唑菌酯的荧光标记方法及其应用

摘要

本发明涉及一种唑菌酯的荧光标记方法及其应用。提出了一种步骤简单、快速、高效的农药唑菌酯荧光标记的方法，即在催化剂的作用下将唑菌酯用乙二胺进行酰胺化，得到的唑菌酯衍生物在氢氧化银的辅助下进一步同丹磺酰氯酰胺化引入荧光基团，经丹磺酰氯标记的唑菌酯具有明显的荧光特性，采用荧光共聚焦显微镜技术可确定荧光标记唑菌酯在生物体内的移动部位，进而可通过丹磺酰氯荧光标记唑菌酯的行踪来追踪确定其代谢途径。

权利要求

1.一种唑菌酯的荧光标记方法，其特征在于，包括如下步骤：

a.唑菌酯用乙二胺进行酰胺化，是将唑菌酯溶解于甲醇中并以氧化钙作为催化剂，按摩尔比1:3至1:10加入乙二胺，在40℃～45℃温度下充分反应后过滤、蒸干反应液，用二氯甲烷：甲醇＝40：1洗脱液进行柱层析纯化，得到唑菌酯衍生物；

b.将步骤a所获得的唑菌酯衍生物和丹磺酰氯按摩尔比1:1.05至1:1.15加入到二氯甲烷中，并加入催化剂4-二甲氨基吡啶、缚酸剂三乙胺和氢氧化银，室温下完全反应，过滤后，用二氯甲烷：甲醇＝40：1洗脱液进行柱层析纯化，得到丹磺酰氯荧光标记的唑菌酯。

2.用权利要求1所述方法所获得的丹磺酰氯荧光标记唑菌酯在农药的安全性检测中的应用，采用荧光共聚焦显微镜技术可确定荧光标记唑菌酯在生物体内的移动部位，进而可通过丹磺酰氯荧光标记唑菌酯的行踪来追踪确定其代谢途径。

说明书

唑菌酯的荧光标记方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种对唑菌酯实施荧光标记的方法及其应用，以用于唑菌酯代谢途径的检测。

背景技术

[0002] 唑菌酯是一种甲氧基丙烯酸酯类高效低毒杀菌剂，具有广谱的杀菌活性，以唑菌酯为主要活性组分的农药具有非常广泛的使用范围，可有效防治黄瓜霜霉病、小麦白粉病，对油菜菌核病菌、葡萄白腐病菌、苹果轮纹病菌、苹果斑点落叶病菌等也具有良好的抑菌活性。

[0003] 但迄今为止，唑菌酯及其以唑菌酯为主要活性组分的农药还没有获得农业部的农药登记许可证书，更不能在国外直接销售，一个主要原因是没有进行完整的药理实验和环境转移实验，也就是完整的农药安全性评价。

[0004] 放射性同位素标记是药物代谢研究经常采用的一种方法，该技术灵敏度高、易于代谢产物的跟踪，但衰变很快的放射性元素通常不易引入唑菌酯中，再有放射性活度对生物体的作用达到一定剂量时，会改变机体的生理状态，产生辐射效应，还存在半衰期短、费用高、检测时间长、特异性差，操作危险、不能反映药物分子在代谢过程中发生的结构变化等缺点。有专利提出在唑菌酯标记方面，采用14C进行标记的《杀菌剂唑菌酯14C标记化合物的合成方法》，申请号：201010558062.6。由于14C半衰期较长，利用其放射性(活度)进行检测时，存在灵敏度低的问题。

发明内容

[0005] 本发明目的是为解决现有技术的不足，提出一种步骤简单、快速、高效的农药唑菌酯荧光标记的方法。可实现对唑菌酯代谢途径的研究，在高灵敏度条件下进行检测分析与追踪。

[0006] 为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：在催化剂的作用下将唑菌酯用乙二胺进行酰胺化，得到的唑菌酯衍生物在氢氧化银的辅助下进一步同丹磺酰氯酰胺化引入荧光基团。

[0007] 所述的将唑菌酯用乙二胺进行酰胺化，是将唑菌酯溶解于甲醇中并以氧化钙作为催化剂，按摩尔比1:3至1:10加入乙二胺，在40℃～45℃温度下充分反应后过滤、蒸干反应液，用二氯甲烷：甲醇＝40：1洗脱液进行柱层析纯化，得到唑菌酯衍生物。

[0008] 所述的用丹磺酰氯酰胺化引入荧光基团，是将所述的唑菌酯衍生物和丹磺酰氯按摩尔比1:1.05至1:1.15加入到二氯甲烷中，并加入催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP)、缚酸剂三乙胺和氢氧化银，室温下完全反应，过滤后，用二氯甲烷：甲醇＝40：1洗脱液进行柱层析纯化，得到丹磺酰氯荧光标记的唑菌酯，收率为93％，总收率为79％。

[0009] 本发明方法制备的丹磺酰氯荧光标记的唑菌酯特别适用于农药的安全性检测，即采用荧光共聚焦显微镜技术可确定荧光标记唑菌酯在生物体内的移动部位，进而可通过丹磺酰氯荧光标记唑菌酯的行踪来追踪确定其代谢途径。

[0010] 本发明唑菌酯的荧光标记方法，较同位素标记方法具有步骤简单、快速、高效的优点。丹磺酰氯作为荧光衍生试剂与含有伯胺官能团化合物进行键合标记，具有简便、快速、灵敏、稳定等特点，经丹磺酰氯标记的唑菌酯还具有不影响其杀虫效果的特点，其杀菌活性对黄瓜黑星病菌的EC50值与唑菌酯106mg/L的EC50值相近似，离体杀菌活性达到80％以上。所制得的丹磺酰氯荧光标记的唑菌酯作用于hela细胞时，观察其荧光信号，可追踪其移动部位，标记效果好、安全可靠，通过荧光标记唑菌酯的行踪，可更加有效地追踪其代谢途径。
本发明将在农药唑菌酯代谢过程的研究中发挥重要作用，实际应用价值高。

[0011] 荧光标记法在生命科学、现代分子生物学及药物学等领域得到广泛应用，具有操作简便、高灵敏度、重现性好等特点。以丹磺酰氯为标记物的技术途径通常是要求底物上含有胺基或需要在底物上引入胺基，再通过酰胺化引入发光基团。采用常规有机合成方法，通过酯的胺解反应，在唑菌酯上引入胺基的效率较低，通常收率只有～50％；通过酰胺引入发光基团，因形成的形成盐酸三甲胺，受平衡影响导致目标产物收率低，通常只有～65％左右。因此，采用常规的有机合成途径两步总收率仅为30％，进而造成唑菌酯与荧光标记物的巨大浪费。

附图说明

[0012] 图1是唑菌酯全扫描质谱谱图；

[0013] 图2是唑菌酯[M+H]+413.2二级串联质谱谱图；

[0014] 图3是唑菌酯衍生物质谱谱图；

[0015] 图4是丹磺酰氯荧光标记唑菌酯的质谱谱图；

[0016] 图5是丹磺酰氯荧光标记唑菌酯的核磁谱图(1HNMR谱图溶剂d6-DMSO)；

[0017] 图6是唑菌酯及其衍生物和荧光标记物的紫外谱图；

[0018] 图7是丹磺酰氯荧光标记唑菌酯的高效液相色谱谱图；

[0019] 图8是丹磺酰氯荧光标记唑菌酯表面增强拉曼光谱；

[0020] 图9是丹磺酰氯荧光标记唑菌酯在hela细胞内的共聚焦显微镜成像照片。

具体实施方式

[0021] 通过以下实施例对本发明作进一步详细说明.

[0022] 实施例1

[0023] 丹磺酰氯荧光标记的唑菌酯的制备。

[0024] a.将唑菌酯用乙二胺进行酰胺化：

[0025] 称取412mg(1mmol)唑菌酯，加入10mL甲醇，加入经500℃焙烧的固体碱氧化钙200mg，滴加0.67mL(～10mmol)乙二胺，缓慢升温至40℃后反应6小时。过滤后，蒸干反应液，制备色谱柱层析纯化(洗脱液组成二氯甲烷：甲醇＝20:1)得374mg(0.85mmol)唑菌酯衍生物，收率为85％；化学反应式如下：

[0026]

[0027] b.用丹磺酰氯酰胺化引入荧光基团：

[0028] 称取188mg(0.43mmol)上述唑菌酯衍生物，127mg(～0.47mmol)丹磺酰氯，5.2mg(0.043mmol)4-二甲氨基吡啶(DMAP)，再加入2mL二氯甲烷，72mg(0.71mmol)三乙胺以及新制备的氢氧化银100mg，室温反应。过滤后，进行柱层析纯化(洗脱液组成二氯甲烷：甲醇＝40：1)得到丹磺酰氯荧光标记的唑菌酯278mg(0.40mmol)，收率为93％，总收率为79％。化学反应式如下：

[0029]

[0030] 实施例2

[0031] 对实施例1制备的丹磺酰氯荧光标记唑菌酯相关特性的检测实验。

[0032] (1)唑菌酯的结构碎片离子解离机理的确定。

[0033] 将唑菌酯的酯基用氨基试剂衍生化后，标记上荧光标记物丹磺酰氯，利用高效液相色谱建立了唑菌酯的痕量分析方法，并设计了唑菌酯荧光标记物的代谢试验方法。首先通过唑菌酯全扫描质谱谱图(见图1)，确定[M+H]+离子峰为413.2，435.1为[M+Na]+离子峰，以[M+H]+离子峰为413.2为母离子进行二级质谱分析(见图2)。由图2可知，二级质谱中两个信号最强的碎片离子145.0和205.0，及碎片离子381.1，其中205.0为母离子脱掉甲氧基丙烯酸甲酯部分得到的，145.0的碎裂方式是继续脱去羰基和羰基上的甲氧基再加氢得到的，381.1为[M-31]+即去甲氧基的离子峰。唑菌酯裂解时(见图3所示)，可裂解成为甲氧基丙烯酸甲酯和吡唑环两种碎片，外加甲氧基。

[0034] (2)丹磺酰氯荧光标记唑菌酯的实时监测与验证。

[0035] 唑菌酯衍生物荧光标记后，利用LTQ质谱进行验证，首先检测唑菌酯用乙二胺进行衍生化衍生物的质谱(见图3)，通过唑菌酯衍生物全扫描质谱谱图，确定441.2为[M+H]+分子离子峰。将唑菌酯衍生物用丹磺酰氯标记后，测定质谱全扫描谱图(见图4)，确定分子离子峰696.4为[M+H]+，表示成功将荧光标记物与唑菌酯衍生物标记上。丹磺酰氯荧光标记唑菌酯的核磁共振波谱谱图(见图5)进一步说明了合成的荧光标记物的结构及纯度。

[0036] (3)丹磺酰氯荧光标记唑菌酯的应用试验。

[0037] 首先利用紫外色谱，确定唑菌酯、唑菌酯衍生物及丹磺酰氯荧光标记唑菌酯的最大紫外吸收波长(见图6)，选择合理吸收波长。在265nm最大吸收波长下，利用高效液相色谱C18色谱柱，观察了唑菌酯及其衍生物和荧光标记物的色谱谱图，确定了不同配比(a:10-3mol/L，b:10-4mol/L，c:10-5mol/L)唑菌酯、唑菌酯衍生物、唑菌酯荧光标记物的峰高及峰面积的变化(见图7)，确定了利用高效液相色谱分析代表性创制农药唑菌酯的检测最低浓度为10-5mol/L。将硅基片浸入piranha溶液使其表面氨基化，在硅片上引入制备的金粒子形成阵列，利用酒石酸钾钠还原方法，银镜反应，将所需要银镀在金纳米粒子修饰的硅片上，浸入超纯水清洗，得到Si02@Ag硅纳米银阵列。借助拉曼光谱仪进行检测分析(见图8)，唑菌酯荧光标记物检测分析灵敏度提高到10-7mol/L以上。

[0038] 使用荧光测试仪测定了唑菌酯荧光标记物的发光情况，确定它的激发波长在338nm左右，发射波长在540nm左右。利用所合成的唑菌酯荧光标记物，在样品浓度为
100umol/L，作用于hela细胞，观察其荧光变化(见图9)。采用荧光共聚焦显微镜技术，通过对比亮场与荧光条件，可以确定存活细胞吞食了荧光标记的唑菌酯，进而在荧光条件下显示出强绿色荧光；而死亡的细胞由于不能吞食荧光标记唑菌酯，在荧光条件下无法观察到。
这表明该方法可用于追踪唑菌酯在细胞及动物体内的移动部位，进而可通过荧光标记物丹磺酰氯荧光标记唑菌酯的行踪确定唑菌酯的代谢途径。