绿原酸在制备治疗室管膜瘤的药物中的用途

摘要

本发明提供了绿原酸在制备治疗室管膜瘤的药物中的用途。本发明绿原酸具有抑制室管膜瘤的功效，并能抑制脑肿瘤干细胞的生长，能替代部分放化疗，减轻患者可以因放化疗引起的不适反应，是治疗室管膜瘤新的药物治疗手段和选择。

权利要求

1.绿原酸作为唯一活性成分在制备治疗室管膜瘤的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的药物是对移植性脑胶质瘤抑制作用的药物。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的药物是对C6胶质瘤细胞有生长抑制作用的药物。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的药物是对C6胶质瘤干细胞有生长抑制作用的药物。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的用途，其特征在于：所述的药物是以有效量的绿原酸为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述的药物制剂中每制剂单位含有绿原酸

1～3000mg。

7.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述的药物制剂中绿原酸的使用剂量为

10-40mg/kg。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述的药物制剂中绿原酸的使用剂量为

20mg/kg。

9.根据权利要求6-8任意一项所述的用途，其特征在于：所述的药剂是口服制剂或者注射剂。

说明书

绿原酸在制备治疗室管膜瘤的药物中的用途

技术领域

[0001] 本发明涉及绿原酸在制备治疗室管膜瘤的药物中的用途。

背景技术

[0002] 近年来，癌症的死亡率已跃居国内各种死因之首。可能与抽烟、人口老龄化、工业化的进程等有关。传统的生活贫困地区常见肿瘤如食管癌、胃癌、肝癌等发病率仍居高不下，而富裕国家的肺癌、乳腺癌、结肠癌等多发肿瘤却已快速增长。最新调查显示，发达国家脑肿瘤的发病率不断上升，该病还表现出明显的低龄化趋势，逐渐逼近40岁以下青年人，且成为威胁儿童健康的重要肿瘤之一。据美国统计，在20-40岁人群肿瘤死亡病因中，脑肿瘤在男性是第一位的死亡病因，在女性排第五位，可见脑肿瘤对社会的危害之大。目前，脑肿瘤仍是病死率最高的成人肿瘤之一，同时也是儿童发病率最高的实体瘤。

[0003] 神经胶质瘤亦称胶质细胞瘤，为中枢神经系统常见的一种恶性肿瘤，来源于神经上皮占全部颅内肿瘤的40％～50％，具有高发病率、高复发率、高病死率和低治愈率的特点。根据胶质瘤细胞的分化情况分为星形细胞瘤、少突胶质瘤、室管膜瘤等，其生长特点为浸润性生长，与正常脑组织无明显界限，多数不限于一个脑叶，向脑组织外呈指状深入破坏脑组织。目前脑胶质瘤的主要治疗措施是手术切除，但术后5年存活率很低，对放疗和化疗都不敏感，因此，急需开发治疗胶质瘤的生物药物。

[0004] 脑肿瘤分类的方法很多，目前尚无统一的分类方法，并且各种肿瘤的组织发生与病理特征不同，其良性与恶性以及物学特性也不一样。而星形细胞瘤和少突胶质瘤、室管膜瘤在多方面都存在差异，具体差异如下：

[0005] 1.星形细胞瘤是指由星形胶质细胞所组成的胶质瘤的一种，是神经系统最常见的难治性肿瘤，约占颅内肿瘤的13％～26％，占神经上皮肿瘤的21.2％～51.6％。其中胶质瘤胶质母细胞瘤为成人最常见的原发性脑肿瘤，其患者的中位生存期仅有15个月左右。胶质膜细胞瘤呈现浸润性生长，可向正常脑组织广泛浸润，导致手术切除困难；其次，胶质母细胞瘤对常规的放、化疗具有抵抗性，成为其致死率高和复发率高的重要原因。由于尚未完全阐明其发病机制，目前缺乏针对脑胶质母细胞瘤的有效治疗方法。星形胶质细胞瘤与少突胶质细胞瘤在RTN4的表达量存在差异，在少突胶质细胞瘤中，RTN4A表达明显高于星形胶质细胞瘤，用以鉴别少突胶质细胞瘤的特异性和灵敏度。

[0006] 2.少突胶质肿瘤是一种较少见的神经上皮性肿瘤，少突胶质瘤多发于成年人，平均发病年龄为40岁左右。过去因检查技术及病理诊断水平的限制，常被漏诊或误诊为其他类型胶质瘤，以往文献认为少突胶质肿瘤占颅内原发性肿瘤的2％～5％，占脑胶质瘤的2％～12％，但近年来随着临床研究不断深入以及病理诊断水平不断提高，少突胶质肿瘤检出率明显增加，有文献报道少突胶质肿瘤约占颅内胶质瘤的33％。少突胶质细胞瘤是颅内起源于少突胶质细胞的肿瘤，是胶质瘤的一种独立类型，约占颅内肿瘤的4.39％。近些年来，少突胶质细胞瘤的分子遗传学研究有了较大的进展，少突胶质细胞瘤最常见的遗传学改变是19号染色体长臂的杂合性缺失，第二个常见的遗传改变是1号染色体短臂的杂合性缺失。根据2007年世界卫生组织(WHO)最新分级病理分类，将少突胶质肿瘤分为单纯型少突胶质细胞瘤和混合型少突星形细胞瘤，前者又可分为低级别少突胶质细胞瘤(Ⅱ级)、高级别少突胶质细胞瘤(Ⅲ级)和多形性恶性胶质瘤(Ⅳ级)；后者分为少突星形细胞瘤(Ⅱ级)、间变型少突星形细胞瘤(Ⅲ级)。近年研究表明，低级别的少突胶质肿瘤对化疗较敏感，且不同级别的少突胶质肿瘤其临床转归及预后有明显差异。

[0007] 3.室管膜瘤来源于脑室与脊髓中央管的室管膜细胞或脑内白质室管膜细胞巢的中枢神经系统肿瘤。在胶质瘤中占18.2％，男多于女，多见于儿童及青年，约75％位于幕下，幕上仅占25％。肿瘤大多位于脑室内，少数瘤主体在脑组织内。室管膜瘤是一种起源于室管膜上皮细胞的神经上皮性肿瘤，可发生于颅内及椎管内，并可沿蛛网膜下腔播散，目前还难以完全治愈。不同病理类型的胶质瘤各有其高发年龄，室管膜瘤的高发年龄在10岁以前。国外统计96％的脊髓室管膜瘤发生在成人，发病年龄多为35～45岁,是成人最常见的脊髓肿瘤，大约占所有中枢神经系统室管膜瘤的34.5％，占髓内肿瘤的60％，占成人室管膜瘤的75％。研究发现，在室管膜瘤中，50％以上有22号染色体片段的丢失，并且发现SV40基因与室管膜瘤的关系较为密切。WHO2000年最新分类将室管膜肿瘤分为：(1)室管膜瘤:又分类4个亚型①细胞型；②乳头型；③透明细胞型；④脑室膜细胞型。(2)间变或恶性室管膜瘤：肿瘤细胞致密成片，细胞及核形态各异，并可见核分裂相及灶性坏死。(3)粘液乳头型室管膜瘤：肿瘤细胞乳头状排列，围绕乳头状结构中心的结缔组织常有粘液样变。(4)室管膜下瘤：
构成肿瘤的主要细胞是室管膜下胶质细胞，可见假菊形团样排列。有时可见少量室管膜细胞以及室管膜母细胞分布于胶质纤维间。室管膜肿瘤是对化疗不敏感的肿瘤，临床试验中，各种化疗药的单独使用或联合使用收效甚微。

[0008] 神经胶质瘤的治疗以手术为主，但由于其分化差、增殖快、侵袭性强，目前的手术方式还无法完全切除肿瘤，一般都主张综合治疗。手术后放疗和化疗是普遍接受的治疗方法，然而肿瘤细胞对放疗的辐射耐受性可能造成残余病灶再次复发。此外，脑肿瘤对化疗均不太敏感，原因之一是只有少数药物可以通过血脑屏障。由于血脑屏障、肿瘤组织内及周边水肿脑组织间隙静水压较高等因素导致肿瘤内化疗药物的有效浓度较低。另外，肿瘤耐药性的产生、全身用药的不良反应等因素均对化疗的治疗效果造成影响。为了提高胶质瘤的治疗效果，人们从胶质瘤的分子发病机制到新的临床治疗手段做了大量的工作。

[0009] 绿原酸广泛存在于各种药用植物，如金银花中，目前对它的化学结构研究已经清楚，已有人对其进行药用研究，报道了绿原酸可以应用于治疗肿瘤等疾病。目前报道的关于绿原酸用于治疗胶质母细胞瘤的文献主要是从作用机制来阐述，如文献：The chemopreventive properties of chlorogenic acid reveal a potential new role for the microsomal glucose-6-phosphate translocase in brain tumor progression(绿原酸的化学预防特性揭示了其在脑肿瘤进展中对葡萄糖-6-磷酸转移酶的新作用)，报道了脑胶质瘤细胞株(U87)中的葡萄糖-6-磷酸转移酶(G6PT)可调节细胞内信号通路，呈高表达状态，与肿瘤细胞的浸润性密切相关；绿原酸能对抗G6PT诱导的U87细胞迁移，绿原酸能明显抑制神经鞘氨醇(SIP)诱导的U87细胞迁移。证实绿原酸通过抑制基质金属蛋白转移酶和葡萄糖-6-磷酸转移酶活性，达到抑制肿瘤转移的效果。文献：Inhibition of MMP-2secretion from brain tumor cells suggests chemopreventive properties of a furanocoumarin glycoside and of chalcones isolated from the twigs of Dorstenia turbinata(呋喃香豆素苷和查耳酮类在脑肿瘤细胞中具有抑制MMP-2的分泌活性)》，报道了绿原酸作为基质金属蛋白转移酶的抑制剂可以抑制MMP-2的分泌，达到抑制脑肿瘤中胶质母细胞瘤细胞的转移。绿原酸是G6PT抑制剂。间接说明绿原酸的抗脑肿瘤作用。
但是文献所阐述的G6PT为广义的致癌物质，涉及的脑肿瘤也是一个广义概念，不能说明绿原酸对脑肿瘤的直接作用。王乐，从元宝枫叶中提取、分离纯化绿原酸的工艺研究，西北大学，硕士学位论文20100401，报道了绿原酸抗癌抗衰老作用，其中公开了绿原酸可抑制神经胶质瘤的迁移以及人Hep3B肝癌细胞中的金属硫蛋白(MMP)分泌，对大肠癌、肝癌和喉癌均有显著疗效，被认为是癌症的有效防护剂。

[0010] 综上所述，现有文献均披露的绿原酸对脑肿瘤的作用一方面局限于星形细胞瘤中的胶质母细胞瘤(作用机制方面阐述)，没有绿原酸治疗脑胶质母细胞瘤的体内药效试验证明，没有绿原酸治疗室管膜瘤的相关报道，也没有绿原酸关于有抑制脑胶质瘤干细胞作用的相关报道。

发明内容

[0011] 本发明的技术方案是提供了绿原酸的新用途。

[0012] 本发明绿原酸在制备治疗室管膜瘤的药物中的用途。

[0013] 其中，所述的药物是对移植性脑胶质瘤抑制作用的药物。

[0014] 其中，所述的药物是对C6胶质瘤细胞有生长抑制作用的药物。

[0015] 其中，所述的药物是对C6胶质瘤干细胞有生长抑制作用的药物。

[0016] 其中，所述的药物是以有效量的绿原酸为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

[0017] 其中，所述的药物制剂中每制剂单位含有绿原酸1～3000mg。

[0018] 进一步地，所述的药物制剂中绿原酸的使用剂量为10-40mg/kg。

[0019] 更进一步优选地，所述的药物制剂中绿原酸的使用剂量为20mg/kg。

[0020] 其中，所述的药剂是口服制剂或者注射剂。

[0021] 虽然文献报道了绿原酸在体外实验中可对抗重组体G6PT蛋白的过分表达所诱发的U-87胶质母细胞瘤的转移，仅仅说明了绿原酸在脑肿瘤进展中对葡萄糖-6-磷酸转移酶的作用，没有直接证明绿原酸具有抗U-87胶质母细胞瘤的作用；且绿原酸抑制U-87人胶质母细胞瘤的转移，是属于胶质母细胞瘤，但胶质母细胞瘤和少突胶质细胞瘤、室管膜瘤是胶质瘤的不同类型，是不同的适应症。因此，不能推之绿原酸具有抑制少突胶质细胞瘤和室管膜瘤的功效。

[0022] 胶质母细胞瘤和少突胶质细胞瘤、室管膜瘤在病因学、组织病理学和临床方面有着明显的不同。室管膜瘤是一种起源于室管膜上皮细胞的神经上皮性肿瘤，可发生于颅内及椎管内，并可沿蛛网膜下腔播散，目前还难以完全治愈。国外统计96％的脊髓室管膜瘤发生在成人，发病年龄多为35～45岁,是成人最常见的脊髓肿瘤，大约占所有中枢神经系统室管膜瘤的34.5％，占髓内肿瘤的60％，占成人室管膜瘤的75％。WHO2000年最新分类将室管膜肿瘤分为：(1)室管膜瘤:又分类4个亚型①细胞型；②乳头型；③透明细胞型；④脑室膜细胞型。(2)间变或恶性室管膜瘤：肿瘤细胞致密成片，细胞及核形态各异，并可见核分裂相及灶性坏死。(3)粘液乳头型室管膜瘤：肿瘤细胞乳头状排列，围绕乳头状结构中心的结缔组织常有粘液样变。(4)室管膜下瘤：构成肿瘤的主要细胞是室管膜下胶质细胞，可见假菊形团样排列。有时可见少量室管膜细胞以及室管膜母细胞分布于胶质纤维间。目前对于没有脑脊液播散的室管膜瘤的治疗方式为手术尽可能全切并在术后辅以局部放射治疗可以提供最佳的治疗效，但是无论是传统联合化疗还是大剂量化疗似乎都不能改善预后,尽管部分试验显示肿瘤对化疗敏感。

[0023] 少突胶质肿瘤是一种较少见的神经上皮性肿瘤，以往文献认为少突胶质肿瘤占颅内原发性肿瘤的2％～5％，占脑胶质瘤的2％～12％，但近年来随着临床研究不断深入以及病理诊断水平不断提高，少突胶质肿瘤检出率明显增加，有文献报道少突胶质肿瘤约占颅内胶质瘤的33％。根据2007年世界卫生组织(WHO)最新分级病理分类，将少突胶质肿瘤分为单纯型少突胶质细胞瘤和混合型少突星形细胞瘤，前者又可分为低级别少突胶质细胞瘤(Ⅱ级)、高级别少突胶质细胞瘤(Ⅲ级)和多形性恶性胶质瘤(Ⅳ级)；后者分为少突星形细胞瘤(Ⅱ级)、间变型少突星形细胞瘤(Ⅲ级)。近年研究表明，少突胶质肿瘤对化疗较敏感，且不同级别的少突胶质肿瘤其临床转归及预后有明显差异。

[0024] 本发明绿原酸具有抑制少突胶质细胞瘤的功效，并能抑制脑肿瘤干细胞的生长，能替代部分放化疗，减轻患者可以因放化疗引起的不适反应，是治疗室管膜瘤新的药物治疗手段和选择。

附图说明

[0025] 图1绿原酸对人脑室管膜瘤的剂量效应曲线

具体实施方式

[0026] 试验例1 绿原酸诱导人室管膜瘤细凋亡的实验研究

[0027] 1.材料

[0028] 细胞：人室管膜瘤细胞由四川大学华西医院卫生部移植工程和移植免疫重点实验室提供。

[0029] 药物与试剂：绿原酸，由四川九章生物科技有限公司提供；谷氨酸购于浙江天瑞化学有限公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)、0.25％胰蛋白酶、RPMI1640培养液及胎牛血清均购自美国Sigma公司。

[0030] 2.方法

[0031] 2.1人脑室管膜瘤细胞的原代培养

[0032] (1)原代培养

[0033] 将新鲜的人脑室管膜瘤瘤组织块用不含血清的RPMI1640培养液冲洗干净，去掉血3
污，剪切成1mm 大小的小块，再用无血清的培养液洗涤2～3次，至液体澄清。弃去培养液，加入5～10倍体积的0.25％胰蛋白酶，在37℃水浴中消化30min，100孔目钢网过滤，制备成肿瘤细胞悬液，移入离心管以1500～2000r/min离心10min后弃去上清。以不含小牛血清的培养液重悬沉淀，按同样的速度同样时间离心2次后去上清。以含10％小牛血清的RPMI1640培养液重悬细胞，CO2孵箱内37℃孵育。

[0034] (2)原代细胞的传代

[0035] 待细胞长满瓶底后，倒去旧培养液，用无血清的RPMI1640培养液洗1遍。加入0.25％的胰酶消化约5min，用含血清培养液终止消化。反复吹打，收集细胞，计数，按5×104个/cm2的密度接种于25cm2培养瓶中传代培养。

[0036] (3)人脑室管膜瘤细胞的形态学观察

[0037] 原代培养的细胞在倒置相差显微镜进行形态学观察。向培养细胞中加入含有5μmol/L Fluo-3/AM荧光探针和5μmol/L Pluronic F-127的1mL Hank’s液，37℃负载40min。用不含荧光探针的Hank’s液洗涤3次。负载好的细胞液在激光共聚焦扫描显微镜观察细胞的状态，与原手术病理检查结果进行对照，确认生长细胞为人脑室管膜瘤细胞。培养细胞再经胶质纤维酸性蛋白免疫组化检测确认。

[0038] (4)MTT法检测绿原酸对原代培养人脑室管膜瘤细胞增殖的抑制作用[0039] 细胞接种：取对数生长期细胞，0.25％胰蛋白酶消化，用基础培养基洗涤离心(1000rpm 5min两次)，用完全培养基悬浮细胞并调整细胞浓度为6×104/ml，接种细胞于96孔板内，每孔50μl(细胞数量6×103/孔)，每个药物浓度接种3个复孔，并设正常对照组(肿瘤细胞+完全培养基)和空白对照组(完全培养基)，每组3个复孔。

[0040] 加药：接种后次日细胞贴壁后按以下分组加药，绿原酸组，用完全培养基将6.4mg/ml绿原酸储存溶液配制成256μg/ml的溶液，然后用完全培养基按对倍稀释法逐步稀释，得含绿原酸256、128、64μg/ml的完全培养基，备用；取50μl上述含不同浓度绿原酸的完全培养基到已接种细胞的96孔板中，使绿原酸终浓度分别为128、64、32μg/ml，每个浓度3复孔。静置培养48小时；空白对照组，每孔不接种细胞，只加等量(100μl)完全培养基，设3个复孔作为空白对照。

[0041] 测定：加药后细胞培养48小时，在上述3个实验组和空白对照组孔内加入10μlWST-1溶液，置37℃细胞培养箱继续孵育4小时后，在μ-Quant微孔板测定仪上测定不同药物组、正常对照组和空白对照组440nm波长处的吸收值。

[0042] 数据处理：肿瘤细胞生长抑制率的计算：抑制率＝(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100％。实验重复3次。

[0043] 3.实验结果

[0044] 3.1绿原酸对人脑室管膜瘤的体外抑瘤作用

[0045] (1)细胞形态观察结果

[0046] 各组加药处理48小时后，在倒置显微镜下观察细胞形态，与正常对照组比较，绿原酸(32～128μg/ml)低浓度时即有细胞数量较正常细胞明显减少；有细胞碎片，产生凋亡。

[0047] (2)绿原酸对人脑室管膜瘤的抑制率和剂量效应曲线

[0048] 绿原酸对人脑室管膜瘤的抑制率见表1，剂量效应曲线见图1。

[0049] 表1 绿原酸对人脑室管膜瘤的抑制率

[0050]

[0051] 绿原酸在32、64和128μg/ml作用48h后对原代培养细胞的抑制率曲线如图1所示。随着绿原酸作用浓度的增加，室管膜瘤细胞受抑制作用越显著。可见,绿原酸对原代培养人脑室管膜瘤细胞的生长抑制呈明显的量效关系。

[0052] 4.结论

[0053] 绿原酸体外抑瘤实验证明，绿原酸对人患脑室管膜瘤有抑制作用。上述试验证明，本发明绿原酸对人脑室管膜瘤有抑制功效，能替代部分放化疗，减轻患者可以因放化疗引起的不适反应，是治疗人脑室管膜瘤的新手段。

[0054] 试验例2 绿原酸对移植性脑胶质瘤抑制作用的研究

[0055] 1.材料

[0056] 材料：人脑胶质瘤细胞株，由四川大学华西医院卫生部移植工程和移植免疫重点实验室提供。绿原酸，由四川九章生物科技有限公司提供。

[0057] 2.方法

[0058] (1)造模 50只小鼠随机分为5组，每组10只。将脑胶质母细胞瘤细胞株配比合适的稀释液，分别接种于5组小鼠左颞叶皮质内。

[0059] (2)给药干预 接种24h后，分别对5组小鼠进行腹腔注射给药。分别为绿原酸高(40mg/kg)、中(20mg/kg)、低(10mg/kg)剂量组，阳性对照组多西他赛5mg/kg，模型对照组给相同体积的生理盐水，连续给药15d。

[0060] (3)测抑瘤率 最后一日停止给药并且将所有小鼠处死，解剖小鼠,取肿瘤组织并且称重。抑制率＝(对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/瘤重对照组平均瘤重×100％。

[0061] (4)统计学方法 所有数据均采用均数±标准差 表示，数据分析采用统计程序软件包(SPSS 13.0for Windows)进行方差分析，以P＜0.05为差异有显著性。

[0062] 3.结果

[0063] 经过分析结果发现，给药组相对于空白组其抑瘤率有显著提升的态势，证明绿原酸有抗肿瘤生长之功效，其抑瘤效果以中剂量组最为明显，高剂量组次之，具体数据请见表2。

[0064] 表2 绿原酸对人脑胶质瘤小鼠瘤重及抑瘤率的影响

[0065]

[0066] 4.结论

[0067] 绿原酸体内抑瘤实验证明，绿原酸对人患脑胶质瘤有抑制作用。上述试验证明，本发明绿原酸对人脑胶质瘤有抑制功效，能替代部分放化疗，减轻患者可以因放化疗引起的不适反应，是治疗人脑胶质瘤的新手段。

[0068] 试验例3 绿原酸对C6胶质瘤干细胞作用的体外实验研究

[0069] 一、药物及主要试剂耗材

[0070] 1.绿原酸粉针剂，纯度99％，由四川九章生物科技有限公司提供，分子量354。

[0071] 2.主要仪器：超净工作台、CO2恒温恒湿培养箱、各种规格微量加样器、电热蒸馏水器、石英重蒸水器、培养器皿、光学显微镜、超低温冰箱、大小离心机、电热压力蒸汽灭菌器、恒温烤箱、流式细胞仪、微量电子天平等。

[0072] 3.细胞株：实验用C6大鼠胶质瘤细胞系，由四川大学华西医院卫生部移植工程和移植免疫重点实验室提供。

[0073] 二、试验步骤

[0074] (一)细胞复苏及接种

[0075] 1.细胞的复苏

[0076] (1)室内紫外消毒；培养基、PBS于37℃恒温水浴预热备用。

[0077] (2)佩戴防护眼镜和手套，从液氮罐中取出装有C6细胞的冻存管，迅速放入盛有36℃-37℃的搪瓷罐中，不时摇动，尽快解冻。

[0078] (3)剪开纱布口袋，取出安剖，用70％酒精擦拭消毒后，超净工作台上打开冻存管盖，用吸管吸出细胞悬液，装入离心管中，再补加预温的8ml含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液，吹打使细胞悬浮。

[0079] (4)低速离心(500-1000转/分)5分钟，取上清后再重复用PBS漂洗、离心。

[0080] (5)加入培养液适当稀释后，再移装入培养瓶中，置37℃、5％CO2温箱培养，记录复苏日期，次日更换一次培养液后再继续培养。

[0081] 2.细胞冻存

[0082] (1)准备细胞：选对数生长期C6胶质瘤细胞，收集前换液1次。0.25％胰酶消化细胞后吹打，制成单细胞悬液，密度达1×105/ml，800转/分钟，离心8分钟。

[0083] (2)制备冻存液：用培养液9份加二甲基亚砜(DMSO)1份制成10％DMSO冻存液。

[0084] (3)将冻存液缓缓加入离心管中的细胞沉淀中，用吸管轻轻吹打使细胞重悬。

[0085] (4)将细胞悬液分装入冻存管中，封口。

[0086] (5)冻存：将冻存管置于-4℃2小时，-20℃2小时，-80℃冰箱过夜，再投入液氮罐中保存。

[0087] 3.C6细胞的培养与传代

[0088] (1)严密观察细胞生长情况，待细胞铺满瓶底约80-90％时，予以传代。

[0089] (2)自37℃,5％CO2培养箱取出培养瓶。超净工作台中，将长成致密单层细胞的细胞瓶中原来的培养液弃去；

[0090] (3)加入0.25％胰酶溶液，视细胞瓶的大小加入体积为0.5ml或更多，以使细胞充分浸润，一般消化时间约为1至3分钟，肉眼观察瓶壁半透明的细胞层，当见到出现细针孔空隙时，弃去胰酶溶液，并加入适量的细胞培养液终止消化；

[0091] (4)低速离心(500-1000转/分)5分钟，弃上清，加入DMEM/F12培养液，轻柔吹打成细胞悬液，按1:3比例分装于75cm2底面积培养瓶中继续培养。

[0092] 4.C6细胞系中胶质瘤干细胞的培养与传代

[0093] (1)先将C6细胞接种于传统含血清培基中，在培养瓶中传代。待细胞处于对数生长期，用PBS液清洗，胰酶(0.25％)消化。自制巴斯德吸管机械吹打成单细胞，重悬于SFM，台盼蓝染色并计数。以1×105/孔接种于25cm2底面积培养瓶中，在37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱中培养。

[0094] (2)接种细胞于SFM后，根据C6GSC增殖的速度和C6GSC的大小，待培养基中悬浮的单克隆细胞团形状规则、体积较大后(一般4-5天)，在超净工作台内将细胞团连同培养基一起提出至试管内，弃瓶底贴壁细胞，吸取培养基并离心后弃去半量陈旧培基，以800rpm/min离心5min，弃上清。SFM重悬细胞，自制巴斯德尖嘴吸管反复轻轻吹打，使细胞团分解成单细胞，按1:2或者1:3的比例接种于25cm2底面积培养瓶，添加SFM至6ml；或以相同浓度接种于标准6孔板，每孔加SFM2.5ml，继续在37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱中培养。

[0095] 5.C6细胞系中胶质瘤干细胞的诱导分化

[0096] 在SFM中第三代C6GSC形成1d后，将C6GSC或吹散后的单细胞用D-Hanks液清洗，重悬于SSM，C6GSC按1×105/孔接种于6孔板。每日观察其分化和生长情况。

[0097] (二)MTT法检测绿原酸对C6胶质瘤和C6胶质瘤干细胞的体外抑瘤作用(本实验重复3次)

[0098] (1)取在含血清培养基和无血清培养基中呈对数生长期的细胞，胰酶消耗后制成单个细胞，肿瘤细胞仍接种于含血清培养基中，肿瘤干细胞接种于无血清干细胞培养基中，均调整细胞密度为2.0×l05/ml，将细胞接种于96孔板，每孔100μl，共5组，其中4组为实验组，1组为阴性对照；并设不含细胞的培养液为空白对照，每组设5个复孔。在37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱中培养，过夜。在接种于96孔板时，周边的培养孔弃去不用，以避免边缘效应。

[0099] (2)接种后次日细胞贴壁后按以下分组加药，静置培养48小时。用完全培养基将6.4mg/ml绿原酸储存溶液配制成256μg/ml的溶液，然后用完全培养基按对倍稀释法逐步稀释，得含绿原酸256、128、64和32μg/ml的完全培养基，备用；取50μl上述含不同浓度绿原酸的完全培养基到已接种细胞的96孔板中，使绿原酸终浓度分别为128、64、32和16μg/ml，每个浓度3复孔。

[0100] (3)同时设肿瘤细胞正常对照组孔，不加药物处理，只加等量(100μl)完全培养基，与上述3个组别同步实验。

[0101] (4)5％CO2，37℃继续孵育，48h后于倒置显微镜下观察并拍照。

[0102] (5)无菌操作台下，避光，每孔加入20μL0.5％MTT，继续培养4h，于37℃放置过夜(各组时间一致)后，用酶标仪测OD，440nm处测量各孔的吸光值。

[0103] (6)计算细胞生长抑制率

[0104] 公式：细胞生长抑制率IR(％)＝1-(实验组细胞OD值/对照组细胞OD值)×100％。

[0105] (三)统计学方法

[0106] 本实验结果用均数±标准差 表示，使用方差分析对结果进行分析。用SPSS13.O软件包完成数据的统计学分析。检验水准：P＜0.05为有统计学差异，P＜0.01为有显著统计学差异。

[0107] 三、试验结果

[0108] (一)细胞培养结果

[0109] 1.C6胶质瘤细胞的培养

[0110] 含血清培养基中，数小时后部分细胞呈贴壁生长，24h后即可观察到细胞核较大，胞浆丰富，细胞贴壁生长，伸出突起，48h后细胞长成突起且形成网状，即形成单层贴壁细胞层，第3d，贴壁细胞约覆盖培养板底部约80％。

[0111] 2.C6胶质瘤干细胞的培养

[0112] 选取对数生长期的C6细胞接种于无血清培养基中，24h后，细胞呈单个细胞均匀分布散在贴壁，有少许细胞聚集并开始产生悬浮于培养基中的球状细胞，48h后可观察到部分细胞长成细胞球样，类似神经干细胞球，细胞球悬浮生长，呈球形或卵圆形，大小不一，折光性强；其余细胞则沉淀于培养板底，呈单细胞生长。3d时数十个细胞呈球状悬浮生长可见球状细胞团，5d、7d时观察，细胞球进一步生长、增大。

[0113] 3.C6胶质瘤干细胞诱导分化后在含血清培养基中的培养

[0114] 把悬浮细胞球接种于10％含胎牛血清培养基中，24h时，细胞球开始出现贴壁现象长出突起，48h后细胞数量增多并形成小片状细胞岛，3d时细胞岛扩大与临近的细胞岛融合，细胞贴壁生长。7d时观察贴壁细胞生长良好，贴壁细胞约覆盖培养板底部约60％。

[0115] (二)绿原酸体外抑瘤率实验结果

[0116] MTT法测定不同浓度的绿原酸作用于两种细胞后，测OD值，计算细胞抑制率。结果显示随着绿原酸药物浓度的增加，各实验组对两种细胞的抑制率也依次增高。

[0117] 表3 绿原酸对C6胶质瘤细胞及C6胶质瘤干细胞作用的OD值及抑制率[0118]

[0119] 四、结论

[0120] 绿原酸对C6胶质瘤干细胞作用的体内实验证明，绿原酸对C6胶质瘤细胞和C6胶质瘤干细胞有生长抑制作用，对肿瘤干细胞的抑制作用较小。上述试验证明，本发明绿原酸对人脑胶质瘤有抑制功效，并且可以抑制脑肿瘤干细胞的生长，是治疗人脑胶质瘤的新手段。