本发明通过巧妙地设计针对转基因玉米品系MIR604的带标记的特异性引物和竞争性引物，应用PCR扩增和试纸条联合检测技术，实现了MIR604的高效快速检测。该方法特异性强，灵敏度高和稳定性好，使用方便快捷，节约成本和时间，原理和操作简单，不需特殊仪器，适合检验检疫部门运用和推广。
1.一种用于转基因玉米品系MIR604检测的特异性引物和竞争性引物，其特征在于，序列为： 上游引物 604-F-bio ： 5’Biotin —TCCGCAATGTGTTATTAAGAGT—3’ 下游引物 604-B-fit： 5’Fitc—TATTATAATCCGAAACGGAGCA—3’ 竞争引物604-F-comp： 5’—GGCCTTAATAACACATTGCGGA—3’。
2.一种用于检测转基因玉米品系MIR604的试剂盒其特征在于，包括如下成分：（1）阳性对照转基因玉米品系MIR604 DNA模板和阴性对照非转基因玉米DNA模板（2）MIR604上下游引物和竞争引物上游引物 604-F-bio： 5’ Biotin—TCCGCAATGTGTTATTAAGAGT—3’ 下游引物 604-B-fit： 5’ Fitc—TATTATAATCCGAAACGGAGCA—3’竞争引物604-F-comp： 5’—GGCCTTAATAACACATTGCGGA—3’（3）10×ExTaq PCR Buffer ,ddH2O,2.5mM dNTP ,5U/μL ExTaq酶（4）生物素（Biotin）、荧光素（Fitc）抗原标记的薄膜层析试纸条。
3.一种转基因玉米品系MIR604的快速检测方法，包括如下步骤：（1）PCR反应体系：
10μM竞争引物604-F-comp 4μl模板DNA 1μl
5U/μL ExTaq酶 0.25μlddH2O 15.25μl总体积： 25μlPCR反应体系中涉及的引物序列如下：
上游引物 604-F-bio： 5’ Biotin—TCCGCAATGTGTTATTAAGAGT—3’下游引物 604-B-fit： 5’ Fitc—TATTATAATCCGAAACGGAGCA—3’竞争引物604-F-comp： 5’—GGCCTTAATAACACATTGCGGA—3’（2）PCR反应条件：94 ℃ 预变性 1 min，94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸
30 s，30个循环，72 ℃延伸5 min（3）判定结果：PCR 产物用试纸条检测，若控制线正常，检测线呈现阳性，则说明该样品含有转基因玉米品系MIR604，若呈现阴性，则说明该样品中不含有转基因玉米品系MIR604。
一种新的转基因玉米品系MIR604检测试剂盒及其检测方
法
技术领域
[0001] 本发明涉转基因玉米品系检测领域，提供了一种利用PCR扩增和核酸试纸条联合检测技术快速检测转基因玉米品系MIR604的方法及其试剂盒，适用于口岸检验检疫机构应用对转基因玉米品系MIR604的检测。
背景技术
[0002] 伴随着转基因技术的快速发展，转基因作物种类越来越多，种植面积也逐年递增，转基因涉及的作物种类繁多，包括大豆、玉米、小麦、棉花、番茄、马铃薯等，而每个转基因品系都有独特的基因组插入位置及边界序列，目前我国对进口转基因玉米产品采取审批制度，未经允许的玉米品系禁止进入我国，建立转基因产品品系鉴定方法有实际的需求。
[0003] 由于普通PCR方法的凝胶成像检测、实时荧光PCR检测方法都需要价格高昂的专用检测设备，昂贵的仪器设备成本限制了PCR检测方法的推广。
[0004] 本发明本研究通过巧妙地设计针对转基因玉米品系MIR604的带标记的特异性引物和竞争性引物，应用PCR扩增和核酸试纸条联合检测技术，实现了转基因玉米品系MIR604的高效快速检测。该方法特异性强，灵敏度高和稳定性好，对于提高MIR604品系的准确性、缩短检测时间具有重要的作用。该检测方法方便快捷，节约成本和时间，原理和操作简单，不需特殊仪器，适合检验检疫部门运用和推广，同时对其他玉米品系的快速检测也具有重要的借鉴意义。
发明内容
[0005] 本发明需要解决的技术问题是提供用于检测MIR604的特异性引物和竞争性引物。
[0006] 本发明需要解决的另一问题是提供包含上述引物的PCR检测试剂盒。
[0007] 本发明用于检测MIR604的PCR引物序列为：
[0008] 上游引物 604-F-bio ： 5’biotin —TCCGCAATGTGTTATTAAGAGT—3’[0009] 下游引物 604-B-fit： 5’fitc—TATTATAATCCGAAACGGAGCA—3’
[0010] 竞争引物604-F-comp： 5’—GGCCTTAATAACACATTGCGGA—3’。
[0011] 本发明的MIR604检测试剂盒，包括以下成分：
[0012] （1）MIR604DNA模板和阴性对照拟MIR604 DNA模板
[0013] （2）MIR604上下游引物和竞争引物
[0014] 上游引物 604-F-bio ： 5’biotin —TCCGCAATGTGTTATTAAGAGT—3’[0015] 下游引物 604-B-fit： 5’fitc—TATTATAATCCGAAACGGAGCA—3’
[0016] 竞争引物604-F-comp： 5’—GGCCTTAATAACACATTGCGGA—3’。
[0017] （3）10×ExTaq PCR Buffer ,DDH2O,2.5mM dNTP ,5U/μl ExTaq酶
[0018] 用上述方法对待测样品DNA进行PCR扩增，PCR 产物用试纸条检测，若控制线正常，检测线呈现阳性，则说明该样品含有MIR604，若呈现阴性，则说明该样品中不含有MIR604。
[0019] 与现有技术相比，本发明的进步在于：使用仪器简单，无需琼脂糖凝胶电泳、紫外凝胶成像，从而避免了溴化乙锭的污染，节省时间，特异性强，灵敏度高，稳定性好，降低了实验室的投入，适合基层实验室推广使用。
附图说明
[0020] 图1为转基因玉米品系MIR604试纸条特异性检测结果，1为MON810，2为MON863、3为TC1507、4为ES3272、5为GA21、6为59122、7为MIR604、8为BT11、9为BT176、10为NK603、11为非转基因玉米基因组DNA、12为DDH2O，从图1 可以看出使用本试剂盒能准确地检测出转基因玉米品系MIR604。
具体实施方式
[0021] MIR604引物设计：
[0022] 1 TCCGCAATGT GTTATTAAGA GTTGGTGGTA CGGGTACTTT AACTAACGAG GTGTGTCGCG[0023] 61 CAGCGCTCCT GCACGGATGT AGCTTTGGAT TGCTGGATAA TGTCTCGCGC AAGCGTCGTA[0024] 121 TTTATTTATT TATTTATTAC AGCCTCCACC GCCGTGCGTG CTCCGTTTCG GATTATAATA[0025] 根据转基因玉米品系MIR604的插入位点特异序列，利用引物设计软件设计两组引物（下划线位置），上游引物5’标记生物素（biotin），下游引物5’标记荧光素（fitc），以及上游引物竞争引物。
[0026] 上游引物 604-F-bio ： 5’biotin —TCCGCAATGTGTTATTAAGAGT—3’[0027] 下游引物 604-B-fit： 5’fitc—TATTATAATCCGAAACGGAGCA—3’
[0028] 竞争引物 604-F-comp： 5’—GGCCTTAATAACACATTGCGGA—3’。
[0029] 本实验测试了10种转基因玉米品系及一种非转基因玉米，见下表：
[0030]编号供试玉米种类
1 MON810
2 MON863
3 TC1507
4 ES3272
5 GA21
6 59122
7 MIR604
8 BT11
9 BT176
10 NK603
11 非转基因玉米
[0031] 实施例1、转基因玉米品系MIR604的检测
[0032] DNA提取：采用Qiagen DNeasy plant mini kit试剂盒，按步骤提取玉米基因组DNA溶于100uL TE中，-20℃保存备用。
[0033] PCR扩增：分别以MON810、MON863、TC1507、ES3272、GA21、59122、BT11、BT176、NK603、非转基因玉米基因组DNA为阴性对照，MIR604基因组DNA作为阳性对照，ddH2O为空白对照，进行PCR扩增。
[0034] PCR反应体系：
[0035] 10×ExTaq Buffer 2.5μl
[0036] dNTP（2.5mmol/L） 1μl
[0037] 上游引物（10μmol/L） 0.5μl
[0038] 下游引物（10μmol/L） 0.5μl
[0039] 竞争引物（10μmol/L） 4 μl
[0040] 模板DNA 1μl
[0041] ExTaq酶(5U/μL) 0.25μl
[0042] ddH2O 15.25μl
[0043]
[0044] 总体积： 25μl
[0045] PCR反应条件：94 ℃ 预变性 1 min，94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环，72 ℃延伸5 min。
[0046] 试纸条检测：分别取4 μL扩增产物加到试纸条的样品垫上，然后滴加2-3滴缓冲液，5 min后判读并记录结果,结果如图1， 1为MON810，2为MON863、3为TC1507、4为ES3272、5为GA21、6为59122、7为MIR604、8为BT11、9为BT176、10为NK603、11为非转基因玉米基因组DNA、12为DDH2O。
[0047] 结果表明，图1的控制线均正常，只有7号MIR604在检测线出现特异性红色条带，其余转基因玉米品系、非转基因玉米及空白对照均无条带出现，只有在MIR604检测试纸条的检测线显示特异性条带时，表明检测物中含有转基因玉米品系MIR604成分。
[0048] 序列表
[0049] SEQUENCE LISTING
[0050] <110> 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心
[0051] <120> 一种新的转基因玉米品系MIR604检测试剂盒及其检测方法
[0052] <141> 2014－08－20
[0053] <160> 3
[0054] <210> 1
[0055] <211> 22
[0056] <212> DNA
[0057] <213> 人工序列
[0058] <400> 1
[0059] tccgcaatgt gttattaaga gt 22[0060] <210> 2
[0061] <211> 22
[0062] <212> DNA
[0063] <213> 人工序列
[0064] <400> 2
[0065] tattataatc cgaaacggag ca 22[0066] <210> 3
[0067] <211> 22
[0068] <212> DNA
[0069] <213> 人工序列
[0070] <400> 3
[0071] ggccttaata acacattgcg ga 22
