啤酒花天然药物组合物的制备方法及用途

摘要

本发明公开了从桑科植物啤酒花中提取制备以黄腐酚、异黄腐酚、8-异戊烯基柚皮素、6-异戊烯基柚皮素、α-酸及β-酸为主要成分的组合物，首次经体外实验证明具有抑制脂肪酶的活性，该组合物具有在制备抑制脂肪酶作用的药物中的新用途。

权利要求

1.一种具有脂肪酶抑制作用的啤酒花天然药物组合物，其特征在于：由黄腐酚、异黄腐酚、8-异戊烯基柚皮素、6-异戊烯基柚皮素、α-酸及β-酸组成，其中黄腐酚占30％～70％、异黄腐酚占2％～10％、8-异戊烯基柚皮素占1％～5％、6-异戊烯基柚皮素占1％～5％、α-酸占10％～50％及β-酸占5％～25％；所述天然药物组合物的制备方法为：啤酒花利用65-

85％乙醇提取2-3次，每次1-3小时，滤过，合并滤液，直接通过处理好的大孔吸附树脂，先用

65-90％乙醇洗脱，收集流出液及乙醇洗脱液，备用；继用95％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩至稠膏，冷冻干燥，得组份Ⅰ；将上述流出液及乙醇洗脱液回收乙醇，浓缩至浓缩液中乙醇的含量为5-35％，再次通过已处理好的聚酰胺吸附树脂，先用5-35％乙醇洗脱再用50-85％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，冷冻干燥，得到组份Ⅱ；合并组份Ⅰ及组份Ⅱ，混匀，即得啤酒花天然药物组合物。

说明书

啤酒花天然药物组合物的制备方法及用途

技术领域

[0001] 本发明涉及以黄腐酚、异黄腐酚、8-异戊烯基柚皮素、6-异戊烯基柚皮素、α-酸及β-酸为主要成分的组合物的制备方法及新用途，具体的说，就是主要含有黄腐酚、异黄腐酚、8-异戊烯基柚皮素、6-异戊烯基柚皮素、α-酸及β-酸的啤酒花天然药物组合物具有抑制脂肪酶作用，本发明属于医药技术领域。

背景技术

[0002] 目前脂肪酶抑制剂的来源主要有化学合成、天然植物提取物和微生物代谢产物等。Gargonuri等人（1997年）发现化学合成的有机磷化合物对脂肪酶有明显的抑制作用，但这类脂肪酶抑制剂主要用于研究脂肪酶催化反应机理。脂肪酶抑制剂就是专门用来对付脂肪酶的降脂减肥药。在脂肪酶抑制剂的作用下，脂肪酶将失去部分的分解能力，因而大约有三分之一的脂肪没有被脂肪酶分解，随食渣一起被排出体外。脂肪酶抑制剂就是它能将人摄入的部分脂肪在进入体血液之前就排出了体外，这样可以从脂肪的源头控制脂肪在人体内的聚积。化学脂肪酶抑制药物主要为奥利司他，但是长期服用副作用较大。目前用于治疗肥胖的脂肪酶抑制剂主要来源于植物提取物和微生物发酵产物。

[0003] 啤酒花为桑科植物啤酒花 Humuluslupulus L.未成熟带花果穗。啤酒花味苦、性平，有健胃、消食、利尿、安神、止咳化痰之功效, 用于治疗食欲不振、腹胀、肺结核、胸膜炎、失眠、癔病、浮肿、膀胱炎等。啤酒花主要含有树脂类、黄酮类及多酚类成分。黄腐酚为主要且特殊化学成分，具有抗艾滋病毒、抗癌、抗氧化、抗炎、抗菌、抑制骨质增生、抑制甘油二酯酰基转移酶的活性及预防动脉硬化和糖尿病、雌激素作用，并且其食用安全（杨小兰，食品科学，2007）。啤酒花含有的α-酸及β-酸也是主要化学成分，具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化作用（马永花，时珍国医国药，2007）啤酒花中含有的黄腐酚对实验性小鼠血糖、甘油三酸酯、饮水量、白脂肪组织具有显著的降低作用，提示黄腐酚具有预防、治疗动脉样硬化和糖尿病的作用（杨小兰等，2007，食品科学）；刘玉梅报道了啤酒花中的苦味成分β-酸及六氢β-酸具有降血糖的作用（刘玉梅等，2009，食品科学）。

[0004] 本发明就是从天然植物啤酒花中提取分离得到以黄腐酚、异黄腐酚、8-异戊烯基柚皮素、6-异戊烯基柚皮素、α-酸及β-酸为主要成分的组合物具有脂肪酶抑制剂作用，长期服用无毒副作用，具有广阔的市场前景。

[0005] 本发明完成前未发现有关以黄腐酚、异黄腐酚、8-异戊烯基柚皮素、6-异戊烯基柚皮素、α-酸及β-酸为主要成分的组合物具有脂肪酶抑制剂作用的报道。

[0006] 本发明的特点在于啤酒花用乙醇提取后提取液不浓缩直接上大孔树脂柱，先分离得到α-酸及β-酸，然后经过聚酰胺树脂分离得到黄腐酚、异黄腐酚、8-异戊烯基柚皮素、6-异戊烯基柚皮素，操作简

[0007] 单，整个生产工艺仅用乙醇，不使用易燃易爆和有毒溶剂，生产工艺简单、生产周期短，安全、不污染环境，成本低，收率高，特别适合产业化大量生产。

发明内容

[0008] 本发明的目的是提供一种主要含有黄腐酚、异黄腐酚、8-异戊烯基柚皮素、6-异戊烯基柚皮素、α-酸及β-酸的啤酒花天然药物组合物(以下简称啤酒花组合物)，该组合物是首次从桑科植物啤酒花中所获得；首次经进一步体外实验研究证明了本发明组合物具有抑制脂肪酶的活性，该组合物具有在制备抑制脂肪酶作用的药物中的新用途，是本发明的一个主要创新点。

[0009] 本发明目的之二是提供了主要含有黄腐酚、异黄腐酚、8-异戊烯基柚皮素、6-异戊烯基柚皮素、α-酸及β-酸组合物提取分离方法，以往公开的提取啤酒花中有效成分的方法多是石油醚脱脂和除叶绿素等脂溶性杂质或仅限于实验室的分离，不适合产业化生产。或以二氧化碳萃取脱脂，乙醇提取，提取液经高效液相分离或硅胶柱分离或硅藻土分离，这些分离方法提取的成分主要以黄腐酚为主。本发明组合物主要包括黄酮类成分及酸性成分，具有本质的区别及明显的技术进步。本发明采用了乙醇提取，大孔树脂及聚酰胺柱层析的方法纯化含有黄腐酚、异黄腐酚、8-异戊烯基柚皮素、6-异戊烯基柚皮素、α-酸及β-酸组合物，可操作性强，适合工业生产。本发明首次采用了乙醇提取啤酒花的提取液不经过浓缩，直接在大孔树脂柱上吸附纯化，解决了乙醇提取液浓缩后部分有效成分与脂溶性物质一起析出，药液混浊，不利于在大孔树脂柱上吸附纯化的问题。也是本发明的创新点之一。

[0010] 本发明有益效果在于利用酿酒的原料啤酒花，采用现代提取手段，制备得到本组合物，组合物主要包括黄酮类成分及酸类成分，具有成分清楚，化学组成具有特色，长期服用无任何毒副作用。

[0011] 本发明的另一目的是提供一种从啤酒花中提取的组合物的制备方法，其特征在于：啤酒花利用65-85%乙醇提取2-3次，每次1-3小时，滤过，合并滤液，直接通过处理好的大孔吸附树脂，先用65-90%乙醇洗脱，收集流出液及乙醇洗脱液，备用；继用95%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩至稠膏，冷冻干燥，得组份Ⅰ；将上述流出液及乙醇洗脱液回收乙醇，浓缩至浓缩液中乙醇的含量为5-35%，再次通过以处理好的聚酰胺吸附树脂，先用5-35%乙醇洗脱再用50-85%乙醇洗脱液，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，冷冻干燥，得到组份Ⅱ；合并组份Ⅰ及组份Ⅱ，混匀，即得啤酒花天然药物组合物。

[0012] 优选提取方法：啤酒花利用8倍量85%乙醇在60℃条件下提取2次，每次2小时，滤过，合并滤液，直接通过处理好的AB-8大孔吸附树脂，先用85%乙醇洗脱3倍柱体积，收集流出液及乙醇洗脱液，备用；继用95%乙醇洗脱4倍柱体积，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩至稠膏，冷冻干燥，得组份Ⅰ；将上述流出液及乙醇洗脱液回收乙醇，浓缩至浓缩液中乙醇的含量为25%，再次通过以处理好的聚酰胺吸附树脂，先用25%乙醇洗脱4倍柱体积，再用70%乙醇洗脱液4倍柱体积，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，冷冻干燥，得到组份Ⅱ；合并组份Ⅰ及组份Ⅱ，混匀，即得啤酒花天然药物组合物。

[0013] 并且本发明还公开了此组合物主要组成成分，主要由黄腐酚、异黄腐酚、8-异戊烯基柚皮素、6-异戊烯基柚皮素、α-酸及β-酸组成。按重量百分比计，各化合物占百分比为：黄腐酚30%~70%、异黄腐酚2%~10%、8-异戊烯基柚皮素1%~5%、6-异戊烯基柚皮素1%~5%、α-酸10%~50%及β-酸5%~25%。

[0014] 为了实现以上技术方案，α-酸、β-酸及黄腐酚、异黄腐酚、8-异戊烯基柚皮素、6-异戊烯基柚皮素的含量通过以下方法测定：

[0015] 1、α-酸、β-酸利用高效液相色谱法测定：

[0016] 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇－0.05%磷酸溶液（85：15）为流动相；检测波长为313nm，柱温：室温，流速：1.0ml/min，进样量：10μl。

[0017] 对照品溶液的制备 精密称取α-酸邻苯二胺盐、β-酸对照品，置容量瓶中，用甲醇溶解制成含α-酸邻苯二胺盐为0.2mg/ml（相当于α-酸0.1509 mg/ml）、β-酸为0.1mg/ml的对照品溶液。

[0018] 供试品溶液的制备 取组合物50mg，精密称定，置100ml量瓶中，加甲醇约80ml，超声30min，放置至室温，甲醇定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

[0019] 测定方法 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

[0020] 2、黄腐酚、异黄腐酚、8-异戊烯基柚皮素、6-异戊烯基柚皮素利用高效液相色谱法测定：

[0021] 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈－1%甲酸溶液为流动相，梯度洗脱（按照表1进行）；黄腐酚检测波长为370nm，异黄腐酚、8-异戊烯基柚皮素、6-异戊烯基柚皮素检测波长为280nm；柱温：30℃，流速：0.8ml/min，进样量：10μl。

[0022] 表1 梯度洗脱流程

[0023]

[0024] 对照品溶液的制备 精密称取黄腐酚15mg、异黄腐酚5mg、8-异戊烯基柚皮素4mg、6-异戊烯基柚皮素对照品4mg，置25ml量瓶中，用甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，精密量取
5ml置25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

[0025] 供试品溶液的制备 取组合物粉末，精密称定50mg，至50ml容量瓶中，加甲醇适量，超声处理20min，取出，放置室温，加甲醇定容至刻度，摇匀，取10ml至25ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度即得。

[0026] 测定方法 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

[0027] 以黄腐酚、异黄腐酚、8-异戊烯基柚皮素、6-异戊烯基柚皮素、α-酸及β-酸为主要成分的组合物（黄腐酚38.5%、异黄腐酚5.2%、8-异戊烯基柚皮素2.2%、6-异戊烯基柚皮素1.7%、α-酸20.6%及β-酸15.5%）具有抑制脂肪酶活性，这些作用，通过以下药效学试验例得到证实。

[0028] 实验原料：本药效学中用到的组合物为本发明人提供，按照实例1制备而成。

[0029] 本药效学试验中用到的奥利司他胶囊为浙江海正药业股份有限公司 生产（批号为：20130302），猪胰脂肪酶（sigma公司），对硝基苯基乙酸酯p-Nitrophenyl acetate（sigma公司）。Zucker肥胖大鼠(遗传性肥胖大鼠)由吉林大学实验中心提供。

[0030] 1、啤酒花组合物对脂肪酶的抑制作用

[0031] 首先底物p-Nitrophenyl acetate（sigma公司）用磷酸缓冲液（PBS，pH 7.4）配成1.35M；猪胰脂肪酶（sigma公司）用磷酸缓冲液配成10mg/ml；本发明组合物用磷酸缓冲液配制成不同浓度的溶液（5.0，2.5，1.0，0.5，0.25，0.1，0.05mg/ml），阳性药用磷酸缓冲液配制成不同浓度的溶液（5.0，2.5，1.0，0.5，0.25，0.1，0.05mg/ml），然后在96孔板中依次加入50μl稀释20倍后的酶溶液、40μl稀释1000倍后的底物溶液以及10μl不同浓度的受试样品，混匀，25℃下反应20分钟，每隔2分钟在405 nm下检测每孔的吸光度；根据在405 nm下的吸光度计算受试样品对胰脂肪酶的抑制率（%），以蒸馏水为对照，抑制率（%）可以根据下式进行：
实验结果见表2。

[0032] 抑制率 (%) = [(A-B)-(C-D)]/(A-B)×100上式中，A表示反应后空白孔在405 nm下的吸光度，

[0033] B表示反应前空白孔在405nm下的吸光度，

[0034] C表示反应后样品孔在405nm下的吸光度，

[0035] D表示反应前样品孔在405nm下的吸光度。

[0036] 表2 啤酒花组合物对脂肪酶的抑制作用

[0037]

[0038] 结果表明，奥利司他对脂肪酶的抑制作用具有良好的量效关系。组合物在浓度为5.0，2.5，1.0，0.5，0.25，0.1，0.05mg/ml条件下，对脂肪酶的抑制作用存在良好的量效关系，组合物对脂肪酶活性的抑制作用较阳性药奥利司他相当。

[0039] 2、啤酒花组合物对肥胖大鼠的减肥作用

[0040] Zucker肥胖大鼠，雄性，6周龄，50只。取正常Zucker大鼠10只，作为空白对照组。将肥胖Zucker大鼠分成5组，即模型对照组、给药三组及阳性对照组，每组10只。啤酒花组合物用0.5％CMC-Na助溶，剂量为400mg/kg、200mg/kg、100mg/kg，阳性对照组剂量为30mg/kg；空白和模型对照组给予同等体积的0.5％CMC-Na，口服灌胃给药二周。定期检测饮食和体重。实验结果见表3。

[0041] 表3 本发明组合物对Zucker肥胖大鼠体重和饮食的影响

[0042]

[0043] 与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01

[0044] 从表3可以看出，啤酒花组合物明显抑制了Zucker肥胖大鼠体重增加，具有减肥作用，对饮食没有显著性影响，而且大鼠粪便形状未见异常。实施例

[0045] 本发明是通过如下的实验施例得以实现（证实），但不仅限于本实例。

[0046] 实例1 啤酒花组合物的制备方法

[0047] 啤酒花利用8倍量85%乙醇在60℃条件下提取2次，每次2小时，滤过，合并滤液，直接通过处理好的AB-8大孔吸附树脂，先用85%乙醇洗脱3倍柱体积，收集流出液及乙醇洗脱液，备用；继用95%乙醇洗脱4倍柱体积，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩至稠膏，冷冻干燥，得组份Ⅰ；将上述流出液及乙醇洗脱液回收乙醇，浓缩至浓缩液中乙醇的含量为25%，再次通过以处理好的聚酰胺吸附树脂，先用25%乙醇洗脱4倍柱体积，再用70%乙醇洗脱液4倍柱体积，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，冷冻干燥，得到组份Ⅱ；合并组份Ⅰ及组份Ⅱ，混匀，即得啤酒花天然药物组合物。利用高效液相测定黄腐酚含量38.5%、异黄腐酚含量5.2%、8-异戊烯基柚皮素含量2.2%、6-异戊烯基柚皮素含量1.7%、α-酸20.6%含量及β-酸含量15.5%。

[0048] 实例2 啤酒花组合物的制备方法

[0049] 啤酒花利用10倍量75%乙醇在60℃条件下提取2次，每次2小时，滤过，合并滤液，直接通过处理好的AB-8大孔吸附树脂，先用75%乙醇洗脱3倍柱体积，收集流出液及乙醇洗脱液，备用；继用95%乙醇洗脱3倍柱体积，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩至稠膏，冷冻干燥，得组份Ⅰ；将上述流出液及乙醇洗脱液回收乙醇，浓缩至浓缩液中乙醇的含量为20%，再次通过以处理好的聚酰胺吸附树脂，先用20%乙醇洗脱4倍柱体积，再用65%乙醇洗脱液4倍柱体积，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，冷冻干燥，得到组份Ⅱ；合并组份Ⅰ及组份Ⅱ，混匀，即得啤酒花天然药物组合物。利用高效液相测定黄腐酚含量38.8%、异黄腐酚含量4.6%、8-异戊烯基柚皮素含量2.0%、6-异戊烯基柚皮素含量1.5%、α-酸16.8%含量及β-酸含量14.2%。