本发明公开一种以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法，其特征是利用脲酶特异性催化尿素生成氨和二氧化碳，新生成的氨能提高体系的pH值，使N‑乙酰‑L‑半胱氨酸保护的金纳米团簇的荧光发生猝灭，从而表现出荧光发射光谱特征的变化，可以直接用于尿素的含量测定。在0.055~0.55mmol/L范围内F650与尿素浓度呈线性关系，检测限为0.055mmol/L。本发明选择性高，重现性好，能够作为分析方法应用于环境及生命科学体系中尿素的高灵敏测定。
1.一种以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法，其特征是利用脲酶特异性催化尿素生成氨和二氧化碳的体系，新生成的氨能提高所述体系的pH值，使N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇的荧光发生猝灭，从而表现出荧光发射光谱特征的变化，能直接用于尿素的含量测定；所述的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇与脲酶溶液和尿素测定液按体积比为4：4：1混合，25°C反应40分钟后测定在650 nm处的发射光强度值（F650）以判断尿素的浓度。
2.根据权利要求1所述的以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法，其特征是所使用的脲酶浓度为10 U/mL。
3.根据权利要求2所述的以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法，其特征是所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备：将浓度为0.02~0.18 mol/L 的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液和浓度为0.1~0.8 mol/L的氢氧化钠溶液加入到浓度为0.01~0.1 g/L的氯金酸溶液中，混匀，置于20~70°C水浴恒温反应0~
3.5小时，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行透析纯化处理，得到N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇荧光材料水溶液。
4.根据权利要求3所述的以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法，其特征是所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备：将0.6 mL浓度为0.5 mol/L的氢氧化钠溶液与0.4 mL浓度为0.02 g/L的氯金酸溶液加入到
4 mL浓度为0.08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于37°C恒温水浴槽中反应
2.5 h，反应液由浅黄色变为无色，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理得到N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇溶液。
5.根据权利要求3或4所述的以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法，其特征是利用N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇在650 nm处的发射光强度值（F650）以判断尿素含量，所使用的激发波长为355 nm。
6.根据权利要求5所述的以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法，其特征是将金纳米团簇溶液和脲酶溶液混合均匀后，将不同浓度尿素溶液加入到上述混合液中，在25°C的恒温水浴槽中反应后，测定在650 nm处的发射光强度值（F650），在尿素浓度为0.055~
0.55mmol/L的范围内F650与尿素浓度呈线性关系，检测限为0.055mmol/L。
7.一种以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法，包括如下步骤：取新鲜人尿液，用pH=6.0的缓冲液稀释，取0.05 mL稀释液加入到由0.2 mL N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇溶液和0.2 mL、浓度为10 U/mL的脲酶溶液组成的混合液中，在25°C的恒温水浴槽中反应40分钟，测定在650 nm处的发射光强度值（F650），通过标准曲线进行定量，获得尿液中的尿素含量。
8.根据权利要求7所述的以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法，其特征是所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备：将0.6 mL浓度为0.5 mol/L的氢氧化钠溶液与0.4 mL浓度为0.02 g/L的氯金酸溶液加入到
4 mL浓度为0.08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于37°C恒温水浴槽中反应
2.5 h，反应液由浅黄色变为无色，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理，纯化后的金纳米团簇溶液放置于4°C冰箱避光保存。
9.根据权利要求7或8所述的以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法，其特征是所述的新鲜人尿液为用pH=6.0的醋酸盐缓冲液稀释200倍后选取的0.05 mL稀释液。
以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法
技术领域
[0001] 本发明涉及以N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇为荧光探针的尿素测定方法，属于分析化学及纳米技术领域。
背景技术
[0002] 尿素是人体蛋白质代谢的终产物，由肝脏产生，经血液运输至肾脏以尿液形式排出。尿素的生成量取决于蛋白质的摄入量、组织蛋白质的分解代谢以及肝功能状况。尿素是
临床及生物化学一个重要的目标分析物，它是评价尿毒症毒素水平、肾脏及肝脏细胞功能
的重要标志。目前，尿素的测定方法包括：氨电极法、脲酶-波氏法，脲酶-谷氨酸脱氢酶偶联法，脲酶-亮氨酸脱氢酶偶联法等。
[0003] 近年来，荧光金属纳米团簇作为一种新型的荧光纳米材料备受关注。金属纳米团簇是指在一定的分子层保护作用下，由几个到几百个金属原子构成的分子级聚集体，其直
径一般小于2 nm，接近于电子的费米波长（约0.7 nm）。由于其独特的物理、电学和光学性
质，金属纳米团簇在单分子光电、催化、生物成像和传感器等领域显示出广泛的应用前景。
在所有的金属纳米团簇材料中，金纳米团簇（gold nanoclusters，AuNCs）因其具有化学性
质稳定和生物相容性好等优点，是目前研究最多的一种金属纳米团簇材料。与小分子荧光
染料和荧光蛋白相比，AuNCs用作荧光探针具有水溶性好、比表面积大、表面易于修饰、抗光漂白能力强以及荧光性质可调等优点。因此，金纳米团簇有望弥补一些有毒小分子荧光染
料的不足，甚至可以取代某些光稳定性差的传统荧光探针。
[0004] 本发明以N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇为荧光探针，建立了一种尿素测定的新方法。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种以N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇为荧光探针的尿素测定方法。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0007] 本发明所述的以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法，其特征是利用脲酶特异性催化尿素生成氨和二氧化碳的体系，新生成的氨能提高所述体系的pH值，使N-乙酰-L-半
胱氨酸保护的金纳米团簇的荧光发生猝灭，从而表现出荧光发射光谱特征的变化，能直接
用于尿素的含量测定。
[0008] 所述金纳米团簇溶液，脲酶溶液和尿素测定液按体积比为4：4：1混合，25°C反应40分钟测定发射光强度值F650以判断尿素的浓度。
[0009] 所使用的脲酶浓度为10 U/mL。
[0010] 所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备：将浓度为0.02~0.18 mol/L 的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液和浓度为0.1~0.8
mol/L的氢氧化钠溶液加入到浓度为0.01~0.1 g/L的氯金酸溶液中，混匀，置于20~70°C水
浴恒温反应0~3.5小时，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行透析纯化
处理，得到N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇荧光材料水溶液。
[0011] 所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备：将0.6 mL浓度为0.5 mol/L的氢氧化钠溶液与0.4 mL浓度为0.02 g/L的
氯金酸溶液加入到4 mL浓度为0.08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于37°C恒
温水浴槽中反应2.5 h，反应液由浅黄色变为无色，反应结束后用截留分子量为3500的透析
袋对反应液进行纯化处理得到N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇溶液。
[0012] 利用N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇在650 nm处的发射光强度值（F650）以判断尿素含量，所使用的激发波长为355 nm。
[0013] 将金纳米团簇溶液和脲酶溶液混合均匀后，将不同浓度尿素溶液加入到上述混合液中，在25°C的恒温水浴槽中反应后，测定发射光强度值F650，在尿素浓度为0.055~
0.55mmol/L的范围内F650与尿素浓度呈线性关系，检测限为0.055mmol/L。
[0014] 本发明所述的以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法，包括如下步骤：取新鲜人尿液，用pH=6.0的缓冲液稀释，取0.05 mL稀释液加入到由0.2 mL N-乙酰-L-半胱氨酸保
护的金纳米团簇溶液和0.2 mL、浓度为10 U/mL的脲酶溶液组成的混合液中，在25°C的恒温
水浴槽中反应40分钟，测定发射光强度值F650，通过标准曲线进行定量，获得尿液中的尿素
含量。
[0015] 所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备：将0.6 mL浓度为0.5 mol/L的氢氧化钠溶液与0.4 mL浓度为0.02 g/L的
氯金酸溶液加入到4 mL浓度为0.08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于37°C恒
温水浴槽中反应2.5 h，反应液由浅黄色变为无色，反应结束后用截留分子量为3500的透析
袋对反应液进行纯化处理，纯化后的金纳米团簇溶液放置于4°C冰箱避光保存。
[0016] 所述的新鲜人尿液为用pH=6.0的醋酸盐缓冲液稀释200倍后选取的0.05 mL稀释液。
[0017] 具体地说，本发明采用的技术方案为：
[0018] （一）金纳米团簇荧光材料的制备
[0019] 以下过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡，并用双蒸水彻底清洗，晾干。金纳米团簇荧光材料的制备方法如下：将0.6 mL浓度为0.5 mol/L的氢氧化钠溶液与0.4 mL
浓度为0.02 g/L的氯金酸溶液加入到4 mL浓度为0.08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液
中，混匀，置于37°C恒温水浴槽中反应2.5小时，反应液由浅黄色变为无色。反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理，纯化后的金纳米团簇溶液放置于4°C冰
箱避光保存。
[0020] （二）尿素的测定：
[0021] 0.2 毫升步骤（一）制备的金纳米团簇溶液与0.2 毫升浓度为10 U/mL的脲酶溶液（pH=6.0）混合均匀后，将0.05 毫升（pH=6.0）的样品溶液加入到上述混合液中，在25 °C的恒温水浴槽中反应40分钟。反应结束后，以355 nm为激发波长，测定在650 nm处的发射光强
度值（F650），通过标准曲线进行尿素的测定。
[0022] 本发明的优点：
[0023] （1）本发明基于脲酶特异性催化尿素生成氨和二氧化碳，新生成的氨能提高体系的pH值，使N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇的荧光发生猝灭，从而表现出荧光发射光
谱特征的变化，可以直接用于尿素的含量检测。
[0024] （2）本发明所使用的金纳米团簇直接由N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸得到，无需进行进一步的修饰，制备过程简单快速。
[0025] （3）本发明对样品的处理要求低，抗干扰性好，尿液仅需适当稀释即可进行测定。
[0026] （4）本发明的检测灵敏度高，荧光分光光度计测定的检测限为0.055 mmol/L。
附图说明
[0027] 图1为金纳米团簇溶液在紫外灯下的外观图。图中（：A）空白对照组（；B）尿素组（尿素浓度为0.88 mmol/L）。
[0028] 图2为金纳米团簇溶液的发射光谱图。图中：（A）空白对照组；（B）尿素组（尿素浓度为0.88 mmol/L）。
[0029] 图3为在金纳米团簇溶液中加入脲酶和尿素后，荧光发射光强度随时间的变化图。
[0030] 图4为金纳米团簇溶液与脲酶催化反应液（不同浓度尿素）孵育后的荧光发射光谱图。
[0031] 图5为金纳米团簇溶液的发射光强度值（F650）与尿素浓度之间的关系图。
[0032] 图6为金纳米团簇溶液的发射光强度值（F650）与尿素浓度之间的线性关系图。
[0033] 图7为金纳米团簇溶液与不同有机物作用后的发射光强度（F650）图。（黑柱：有机物+脲酶+金簇；白柱：有机物+脲酶+尿素（0.55 mM）+金簇）
[0034] 图8为金纳米团簇溶液与不同阳离子作用后的发射光强度（F650）图。（黑柱：阳离子+脲酶+金簇；白柱：阳离子+脲酶+尿素（0.55 mM）+金簇）
[0035] 图9为金纳米团簇溶液与不同阴离子作用后的发射光强度（F650）图。（黑柱：阴离子+脲酶+金簇；白柱：阴离子+脲酶+尿素（0.55 mM）+金簇）。
具体实施方式
[0036] 实例1：
[0037] 金纳米团簇荧光材料的制备过程如下：将0.6 mL浓度为0.5 mol/L的氢氧化钠溶液与0.4 mL浓度为0.02 g/L的氯金酸溶液加入到4 mL浓度为0.08 mol/L的N-乙酰-L-半胱
氨酸溶液中，混匀，置于37°C恒温水浴槽中反应2.5 h。反应结束后用截留分子量为3500的
透析袋对反应液进行纯化处理。所得到的金纳米团簇溶液可见光下为无色，紫外灯照射下
产生强烈的红色荧光。4°C暗处保存，能保持至少一个月的相对稳定。
[0038] 实例2：
[0039] 0.2 毫升实例1所制得的金纳米团簇溶液与0.2 毫升浓度为10 U/mL的脲酶溶液（pH=6.0）混合均匀后，将0.05 毫升（pH=6.0）尿素溶液（0.88 mmol/L）加入到上述混合液中，在25°C的恒温水浴槽中反应40 分钟。设置一组无尿素的空白对照。反应结束后，在紫外灯下观察，空白对照组显现红色荧光（图1中的A），而尿素组的金纳米团簇的红色荧光发生
猝灭（图1中的B）。图2为空白对照组和尿素组金纳米团簇溶液的荧光发射光谱图。
[0040] 实例3：
[0041] 0.2 毫升实例1所制得的金纳米团簇溶液与0.2 毫升浓度为10 U/mL的脲酶溶液（pH=6.0）混合均匀后，将0.05 毫升（pH=6.0）含有不同浓度尿素的溶液加入到上述混合液中，在25°C的恒温水浴槽中反应0~50分钟。结果表明，金纳米团簇的荧光在40分钟后趋于稳
定（见图3）。
[0042] 实例4：
[0043] 0.2 毫升实例1所制得的金纳米团簇溶液与0.2 毫升浓度为10 U/mL的脲酶溶液（pH=6.0）混合均匀后，将0.05 毫升（pH=6.0）含有不同浓度尿素的溶液加入到上述混合液中，在25°C的恒温水浴槽中反应40分钟。由图可知，随着尿素浓度的逐渐增大，金纳米团簇
的发射光谱逐渐受到抑制（见图4），发射光强度值F650逐渐减小（见图5）。如图6所示，在尿素浓度为0.055~0.55 mmol/L的范围内发射光强度值F650与尿素浓度呈线性关系，检测限为
0.055mmol/L。
[0044] 实例5：
[0045] 0.2 毫升实例1所制得的金纳米团簇溶液与0.2 毫升浓度为10 U/mL的脲酶溶液（pH=6.0）混合均匀后，将0.05 毫升（pH=6.0）浓度为0.22 mmol/L尿素的溶液加入到上述混合液中，在25°C的恒温水浴槽中反应40分钟，测定发射光强度值F650。重复上述实验12次，得相对标准偏差（RSD）为3.6%，表明本方法重现性良好。
[0046] 实例7：
[0047] 0.2 毫升实例1所制得的金纳米团簇溶液与0.2 毫升浓度为10 U/mL的脲酶溶液（pH=6.0）混合均匀后，将0.05 毫升（pH=6.0）浓度为0.1 mmol/L的不同有机物溶液加入到上述混合液中，在25°C的恒温水浴槽中反应40分钟，测定发射光强度值F650。如图7所示， 0~
20依次为空白、谷胱甘肽、抗坏血酸、牛血清蛋白、ATP、尿酸、葡萄糖、L-精氨酸、L-半胱氨酸、L-甲硫氨酸、L-丝氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、L-组氨酸、L-天冬氨酸、L-苯丙氨酸、L-亮氨酸、L-丙氨酸、L-苏氨酸、L-乳糖、麦芽糖，结果表明本方法抗有机物干扰能力强。
[0048] 实例8：
[0049] 0.2 毫升实例1所制得的金纳米团簇溶液与0.2 毫升浓度为10 U/mL的脲酶溶液（pH=6.0）混合均匀后，将0.05 毫升（pH=6.0）浓度为0.01 mmol/L的不同阳离子加入到上述混合液中，在25°C的恒温水浴槽中反应40分钟，测定发射光强度值F650。如图8所示，0~19依次为空白，Ni2+、Mg2+、Fe3+、Cd2+、Mn2+、NH4+、Cu2+、Ag+、Fe2+、Al3+、Pb2+、Zn2+、Ba2+、Co2+、Hg+、Cr3+、Ca2+、 Na+、K+，结果表明本方法抗阳离子干扰能力强。
[0050] 实例9：
[0051] 0.2 毫升实例1所制得的金纳米团簇溶液与0.2 毫升浓度为10 U/mL的脲酶溶液（pH=6.0）混合均匀后，将0.05 毫升（pH=6.0）浓度为0.01 mmol/L的不同阴离子加入到上述混合液中，在25°C的恒温水浴槽中反应40分钟，测定发射光强度值F650。如图8所示，0~18依
2- - 2- - - 2- - 2- - - 2- - 2- -
次为空白、S2O3 、NO2、SO3 、F、SCN 、S 、H2PO4、BrO7 、IO3、BrO3、SO4 、NO3、S2O8 、ClO4 、I-、Br-、CO32-、Ac-，结果表明本方法抗阴离子干扰能力强。
[0052] 实例10：
[0053] 取新鲜人尿液，用pH=6.0的醋酸盐缓冲液稀释200倍，取0.05 mL稀释液加入到由实例1所制得的0.2 mL金纳米团簇溶液和0.2 mL脲酶溶液（浓度为10 U/mL）组成的混合液
中，在25°C的恒温水浴槽中反应40分钟，测定发射光强度值F650。通过标准曲线进行定量，获得尿样中的尿素含量。与标准方法测定结果进行比较，结果表明本发明所使用的方法与标
准方法无显著性差异（表1）。
[0054] 表1
[0055]
[0056] F0.05, 2, 2=19.00, t0.05, 4=2.776。
