青虾卵黄蛋白原Vg基因、编码蛋白及应用

摘要

本发明公开一种青虾卵黄蛋白原Vg基因、编码蛋白及应用。利用本发明提供的引物组从青虾肝胰腺中克隆到了一种Vg基因全长cDNA序列，该基因dsRNA注入雌性青虾围心腔后可以沉默卵巢和肝脏内的卵黄蛋白原基因的表达，使青虾卵巢发育显著延缓。本发明为解决青虾性早熟现象，培育优良品种提供新的思路和有效手段。

权利要求

1.青虾卵黄蛋白原Vg基因在延缓雌性青虾卵巢发育中的应用；所述的青虾卵黄蛋白原Vg基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1中的第35位～第7645位所示；包括如下步骤：对青虾DNA样本中的青虾卵黄蛋白原Vg基因进行PCR扩增，将扩增产物进行体外转录合成dsRNA，再将dsRNA以注射到青虾的围心腔内；PCR扩增中使用的上下游引物的序列如SEQ ID NO.3～4所示；所述的注射步骤中的注射剂量是4μg/g。

说明书

青虾卵黄蛋白原Vg基因、编码蛋白及应用

技术领域

[0001] 本发明公开一种青虾卵黄蛋白原Vg基因、编码蛋白及应用，涉及生物技术和发育调控领域，具体涉及青虾卵黄蛋白原基因的克隆，还涉及利用该基因dsRNA来调控青虾卵巢的发育速度。

背景技术

[0002] 青虾，学名日本沼虾(Macrobrachium nipponense)，俗称河虾，隶属十足目（Decapoda）、长臂虾科（Palaemonidae）、沼虾属（Macrobrachium），广泛分布于我国各地水域，生长快、适应性强、养殖经济效益高，是我国重要的淡水养殖虾类。据2012年《中国渔业年鉴》记载，全国养殖青虾年产量超过23万吨，年产值超过150亿元，是目前淡水养殖业中最有发展前途的品种之一。近年来,随着其自然资源的锐减和养殖规模的扩大,养殖的青虾出现了生产性能下降和种质资源退化的情况,其中虾个体小型化和“性早熟”的现象尤为突出。“性早熟”即雌、雄性个体性腺提前发育，在生产中小虾性腺过早成熟，产卵导致个体变小、池塘养殖密度过大、生长规格不齐、近亲交配等一系列问题，最终商品虾的规格降低,繁殖性能下降,严重影响了青虾的品质和产值，成为青虾养殖业发展的一大瓶颈。为实现青虾产业的可持续发展，寻找解决雌性青虾“性早熟”的解决方法变得刻不容缓。

[0003] 卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vg)是一种普遍存在于卵生非哺乳动物血液中的蛋白,是几乎所有卵生动物中卵黄蛋白(vitellin,Vn)的前体。卵黄蛋白是所有卵生的脊椎动物和无脊椎动物雌性卵黄的主要成分，在卵黄发生期迅速积累。它被认为是由卵巢外组织合成，分泌释放到血液中，通过血液运输到卵母细胞，以卵黄蛋白的形式积累和储存，是胚胎和幼体早期发育主要的营养来源。卵黄蛋白和卵黄蛋白原含有许多脂肪成分,可为正在发育的胚胎提供氨基酸、脂肪、碳水化合物、维生素、磷和硫等营养和功能性物质。

[0004] RNAi（RNA interference, RNAi）是一种广泛存在于真核生物中的高效的序列特异性基因剔除技术。RNAi是由不同来源和长度的双链 RNA（double-stranded RNA, dsRNA）前体所诱发的，可以有效地抑制靶基因RNA 的翻译。近年开始在甲壳动物基因功能研究中使用。目前，甲壳类关于Vg基因的沉默表达尚未见报道。

发明内容

[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种青虾卵黄蛋白原Vg基因、编码蛋白及应用，该基因用于调控雌性青虾卵巢发育速度，为解决青虾性早熟提供理论基础。

[0006] 技术方案：

[0007] 一种青虾卵黄蛋白原，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0008] 编码上述青虾卵黄蛋白原的青虾卵黄蛋白原Vg基因。

[0009] 所述的青虾卵黄蛋白原Vg基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1中的第35位～第7645位所示。

[0010] 所述的青虾卵黄蛋白原Vg基因所合成的dsRNA。

[0011] 所述的青虾卵黄蛋白原Vg基因在延缓雌性青虾卵巢发育中的应用。

[0012] 所述的应用，包括如下步骤：对青虾DNA样本中的青虾卵黄蛋白原Vg基因进行PCR扩增，将扩增产物进行体外转录合成dsRNA，再将dsRNA以注射到青虾的围心腔内。

[0013] 所述的应用，PCR扩增中使用的上下游引物的序列如SEQ ID NO.3～4所示。

[0014] 所述的应用，注射步骤中的注射剂量是4μg/g。

[0015] 有益效果

[0016] 本发明提供的青虾卵黄蛋白原Vg基因可以制备得到dsRNA，通过注射的方式注入青虾围心腔内，可以有效地延缓青虾卵巢成熟的时间，证明该基因的表达对雌性卵巢发育有非常重要的影响。

附图说明

[0017] 图1是外源性注射Vg-dsRNA对雌性青虾卵巢GSI性腺发育指数影响的示意图。

[0018] 注： 1d，3d, 5d, 7d, 9d, 11d, 13d, 15d，17d分别为注射后1，3，5，7，9，13，15和17天(样本量N≥ 3)。

[0019] 图2是外源性注射Vg-dsRNA对雌性青虾内源Vg基因的表达量影响的示意图。

[0020] 注： 1d, 3d, 5d, 7d, 9d,11d, 13d, 15d，17d分别为注射后1，3，5，7，9，13，15和17天(样本量N≥ 3)。对照组注射相同剂量的DEPC水。

[0021] 图3是在肝脏中外源性注射Vg-dsRNA对雌性青虾内源Vg基因的表达量的影响的示意图。

[0022] 注： 1d，3d, 5d, 7d, 9d, 11d, 13d, 15d，17d分别为注射后1，3，5，7，9，13，15和17天(样本量N≥3)。对照组注射相同剂量的DEPC水。

具体实施方式

[0023] 下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J. 萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

[0024] 本文使用的近似语在整个说明书和权利要求书中可用于修饰任何数量表述，其可在不导致其相关的基本功能发生变化的条件下准许进行改变。因此，由诸如“约”的术语修饰的值并不局限于所指定的精确值。在至少一些情况下，近似语可与用于测量该值的仪器的精度相对应。除非上下文或语句中另有指出，否则范围界限可以进行组合和/或互换，并且这种范围被确定为且包括本文中所包括的所有子范围。除了在操作实施例中或其他地方中指明之外，说明书和权利要求书中所使用的所有表示成分的量、反应条件等等的数字或表达在所有情况下都应被理解为受到词语“约”的修饰。

[0025] 本研究的目的就是通过用Vg-dsRNA 注入青虾体内，研究该基因在dsRNA 刺激下的表达变化以及对卵巢发育的影响，阐释 dsRNA 对青虾卵巢发育的调节机制，为利用Vg-dsRNA干扰技术抗性早熟的实用化提供新思路和参考依据。

[0026] 实施例1：青虾Vg基因全长cDNA的获得

[0027] 总RNA提取：选取3～4支成熟雌虾的肝脏，迅速放入盛有液氮的预冷研钵中，迅速的研磨。总RNA的提取使用Takara公司的RNAiso Plus提取试剂结合传统的酚仿抽提法进行，提取方法参照使用说明书。经过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，分光光度计分析该样品OD260/280 比值在1.8～2.0 之间，并测定RNA的浓度。

[0028] cDNA第一链合成：参照Takara M-MLV反转录试剂盒进行第一链cDNA的合成。

[0029] 青虾Vg基因全长cDNA序列的克隆：

[0030] 根据已获得的Vg基因全长cDNA序列(罗氏沼虾Macrobrachium rosenbergii, BAB69831；日本仿长额虾Pandalopsis japonica, ACU51164; 高背长额虾Pandalus hypsinotus BAD11098;)的编码区进行比对，依据比对结果，在保守区域设计引物，利用引物组一（SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:14） 和上述反转录的cDNA为模板进行中间片段的克隆。

[0031] 更具体地，上述的引物组的组成如下：

[0032] 正向引物VGAF1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

[0033] 正向引物VGBF2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

[0034] 正向引物VGCF3的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

[0035] 正向引物VGDF4的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

[0036] 正向引物VGEF5的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示;

[0037] 反向引物VGAR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

[0038] 反向引物VGBR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

[0039] 反向引物VGCR3的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

[0040] 反向引物VGDR4的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；

[0041] 反向引物VGER5的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

[0042] 进行PCR扩增反应体系如下：

[0043]

[0044] PCR反应程序为：94℃预变性3min，然后进入下列循环：94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

[0045] 利用上海生工生物工程有限公司(Sangon)的柱式DNA 胶回收试剂盒进行目的片段的回收，将产物连接到pMD18-T载体（Takara），并转化入大肠杆菌DH5α，进行蓝白斑筛选，挑取单克隆白斑扩增培养后，将插入目的片段的阳性克隆送至上海铂尚生物公司进行测序分析。将得到的几段产物进行拼接，得到青虾Vg基因的中间片段。

[0046] 根据Vg基因cDNA中间片段序列，又设计特异性正向引物3VGF1（SEQ ID NO.15）、3VGF2（SEQ ID NO.16）；和反向引物5VGR1（SEQ ID NO.17）、5VGR2（SEQ ID NO.18）分别进行cDNA 3’和5’快速扩增，操作步骤按TaKaRa 3’-RACE和TaKaRa5’-RACE试剂盒说明书进行。
按上述克隆的步骤进行随后的切胶、回收、转化、克隆及测序最终得到Vg 基因的3’和5’端的序列。将中间片段和3’和5’端的测序结果进行比对，拼接得到青虾Vg基因全长cDNA序列。
经过序列比对显示，青虾Vg基因和其它甲壳类的同源性在70%以上。其核苷酸序列如SEQ ID NO.1中的第35位～第7645位所示（第1～34和第7646～7800位是3’和5’端的非编码区），其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0047] 实施例2：青虾Vg基因dsRNA的合成

[0048] 以SEQ ID NO.1核苷酸序列为依据，在开放阅读框以内采用NCBI在线dsRNA引物设计软件（http://www.flyrnai.org/cgi-bin/RNAi_find_primers.pl）设计制备双链RNA 的引物(SEQ ID NO.3-  SEQ  ID NO.4)，根据Transcript AidTM  T7 High  Yield Transcription kit (Fermentas, Inc., USA)试剂盒说明进行体外转录合成dsRNA。将制备好的dsRNA溶解在DEPC 水中，测定其浓度并在1.5%琼脂糖凝胶上检测其纯度。将上述dsRNA溶液以4μg/g的剂量注射到青虾的围心腔内。对照组注射相同体积的DEPC 水，实验所用的雌虾都处于卵巢发育初期（刚排完卵）。在注射后的第1、3、5、7、9、11、13、15和17天收集样品(N≥3)，并将组织保存在RNA 保存液中（Takara）。最后提取各样品的总RNA并反转成cDNA，采用Real Time PCR检测Vg基因相对于对照组的表达量变化，以此来计算Vg基因干扰的效率。性腺指数是评价动物性腺发育状况的重要指标。根据公式GSI=性腺湿重/体重湿重×100%，计算两组雌性青虾的GSI性腺发育指数（Gonad Somatic Index，GSI)。

[0049] 实验结果

[0050] 图1所示，为对照组的GSI性腺发育指数和注射组的性腺发育指数对比的示意图，可以看出Vg-dsRNA 注射显著延缓了青虾卵巢的发育在第11天对照组卵巢发育已处于成熟期实验组仍处于卵黄积累时期。

[0051] 如图2所示，在卵巢中，相对于对照组，注射后第1天，青虾Vg基因的表达量显著下降了76%，在第5天已经下降了92%，随着对照组卵巢的发育，Vg 基因在卵巢中呈现了先升高后降低的表达规律。然而在对照组这一规律明显被延后，在第15天时处理组处于卵黄发生的高峰期，而对照组卵巢已完成一轮发育周期，已经排空。

[0052] 如图3所示，在肝脏中，相对于对照组，注射后第1天，青虾Vg基因的表达量显著下降了74%，在第5天已经下降了97%，随着对照组卵巢的发育，Vg 基因在肝脏中同样呈现了先升高后降低的表达规律。根据表达规律来看对照组的发育明显被延缓。结果证明外源注射Vg-dsRNA  ,可以有效地延缓性腺发育，这一研究结果为解决青虾性早熟这一难题提供了理论基础，也为后续将该方法应用到生产实践提供指导意义。