本发明公开了一种降低镉含量的菌株、菌剂及其制备和使用方法。该菌株是保藏编号为CCTCC NO：M 2014319的多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)P1；经过发酵后得到的菌剂施用于轻中度镉污染稻田，能够有效降低水稻米中镉含量，具有巨大的推广应用价值。
1.一种降低镉含量的菌株，其特征在于，所述的菌株是保藏编号为CCTCC NO：M
2014319的多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)P1。
2.一种降低镉含量的菌剂，其特征在于，是由权利要求1所述的多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)P1发酵后得到的菌剂。
3.根据权利要求2所述的降低镉含量的菌剂，其特征在于，多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)P1发酵后的菌液的菌含量为1×106～1×108个活菌/毫升。
4.根据权利要求3所述的降低镉含量的菌剂，其特征在于，所述的菌剂是将多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)P1发酵后的菌液与灭菌草炭混合后得到的菌剂。
5.根据权利要求4所述的降低镉含量的菌剂，其特征在于，多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)P1发酵后的菌液与灭菌草炭是等质量比例混合。
6.权利要求2-5任一项所述的降低镉含量的菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a、菌种活化
将权利要求1所述的多粘芽孢杆菌P1接种于固体种子培养基斜面上，活化培养；
将多粘芽孢杆菌从固体种子培养基斜面上接种于液体种子培养基中，震荡培养，制备种子液；
将步骤b得到的种子液接种到种子罐；通入无菌空气和搅拌培养，得一级种子罐发酵菌液；将一级种子罐发酵液接入二级种子罐，通入无菌空气和搅拌培养，得二级种子罐发酵菌液；
将二级种子罐发酵液接入发酵罐，通入无菌空气和搅拌培养，发酵完毕后微生物发酵液中多粘芽孢杆菌含量：1×106～1×108个活菌/毫升；
e、将粉粹的草炭进行灭菌，然后和步骤d得到的微生物发酵液混合均匀，即为菌剂产品。
7.根据权利要求6所述的降低镉含量的菌剂的制备方法，其特征在于，a、菌种活化
将所述的多粘芽孢杆菌P1接种于固体种子培养基斜面上，在28～35℃条件下活化培养
固体种子培养基：胰蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；氯化钠10g/L；琼脂2％；pH自然；
将多粘芽孢杆菌从固体种子培养基斜面上接种于液体种子培养基中，在28～35℃条件下震荡培养24～36h，制备种子液；
液体种子培养基：胰蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；氯化钠10g/L；pH自然；
将步骤b得到的种子液以待接种培养基体积百分比5％-8％的接种量接种到种子罐；通入无菌空气和搅拌，在28～35℃条件下培养24～36h，通气量1～2Vols/vol·min，搅拌转速
180-250rpm，得一级种子罐发酵菌液；将一级种子罐发酵液按培养基体积百分比5％～8％接种量接入二级种子罐，通入无菌空气和搅拌，在28～35℃条件下培养24～36h，通气量1～
2Vols/vol·min，搅拌转速180-250rpm，得二级种子罐发酵菌液；
1L一级或二级种子罐培养基配方：牛肉膏0.3～0.8％，蛋白胨0.7～1.2％，葡萄糖0.1～0.6％，NaCl 0.1～0.6％，MgSO4·7H2O 0.01～0.06％，K2HPO40.01％～0.06％，MnSO40.001％～0.008％，余为水，pH值消毒前7.0～7.8，消毒后pH6.8～7.5；所述培养基配方成分的百分比含量均为重量百分比；
28℃～35℃，按培养基体积百分比5％～8％的接种量将二级种子罐发酵液接入发酵罐，通入无菌空气和搅拌，在28～35℃条件下培养24～36h，通气量1～2Vols/vol·min，搅拌转速180-250rpm，发酵完毕后微生物发酵液中多粘芽孢杆菌含量：1×106～1×108个活菌/毫升；
1L发酵罐培养基配方：淀粉2％～3％，豆饼粉0.5～1.5％，酵母粉0.5～1.0％，KH2PO40.08～0.22％，K2HPO40.10～2.2％，CaCO30.1～2.20％,FeSO4·7H2O 0.001～
0.005％，余为水，pH值消毒前8.5～11.0，消毒后6.5～9.5；所述培养基配方成分的百分比含量均为重量百分比；
e、粉粹的草炭进行灭菌，然后和微生物发酵液混合均匀，即为菌剂产品。
8.根据权利要求7所述的降低镉含量的菌剂的制备方法，其特征在于，草炭经粉碎后过
9.权利要求2-5任一项所述的降低镉含量的菌剂的使用方法，其特征在于，用于降低土壤中镉的含量。
10.根据权利要求9所述的降低镉含量的菌剂的使用方法，其特征在于，用于降低水稻田中镉的含量，整地前将所述的菌剂按75-100kg/亩全田均匀撒施，翻地，经耕耙整地后即可种植。
一种降低镉含量的菌株、菌剂及其制备和使用方法
技术领域
[0001] 本发明属于重金属污染土壤修复的技术领域，具体涉及一种降低镉含量的菌株、菌剂及其制备和使用方法。
背景技术
[0002] 土壤是人类赖以生存的主要物质基础。但由于人类对重金属的开采、冶炼、加工及商业制造活动日益增多，造成不少重金属如铅、镉、汞等重金属进入大气、水和土壤中，引起严重的环境污染。据统计全世界每年向环境中释放的镉达3万吨左右，其中82％-94％的镉会进入到土壤中。长期摄入被镉严重污染的稻米、蔬菜、水果，饮用含镉量超标的水，都会出现慢性中毒的症状，影响人体的神经系统、造血系统、消化系统以及生殖系统，危害人体健康。湖南省是全国粮食的主产区，自古便有“鱼米之乡”和“天下粮仓”的美誉，担负着保障国家粮食安全的重大责任，但同时湖南省也是重金属污染最严重的地区之一，严重威胁了“湘米”的品质，对当地居民的健康造成了巨大的危害。
[0003] 目前重金属污染土壤修复技术主要有植物修复法、电动力修复法、淋滤法、热解吸法、玻璃化法和固定稳定化法等，在以上重金属污染土壤治理方法中，植物修复法需要相当长的时间(几十年甚至几百年)且存在植物的处理问题；电动力学修复只适用于小面积污染，而且现场不易操作；淋滤法需要添加表面活性剂，存在污染地下水的危险；热解吸法是利用加热回收气体的方法，该方法不适合现场操作且费用高，适用范围窄等问题；玻璃化法改变了土壤的性质，只适用于污染严重且面积小的情况；添加石灰的稳定化方法提高了土壤的pH值，会造成土壤板结，而且对碱性土壤效果不好。因此都不适合用来治理大面积的稻田重金属污染。
[0004] 微生物的原位钝化修复方法从成本和时间上能较好的满足治理土壤中重金属污染的要求。加入含有微生物的钝化剂，调节和改变重金属在土壤中的物理化学性质，使其产生沉淀、吸附、离子交换、腐殖化和氧化-还原等一系列反应，降低其在土壤环境中的生物有效性和可迁移性，可显著减少重金属进入食物链，可以实现环保与生产的协调发展以及确保社会与经济的持续发展。
[0005] 此种修复技术，不占用耕地、不影响农业生产和收益，而且成本低、对环境影响小、不破坏土壤环境，非常适合用来处理大面积受到中轻度镉污染的农田土壤，如果能够成功实现产业化和大面积应用，将在重金属污染原位修复领域实现重大突破，为我省稻田镉污染土壤的修复、降低稻米中的重金属含量、实现农业增产、农民增收等都将起到巨大的推动作用。
发明内容
[0006] 本发明的目的是，提供一种降低镉含量的菌株、菌剂及它们的制备和使用方法，本发明操作简便、成本低廉、安全性好、实用性强，所述的微生物菌株或其制备的菌剂通过对重金属的胞外络合、胞内积累、沉淀和氧化还原反应等作用，能有效降低土壤中重金属的生物可利用率，进而降低农作物和农产品中镉的含量。
[0007] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0008] 一种降低水稻米中镉含量的菌株是保藏编号为CCTCC NO：M 2014319的多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)P1。
[0009] 一种降低水稻米中镉含量的菌剂，是由所述的多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)P1发酵后得到的菌剂。多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)P1发酵后的菌液的菌含量为1×106～1×108个活菌/毫升。
[0010] 所述的菌剂是将多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)P1发酵后的菌液与灭菌草炭混合后得到的菌剂。多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)P1发酵后的菌液与灭菌草炭是等质量比例混合。
[0011] 所述的降低水稻米中镉含量的菌剂的制备方法，包括以下步骤：
[0012] a、菌种活化
[0013] 将权利要求1所述的多粘芽孢杆菌P1接种于固体种子培养基斜面上，活化培养；
[0014] b、种子液制备
[0015] 将多粘芽孢杆菌从固体种子培养基斜面上接种于液体种子培养基中，震荡培养，制备种子液；
[0016] c、种子罐发酵
[0017] 将步骤b得到的种子液接种到种子罐；通入无菌空气和搅拌培养，得一级种子罐发酵菌液；将一级种子罐发酵液接入二级种子罐，通入无菌空气和搅拌培养，得二级种子罐发酵菌液；
[0018] d、生产发酵罐培养
[0019] 将二级种子罐发酵液接入发酵罐，通入无菌空气和搅拌培养，发酵完毕后微生物发酵液中多粘芽孢杆菌含量：1×106～1×108个活菌/毫升；
[0020] e、将粉粹的草炭进行灭菌，然后和步骤d得到的微生物发酵液混合均匀，即为菌剂产品。
[0021] 上述降低水稻米中镉含量的菌剂的制备方法，具体如下：
[0022] a、菌种活化
[0023] 将所述的多粘芽孢杆菌P1接种于固体种子培养基斜面上，在28～35℃条件下活化培养24～36h；
[0024] 固体种子培养基：胰蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；氯化钠10g/L；琼脂2％；pH自然；
[0025] b、种子液制备
[0026] 将多粘芽孢杆菌从固体种子培养基斜面上接种于液体种子培养基中，在28～35℃条件下震荡培养24～36h，制备种子液；
[0027] 液体种子培养基：胰蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；氯化钠10g/L；pH自然；
[0028] c、种子罐发酵
[0029] 将步骤b得到的种子液以待接种培养基体积百分比5％-8％的接种量接种到种子罐；通入无菌空气和搅拌，在28～35℃条件下培养24～36h，通气量1～2Vols/vol·min，搅拌转速180-250rpm，得一级种子罐发酵菌液；将一级种子罐发酵液按培养基体积百分比5％～8％接种量接入二级种子罐，通入无菌空气和搅拌，在28～35℃条件下培养24～36h，通气量1～2Vols/vol·min，搅拌转速180-250rpm，得二级种子罐发酵菌液；
[0030] 1L一级或二级种子罐培养基配方：牛肉膏0.3～0.8％，蛋白胨0.7～1.2％，葡萄糖0.1～0.6％，NaCl 0.1～0.6％，MgSO4·7H2O 0.01～0.06％，K2HPO40.01％～0.06％，MnSO40.001％～0.008％，余为水，pH值消毒前7.0～7.8，消毒后pH6.8～7.5；所述培养基配方成分的百分比含量均为重量百分比；
[0031] d、生产发酵罐培养
[0032] 28℃～35℃，按培养基体积百分比5％～8％的接种量将二级种子罐发酵液接入发酵罐，通入无菌空气和搅拌，在28～35℃条件下培养24～36h，通气量1～2Vols/vol·min，搅拌转速180-250rpm，发酵完毕后微生物发酵液中多粘芽孢杆菌含量：1×106～1×108个活菌/毫升；
[0033] 1L发酵罐培养基配方：淀粉2％～3％，豆饼粉0.5～1.5％，酵母粉0.5～1.0％，KH2PO40.08～0.22％，K2HPO40.10～2.2％，CaCO30.1～2.20％,FeSO4·7H2O0.001～0.005％，余为水，pH值消毒前8.5～11.0，消毒后6.5～9.5；所述培养基配方成分的百分比含量均为重量百分比。
[0034] e、粉粹的草炭进行灭菌，然后和微生物发酵液混合均匀，即为菌剂产品。草炭经粉碎后过3-5mm筛备用。
[0035] 所述的降低镉含量的菌剂的使用方法，用于降低土壤中镉的含量。
[0036] 具体用于降低水稻田中镉的含量，整地前将所述的菌剂按75-100kg/亩全田均匀撒施，翻地，经耕耙整地后即可种植。
[0037] 本发明的菌株主要依靠细胞壁上的羟基(-OH)、羰基(-CO-)、酰胺基(-CO-NH-)、磷酸基(-PO43-)等基团进行表面吸附、并通过其代谢产物进行胞外络合、胞外沉淀等络合和固定土壤中的重金属镉，从而有效降低土壤中的有效镉含量。本发明多粘芽孢杆菌来源于湘潭县河口镇镉污染稻田土壤，革兰氏染色阳性，兼性厌氧，杆状，产芽孢，经16S rDNA分子鉴定和系统发育分析初步鉴定为多粘芽孢杆菌。而且通过吸附试验表明，该多粘芽孢杆菌能够在镉浓度15mmol/L的培养基上生长，在溶液中对镉的吸附率高达91.8％，冻干菌粉对镉的吸附率高达98.5％。在土壤中，该菌株定植能力强，能够高效吸附土壤中的重金属，降低植物的吸收。所述多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)P1于2014年7月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：武汉珞珈山武汉大学内)，保藏编号为CCTCC NO：M 2014319。
[0038] 本发明采用草炭和发酵菌液混合得到菌剂，草炭富含有机质(50wt％-80wt％)和腐殖质(20wt％-40wt％)，含氮、磷、钾总含量在3wt％以上，具有很大的内表面(孔隙率约为2
95％，比表面积约为200m/g)和良好的胶体表面性质，如吸附力、黏结力和高度分散性等，含有大量的极性基团，包括醇类、醛类、羧酸、羟基等，可以络合或螯合土壤中的重金属，同时，可以增进土壤透气、透水性，改良土壤，提高肥料利用率。
[0039] 本产品治理修复过程属于原位修复，不占用耕地、不影响农业生产和收益，而且成本低、对环境影响小、不破坏土壤环境，非常适合用来处理大面积受到轻中度镉污染的农田土壤。
[0040] 本发明的原材料来源广泛，成本低廉，制备工艺简单，方便易行，具有很广阔的应用前景。
附图说明
[0041] 图1为本发明微生物菌剂WSW与对照CK(不添加任何钝化剂)在水稻不同生长时期降低水稻植株各器官镉含量的实验结果图。
具体实施方式
[0042] 以下结合实施例对本发明作进一步详细说明，而不会形成对本发明的限制。实施例1,微生物发酵菌剂制备；
[0043] a、菌种活化
[0044] 将多粘芽孢杆菌P1接种于固体种子培养基斜面上，在28～35℃条件下活化培养24～36h；
[0045] 固体种子培养基：胰蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；氯化钠10g/L；琼脂2％；pH自然；
[0046] b、种子液制备
[0047] 将多粘芽孢杆菌从固体种子培养基斜面上接种于液体种子培养基中，在28～35℃条件下震荡培养24～36h，制备种子液；
[0048] 液体种子培养基：胰蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；氯化钠10g/L；pH自然；
[0049] c、种子罐发酵
[0050] 将步骤b得到的种子液以待接种培养基体积百分比5％-8％的接种量接种到种子罐；通入无菌空气和搅拌，在28～35℃条件下培养24～36h，通气量1～2Vols/vol·min，搅拌转速180-250rpm，得一级种子罐发酵菌液；将一级种子罐发酵液按体积百分比5％～8％接种量接入二级种子罐，通入无菌空气和搅拌，在28～35℃条件下培养24～36h，通气量1～2Vols/vol·min，搅拌转速180-250rpm，得二级种子罐发酵菌液；
[0051] 1L一级或二级种子罐培养基配方：牛肉膏0.3～0.8％，蛋白胨0.7～1.2％，葡萄糖0.1～0.6％，NaCl 0.1～0.6％，MgSO4·7H2O 0.01～0.06％，K2HPO40.01％～0.06％，MnSO40.001％～0.008％，余为水，pH值消毒前7.0～7.8，消毒后pH6.8～7.5；所述培养基配方成分的百分比含量均为重量百分比；
[0052] d、生产发酵罐培养
[0053] 28℃～35℃，按培养基体积百分比5％～8％的接种量将二级种子罐发酵液接入发酵罐，通入无菌空气和搅拌，在28～35℃条件下培养24～36h，通气量1～2Vols/vol·min，搅拌转速180-250rpm，发酵完毕后微生物发酵液中多粘芽孢杆菌含量：1×106～1×108个活菌/毫升；
[0054] 1L发酵罐培养基配方：淀粉2％～3％，豆饼粉0.5～1.5％，酵母粉0.5～1.0％，KH2PO40.08～0.22％，K2HPO40.10～2.2％，CaCO30.1～2.20％,FeSO4·7H2O0.001～0.005％，余为水，pH值消毒前8.5～11.0，消毒后6.5～9.5；所述培养基配方成分的百分比含量均为重量百分比。
[0055] 发酵完毕放罐后的功能菌菌液，与无菌草炭进行等质量比例混合，混合均匀，即为菌剂产品。
[0056] 实施例2
[0057] 本发明微生物菌剂WSW与对照CK(不添加任何钝化剂)在水稻不同生长时期降低水稻植株各器官镉含量的实验结果，见图1和表1。
[0058] 本发明微生物菌剂使用方式：整地前将菌剂按100kg/亩水稻全田均匀撒施，翻地，经耕耙整地后即可种植。
[0059] 表1本发明微生物菌剂产品在水稻上应用的降镉效果
[0060]
