一种测定甘露聚糖肽中甘露糖含量的方法

摘要

本发明公开了一种测定甘露聚糖肽中甘露糖含量的方法，属于检测技术领域。本发明技术方案包括发酵液的粗提取、样品的酸解、衍生化、通过气相色谱检测水解的甘露糖单体的含量，进而表征发酵液中甘露聚糖肽含量，排除其他杂质的干扰，为发酵过程的实时监控提供可靠方法。本发明提供的方法可靠可重复性高，较简单、快捷且灵敏度高，可通过测定甘露糖含量表征甘露聚糖肽发酵情况。

权利要求

1.一种测定甘露聚糖肽中甘露糖含量的方法，是对发酵液中的甘露聚糖肽进行粗提纯，然后酸解获得甘露糖单体，再将甘露糖单体进行衍生化，通过气相色谱检测甘露糖含量，进而表征甘露聚糖肽的含量；所述甘露聚糖肽经过粗提纯，去除分子量小于10KD及大于100KD的杂质；

所述气相色谱检测甘露糖含量的气相色谱条件是：色谱柱：OV1701石英毛细管柱，30m，I.D.0.53mm；

检测器：氢火焰离子鉴定器；

气化室温度：260℃，检测器温度：250℃；

柱温：程序升温：起始温度120℃，保持3min，每分钟升10℃，至195℃，保留0.1min，每分钟升3℃，至240℃，保留10min；

2

载气压力：0.60kg/cm，载气为N2；

2

燃气压力：0.65kg/cm，燃气为H2；

2

助燃气压力：0.50kg/cm，助燃气为空气；

分流比为30∶1。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酸解是将甘露聚糖肽用1-2M H2SO4于

105℃进行酸解反应，反应结束后用BaCO3分次加入中和，振荡、离心取上清液，加入肌醇内标、混匀，进行冷冻干燥。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甘露糖单体的衍生化，是称取10mg盐酸羟胺溶于0.5mL吡啶中，再将甘露聚糖肽酸解产物的冻干物加入到盐酸羟胺溶液中，充分溶解，90℃水浴30min，冷却至室温，加入0.5mL乙酸酐，90℃水浴30min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵液中甘露聚糖肽中甘露糖含量的测定步骤为：(1)发酵产物的粗提纯：量取发酵液20-30mL于50mL离心管中，10000rpm离心20min，去沉淀取上清液，转至100KD超滤管，5000g离心20min，收集流出液，再加5mL去离子水至

100KD超滤管，5000g离心20min，重复一次，合并流出液；将流出液转移至10KD超滤管中，

7500g离心20min，截留液转移至新离心管，用去离子水多次冲洗10KD超滤管，合并截留液，将截留液进行冷冻干燥；

(2)甘露聚糖肽的酸解：称取20mg冻干物于15mL离心管中，加2mL1MH2SO4于105℃反应8h，反应后每管添加1mL1mg/mL的肌醇内标，混匀，称取2gBaCO3分两次加入中和，振荡，

12000rpm离心20min，取上清液于新1.5mL离心管中，进行冷冻干燥；

(3)酸解样品的衍生化：称取10mg盐酸羟胺溶于0.5mL吡啶中，再将冻干物加入到盐酸羟胺溶液中，充分溶解，90℃水浴30min，冷却至室温，加入0.5mL乙酸酐，90℃水浴

30min，冷却后进行气相色谱分析；

(4)气相色谱条件：

色谱柱：OV1701石英毛细管柱，30m，I.D.0.53mm；

检测器：氢火焰离子鉴定器；

气化室温度：260℃，检测器温度：250℃；

柱温：程序升温：起始温度120℃，保持3min，每分钟升10℃，至195℃，保留0.1min，每分钟升3℃，至240℃，保留10min；

2

载气压力：0.60kg/cm，载气为N2；

2

燃气压力：0.65kg/cm，燃气为H2；

2

助燃气压力：0.50kg/cm，助燃气为空气；

分流比为30∶1；

(5)单糖结果分析：

单糖组分比例以肌醇为内标，以内标法测定出甘露糖含量，甘露聚糖肽的含量(％)＝甘露糖含量(％)/甘露聚糖肽中甘露糖含量(％)。

说明书

一种测定甘露聚糖肽中甘露糖含量的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种测定甘露聚糖肽中甘露糖含量的方法，尤其是一种基于气相色谱的表征甘露聚糖肽含量的方法，属于检测技术领域。

背景技术

[0002] 甘露聚糖肽(Mannatide)曾用名：多抗甲素(PolyactinA，PAA)，是由α-溶血性链球菌(alpha-Hemolytic streptococci)33#菌株经发酵培养，提取制备的多糖类物质。它具有抑制肿瘤细胞生长与代谢，促进造血干细胞生长，增强免疫细胞活化增殖及特异抗体生成，提高外周血白细胞数，改善机体抗应激能力及抗炎等多种生理活性。该药作为治疗肿瘤的辅助药物，能够减轻放、化疗的毒副作用，增强和调节免疫功能；对贫血、血细胞减少症、过敏性关节炎、多种口腔粘膜病等非肿瘤疾病都有很好的治疗效果。

[0003] 甘露聚糖肽不仅可以治疗人体的多种疾病，在畜牧生产中合理运用该药品，也可以起到很好的效果，具有光明的市场前景。但在发酵生产当中，对发酵情况的监控多依靠对发酵液中菌体的形态学观察及发酵时间等经验值，缺乏对发酵情况的有效评估质量标准，而以发酵产物甘露聚糖肽，含量作为质量标准是一种可行的方案。甘露聚糖肽可以分解为碱性多肽和甘露聚糖两部分，甘露聚糖肽经水解后测得含甘露糖含量为87.7-90.3％，根据甘露聚糖的特性可对发酵产物进行检测以表征甘露聚糖肽的含量。冯锁民利用Molisch反应使甘露糖与α-萘酚显色形成橙红色物，在490nm处检测甘露糖吸收度表征产物含量，但是培养基中添加的其他还原糖也会与α-萘酚发生显色反应，从而干扰测定结果。张运涛建立了紫外分光法直接测定啤酒酵母中甘露糖含量的方法。甘露糖在90％H2SO4溶液中脱水生成5-羟甲基-2-呋喃醛，添加NaCl-H3BO3，使5-羟甲基-2-呋喃醛转化为5-氯甲基-2-呋喃醛，此转化量与甘露糖的量呈线性关系，测定前后两次在280nm处的吸光值之差，得出甘露糖含量。

[0004] 然而，发酵液成分较复杂，可能含有其他有紫外吸收的物质对甘露糖的含量测定有干扰，有很大局限性，不能准确反应甘露聚糖的含量。为此，本发明通过先对发酵液进行粗提纯，甘露聚糖的酸解，衍生化及气相色谱(GC)分离-氢火焰离子鉴定器(FID)检测发酵液中甘露糖单体含量，排除其他单糖因素的干扰，表征产物甘露聚糖肽的含量，为发酵过程的实时监控提供有据可依的数据。

发明内容

[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种准确可靠、较简便且有应用价值的测定甘露聚糖肽中甘露糖含量的方法，是对甘露聚糖肽进行酸解获得甘露糖单体，再将甘露糖单体进行衍生化，利用气相色谱检测甘露糖含量，进而表征甘露聚糖肽的含量。

[0006] 所述甘露聚糖肽的含量(％)＝甘露糖含量(％)/甘露聚糖肽中甘露糖含量(％)，所述百分比为质量百分比。

[0007] 所述酸解是将甘露聚糖肽用1-2M H2SO4于105℃进行酸解反应，1M与2M H2SO4可以达到同样的水解效果，反应结束后加入肌醇内标、混匀，用BaCO3分次加入中和，振荡、离心取上清液，进行冷冻干燥。所述甘露聚糖肽经过粗纯化，去除分子量小于10KD及大于100KD的杂质。

[0008] 所述甘露糖单体的衍生化，是称取10mg盐酸羟胺溶于0.5mL吡啶中，再将甘露聚糖肽酸解产物的冻干物加入到盐酸羟胺溶液中，充分溶解，90℃水浴30min，冷却至室温，加入0.5mL乙酸酐，90℃水浴30min。

[0009] 所述气相色谱检测甘露糖含量的条件是：

[0010] 色谱柱：OV1701石英毛细管柱，30m，I.D.0.53mm；

[0011] 检测器：FID(氢火焰离子鉴定器)；

[0012] 气化室温度：260℃，检测器温度：250℃；

[0013] 柱温：程序升温：起始温度120℃，保持3min，每分钟升10℃，至195℃，保留0.1min，每分钟升3℃，至240℃，保留10min；

[0014] 载气压力(N2)：0.60kg/cm2；

[0015] 燃气压力(H2)：0.65kg/cm2；

[0016] 助燃气压力(空气)：0.50kg/cm2；

[0017] 分流比为30∶1。

[0018] 所述方法应用于测定发酵液中甘露聚糖肽中甘露糖含量的步骤为：

[0019] (1)对发酵液进行粗提纯，利用10KD与100KD的超滤管对发酵液进行分子截留，去除小分子及大分子杂质，实现对甘露聚糖肽的粗提纯；

[0020] (2)对甘露聚糖肽进行酸解，获得甘露糖单体；

[0021] (3)将甘露糖单体衍生化，进行气相色谱检测，得出甘露糖含量，表征甘露聚糖肽的含量。

[0022] 所述方法应用于测定发酵液中甘露聚糖肽中甘露糖含量的具体步骤为：

[0023] (1)发酵产物的粗提纯：

[0024] 量取发酵液20-30mL于50mL离心管中，10000rpm离心20min，去沉淀取上清液，转至100KD超滤管，5000g离心20min，收集流出液，再加5mL去离子水至100KD超滤管，5000g离心20min，重复一次，合并流出液。将流出液转移至10KD超滤管中，7500g离心20min，截留液转移至新离心管，用去离子水多次冲洗10KD超滤管，合并截留液，将截留液进行冷冻干燥。

[0025] (2)甘露聚糖肽的酸解：

[0026] 称取20mg冻干物于15mL离心管中，加2mL 1-2M H2SO4于105℃反应8h(用保鲜膜封口，膜上戳少许小孔)，反应后每管添加1mL 1mg/mL的肌醇内标，混匀，称取2g BaCO3分两次加入中和，振荡，12000rpm离心20min，取上清液于新1.5mL离心管中，进行冷冻干燥。

[0027] (3)酸解样品的衍生化：

[0028] 称取10mg盐酸羟胺溶于0.5mL吡啶中，再将冻干物加入到盐酸羟胺溶液中，充分溶解，90℃水浴30min，冷却至室温，加入0.5mL乙酸酐，90℃水浴30min，冷却后进行气相色谱分析。

[0029] (4)气相色谱条件：

[0030] 色谱柱：OV1701石英毛细管柱，30m，I.D.0.53mm；

[0031] 检测器：FID(氢火焰离子鉴定器)；

[0032] 气化室温度：260℃，检测器温度：250℃；

[0033] 柱温；程序升温：起始温度120℃，保持3min，每分钟升10℃，至195℃，保留0.1min。每分钟升3℃，至240℃，保留10min；

[0034] 载气压力(N2)：0.60kg/cm2；

[0035] 燃气压力(H2)：0.65kg/cm2；

[0036] 助燃气压力(空气)：0.50kg/cm2；

[0037] 分流比：30∶1。

[0038] (5)单糖结果分析：

[0039] 单糖组分比例以肌醇为内标，以内标法测定出甘露糖含量，甘露聚糖肽的含量(％)＝甘露糖含量(％)/甘露聚糖肽中甘露糖含量(％)。

[0040] 所述方法应用于测定甘露聚糖肽精制产品中甘露聚糖肽中甘露糖含量时，不需要进行纯化，其他步骤与测定发酵液中甘露聚糖肽中甘露糖含量的具体步骤相同。

[0041] 目前其他测定甘露聚糖肽中甘露糖含量的方法，都会存在诸如杂单糖等的干扰因素，从而得不到准确的检测结果。本发明通过先对发酵液进行粗提纯、甘露聚糖的酸解、衍生化及气相色谱(GC)分离-氢火焰离子鉴定器(FID)检测发酵液中甘露糖单体含量，根据甘露聚糖肽中甘露糖的含量表征产物甘露聚糖肽的含量，排除了其他杂质，尤其是其他单糖的干扰，为发酵过程的实时监控提供有据可依的数据，并且适用于其他发酵过程中糖复合物中单糖组分含量的测定，具有显著地技术进步。

附图说明

[0042] 图1：六种单糖标样气相色谱峰

[0043] 图2：甘露聚糖肽精制样品(140401)通过气相色谱测甘露糖含量

[0044] 图3：甘露聚糖肽精制样品(140501)通过气相色谱测甘露糖含量

[0045] 图4：48h的发酵粗提液通过气相色谱测甘露糖含量

[0046] 图5：60h的发酵粗提液通过气相色谱测甘露糖含量

具体实施方式

[0047] 下面结合精制的甘露聚糖肽产品对本发明做进一步说明。

[0048] 实施例1测定精制甘露聚糖肽样品中甘露糖的含量

[0049] 样品：两批次的精制甘露聚糖肽样品均由成都利尔药业有限公司提供，成都利尔药业有限公司将发酵液经过多步分离纯化得到的甘露聚糖肽样品作为精制甘露聚糖肽样品。

[0050] 试剂：浓硫酸、NaOH、乙醇、BaCO3、肌醇、盐酸羟胺、吡啶、乙酸购自国药集团化学试剂有限公司。

[0051] (1)精制甘露聚糖肽样品的酸解

[0052] 称取20mg甘露聚糖肽样品于15mL离心管中，加2mL 1-2M H2SO4于105℃反应8hr(用保鲜膜封口，膜上戳少许小孔)，反应后每管添加1mL 1mg/mL的肌醇内标，混匀，称取2g BaCO3分两次加入中和，振荡，12000rpm离心20min，取上清液于新1.5mL离心管中，进行冷冻干燥。

[0053] (2)酸解样品的衍生化

[0054] 称取10mg盐酸羟胺溶于0.5mL吡啶中，再将冻干物加入到盐酸羟胺溶液中，充分溶解，90℃水浴30min，冷却至室温，加入0.5mL乙酸酐，90℃水浴30min，冷却后进行气相色谱分析。

[0055] (3)高效液相色谱分析

[0056] 色谱柱：OV1701石英毛细管柱，30m，I.D.0.53mm；检测器：FID(氢火焰离子鉴定器)；气化室温度：260℃，检测器温度：250℃；柱温，程序升温：起始温度120℃，保持3min，每分钟升10℃，至195℃，保留0.1min。每分钟升3℃，至240℃，保留10min；载气压力(N2)：2 2 2
0.60kg/cm，燃气压力(H2)：0.65kg/cm，助燃气压力(空气)：0.50kg/cm，分流比：30∶1[0057] (4)单糖结果分析

[0058] 单糖组分比例以肌醇为内标，以内标法定出各单糖含量。

[0059] 某单糖含量(％)＝(Ai/AIi)×(AIs/As)×(Ws/WIs)×(WIi/W)×100

[0060] 式中：Ai表示某单糖样品峰面积，

[0061] AIi表示样品中加入的肌醇内标峰面积，

[0062] AIs表示标样中加入的肌醇内标峰面积，

[0063] As表示某单糖标样峰面积，

[0064] Ws表示某单糖标样的质量mg，

[0065] WIs表示标样中加入的肌醇内标的质量mg，

[0066] WIi表示样品中加入的肌醇内标的质量mg，

[0067] W表示称取糖样品的质量mg。

[0068] 其中，六种单糖标样气相色谱信息如下表：

[0069] 表1：六种六碳糖标样的气相色谱信息

[0070]

[0071] 样品(140401)进行气相色谱分析，获得信息如下：

[0072] 表2：甘露聚糖肽精制样品(140401)气相色谱信息

[0073]峰 保留时间 峰面积 峰高 峰面积比例％
1 22.222 6458514.8 658630.7 81.8039
2 23.070 745706.4 73315.8 9.4452
3 23.728 36150.7 3242.9 0.4579
4 25.695 654749.9 60903.9 8.2931

[0074] 根据公式，算出其中甘露糖含量为：47.7％。

[0075] 样品(140501)进行气相色谱分析，获得信息如下：

[0076] 表3：甘露聚糖肽精制样品(100603)气相色谱信息

[0077]峰 保留时间 峰面积 峰高 峰面积比例％
1 22.229 7464023.4 732459.2 87.4106
2 23.058 392058.7 37477.7 4.5914
3 23.720 44850.3 4195.6 0.5252
4 25.688 638107.7 60522.2 7.4728

[0078] 根据公式，算出其中甘露糖含量为：56.6％。

[0079] 在气相色谱图中可以看到，甘露糖色谱峰与其他单糖色谱峰明显分开，据此可以排除其他单糖在测定过程中的影响。例如葡萄糖，其作为培养基中的主要碳源，在对甘露聚糖肽中甘露糖含量测定的其他方法中(例如Molisch反应)，会对结果造成很大干扰，所以本方法可以准确并专一性的分析甘露糖含量，表征甘露聚糖肽含量，为发酵过程的实时控制提供可靠数字化的数据支持。应用本文方法分别测定甘露糖精制样品(140401)及(140501)中甘露聚糖肽中甘露糖含量为47.7％与56.6％，而且每批精制样品中甘露糖含量基本相同，也说明该方法较可靠，重复性高。

[0080] 实施例2测定发酵液粗提液中甘露聚糖肽中甘露糖的含量

[0081] 样品：以溶血性链球菌为菌种发酵产甘露聚糖肽，将0.5％葡萄糖、0.5％NaCl、0.6％蛋白胨、0.2％胰蛋白胨、0.5％牛肉膏与0.3％酵母膏，调pH为7.2-7.6作为培养基，将不同发酵时间点的发酵液经过简单的纯化过程得到粗提发酵液，利用本发明的方法进行分析。

[0082] 试剂：浓硫酸、NaOH、乙醇、BaCO3、肌醇、盐酸羟胺、吡啶、乙酸购自国药集团化学试剂有限公司；100KD、10KD超滤管，Millipore公司。

[0083] (1)发酵产物的粗提纯：

[0084] 量取发酵液30mL于50mL离心管中，10000rpm离心20min，去沉淀取上清液，转至100KD超滤管，5000g离心20min，收集流出液，再加5mL去离子水至100KD超滤管，5000g离心20min，重复一次，合并流出液。流出液转移至10KD超滤管中，7500g离心20min，截留液转移至新离心管，用去离子水多次冲洗10KD超滤管，合并截留液，将截留液进行冷冻干燥。

[0085] (2)粗提样品的酸解

[0086] 称取20mg甘露聚糖肽样品于15mL离心管中，加2mL 1-2M H2SO4于105℃反应8hr(用保鲜膜封口，膜上戳少许小孔)，反应后每管添加1mL 1mg/mL的肌醇内标，混匀，称取2g BaCO3分两次加入中和，振荡，12000rpm离心20min，取上清液于新1.5mL离心管中，进行冷冻干燥。

[0087] (3)酸解样品的衍生化

[0088] 称取10mg盐酸羟胺溶于0.5mL吡啶中，再将冻干物加入到盐酸羟胺溶液中，充分溶解，90℃水浴30min，冷却至室温，加入0.5mL乙酸酐，90℃水浴30min，冷却后进行气相色谱分析。

[0089] (4)高效液相色谱分析

[0090] 色谱柱：OV1701石英毛细管柱，30m，I.D.0.53mm；检测器：FID(氢火焰离子鉴定器)；气化室温度：260℃，检测器温度：250℃；柱温，程序升温：起始温度120℃，保持3min，每分钟升10℃，至195℃，保留0.1min。每分钟升3℃，至240℃，保留10min；载气压力(N2)：2 2 2
0.60kg/cm，燃气压力(H2)：0.65kg/cm，助燃气压力(空气)：0.50kg/cm，分流比：30∶1[0091] (5)单糖结果分析

[0092] 单糖组分比例以肌醇为内标，以内标法定出各单糖含量。

[0093] 某单糖含量(％)＝(Ai/AIi)×(AIs/As)×(Ws/WIs)×(WIi/W)×100

[0094] 发酵48h的粗提液进行气相色谱分析，获得信息如下：

[0095] 表4：发酵48h的粗提液气相色谱信息

[0096]峰 保留时间 峰面积 峰高 峰面积比例％
1 22.254 432444.8 43951.5 10.1684
2 23.152 653414.4 63212.6 15.3642
3 23.800 37517.2 3528.2 0.8822
4 25.818 3129450.6 293155.7 73.5852

[0097] 根据公式，算出其中甘露糖含量为：0.71％。

[0098] 发酵60h的粗提液进行气相色谱分析，获得信息如下：

[0099] 表5：发酵60h的粗提液气相色谱信息

[0100]峰 保留时间 峰面积 峰高 峰面积比例％
1 22.255 616683.8 62928.6 21.4044
2 23.147 506335.2 49280.5 17.5743
3 23.797 49188.5 4769.7 1.7073
4 25.796 1708899.4 160371.9 59.3140

[0101] 根据公式，算出其中甘露糖含量为：1.86％。

[0102] 从气相色谱得出的数据中，可知，发酵60h的发酵粗提液中甘露糖含量要比发酵48h粗提液中多两倍左右，可以看出随着发酵时间的延长，发酵液中的甘露聚糖肽有所积累。而粗提发酵液中甘露糖含量要比精制发酵液中低，是由于精制样品中除去了发酵液中大部分的杂质，而粗提发酵液只是简单的进行了分子截留，并没有进行精制，目的在于更简单快速的获得发酵液中的甘露糖含量，为发酵过程的实时控制提供可靠方法。

[0103] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。