细胞(图9a)，其对应的信号值也与成像图片的结果一致(图9b)。在CT成像中，当Au的浓度相同时，NSs处理后HeLa细胞的信号强度明显比U87MG细胞亮(图9c)，通过对信号强度的定量分析，我们发现相同浓度下，HeLa细胞的亨氏单位(HU)在研究的浓度范围内均比U87MG细胞高(图9d)。该实验结果很好的证明了本发明制备的Fe3O4/Au-HA NSs对HeLa细胞的特异性靶向作用。

[0067] 实施例8

[0068] 以HeLa细胞为模型细胞，在915nm激光照射下评价Fe3O4/Au-HA NSs对细胞的杀死作用。用无菌PBS配置不同浓度的Fe3O4/Au-HA NSs的PBS溶液。HeLa细胞与本发明制备的Fe3O4/Au-HA NSs(Au浓度为0.1、0.2、0.3和0.4mM)共培养6小时后用915nm激光器分别照射5分钟和10分钟，未照射的细胞用作对照组。然后，向培养板孔中加入20μL MTT，继续在37℃下培养4小时后，弃去培养液，并加入200μL DMSO，振荡15分钟后在570nm处测量吸光值，并根据此值计算细胞的活力(见附图10)。结果表明随着浓度的增加，未照射的细胞仍然保持很高的细胞存活率；而经过激光照射5分钟，细胞表现出凋亡趋势，并且随着金浓度的增加，细胞的存活率越低；照射10分钟后，细胞的存活率明显降低，并且在金浓度为0.4mM时，仅有37.2％的细胞存活。该实验结果说明本发明制备的Fe3O4/Au-HA NSs在近红外激光照射下能引起细胞的凋亡。

[0069] 实施例9

[0070] ICP-OES测试结果显示Fe3O4/Au-HA NSs中Fe元素和Au元素的比例是1∶24.7。通过瘤内注射Fe3O4/Au-HA NSs的PBS溶液([Fe]＝5.0mM，[Au]＝123.5mM，0.1mL)来评价体内肿瘤部位的MR/CT成像效果(见附图11)。结果表明注射纳米颗粒([Fe]＝5.0mM，0.1mL)10分钟后，老鼠肿瘤部位较注射前(0分钟)明显的变暗，其MR信号强度从注射前的641降低到41.1(见附图11a和11b)。在CT成像中，注射纳米颗粒10分钟后，肿瘤部位信号明显增加，肿瘤清晰可见(见附图11c)。肿瘤部位的信号值(亨氏单位)从157.3HU增加到2303.3HU(见附图11d)。该组实验结果说明制备的Fe3O4/Au-HA NSs具有很好的MR和CT成像性能。

[0071] 实施例10

[0072] 瘤内注射Fe3O4/Au-HA NSs的PBS溶液([Au]＝32mM，0.1mL)到裸鼠的肿瘤部位，然后用915nm激光照射肿瘤部位，通过红外摄像机来评价体内肿瘤部位的近红外成像效果，同时以注射相同体积的PBS的裸鼠作为对照组(见附图12)。结果表明注射后1.5分钟，注射Fe3O4/Au-HA NSs的小鼠肿瘤部位的温度明显升高，达到了59.1℃，而此时注射PBS小鼠的肿瘤部位的温度仅仅达到36.2℃。在随后的一段时间内，注射Fe3O4/Au-HA NSs的小鼠肿瘤部位的温度保持在50℃以上。而对照小鼠肿瘤部位的温度仅仅维持在36℃左右。实验结果说明本发明制备的Fe3O4/Au-HA NSs能使肿瘤部位的温度升高，从而达到杀死肿瘤细胞的作用。

[0073] 实施例11

[0074] 将负荷肿瘤的裸鼠分为四组，分别经过不同方式处理：(a)瘤内注射PBS但不经过激光照射，(b)肿瘤只经激光照射10分钟，(c)瘤内注射本发明制备的Fe3O4/Au-HA NSs，(d)瘤内注射本发明制备的Fe3O4/Au-HA NSs且经过激光照射10分钟。处理后这些肿瘤被取出并用HE染色，通过相差显微镜观察组织的结构来确定肿瘤是否出现坏死(如图13)。观察结果显示(a)、(b)和(c)组的裸鼠肿瘤没有出现坏死现象，生长良好，而(d)组裸鼠肿瘤出现明显的坏死。该实验结果说明本发明制备的Fe3O4/Au-HA NSs在近红外激光的照射下能引起肿瘤细胞的坏死，从而达到治疗肿瘤的目的。

[0075] 实施例12

[0076] 负荷肿瘤的裸鼠被分为四组(每组4只)，然后分别经过不同方式处理：(a)瘤内注射生理盐水(PBS)但不经过激光照射，(b)肿瘤只经激光照射10分钟，(c)瘤内注射本发明制备的Fe3O4/Au-HA NSs，(d)瘤内注射本发明制备的Fe3O4/Au-HA NSs且经过激光照射10分钟。第二天，裸鼠经过同第0天相同的处理，但是注射PBS或者Fe3O4/Au-HA NSs的量减少一半。随后观察并记录各组老鼠在不同时间点的肿瘤体积大小，肿瘤相对体积＝V/V0。V表示裸鼠在不同时间点的肿瘤体积，V0表示第0天的肿瘤体积。从图14可以看出，a-c三组裸鼠的肿瘤体积随着时间的变化逐渐增加，而d组裸鼠的肿瘤体积经过照射后明显减小，并且再第二次注射纳米颗粒并照射后，肿瘤体积变为0。因此可见，本发明制备的Fe3O4/Au-HA NSs能有效抑制肿瘤的生长。