截短的人乳头瘤病毒45型L1蛋白

摘要

本发明涉及一种截短的人乳头瘤病毒45型L1蛋白，其编码序列和制备方法，以及包含其的病毒样颗粒，所述蛋白和病毒样颗粒可用于预防HPV（特别是HPV45）感染及由HPV（特别是HPV45）感染所导致的疾病例如宫颈癌等。本发明还涉及上述蛋白和病毒样颗粒用于制备药物组合物或疫苗的用途，所述药物组合物或疫苗用于预防HPV（特别是HPV45）感染及由HPV（特别是HPV45）感染所导致的疾病例如宫颈癌等。

权利要求

1.一种截短的HPV45L1蛋白，其与野生型HPV45L1蛋白相比，N端截短了30个、35个或40个氨基酸。

2.权利要求1的截短的HPV45L1蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示。

3.一种分离的核酸，其编码权利要求1或2的截短的HPV45L1蛋白。

4.包含权利要求3的分离的核酸的载体。

5.包含权利要求3的分离的核酸和/或权利要求4的载体的宿主细胞。

6.一种HPV45病毒样颗粒，其含有权利要求1或2的截短的HPV45L1蛋白，或者由权利要求1或2的截短的HPV45L1蛋白组成。

7.一种组合物，其包含权利要求1或2的截短的HPV45L1蛋白，或权利要求3的分离的核酸，或权利要求4的载体，或权利要求5的宿主细胞，或权利要求6的HPV45病毒样颗粒。

8.一种药物组合物或疫苗，其包含权利要求6的HPV45病毒样颗粒，任选地还包含药学可接受的载体和/或赋形剂。

9.权利要求8的药物组合物或疫苗，其中，所述HPV45病毒样颗粒以预防HPV感染或宫颈癌有效量存在。

10.权利要求8或9的药物组合物或疫苗，其中，所述药物组合物或疫苗还包含至少一种选自下列的病毒样颗粒：HPV6L1蛋白病毒样颗粒，HPV11L1蛋白病毒样颗粒，HPV16L1蛋白病毒样颗粒，HPV18L1蛋白病毒样颗粒，HPV31L1蛋白病毒样颗粒，HPV33L1蛋白病毒样颗粒，HPV52L1蛋白病毒样颗粒和HPV58L1蛋白病毒样颗粒。

11.获得截短的HPV45L1蛋白的方法，其包括利用大肠杆菌表达系统表达权利要求1或2的截短的HPV45L1蛋白，然后将含有该蛋白的裂解上清进行纯化处理。

12.权利要求11的方法，其中，所述方法包括步骤：

a)在大肠杆菌中表达所述截短的HPV45L1蛋白，

b)将表达所述截短的HPV45L1蛋白的大肠杆菌在盐浓度为100mM-600mM的溶液中破碎，分离得到上清液，c)用水或低盐溶液将b)获得的上清液的盐浓度降至100mM或以下，最低至0，并收集沉淀，d)将c)获得的沉淀在150mM－2500mM盐溶液中重新溶解，同时加入还原剂，分离得到溶液，该溶液中含纯度至少50％的截短的HPV45L1蛋白。

13.制备权利要求6的HPV45病毒样颗粒的方法，其包括步骤：

a)将权利要求12的方法获得的截短的HPV45L1蛋白通过色谱层析进行纯化，b)将步骤a)中得到的截短的HPV45L1蛋白去除还原剂。

14.一种制备疫苗的方法，其包括将权利要求6的HPV45病毒样颗粒或通过权利要求13的方法获得的HPV45病毒样颗粒与药学可接受的载体和/或赋形剂混合，任选地还混合一种或多种选自HPV6，11，16，18，31，33，52和58的HPV型别的病毒样颗粒。

15.权利要求1或2的截短的HPV45L1蛋白，或权利要求6的HPV45病毒样颗粒，或通过权利要求11或12的方法获得的截短的HPV45L1蛋白，或通过权利要求13的方法获得的HPV45病毒样颗粒在制备药物组合物或疫苗中的用途，所述药物组合物或疫苗用于预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病。

16.权利要求15的用途，其中，所述HPV感染是HPV45感染。

17.权利要求15的用途，其中，所述由HPV感染所导致的疾病是宫颈癌。

说明书

截短的人乳头瘤病毒45型L1蛋白

技术领域

[0001] 本发明涉及分子病毒学和免疫学领域。具体地，本发明涉及一种截短的人乳头瘤病毒45型L1蛋白，其编码序列和制备方法，以及包含其的病毒样颗粒，所述蛋白和病毒样颗粒可用于预防HPV（特别是HPV45）感染及由HPV（特别是HPV45）感染所导致的疾病例如宫颈癌等。本发明还涉及上述蛋白和病毒样颗粒用于制备药物组合物或疫苗的用途，所述药物组合物或疫苗用于预防HPV（特别是HPV45）感染及由HPV（特别是HPV45）感染所导致的疾病例如宫颈癌等。

背景技术

[0002] 人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)属于乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)乳头瘤病毒属，为无包膜DNA病毒。该病毒基因组为双链闭环DNA，大小约为7.2～8kb，具有8个开放阅读框。该病毒基因组按功能的不同可以分为三个区域：①早期区(E)，约4.5kb，编码E1、E2、E4～E7共6个与病毒复制，转录及转化有关的非结构蛋白；②晚期区(L)，约2.5kb，编码主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2；③长调控区(LCR)，位于L区末端与E区起始端之间，长约800～900bp，不编码任何蛋白，含DNA复制和表达调控元件。HPV病毒颗粒直径为45～55nm，核衣壳呈20面体对称，有72个壳微粒，由L1及L2组成。

[0003] 目前已知的HPV约有90多种亚型，在人群中主要引起皮肤，粘膜的疣状病变。根据其与肿瘤发生的关系，HPV可分为3组：①低或无致癌风险组，包括HPV6、11、39、41、42、43；②中度致癌风险组，包括HPV31、33、35、51、52；③高度致癌风险组，包括HPV16、18、58、45。

[0004] HPV分子流行病学调查证实，高危型HPV感染是宫颈癌发生的重要启动因子。在所有宫颈癌标本中，HPV DNA检出率高达80％以上。宫颈癌是一种常见的女性恶性肿瘤，其发病率仅次于乳腺癌，是严重威胁女性健康的杀手。据统计，每年世界范围内约有490,000例的新发病例，约有270,000人死于该疾病（Boyle，P.，and J.Ferlay.Ann Oncol2005，16:481-8）。在所有宫颈癌病例中，发生于发展中国家的占了约83％，在这些国家中，宫颈癌甚至能够占到女性恶性肿瘤的15％。而在发达国家，这个数字仅占到1.5％。在撒哈拉以南地区，中南亚，拉丁美洲，东亚均为宫颈癌的高发区。我国也属于宫颈癌高发区。在陕西略阳县，已婚妇女中宫颈癌的发病率高达1026/100000。

[0005] 有关世界范围内宫颈癌标本中HPV型别分布的荟萃分析发现，宫颈癌中最常见的HPV型别依次是16、18、58、33、45、31、52、35、59、39、51、59、68、6、73、66、70、82（按照降序排列）。在宫颈癌患者中HPV45的感染率为4.4%，在HPV16(54.4%)、HPV18(16.5%)、HPV58(5.1%)、HPV33(4.7%)之后，位于第5位(Y  P  Bao，N Li，J  S  Smith and  Y  L Qiao.International Journal of STD&AIDS，2008，19:106-111)。这说明HPV45在世界范围内的妇女宫颈癌患者中的感染率较高，是普遍易感染的HPV型别之一。

[0006] 目前已上市的HPV疫苗为Merck的 及GSK的 上述两种疫苗分别含有HPV6/11/16/18及HPV16/18VLP，但均不包含在中国及亚洲妇女中普遍易感的HPV45型别VLP。

[0007] 因此，针对中国以及亚洲等发展中国家妇女安全有效的HPV疫苗，特别是针对HPV16，18及45等高危型别的疫苗，是有效预防宫颈癌，改善广大妇女（特别是我国及亚洲妇女）健康状况的有效途径。

[0008] HPV L1蛋白为主要衣壳蛋白，分子量为55-60kDa，是HPV疫苗主要靶蛋白。在多种表达系统中表达的HPV L1蛋白无需L2蛋白辅助即可形成在形态结构上与天然病毒颗粒相似的病毒样颗粒（Virus-Like Particle，VLP）。该病毒样颗粒为二十面体立体对称结构，由72个L1蛋白的五聚体组成。其保留了病毒颗粒的天然表位，具有较强的免疫原性，可诱导针对同型HPV病毒的中和抗体(Kirnbauer，R.，F.Booy，et al.1992Proc Natl Acad Sci U S A89(24):12180-4)。并且，病毒样颗粒不带有病毒核酸，无潜在致癌危险，具有良好的安全性。因此，VLP疫苗已成为HPV疫苗发展的主要方向。

[0009] HPV VLP疫苗研制的关键是能够大量高效制备VLP样品。目前较为常用的VLP表达系统可以分为真核表达系统及原核表达系统。

[0010] 常用的真核表达系统有痘病毒表达系统、昆虫杆状病毒表达系统、酵母表达系统。在真核表达系统中所表达的HPV L1蛋白天然构象破坏少，能自发形成VLP，往往只需进行简单的密度梯度离心即可得到纯化的VLP，为纯化工作提供极大的便利。但是由于真核表达系统的表达量低，培养成本高，给大规模工业化生产带来了极大困难。目前已上市的HPV疫苗采用了酿酒酵母表达系统，其表达量低，生产成本高，因此该产品价位偏高，
影响其广泛应用。

[0011] 在原核表达系统中利用大肠杆菌表达系统表达HPV L1蛋白已有报道。例如已报道利用大肠杆菌表达HPV16L1蛋白（Banks，L.，G.Matlashewski，et al.(1987).J Gen Virol68(Pt12):3081-9）。但是大肠杆菌表达的HPV L1蛋白大多失去其天然构象，不能产生针对HPV的保护抗体。或者尽管上述蛋白通过包含体纯化，复性等步骤也可得到HPV VLP（Kelsall，S.R.and J.K.Kulski(1995).J Virol Methods53(1):75-90），但是在复性过程中蛋白损失量大，得率低，因此，难以在大规模生产上应用。虽然HPV L1蛋白也可以在大肠杆菌中以正确构象可溶性地表达，溶解于菌体的裂解上清中，但是其表达量较低，而且上清中杂蛋白种类多且量大，要从中纯化出目的蛋白难度相当大。虽然也有文献报道通过GST融合表达的方式可以增加上清中L1蛋白的表达量，而且有助目的蛋白的纯化（Li，M.，T.P.Cripe，et al.(1997).J Virol71(4):2988-95），但融合蛋白的切割往往需要价格昂贵的酶，依然无法应用于大规模生产。

[0012] 因此，本领域仍然需要能够低成本获得且能够诱导针对HPV的保护性抗体的HPV L1蛋白及由其组成的病毒样颗粒，从而使大规模工业化生产宫颈癌疫苗成为可能。

发明内容

[0013] 本发明至少部分基于发明人的出人意料的发现：利用大肠杆菌表达系统能大量表达可以诱导针对HPV45的中和抗体的截短的HPV45L1蛋白，该截短的HPV45L1蛋白具有高产率，且经纯化后纯度可达到96％或更高，并且纯化后的所述蛋白经进一步处理可得到可诱导针对HPV45的保护性抗体的病毒样颗粒。

[0014] 因此，在一个方面，本发明涉及一种截短的HPV45L1蛋白或其变体，其与野生型HPV45L1蛋白相比，N端截短了27-40个氨基酸，例如27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39和40个氨基酸。

[0015] 在一个优选的实施方案中，与野生型HPV45L1蛋白相比，该截短的HPV45L1蛋白的N端截短了27个、30个、35个或40个氨基酸。

[0016] 在另一个优选的实施方案中，该截短的HPV45L1蛋白（以下也简称为截短蛋白）具有SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，该截短蛋白具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

[0017] 在另一个方面，本发明涉及编码本发明的截短蛋白或其变体的多核苷酸以及含有该多核苷酸的载体。

[0018] 可用于插入目的多核苷酸的载体是本领域公知的，包括但不限于克隆载体和表达载体。在一个实施方案中，载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，柯斯质粒等等。

[0019] 在另一个方面，本发明还涉及包含上述多核苷酸或载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞（如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等）。本发明的宿主细胞还可以是细胞系，例如293T细胞。

[0020] 在另一个方面，本发明涉及一种HPV45病毒样颗粒，其中该病毒样颗粒含有本发明的截短蛋白或其变体，或者由本发明的截短蛋白或其变体组成或形成。

[0021] 在一个优选的实施方案中，本发明的HPV45病毒样颗粒包含与野生型HPV45L1蛋白相比，N端截短了27-40个氨基酸，例如27个、30个、35个或40个氨基酸的截短的HPV45L1蛋白，或由所述蛋白组成或形成。在一个特别优选的实施方案中，本发明的HPV45病毒样颗粒包含具有SEQ ID NO：3，4，5或6所示序列的截短的HPV45L1蛋白，或由所述蛋白组成或形成。

[0022] 在另一个方面，本发明还涉及包含上述截短蛋白或其变体，或上述多核苷酸或载体或宿主细胞或HPV45病毒样颗粒的组合物。在一个优选的实施方案中，所述组合物包含本发明的截短蛋白或其变体。在另一个优选的实施方案中，所述组合物包含本发明的HPV45病毒样颗粒。

[0023] 在另一个方面，本发明还涉及一种药物组合物或疫苗，其包含本发明的HPV45病毒样颗粒，任选地还包含药学可接受的载体和/或赋形剂。本发明的药物组合物或疫苗可以用于预防HPV（特别是HPV45）感染或由HPV（特别是HPV45）感染所导致的疾病例如宫颈癌等。

[0024] 在一个优选的实施方案中，所述HPV45病毒样颗粒以预防HPV感染或宫颈癌有效量存在。在另一个优选的实施方案中，本发明的药物组合物或疫苗还包含至少一种选自下列的病毒样颗粒：HPV6L1蛋白病毒样颗粒，HPV11L1蛋白病毒样颗粒，HPV16L1蛋白病毒样颗粒，HPV18L1蛋白病毒样颗粒，HPV31L1蛋白病毒样颗粒，HPV33L1蛋白病毒样颗粒，HPV52L1蛋白病毒样颗粒，HPV58L1蛋白病毒样颗粒；优选地，这些病毒样颗粒各自独立地以预防宫颈癌或者相应HPV亚型感染有效量存在。

[0025] 本发明的药物组合物或疫苗可通过本领域公知的方法进行施用，例如但不限于通过口服或者注射进行施用。在本发明中，特别优选的施用方式是注射。

[0026] 在一个优选的实施方案中，本发明的药物组合物或疫苗以单位剂量形式进行施用。例如但不意欲限定本发明，每单位剂量中包含的HPV45病毒样颗粒的量为5μg－80μg，优选20μg－40μg。

[0027] 在另一个方面，本发明涉及一种获得本发明的截短蛋白的方法，其包括利用大肠杆菌表达系统表达本发明的截短蛋白，然后将含有该截短蛋白的裂解上清进行纯化处理。

[0028] 在一个优选实施方案中，获得本发明的截短蛋白的方法包括

[0029] a)在大肠杆菌中表达所述截短蛋白，

[0030] b)将表达所述截短蛋白的大肠杆菌在盐浓度为100mM-600mM的溶液中破碎，分离得到上清液，

[0031] c)用水或低盐溶液将b）获得的上清液的盐浓度降至100mM或以下，最低至0，并收集沉淀，

[0032] d)将c）获得的沉淀在150mM－2500mM盐溶液中重新溶解，同时加入还原剂，分离得到溶液，该溶液中含纯度至少50％的截短的HPV45L1蛋白。

[0033] 更一般性地，本发明还涉及一种获得HPV L1蛋白例如本发明的截短蛋白的方法，其包括

[0034] a)在大肠杆菌中表达编码HPV L1蛋白的HPV L1基因，

[0035] b)将表达HPV L1蛋白的大肠杆菌在盐浓度为100mM-600mM的溶液中破碎，分离得到上清液，

[0036] c)用水或低盐溶液将b）获得的上清液的盐浓度降至100mM或以下，最低至0，收集沉淀，

[0037] d)将c）获得的沉淀在150mM－2500mM盐溶液中重新溶解，同时加入还原剂，分离得到溶液，该溶液中含纯度至少50％的HPV L1蛋白。

[0038] 本发明还涉及一种获得本发明的HPV45病毒样颗粒的方法，其在获得本发明的截短蛋白的基础上，包括步骤：

[0039] e)将纯度至少50％的上述截短的HPV45L1蛋白进一步通过色谱层析纯化，

[0040] f)将步骤e)中得到的截短蛋白去除还原剂。

[0041] 本发明还涉及一种制备疫苗的方法，其包括将本发明的HPV45病毒样颗粒与药学可接受的载体和/或赋形剂混合，任选地还混合一种或多种选自HPV6，11，16，18，31，33，52和58的HPV型别的病毒样颗粒。如上所论述的，所获得的疫苗可以用于预防HPV（特别是HPV45）感染或由HPV（特别是HPV45）感染所导致的疾病例如宫颈癌等。

[0042] 在另一个方面，本发明涉及一种预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病的方法，其包括将预防有效量的根据本发明的HPV45病毒样颗粒或药物组合物或疫苗施用给受试者。在一个优选的实施方案中，所述HPV感染是HPV45感染。在另一个优选的实施方案中，所述由HPV感染所导致的疾病包括但不限于，宫颈癌。在另一个优选的实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

[0043] 在另一个方面，还涉及根据本发明的截短蛋白或HPV45病毒样颗粒在制备药物组合物或疫苗中的用途，所述药物组合物或疫苗用于预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病。在一个优选的实施方案中，所述HPV感染是HPV45感染。在另一个优选的实施方案中，所述由HPV感染所导致的疾病包括但不限于，宫颈癌。

[0044] 本发明中相关术语的说明及解释

[0045] 在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

[0046] 根据本发明，表述“N端截短了X个氨基酸的蛋白质”是指，用起始密码子（用于起始蛋白质翻译）编码的甲硫氨酸残基置换蛋白质N末端的第1－X位氨基酸残基所获得的蛋白质。例如N端截短了27个氨基酸的HPV45L1蛋白是指，用起始密码子编码的甲硫氨酸残基置换野生型HPV45L1蛋白N末端的第1－27位氨基酸残基所获得的蛋白质。

[0047] 根据本发明，术语“变体”是指这样的蛋白，其氨基酸序列与本发明的截短的HPV45L1蛋白（如SEQ ID NO：3，4，5或6所示的蛋白）的氨基酸序列具有一个或多个（例如1-10个或1-5个或1-3个）氨基酸不同或者具有至少60%，80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，或
99%的同一性，并且其保留了所述截短蛋白的必要特性。此处术语“必要特性”可以是如下特性中的一个或者多个：能够诱导针对HPV45的中和抗体；能够在大肠杆菌中可溶性地表达；
利用本发明所涉及的表达纯化方法能够获得高产率的纯化蛋白。术语“同一性”是对核苷酸序列或氨基酸序列的相似性的量度。通常将序列排列起来，以获得最大限度的匹配。“同一性”本身具有本领域公知的意义并且可用公开的算法（例如BLAST）来计算。

[0048] 根据本发明，术语“大肠杆菌表达系统”是指由大肠杆菌(菌株)与载体组成的表达系统，其中大肠杆菌（菌株）来源于市场上可得到的菌株，例如但不限于：ER2566，BL21(DE3)，B834(DE3)，BLR(DE3)。

[0049] 根据本发明，术语“载体（vector）”是指，可将多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸所编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌体；柯斯质粒等等。

[0050] 根据本发明，术语“截短的HPV45L1蛋白”是指在野生型HPV45L1蛋白的N端和/或C端去掉一个或者多个氨基酸后的蛋白质，其中野生型HPV45L1蛋白的例子包括但不限于NCBI数据库中P36741.1，ABP99903.1，ABP99887.1，ABP99855.1或ABP99839.1等全长L1蛋白。

[0051] 术语“截短的HPV45L1蛋白基因片段”是指这样的基因片段，其与野生型HPV45L1蛋白基因（cDNA）相比，在5'端或3'端去掉编码一个或多个氨基酸的核苷酸，其中野生型HPV45L1蛋白基因的全长序列例如但不限于NCBI数据库中如下序列：Qv31748，Qv26351，Qv06560，Qv00550，Qv34178，Qv27565，Qv31035，Qv25000，Qv35960或Qv30004等。

[0052] 根据本发明，术语“药学可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的（参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995），并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；佐剂包括但不限于铝佐剂（例如氢氧化铝），弗氏佐剂（例如完全弗氏佐剂）；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。

[0053] 根据本发明，术语“有效量”是指能够有效实现预期目的的量。例如，预防疾病（例如HPV感染）有效量是指，能够有效预防，阻止，或延迟疾病（例如HPV感染）的发生的量。测定这样的有效量在本领域技术人员的能力范围之内。

[0054] 根据本发明，术语“色谱层析”包括但不限于：离子交换色谱（例如阳离子交换色谱）、疏水相互作用色谱、吸附层析法（例如羟基磷灰石色谱）、凝胶过滤（凝胶排阻）层析、亲和层析法。

[0055] 根据本发明，本发明的截短的HPV45L1蛋白优选通过如下步骤获得：将表达截短的HPV45L1蛋白的大肠杆菌在盐浓度为100－600mM，优选200－500mM的缓冲液中进行破碎，离心破碎溶液，得到上清液；用水或低盐浓度（通常低于破碎用的盐浓度）的溶液降低所得上清液的盐浓度至盐浓度100mM－0mM，从而截短的HPV45L1蛋白在上清液中沉淀；将沉淀在含还原剂及盐浓度为150－2500mM，优选200mM以上的溶液中重新溶解，从而分离得到含截短的HPV45L1蛋白的溶液，其中所述蛋白的纯度为至少50％，优选至少70％，更优选至少80％。

[0056] 可用于本发明的方法中的缓冲液是本领域公知的，包括但不限于，Tris缓冲液，磷酸盐缓冲液，HEPES缓冲液，MOPS缓冲液等等。

[0057] 根据本发明，宿主细胞的破碎可通过本领域技术人员熟知的各种方法来实现，包括但不限于匀浆器破碎、均质机破碎、超声波处理、研磨、高压挤压、溶菌酶处理等等。

[0058] 可用于本发明的方法中的盐包括但不限于酸式盐，碱式盐，中性盐，例如碱金属盐、碱土金属盐、铵盐、盐酸盐、硫酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐或磷酸氢盐，特别是NaCl、KCl、NH4Cl、(NH4)2SO4中的一种或几种。特别优选的盐是NaCl。可用于本发明的方法中的还原剂包括但不限于DTT，2－巯基乙醇，其用量包括但不限于10mM-100mM。

[0059] 根据本发明的HPV45病毒样颗粒可通过如下步骤获得：将上述纯度至少50％的截短的HPV45L1蛋白通过例如色谱层析进行进一步分离，得到经纯化的截短蛋白溶液；去除该溶液中的还原剂，得到所述HPV45病毒样颗粒。去除还原剂的方式是本领域已知的，包括但不限于，透析，超滤或者层析等。

[0060] 发明的有益效果

[0061] 目前用于制备HPV病毒样颗粒的表达系统可以分为真核表达系统和原核表达系统。

[0062] 在真核表达系统中表达的HPV L1蛋白天然构象破坏少，能自发形成VLP，往往只需进行简单的纯化过程即可获得具有正确构象的VLP。但目前真核表达系统例如杆状病毒表达系统和酵母表达系统存在表达量低，培养成本高等缺陷，给大规模工业化生产带来了极大困难。

[0063] 在原核表达系统中，大肠杆菌表达系统具有培养成本低，表达量大的优点。然而，在大肠杆菌中表达的HPV L1蛋白往往失去正确的天然构象，以包含体形式表达于沉淀中。目前对表达于包含体中的蛋白进行复性依然是一个世界性难题。复性困难和效率低下使得从包含体中获得有正确构象的VLP难以在大规模生产中实施，只能局限于小规模的实验室研究中。虽然HPV L1也可以以正确构象可溶性地表达于大肠杆菌中，但是其表达量低下。并且，从包含种类繁多的可溶性蛋白的大肠杆菌裂解上清中纯化出HPV L1蛋白也相当困难，往往需要借助融合表达及亲和层析等手段，而这些手段又往往需要昂贵的酶，因此，仍然无法实现工业化生产。

[0064] 本发明提供的N端截短的HPV45L1蛋白和其制备方法有效地解决了上述问题。首先，本发明使用大肠杆菌表达系统来表达N端截短的HPV45L1蛋白，确保了其高表达量。其次，本发明采用温和的手段选择性沉淀大肠杆菌裂解上清中的截短蛋白，然后采用含盐缓冲液重新溶解截短蛋白，从而在保持截短蛋白的正确构象的前提下使蛋白纯度有了显著提高，并且获得的截短蛋白溶液可以直接通过色谱层析例如离子交换层析及疏水交换层析进行进一步纯化，获得高纯度的目的蛋白（例如纯度达到96%）。进一步，所获得的高纯度截短蛋白可以组装为病毒样颗粒，并且该病毒样颗粒可以在体内诱导高滴度的针对HPV45的中和抗体，具有良好的免疫原性，是一种良好的疫苗形式，可用于预防HPV45对人体的感染。由此可见，本发明具有以下优点：本发明的截短蛋白在保留全长HPV45L1蛋白的抗原性及颗粒组装能力的同时，可在大肠杆菌表达系统中实现大量表达；本发明所采用的制备方法无需使用昂贵的酶，成本低廉；截短蛋白在纯化过程中构象没有经过剧烈的变性复性过程，损失小，产率高；截短蛋白所形成的病毒样颗粒能够诱导高滴度的针对HPV的保护性抗体，可用于生产疫苗。因此，本发明的截短蛋白和其制备方法可应用于大规模工业化生产，并且使大规模工业化生产宫颈癌疫苗成为可能。

[0065] 下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

[0066] 图1显示了在实施例2的不同步骤中获得的HPV45N27C-L1蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。泳道1：破菌上清（即，破碎菌体后离心获得的上清）；泳道2：无盐沉淀产物（即，透析后离心获得的沉淀）；泳道3：重溶后上清（即，将无盐沉淀产物重新溶解后离心获得的上清）；泳道4：重溶后沉淀（即，将无盐沉淀产物重新溶解后离心获得的沉淀）。结果显示，HPV45N27C-L1蛋白在通过沉淀，重溶的步骤之后，纯度从之前的约10％提高到了约70％（参见泳道1和3）。

[0067] 图2显示了实施例3中经CHT Sepharose4Fast Flow柱纯化获得的HPV45N27C-L1的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。泳道M：蛋白分子量标记；泳道1:CHT Sepharose4Fast Flow柱1000mmol/L NaCl洗脱级分（10μl）；泳道2:用CHT Sepharose4Fast Flow柱进行纯化前的样品。结果显示，经过CHT Sepharose4Fast Flow柱纯化后，HPV45N27C-L1蛋白纯度达到95％以上（参见泳道1）。

[0068] 图3显示了实施例4中所得的HPV45N27C-L1病毒样颗粒的透射电镜观察（放大100,000倍，Bar=0.1μm）结果。视野中可见大量半径为25nm左右的病毒样颗粒，颗粒大小与理论大小相符，且均匀一致。

[0069] 图4显示了实施例5中所述的实施例4所得的HPV45N27C-L1病毒样颗粒的低温电镜观察的结果及其重建的三维结构。图4A，HPV45N27C-L1病毒样颗粒的低温电镜观察结果；图4B，HPV45N27C-L1病毒样颗粒的重建的三维结构。重建的三维结构显示，HPV45N27C-L1VLP是由72个壳粒（形态亚单位，五聚体）形成的T=7的二十面体结构（h=1,k=2）。与一般的符合准等价原理的二十面体病毒衣壳不同，HPV45N27C-L1VLP结构中所有的组成亚单位均为五聚体，而未见六聚体，且VLP的最外围直径为约60nm。这与之前报道的天然HPV病毒颗粒及真核表达系统（例如，痘病毒表达系统）来源的HPV VLP的三维结构（Baker TS,Newcomb WW,Olson NH.et al.Biophys J.(1991),60(6):1445-1456；Hagensee ME,Olson NH,Baker TS,et al.J Virol.(1994),68(7):4503-4505；Buck CB,Cheng N,Thompson CD.et al.J Virol.(2008),82(11):5190-7）类似。

[0070] 图5显示了实施例4中所得的HPV45N27C-L1病毒样颗粒的动态光散射观测结果。结果显示，HPV45N27C-L1病毒样颗粒的水化分子动力学半径为28.68nm，颗粒组装百分比为92.7%。

[0071] 图6显示了实施例6中用HPV45N27C-L1病毒样颗粒接种小鼠后不同阶段血清的中和抗体滴度。红色箭头指示处为免疫时间点，在初次免疫1周后，中和抗体滴度即有明显上升；在经过两次加强免疫后，中和抗体的滴度即能达到接近106的较高水平。

[0072] 图7显示了实施例6中用HPV45N27C-L1病毒样颗粒接种兔子后不同阶段血清的中和抗体滴度。红色箭头指示处为免疫时间点，在初次免疫两周后，中和抗体滴度即有明显上升；在经过两次加强免疫后，中和抗体的滴度即能达到106的较高水平。

[0073] 图8显示了实施例7中各HPV45L1截短蛋白在大肠杆菌中的表达情况的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。泳道M，蛋白分子量标记；泳道1，HPV45L1全长破菌上清，上样体积为10μl；泳道2，HPV45N24C-L1破菌上清，上样体积为10μl；泳道3，HPV45N27C-L1破菌上清，上样体积为10μl；泳道4，HPV45N30C-L1破菌上清，上样体积为10μl；泳道5，HPV45N35C-L1破菌上清，上样体积为10μl；泳道6，HPV45N40C-L1破菌上清，上样体积为10μl；泳道7，HPV45N45C-L1破菌上清，上样体积为10μl。

[0074] 图9显示了实施例7得到的、经纯化的N端截短了30个,35个或40个氨基酸的HPV45L1蛋白――HPV45N30C-L1，HPV45N35C-L1，HPV45N40C-L1（其氨基酸序列分别是SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6）的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。泳道M，蛋白分子量标记；泳道1，HPV45N30C-L1蛋白，上样体积为10μl；泳道2，HPV45N35C-L1蛋白，上样体积为10μl；泳道3，HPV45N40C-L1蛋白，上样体积为10μl。结果显示，实施例6得到的蛋白HPV45N30C-L1，HPV45N35C-L1，HPV45N40C-L1的蛋白纯度均达到了95％以上。

[0075] 图10显示了实施例7中所述的HPV45N30C-L1病毒样颗粒的透射电镜观察（100,000倍，0.1um）结果。结果显示，视野中可见大量半径为25nm左右的病毒样颗粒，颗粒大小与理论大小相符，且均匀一致。

[0076] 图11显示了实施例7中所述的HPV45N35C-L1病毒样颗粒的透射电镜观察（100,000倍，0.1um）结果。结果显示，视野中可见大量半径为25nm左右的病毒样颗粒，颗粒大小与理论大小相符，且均匀一致。

[0077] 图12显示了实施例7中所述的HPV45N40C-L1病毒样颗粒的透射电镜观察（100,000倍，0.1um）结果。结果显示，视野中可见大量半径为25nm左右的病毒样颗粒，颗粒大小与理论大小相符，且均匀一致。

[0078] 图13显示了实施例7中所述的HPV45N30C-L1病毒样颗粒的动态光散射观测结果。结果显示，HPV45N30C-L1病毒样颗粒的水化分子动力学半径为32.02nm左右，颗粒组装百分比为95.7%。

[0079] 图14显示了实施例7中所述的HPV45N35C-L1病毒样颗粒的动态光散射观测结果。结果显示，HPV45N35C-L1病毒样颗粒的水化分子动力学半径为29.17m左右，颗粒组装百分比为95.4%。

[0080] 图15显示了实施例7中所述的HPV45N40C-L1病毒样颗粒的动态光散射观测结果。结果显示，HPV45N40C-L1病毒样颗粒的水化分子动力学半径为29.98nm左右，颗粒组装百分比为93.0%。

[0081] 本发明涉及的序列的信息提供于下面的表1中。

[0082] 表1：序列的说明

[0083]SEQ ID NO 说明
1 野生型HPV45L1蛋白（P36741.1）的氨基酸序列
2 N端缺失24个氨基酸的HPV45L1蛋白序列
3 N端缺失27个氨基酸的HPV45L1蛋白序列
4 N端缺失30个氨基酸的HPV45L1蛋白序列
5 N端缺失35个氨基酸的HPV45L1蛋白序列
6 N端缺失40个氨基酸的HPV45L1蛋白序列
7 N端缺失45个氨基酸的HPV45L1蛋白序列
8 编码SEQ ID NO:1的DNA序列
9 编码SEQ ID NO:2的DNA序列
10 编码SEQ ID NO:3的DNA序列
11 编码SEQ ID NO:4的DNA序列
12 编码SEQ ID NO:5的DNA序列
13 编码SEQ ID NO:6的DNA序列
14 编码SEQ ID NO:7的DNA序列
15 引物
16 引物

[0084] 序列1(SEQ ID NO:1)：

[0085]MAHNIIYGHGIIIFLKNVNVFPIFLQMALWRPSDSTVYLPPPSVARVVSTDDYVSRTSIFYHAGSSRLLTVGNPYFRVVP NGAGNKQAVPKVSAYQYRVFRVALPDPNKFGLPDSTIYNPETQRLVWACVGMEIGRGQPLGIGLSGHPFYNKLDDTESAH AATAVITQDVRDNVSVDYKQTQLCILGCVPAIGEHWAKGTLCKPAQLQPGDCPPLELKNTIIEDGDMVDTGYGAMDFSTL QDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSADPYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGVMGDTVPTDLYIKGTSANMRETPGSCVY SPSPSGSIITSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGICWHNQLFVTVVDTTRSTNLTLCASTQNPVPSTYDPTKFKQYSRHVEEY DLQFIFQLCTITLTAEVMSYIHSMNSSILENWNFGVPPPPTTSLVDTYRFVQSVAVTCQKDTTPPEKQDPYDKLKFWTVD LKEKFSSDLDQYPLGRKFLVQAGLRRRPTIGPRKRPAASTSTASTASRPAKRVRIRSKK

[0086] 序列2(SEQ ID NO:2)：

[0087]MLQMALWRPSDSTVYLPPPSVARVVSTDDYVSRTSIFYHAGSSRLLTVGNPYFRVVPNGAGNKQAVPKVSAYQYRVFRVA LPDPNKFGLPDSTIYNPETQRLVWACVGMEIGRGQPLGIGLSGHPFYNKLDDTESAHAATAVITQDVRDNVSVDYKQTQL CILGCVPAIGEHWAKGTLCKPAQLQPGDCPPLELKNTIIEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQ MSADPYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGVMGDTVPTDLYIKGTSANMRETPGSCVYSPSPSGSIITSDSQLFNKPYWLH KAQGHNNGICWHNQLFVTVVDTTRSTNLTLCASTQNPVPSTYDPTKFKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTAEVMSYIHS MNSSILENWNFGVPPPPTTSLVDTYRFVQSVAVTCQKDTTPPEKQDPYDKLKFWTVDLKEKFSSDLDQYPLGRKFLVQAG LRRRPTIGPRKRPAASTSTASTASRPAKRVRIRSKK

[0088] 序列3(SEQ ID NO:3)：

[0089]MALWRPSDSTVYLPPPSVARVVSTDDYVSRTSIFYHAGSSRLLTVGNPYFRVVPNGAGNKQAVPKVSAYQYRVFRVALPD PNKFGLPDSTIYNPETQRLVWACVGMEIGRGQPLGIGLSGHPFYNKLDDTESAHAATAVITQDVRDNVSVDYKQTQLCIL GCVPAIGEHWAKGTLCKPAQLQPGDCPPLELKNTIIEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSA DPYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGVMGDTVPTDLYIKGTSANMRETPGSCVYSPSPSGSIITSDSQLFNKPYWLHKAQ GHNNGICWHNQLFVTVVDTTRSTNLTLCASTQNPVPSTYDPTKFKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTAEVMSYIHSMNS SILENWNFGVPPPPTTSLVDTYRFVQSVAVTCQKDTTPPEKQDPYDKLKFWTVDLKEKFSSDLDQYPLGRKFLVQAGLRR RPTIGPRKRPAASTSTASTASRPAKRVRIRSKK

[0090] 序列4(SEQ ID NO:4)：

[0091]MRPSDSTVYLPPPSVARVVSTDDYVSRTSIFYHAGSSRLLTVGNPYFRVVPNGAGNKQAVPKVSAYQYRVFRVALPDPNK FGLPDSTIYNPETQRLVWACVGMEIGRGQPLGIGLSGHPFYNKLDDTESAHAATAVITQDVRDNVSVDYKQTQLCILGCV PAIGEHWAKGTLCKPAQLQPGDCPPLELKNTIIEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSADPY GDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGVMGDTVPTDLYIKGTSANMRETPGSCVYSPSPSGSIITSDSQLFNKPYWLHKAQGHN NGICWHNQLFVTVVDTTRSTNLTLCASTQNPVPSTYDPTKFKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTAEVMSYIHSMNSSIL ENWNFGVPPPPTTSLVDTYRFVQSVAVTCQKDTTPPEKQDPYDKLKFWTVDLKEKFSSDLDQYPLGRKFLVQAGLRRRPT IGPRKRPAASTSTASTASRPAKRVRIRSKK

[0092] 序列5(SEQ ID NO:5)：

[0093]MTVYLPPPSVARVVSTDDYVSRTSIFYHAGSSRLLTVGNPYFRVVPNGAGNKQAVPKVSAYQYRVFRVALPDPNKFGLPD STIYNPETQRLVWACVGMEIGRGQPLGIGLSGHPFYNKLDDTESAHAATAVITQDVRDNVSVDYKQTQLCILGCVPAIGE HWAKGTLCKPAQLQPGDCPPLELKNTIIEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSADPYGDSMF FCLRREQLFARHFWNRAGVMGDTVPTDLYIKGTSANMRETPGSCVYSPSPSGSIITSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGICW HNQLFVTVVDTTRSTNLTLCASTQNPVPSTYDPTKFKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTAEVMSYIHSMNSSILENWNF GVPPPPTTSLVDTYRFVQSVAVTCQKDTTPPEKQDPYDKLKFWTVDLKEKFSSDLDQYPLGRKFLVQAGLRRRPTIGPRK RPAASTSTASTASRPAKRVRIRSKK

[0094] 序列6(SEQ ID NO:6)：

[0095]MPPSVARVVSTDDYVSRTSIFYHAGSSRLLTVGNPYFRVVPNGAGNKQAVPKVSAYQYRVFRVALPDPNKFGLPDSTIYN PETQRLVWACVGMEIGRGQPLGIGLSGHPFYNKLDDTESAHAATAVITQDVRDNVSVDYKQTQLCILGCVPAIGEHWAKG TLCKPAQLQPGDCPPLELKNTIIEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSADPYGDSMFFCLRR EQLFARHFWNRAGVMGDTVPTDLYIKGTSANMRETPGSCVYSPSPSGSIITSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGICWHNQLF VTVVDTTRSTNLTLCASTQNPVPSTYDPTKFKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTAEVMSYIHSMNSSILENWNFGVPPP PTTSLVDTYRFVQSVAVTCQKDTTPPEKQDPYDKLKFWTVDLKEKFSSDLDQYPLGRKFLVQAGLRRRPTIGPRKRPAAS TSTASTASRPAKRVRIRSKK

[0096] 序列7(SEQ ID NO:7)：

[0097]MRVVSTDDYVSRTSIFYHAGSSRLLTVGNPYFRVVPNGAGNKQAVPKVSAYQYRVFRVALPDPNKFGLPDSTIYNP ETQRLVWACVGMEIGRGQPLGIGLSGHPFYNKLDDTESAHAATAVITQDVRDNVSVDYKQTQLCILGCVPAIGEHW AKGTLCKPAQLQPGDCPPLELKNTIIEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSADPYGDS MFFCLRREQLFARHFWNRAGVMGDTVPTDLYIKGTSANMRETPGSCVYSPSPSGSIITSDSQLFNKPYWLHKAQGH NNGICWHNQLFVTVVDTTRSTNLTLCASTQNPVPSTYDPTKFKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTAEVMSYIHSM NSSILENWNFGVPPPPTTSLVDTYRFVQSVAVTCQKDTTPPEKQDPYDKLKFWTVDLKEKFSSDLDQYPLGRKFLV QAGLRRRPTIGPRKRPAASTSTASTASRPAKRVRIRSKK

[0098] 序列8(SEQ ID NO:8)：

[0099]ATGGCACACAATATTATTTATGGCCATGGTATTATTATTTTCCTAAAAAACGTAAACGTATTCCCTATTTTTTTGCAGA TGGCCCTGTGGAGGCCCAGCGACAGCACCGTGTACCTGCCCCCCCCCAGCGTGGCCAGGGTGGTGAGCACCGACGACTA CGTGAGCAGGACCAGCATCTTCTACCACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGACCGTGGGCAACCCCTACTTCAGGGTGGTGC CCAACGGCGCCGGCAACAAGCAGGCCGTGCCCAAGGTGAGCGCCTACCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGGCCCTGCCCGAC CCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACAGCACCATCTACAACCCCGAGACCCAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCATGGA GATCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCATCGGCCTGAGCGGCCACCCCTTCTACAACAAGCTGGACGACACCGAGAGCGCCC ACGCCGCCACCGCCGTGATCACCCAGGACGTGAGGGACAACGTGAGCGTGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCCTG GGCTGCGTGCCCGCCATCGGCGAGCACTGGGCCAAGGGCACCCTGTGCAAGCCCGCCCAGCTGCAGCCCGGCGACTGCCC CCCCCTGGAGCTGAAGAACACCATCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTACGGCGCCATGGACTTCAGCACCC TGCAGGACACCAAGTGCGAGGTGCCCCTGGACATCTGCCAGAGCATCTGCAAGTACCCCGACTACCTGCAGATGAGCGCC GACCCCTACGGCGACAGCATGTTCTTCTGCCTGAGGAGGGAGCAGCTGTTCGCCAGGCACTTCTGGAACAGGGCCGGCGT GATGGGCGACACCGTGCCCACCGACCTGTACATCAAGGGCACCAGCGCCAACATGAGGGAGACCCCCGGCAGCTGCGTGT ACAGCCCCAGCCCCAGCGGCAGCATCATCACCAGCGACAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAAGGCCCAG GGCCACAACAACGGCATCTGCTGGCACAACCAGCTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACCTGACCCT GTGCGCCAGCACCCAGAACCCCGTGCCCAGCACCTACGACCCCACCAAGTTCAAGCAGTACAGCAGGCACGTGGAGGAGT ACGACCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCACCATCACCCTGACCGCCGAGGTGATGAGCTACATCCACAGCATGAACAGC AGCATCCTGGAGAACTGGAACTTCGGCGTGCCCCCCCCCCCCACCACCAGCCTGGTGGACACCTACAGGTTCGTGCAGAG 
CGTGGCCGTGACCTGCCAGAAGGACACCACCCCCCCCGAGAAGCAGGACCCCTACGACAAGCTGAAGTTCTGGACCGTGG ACCTGAAGGAGAAGTTCAGCAGCGACCTGGACCAGTACCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGGTGCAGGCCGGCCTGAGGAGG AGGCCCACCATCGGCCCCAGGAAGAGGCCCGCCGCCAGCACCAGCACCGCCAGCACCGCCAGCAGGCCCGCCAAGAGGGT GAGGATCAGGAGCAAGAAGTGA

[0100] 序列9(SEQ ID NO:9)：

[0101]ATGTTGCAGATGGCCCTGTGGAGGCCCAGCGACAGCACCGTGTACCTGCCCCCCCCCAGCGTGGCCAGGGTGGTGAGCAC CGACGACTACGTGAGCAGGACCAGCATCTTCTACCACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGACCGTGGGCAACCCCTACTTCA GGGTGGTGCCCAACGGCGCCGGCAACAAGCAGGCCGTGCCCAAGGTGAGCGCCTACCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGGCC CTGCCCGACCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACAGCACCATCTACAACCCCGAGACCCAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGT GGGCATGGAGATCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCATCGGCCTGAGCGGCCACCCCTTCTACAACAAGCTGGACGACACCG AGAGCGCCCACGCCGCCACCGCCGTGATCACCCAGGACGTGAGGGACAACGTGAGCGTGGACTACAAGCAGACCCAGCTG TGCATCCTGGGCTGCGTGCCCGCCATCGGCGAGCACTGGGCCAAGGGCACCCTGTGCAAGCCCGCCCAGCTGCAGCCCGG CGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGAAGAACACCATCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTACGGCGCCATGGACT TCAGCACCCTGCAGGACACCAAGTGCGAGGTGCCCCTGGACATCTGCCAGAGCATCTGCAAGTACCCCGACTACCTGCAG ATGAGCGCCGACCCCTACGGCGACAGCATGTTCTTCTGCCTGAGGAGGGAGCAGCTGTTCGCCAGGCACTTCTGGAACAG GGCCGGCGTGATGGGCGACACCGTGCCCACCGACCTGTACATCAAGGGCACCAGCGCCAACATGAGGGAGACCCCCGGCA GCTGCGTGTACAGCCCCAGCCCCAGCGGCAGCATCATCACCAGCGACAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAC AAGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGCACAACCAGCTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAA CCTGACCCTGTGCGCCAGCACCCAGAACCCCGTGCCCAGCACCTACGACCCCACCAAGTTCAAGCAGTACAGCAGGCACG TGGAGGAGTACGACCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCACCATCACCCTGACCGCCGAGGTGATGAGCTACATCCACAGC ATGAACAGCAGCATCCTGGAGAACTGGAACTTCGGCGTGCCCCCCCCCCCCACCACCAGCCTGGTGGACACCTACAGGTT 
CGTGCAGAGCGTGGCCGTGACCTGCCAGAAGGACACCACCCCCCCCGAGAAGCAGGACCCCTACGACAAGCTGAAGTTCT GGACCGTGGACCTGAAGGAGAAGTTCAGCAGCGACCTGGACCAGTACCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGGTGCAGGCCGGC CTGAGGAGGAGGCCCACCATCGGCCCCAGGAAGAGGCCCGCCGCCAGCACCAGCACCGCCAGCACCGCCAGCAGGCCCGC CAAGAGGGTGAGGATCAGGAGCAAGAAGTGA

[0102] 序列10(SEQ ID NO:10)：

[0103]ATGGCCCTGTGGAGGCCCAGCGACAGCACCGTGTACCTGCCCCCCCCCAGCGTGGCCAGGGTGGTGAGCACCGACGACTA CGTGAGCAGGACCAGCATCTTCTACCACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGACCGTGGGCAACCCCTACTTCAGGGTGGTGC CCAACGGCGCCGGCAACAAGCAGGCCGTGCCCAAGGTGAGCGCCTACCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGGCCCTGCCCGAC CCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACAGCACCATCTACAACCCCGAGACCCAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCATGGA GATCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCATCGGCCTGAGCGGCCACCCCTTCTACAACAAGCTGGACGACACCGAGAGCGCCC ACGCCGCCACCGCCGTGATCACCCAGGACGTGAGGGACAACGTGAGCGTGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCCTG GGCTGCGTGCCCGCCATCGGCGAGCACTGGGCCAAGGGCACCCTGTGCAAGCCCGCCCAGCTGCAGCCCGGCGACTGCCC CCCCCTGGAGCTGAAGAACACCATCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTACGGCGCCATGGACTTCAGCACCC TGCAGGACACCAAGTGCGAGGTGCCCCTGGACATCTGCCAGAGCATCTGCAAGTACCCCGACTACCTGCAGATGAGCGCC GACCCCTACGGCGACAGCATGTTCTTCTGCCTGAGGAGGGAGCAGCTGTTCGCCAGGCACTTCTGGAACAGGGCCGGCGT GATGGGCGACACCGTGCCCACCGACCTGTACATCAAGGGCACCAGCGCCAACATGAGGGAGACCCCCGGCAGCTGCGTGT ACAGCCCCAGCCCCAGCGGCAGCATCATCACCAGCGACAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAAGGCCCAG GGCCACAACAACGGCATCTGCTGGCACAACCAGCTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACCTGACCCT GTGCGCCAGCACCCAGAACCCCGTGCCCAGCACCTACGACCCCACCAAGTTCAAGCAGTACAGCAGGCACGTGGAGGAGT ACGACCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCACCATCACCCTGACCGCCGAGGTGATGAGCTACATCCACAGCATGAACAGC AGCATCCTGGAGAACTGGAACTTCGGCGTGCCCCCCCCCCCCACCACCAGCCTGGTGGACACCTACAGGTTCGTGCAGAG 
CGTGGCCGTGACCTGCCAGAAGGACACCACCCCCCCCGAGAAGCAGGACCCCTACGACAAGCTGAAGTTCTGGACCGTGG ACCTGAAGGAGAAGTTCAGCAGCGACCTGGACCAGTACCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGGTGCAGGCCGGCCTGAGGAGG AGGCCCACCATCGGCCCCAGGAAGAGGCCCGCCGCCAGCACCAGCACCGCCAGCACCGCCAGCAGGCCCGCCAAGAGGGT GAGGATCAGGAGCAAGAAGTGA

[0104] 序列11(SEQ ID NO:11)：

[0105]ATGAGGCCCAGCGACAGCACCGTGTACCTGCCCCCCCCCAGCGTGGCCAGGGTGGTGAGCACCGACGACTACGTGAGCAG GACCAGCATCTTCTACCACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGACCGTGGGCAACCCCTACTTCAGGGTGGTGCCCAACGGCG CCGGCAACAAGCAGGCCGTGCCCAAGGTGAGCGCCTACCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGGCCCTGCCCGACCCCAACAAG TTCGGCCTGCCCGACAGCACCATCTACAACCCCGAGACCCAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCATGGAGATCGGCAG GGGCCAGCCCCTGGGCATCGGCCTGAGCGGCCACCCCTTCTACAACAAGCTGGACGACACCGAGAGCGCCCACGCCGCCA CCGCCGTGATCACCCAGGACGTGAGGGACAACGTGAGCGTGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCCTGGGCTGCGTG CCCGCCATCGGCGAGCACTGGGCCAAGGGCACCCTGTGCAAGCCCGCCCAGCTGCAGCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGA GCTGAAGAACACCATCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTACGGCGCCATGGACTTCAGCACCCTGCAGGACA CCAAGTGCGAGGTGCCCCTGGACATCTGCCAGAGCATCTGCAAGTACCCCGACTACCTGCAGATGAGCGCCGACCCCTAC GGCGACAGCATGTTCTTCTGCCTGAGGAGGGAGCAGCTGTTCGCCAGGCACTTCTGGAACAGGGCCGGCGTGATGGGCGA CACCGTGCCCACCGACCTGTACATCAAGGGCACCAGCGCCAACATGAGGGAGACCCCCGGCAGCTGCGTGTACAGCCCCA GCCCCAGCGGCAGCATCATCACCAGCGACAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAAGGCCCAGGGCCACAAC AACGGCATCTGCTGGCACAACCAGCTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACCTGACCCTGTGCGCCAG CACCCAGAACCCCGTGCCCAGCACCTACGACCCCACCAAGTTCAAGCAGTACAGCAGGCACGTGGAGGAGTACGACCTGC AGTTCATCTTCCAGCTGTGCACCATCACCCTGACCGCCGAGGTGATGAGCTACATCCACAGCATGAACAGCAGCATCCTG GAGAACTGGAACTTCGGCGTGCCCCCCCCCCCCACCACCAGCCTGGTGGACACCTACAGGTTCGTGCAGAGCGTGGCCGT 
GACCTGCCAGAAGGACACCACCCCCCCCGAGAAGCAGGACCCCTACGACAAGCTGAAGTTCTGGACCGTGGACCTGAAGG AGAAGTTCAGCAGCGACCTGGACCAGTACCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGGTGCAGGCCGGCCTGAGGAGGAGGCCCACC ATCGGCCCCAGGAAGAGGCCCGCCGCCAGCACCAGCACCGCCAGCACCGCCAGCAGGCCCGCCAAGAGGGTGAGGATCAG GAGCAAGAAGTGA

[0106] 序列12(SEQ ID NO:12)：

[0107]ATGACCGTGTACCTGCCCCCCCCCAGCGTGGCCAGGGTGGTGAGCACCGACGACTACGTGAGCAGGACCAGCATCTTCTA CCACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGACCGTGGGCAACCCCTACTTCAGGGTGGTGCCCAACGGCGCCGGCAACAAGCAGG CCGTGCCCAAGGTGAGCGCCTACCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGGCCCTGCCCGACCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGAC AGCACCATCTACAACCCCGAGACCCAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCATGGAGATCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGG CATCGGCCTGAGCGGCCACCCCTTCTACAACAAGCTGGACGACACCGAGAGCGCCCACGCCGCCACCGCCGTGATCACCC AGGACGTGAGGGACAACGTGAGCGTGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCCTGGGCTGCGTGCCCGCCATCGGCGAG CACTGGGCCAAGGGCACCCTGTGCAAGCCCGCCCAGCTGCAGCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGAAGAACACCAT CATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTACGGCGCCATGGACTTCAGCACCCTGCAGGACACCAAGTGCGAGGTGC CCCTGGACATCTGCCAGAGCATCTGCAAGTACCCCGACTACCTGCAGATGAGCGCCGACCCCTACGGCGACAGCATGTTC TTCTGCCTGAGGAGGGAGCAGCTGTTCGCCAGGCACTTCTGGAACAGGGCCGGCGTGATGGGCGACACCGTGCCCACCGA CCTGTACATCAAGGGCACCAGCGCCAACATGAGGGAGACCCCCGGCAGCTGCGTGTACAGCCCCAGCCCCAGCGGCAGCA TCATCACCAGCGACAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAAGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGG CACAACCAGCTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACCTGACCCTGTGCGCCAGCACCCAGAACCCCGT GCCCAGCACCTACGACCCCACCAAGTTCAAGCAGTACAGCAGGCACGTGGAGGAGTACGACCTGCAGTTCATCTTCCAGC TGTGCACCATCACCCTGACCGCCGAGGTGATGAGCTACATCCACAGCATGAACAGCAGCATCCTGGAGAACTGGAACTTC GGCGTGCCCCCCCCCCCCACCACCAGCCTGGTGGACACCTACAGGTTCGTGCAGAGCGTGGCCGTGACCTGCCAGAAGGA CACCACCCCCCCCGAGAAGCAGGACCCCTACGACAAGCTGAAGTTCTGGACCGTGGACCTGAAGGAGAAGTTCAGCAGCG 
ACCTGGACCAGTACCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGGTGCAGGCCGGCCTGAGGAGGAGGCCCACCATCGGCCCCAGGAAG AGGCCCGCCGCCAGCACCAGCACCGCCAGCACCGCCAGCAGGCCCGCCAAGAGGGTGAGGATCAGGAGCAAGAAGTGA

[0108] 序列13(SEQ ID NO:13)：

[0109]ATGCCCCCCAGCGTGGCCAGGGTGGTGAGCACCGACGACTACGTGAGCAGGACCAGCATCTTCTACCACGCCGGCAGCAG CAGGCTGCTGACCGTGGGCAACCCCTACTTCAGGGTGGTGCCCAACGGCGCCGGCAACAAGCAGGCCGTGCCCAAGGTGA GCGCCTACCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGGCCCTGCCCGACCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACAGCACCATCTACAAC CCCGAGACCCAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCATGGAGATCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCATCGGCCTGAGCGG CCACCCCTTCTACAACAAGCTGGACGACACCGAGAGCGCCCACGCCGCCACCGCCGTGATCACCCAGGACGTGAGGGACA ACGTGAGCGTGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCCTGGGCTGCGTGCCCGCCATCGGCGAGCACTGGGCCAAGGGC ACCCTGTGCAAGCCCGCCCAGCTGCAGCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGAAGAACACCATCATCGAGGACGGCGA CATGGTGGACACCGGCTACGGCGCCATGGACTTCAGCACCCTGCAGGACACCAAGTGCGAGGTGCCCCTGGACATCTGCC AGAGCATCTGCAAGTACCCCGACTACCTGCAGATGAGCGCCGACCCCTACGGCGACAGCATGTTCTTCTGCCTGAGGAGG GAGCAGCTGTTCGCCAGGCACTTCTGGAACAGGGCCGGCGTGATGGGCGACACCGTGCCCACCGACCTGTACATCAAGGG CACCAGCGCCAACATGAGGGAGACCCCCGGCAGCTGCGTGTACAGCCCCAGCCCCAGCGGCAGCATCATCACCAGCGACA GCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAAGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGCACAACCAGCTGTTC GTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACCTGACCCTGTGCGCCAGCACCCAGAACCCCGTGCCCAGCACCTACGA CCCCACCAAGTTCAAGCAGTACAGCAGGCACGTGGAGGAGTACGACCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCACCATCACCC TGACCGCCGAGGTGATGAGCTACATCCACAGCATGAACAGCAGCATCCTGGAGAACTGGAACTTCGGCGTGCCCCCCCCC 
CCCACCACCAGCCTGGTGGACACCTACAGGTTCGTGCAGAGCGTGGCCGTGACCTGCCAGAAGGACACCACCCCCCCCGA GAAGCAGGACCCCTACGACAAGCTGAAGTTCTGGACCGTGGACCTGAAGGAGAAGTTCAGCAGCGACCTGGACCAGTACC CCCTGGGCAGGAAGTTCCTGGTGCAGGCCGGCCTGAGGAGGAGGCCCACCATCGGCCCCAGGAAGAGGCCCGCCGCCAGC ACCAGCACCGCCAGCACCGCCAGCAGGCCCGCCAAGAGGGTGAGGATCAGGAGCAAGAAGTGA[0110] 序列14(SEQ ID NO:14)：

[0111]ATGAGGGTGGTGAGCACCGACGACTACGTGAGCAGGACCAGCATCTTCTACCACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGACCGTG GGCAACCCCTACTTCAGGGTGGTGCCCAACGGCGCCGGCAACAAGCAGGCCGTGCCCAAGGTGAGCGCCTACCAGTACAGG GTGTTCAGGGTGGCCCTGCCCGACCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACAGCACCATCTACAACCCCGAGACCCAGAGGCTG GTGTGGGCCTGCGTGGGCATGGAGATCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCATCGGCCTGAGCGGCCACCCCTTCTACAACAAG CTGGACGACACCGAGAGCGCCCACGCCGCCACCGCCGTGATCACCCAGGACGTGAGGGACAACGTGAGCGTGGACTACAAG CAGACCCAGCTGTGCATCCTGGGCTGCGTGCCCGCCATCGGCGAGCACTGGGCCAAGGGCACCCTGTGCAAGCCCGCCCAG CTGCAGCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGAAGAACACCATCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTACGGC GCCATGGACTTCAGCACCCTGCAGGACACCAAGTGCGAGGTGCCCCTGGACATCTGCCAGAGCATCTGCAAGTACCCCGAC TACCTGCAGATGAGCGCCGACCCCTACGGCGACAGCATGTTCTTCTGCCTGAGGAGGGAGCAGCTGTTCGCCAGGCACTTC TGGAACAGGGCCGGCGTGATGGGCGACACCGTGCCCACCGACCTGTACATCAAGGGCACCAGCGCCAACATGAGGGAGACC CCCGGCAGCTGCGTGTACAGCCCCAGCCCCAGCGGCAGCATCATCACCAGCGACAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGG CTGCACAAGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGCACAACCAGCTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGC ACCAACCTGACCCTGTGCGCCAGCACCCAGAACCCCGTGCCCAGCACCTACGACCCCACCAAGTTCAAGCAGTACAGCAGG 
CACGTGGAGGAGTACGACCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCACCATCACCCTGACCGCCGAGGTGATGAGCTACATCCAC AGCATGAACAGCAGCATCCTGGAGAACTGGAACTTCGGCGTGCCCCCCCCCCCCACCACCAGCCTGGTGGACACCTACAGG TTCGTGCAGAGCGTGGCCGTGACCTGCCAGAAGGACACCACCCCCCCCGAGAAGCAGGACCCCTACGACAAGCTGAAGTTC TGGACCGTGGACCTGAAGGAGAAGTTCAGCAGCGACCTGGACCAGTACCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGGTGCAGGCCGGC CTGAGGAGGAGGCCCACCATCGGCCCCAGGAAGAGGCCCGCCGCCAGCACCAGCACCGCCAGCACCGCCAGCAGGCCCGCC AAGAGGGTGAGGATCAGGAGCAAGAAGTGA

[0112] 序列15(SEQ ID NO:15)：

[0113] CATATGGCCCTGTGGAGGCCCAGCGAC

[0114] 序列16(SEQ ID NO:16)：

[0115] GTCGACTCACTTCTTGCTCCTGATCCTCACCCT

具体实施方式

[0116] 现参照下列意在举例说明本发明（而非限定本发明）的实施例来描述本发明。

[0117] 除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons，Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。

[0118] 实施例1.具有SEQ ID NO：3所示序列的截短的HPV45L1蛋白的表达

[0119] 用做模板的全长HPV45L1基因片段的制备

[0120] 用做模板的全长HPV45L1基因片段由上海博亚公司合成。所合成的基因片段全长为1620bp(SEQ ID NO:8)。在此人工合成的全长HPV45L1基因片段的基础上，制备编码本发明的截短的HPV45L1蛋白的多核苷酸。

[0121] 截短的HPV45L1基因的非融合表达载体的构建

[0122] 以前一个步骤获得的HPV45L1全长基因片段为模板，以HPV45N27F:5'-CAT ATg gCC CTg Tgg Agg CCC AgC gAC-3'（SEQ ID NO：15）为正向引物（其5'端引入限制性内切酶NdeI位点CAT ATG，ATG为大肠杆菌系统中的起始密码子）；以HPV45R:5'-GTC gAC TCA CTT CTT gCT CCT gAT CCT CAC CCT-3'（SEQ ID NO：16）为反向引物(其5'端引入限制性内切酶SalI位点)，在PCR热循环仪(Biometra T3)中按照如下条件进行PCR反应。

[0123]

[0124] 扩增得到1.5kb左右的大小特异的DNA片段。将该PCR产物与商售的pMD18-T载体（TAKARA公司生产）连接，转入大肠杆菌；提取质粒，经NdeI/SalI酶切鉴定，得到插入截短的HPV45L1基因的阳性克隆pMD18-T-HPV45N27C-L1。

[0125] 利用M13(+)/(-)引物，测得pMD18-T-HPV45N27C-L1质粒中插入的目的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。该序列对应的蛋白质为N端被截短27个氨基酸、C端未被截短的HPV45L1蛋白，将其命名为HPV45N27C-L1。

[0126] 将上述的pMD18-T-HPV45N27C-L1质粒进行NdeI/SalI酶切，获得HPV45N27C-L1基因片段。再将该片段与经NdeI/SalI酶切的非融合表达载体pTO-T7（罗文新等，生物工程学报，2000，16:53-57）相连接，转入ER2566细菌；提取质粒，经NdeI/SalI酶切鉴定得到插入目的片段的阳性表达克隆pTO-T7–HPV45N27C-L1。

[0127] 取1μL的pTO-T7-HPV45N27C-L1质粒（0.15mg/ml）转化40μL以氯化钙法制备的感受态大肠杆菌BL21（购自新英格兰生物实验室公司），将其涂布于含卡那霉素（终浓度25mg/mL，下同）的固体LB培养基（LB培养基成分：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，下同），并37℃静置培养10-12小时至单菌落清晰可辨。挑取单菌落至含4mL液体LB培养基（含卡那霉素）的试管，在37℃220转/分钟下振荡培养10小时，从中取1mL菌液于-70℃保存。

[0128] HPV45N27C-L1蛋白的大量表达

[0129] 从-70℃中取出携带重组质粒pTO-T7-HPV45N27C-L1的大肠杆菌菌液，接种入50ml含卡那霉素的LB液体培养基中，在200rpm，37℃下培养大约8小时；然后转接入10瓶500ml含卡那霉素的LB培养基中（每瓶接入5ml菌液），在200rpm，37℃下培养过夜，作为种子液。

[0130] 采用上海保兴生物公司生产的50L发酵罐进行大规模培养。校正发酵罐PH电极，将30L LB培养基装入发酵罐，原位121℃灭菌30min；校正溶氧电极，以灭菌后未通气前为零点，以发酵时通气后未接种前初始搅拌速度100rpm时为100%。

[0131] 补料准备：配制30%的蛋白胨和酵母膏混合物（20g蛋白胨、10g酵母膏溶至100ml），50%的葡萄糖(50g溶至100ml)，121℃灭菌20min。

[0132] 次日将10瓶种子液共5L接入发酵罐中，设定温度37℃，pH值7.0，手动调节搅拌速度及通气量，维持溶氧在40%以上。

[0133] 流加补料：将50%的葡萄糖和30%的蛋白胨和酵母膏混合物按溶质质量比2：1的比例混合。

[0134] 流加速度如下：第一小时：5%；第二小时：10%；第三小时：20%；第四小时：40%；第五小时及以后60%（以25mL/min为100%）。

[0135] 当细菌浓度达到OD600为10左右时，将培养温度降至25℃，加入4g IPTG诱导培养4小时。终浓度为大约60（OD600），下罐，离心收集菌体。获得表达了HPV45N27C-L1蛋白的菌体，重大约2.5kg。

[0136] 实施例2.纯度约70％的HPV45N27C-L1蛋白的获得

[0137] 按1g菌体对应10mL裂解液(20mM Tris缓冲液，pH7.2，300mM NaCl)的比例重悬菌体。采用APV均质机(An Invensys Group产品)以600bar压力破碎菌体5次。以13500rpm(30000g)离心菌体破碎液15min，留取上清（即，破菌上清）。通过10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测上清，此时上清中HPV45N27C-L1的纯度约为10%（参见图1，泳道1）。

[0138] 采用CENTRASETTE5切向流装置（PALL产品）对上清进行透析，所用膜包截留分子量为30kDa，透析液为10mM磷酸盐缓冲液pH6.0，透析体积为三倍上清体积，运行压力为0.5psi，流速为500mL/min，切向流速为200mL/min。

[0139] 充分透析后，使用Beckman J25高速离心机以9500rpm(12000g)离心20min，收获沉淀（即，无盐沉淀产物）。用1/10上清体积的20mM磷酸盐缓冲液pH8.0，20mM DTT，300mM NaCl重悬沉淀，搅拌30min，然后使用Beckman J25高速离心机以13500rpm(30000g)离心20min,并收获上清和沉淀（即，重溶后沉淀）。使用20mM磷酸盐缓冲液pH8.0，20mM DTT稀释该上清至3倍体积，以使NaCl终浓度为0.1M，然后使用0.22μm孔径滤膜进行过滤，所获得的样品（即，重溶后上清）用于进行阳离子交换色谱纯化（如实施例3所述）。取150μL过滤后样品，加入30μL6X Loading Buffer（12%(w/v)SDS，0.6%(w/v)溴酚蓝，0.3M Tris-HCl pH6.8，60%(v/v)甘油，5%(v/v)β－巯基乙醇），混匀并于80℃水浴10min；然后取10μL于10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中以120V电压电泳120min；然后以考马斯亮兰染色显示电泳条带。电泳结果见图1。结果显示，HPV45N27C-L1蛋白在经过沉淀、重溶的步骤之后，得到了纯化和富集，其纯度从之前的约10％提高到了约70％（见图1，泳道1和3）。

[0140] 实施例3：HPV45N27C-L1的色谱纯化

[0141] HPV45N27C-L1的阳离子交换色谱纯化

[0142] 仪器系统：GE Healthcare公司（原Amershan Pharmacia公司）生产的AKTA explorer100型制备型液相色谱系统。

[0143] 层析介质：SP Sepharose4Fast Flow（GE Healthcare公司）。

[0144] 柱体积：5.5cm×20cm。

[0145] 缓冲液：20mM磷酸盐缓冲液pH8.0，20mM DTT

[0146] 20mM磷酸盐缓冲液pH8.0，20mM DTT，2M NaCl。

[0147] 流速：25mL/min

[0148] 检测器波长：280nm。

[0149] 样品为实施例2中获得的经0.22μm孔径滤膜过滤的、纯度约为70％的HPV45N27C-L1蛋白溶液。

[0150] 洗脱程序为：400mM NaCl洗脱杂蛋白，800mM NaCl洗脱目的蛋白，收集800mM NaCl洗脱级分。

[0151] HPV45N27C-L1的羟基磷灰石色谱纯化

[0152] 仪器系统：GE Healthcare公司（原Amershan Pharmacia公司）生产的AKTA explorer100型制备型液相色谱系统。

[0153] 层析介质：CHT Sepharose4Fast Flow(购自Bio－RAD)

[0154] 柱体积：5.5cm×20cm

[0155] 缓冲液：20mM磷酸盐缓冲液pH8.0，20mM DTT

[0156] 20mM磷酸盐缓冲液pH8.0，20mM DTT，2M NaCl。

[0157] 流速：20mL/min。

[0158] 检测器波长：280nm。

[0159] 样品为：前一步骤获得的800mM NaCl洗脱级分，将NaCl浓度稀释至0.5M。

[0160] 洗脱程序为：500mM NaCl洗脱杂蛋白，1000mM NaCl洗脱目的蛋白，收集1000mM NaCl浓度时的洗脱级分。

[0161] 取最终的洗脱级分150μL，加入30μL6X Loading Buffer，混匀并于80℃水浴10min；然后取10μl于10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中以120V电压电泳120min；然后以考马斯亮兰染色显示电泳条带。电泳结果见图2。结果显示，经过上述纯化步骤后，HPV45N27C-L1蛋白纯度达到95％以上（参见泳道1）。

[0162] 实施例4：HPV45N27C-L1病毒样颗粒的组装

[0163] 仪器系统为PALL生产的CENTRASETTE5切向流系统；膜包截留分子量为30kDa；样品为实施例3所得的纯度大于95％的HPV45N27C-L1。

[0164] 样品的复性：以复性缓冲液（50mM PB（磷酸钠缓冲液）pH6.0，2mM CaCl2，2mM MgCl2，0.5M NaCl，0.003%Tween-80）充分交换样品缓冲液，交换体积为样品原始体积的10倍以上。切向流装置的运行压力为0.5psi，切向流速度为10mL/min。在复性缓冲液交换完后，用储存缓冲液（20mM PB（磷酸钠缓冲液）pH6.5，0.5M NaCl）进行交换，交换体积为样品体积4倍以上。切向流装置的运行压力为0.5psi，切向流速度为25mL/min。交换完毕后，使用PALL0.20μm滤器无菌过滤样品，得到HPV45N27C-L1病毒样颗粒，将其置于4℃保存备用。

[0165] 实施例5：HPV45N27C-L1VLP的形态学检测

[0166] HPV45N27C-L1病毒样颗粒的透射电镜观察

[0167] 使用的仪器为日本电子公司生产的100kV透射电镜，放大倍数为100,000倍。将实施例4所得HPV45N27C-L1病毒样颗粒用2%磷钨酸pH7.0负染，固定于喷炭的铜网上，进行观察。电镜结果见图3，其中可见大量半径为25nm左右的病毒样颗粒，大小均匀，呈现为空心形态。

[0168] HPV45N27C-L1病毒样颗粒的三维结构重建

[0169] 使用低温电镜三维结构重建实验(Wolf M,Garcea RL,Grigorieff N.et al.Proc Natl Acad Sci U S A.(2010),107(14):6298-303)来重建HPV45N27C-L1病毒样颗粒的三维结构。简而言之，在HPV45N27C-L1VLP的冷冻电镜图像中（图4A）分别选取400个大小均一、直径超过50nm的颗粒进行计算机重叠和结构重建，从而获取HPV45N27C-L1VLP的三维结构。所获得的三维结构如图4B所示，其中HPV45N27C-L1VLP的分辨率为 结果显示，
HPV45N27C-L1VLP是由72个壳粒(形态亚单位，五聚体)形成的T=7的二十面体结构(h=1,k=
2)。与一般的符合准等价原理的二十面体病毒衣壳不同，HPV45N27C-L1VLP结构中所有的组成亚单位均为五聚体，而未见六聚体，且VLP的最外围直径为约60nm。这与之前报道的天然HPV病毒颗粒及真核表达系统（例如，痘病毒表达系统）来源的HPV VLP的三维结构类似。

[0170] HPV45N27C-L1病毒样颗粒动态光散射观察

[0171] 使用的仪器为美国Protein Solutions公司生产的DynaPro MS/X型动态光散射仪（含温度控制器），使用的算法为Regulation算法。样品为实施例4所得HPV45N27C-L1病毒样颗粒。样品经0.22μm滤膜过滤后进行测量。测量结果见图5。结果显示，HPV45N27C-L1VLP的水化分子动力学半径为28.68nm。

[0172] 实施例6：HPV45N27C-L1VLP的免疫原性测定

[0173] HPV45假病毒中和细胞模型的建立

[0174] 由于HPV难以在体外进行培养，而且HPV宿主特异性强，难以在人以外的宿主上繁殖，缺乏合适的动物模型，因此，为了能对HPV疫苗的免疫保护性进行快速评估，需要建立有效的体外中和实验模型。

[0175] 假病毒（pseudovirions）体外感染模型:利用HPV VLP可非特异性包装核酸的特性,通过在细胞内表达HPV的L1和L2蛋白，通过包裹细胞内的游离体病毒DNA或外源导入的报告质粒，组成HPV假病毒(Yeager,M.D,Aste-Amezaga,M.et al(2000)Virology(278)570－7)。具体方法包括重组病毒表达系统法及多质粒共转染方法。本实施例示例性采用多质粒共转染方法。

[0176] HPV假病毒的构建方法如下：

[0177] 用CsCl密度梯度离心方法分别纯化质粒p45L1h(携带编码HPV45L1蛋白(NCBI数据库，P36741.1)的核苷酸序列的pAAV载体)、质粒p45L2h(携带编码HPV45L2蛋白(NCBI数据库，AAY86493.1)的核苷酸序列的pAAV载体)及带有绿色荧光蛋白基因的质粒pN31-EGFP（pN31-EGFP和上述的pAAV载体均由NIH的John T.Schiller教授馈赠）。利用CsCl密度梯度离心来纯化质粒的方法是本领域公知的，参见《分子克隆：第三版》。

[0178] 使用磷酸钙转染法，用纯化后的p45L1h、p45L2h、pN31-EGFP各40μg共转染培育于10cm细胞培养皿中的293FT细胞（Invitrogen）。磷酸钙转染法是本领域公知的，参见《分子克隆：第三版》。简言之，将p45L1h、p45L2h、pN31-EGFP各40μg加入1mL的HEPES溶液（每50mL去离子水含有pH＝7.3的1M Hepes125μL，4℃储存）和1mL的0.5mol/L CaCl2溶液的混合溶液中，混匀，然后逐滴加入2mL2×HeBS溶液（0.28M NaCl(16.36g)，0.05M HEPES(11.9g)，
1.5mM Na2HPO4(0.213g)，溶解于1000mL去离子水，pH＝6.96，-70℃储存）中，室温下静置
1min；然后将混合液加入培养有293FT细胞的10cm细胞培养皿中，培养6hr；然后弃去原培养液，加入10mL新鲜的完全培养液（Invitrogen公司）。转染48hr后，弃去培养基，用PBS清洗细胞2次；然后将细胞刮下收集细胞，进行细胞计数，并且每108个细胞用1mL裂解液（0.25%Brij58，9.5mM MgCl2）重悬。裂解后，以5000g离心10min，收集上清，加入5M NaCl（终浓度为
850mM），从而获得假病毒液，将其分装为小份后置于-20℃保存。

[0179] 抗体中和滴度的测定

[0180] 将293FT细胞（Invitrogen）铺于96孔细胞培养板中（1.5×104/孔）。5hr后如下进行中和实验：将待测的血清样品（含待测抗体）分别用10％DMEM进行连续倍比稀释，然后取50μL各个经稀释的样品分别与50μL稀释于10％DMEM中的如上制备的假病毒液混合（moi=
0.1）；在4℃下孵育1h后，将混合物分别加入预铺有293FT细胞的96孔细胞培养板中，并在37℃培养72h；然后先通过荧光观察确定各样品大概的抗体滴度，再用流式细胞仪（EPICS XL，美国Beckman Coulter公司）检测各孔细胞的感染率，计算血清的准确抗体滴度。感染率为待测细胞样品在阳性区中的细胞数量百分率减去未感染的对照细胞样品在阳性区中的数量百分率。

[0181] 感染抑制率＝（1﹣加入血清的孔的感染率/未加入血清的孔的感染率）×100%。

[0182] 抗体中和滴度的定义为：达到高于50％感染抑制率的最大稀释倍数。经50倍稀释后仍能达到50％以上感染抑制率的抗体被视为具有中和能力。

[0183] HPV45VLP用于免疫动物的免疫保护性的评价

[0184] 使用小鼠来评价本发明的HPV45VLP的免疫保护性。免疫用动物为4-5周龄SPF级BALB/c小鼠8只。根据实施例1－4所述方法制备HPV45N27C-L1病毒样颗粒。将该颗粒稀释至0.1mg/ml，然后加入等体积的完全弗氏佐剂（用于初次免疫）或等体积的不完全弗氏佐剂（用于加强免疫），混合均匀。免疫程序为：0周时初次免疫；2，4和6周时加强。免疫方式为肌肉注射，初次免疫剂量为10μg/只，加强免疫剂量为10μg/只。

[0185] 初次免疫后，每周抽取外周静脉血，分离血清。然后根据上述方法检测第0、1、5、7、9周小鼠血清中针对HPV45假病毒颗粒的中和抗体滴度。检测结果如图6所示。结果表明，根据实施例1-4所述方法获得的HPV45N27C-L1病毒样颗粒具有良好的免疫原性，可在小鼠体内诱导高滴度的针对HPV45的中和抗体，可用作预防HPV45感染的有效疫苗。除了使用弗氏佐剂外，该疫苗也可使用本领域公知的其他佐剂，例如氢氧化铝或磷酸铝佐剂。

[0186] 还使用兔来评价本发明的HPV45VLP的免疫保护性。免疫用动物为6～8周龄普通级雌性兔4只（购自广西省疾病预防与控制中心）。将实施例1-4所制备的HPV45N27C-L1病毒样颗粒稀释至1.0mg/ml，然后加入等体积的完全弗氏佐剂（用于初次免疫）或等体积的不完全弗氏佐剂（用于加强免疫），混合均匀。免疫程序为：0周时初次免疫；4，8和12周时加强。免疫方式为肌肉注射，初次免疫剂量为1.0mg/只，加强免疫剂量为1.0mg/只。

[0187] 初次免疫后，每周抽取外周静脉血，分离血清。然后根据上述方法检测第0、2、4、6、9、11、22周兔血清中针对HPV45假病毒颗粒的中和抗体滴度。检测结果如图7所示。结果表明，根据实施例1-4所述方法获得的HPV45N27C-L1病毒样颗粒具有良好的免疫原性，可在兔体内诱导高滴度的针对HPV45的中和抗体，可用作预防HPV45感染的有效疫苗。除了使用弗氏佐剂外，该疫苗也可使用本领域公知的其他佐剂，例如氢氧化铝或磷酸铝佐剂。

[0188] 以上结果表明，通过本发明的方法获得的HPV45病毒样颗粒具有良好的免疫原性，可在动物体内诱导高滴度的中和抗体，从而可用作预防HPV感染的疫苗。

[0189] 实施例7：HPV45N30C-L1，HPV45N35C-L1，HPV45N40C-L1蛋白和病毒样颗粒的制备以及形态学观察

[0190] 依据实施例1-2描述的方法，获得编码N端截短24个、27个、30个、35个、40个或45个氨基酸的截短的HPV45L1蛋白（其氨基酸序列分别为SEQ ID NO:2-7；核苷酸序列分别为SEQ ID NO：9-14）的表达质粒，然后在大肠杆菌中对这些表达质粒的表达情况进行鉴定。结果示于图8中。结果显示，编码N端截短27个，30个,35个或40个氨基酸的截短的HPV45L1蛋白的表达质粒能够在大肠杆菌中高效表达，并且其中，N端截短27个氨基酸的HPV45L1蛋白的表达量最高（参见，图8，泳道3－6）。此外，结果显示，N端截短24或45个氨基酸的HPV45L1蛋白不能在大肠杆菌中高效表达（参见，图8，泳道2和7）。这些结果表明，在HPV45L1蛋白的N端截短太多（例如多于45个）或太少（例如少于24个）数目的氨基酸都是不合适的，不利于在大肠杆菌中的高效表达。

[0191] 依据实施例1－3描述的方法，制备和纯化N端截短了30个,35个或40个氨基酸的HPV45L1蛋白（其氨基酸序列分别为SEQ ID NO:4，5和6；核苷酸序列分别为SEQ ID NO：11，12和13）。这些蛋白质的纯度都达到95％以上（见图9）。

[0192] 依据实施例4的方法，将经纯化的HPV45N30C-L1，HPV45N35C-L1，HPV45N40C-L1蛋白组装成病毒样颗粒。

[0193] 依据实施例5描述的方法，对HPV45N30C-L1，HPV45N35C-L1，HPV45N40C-L1病毒样颗粒进行透射电镜观察和动态光散射观察。结果示于图10-15。图10，11和12显示，这些截短蛋白可形成半径为25nm左右的病毒样颗粒，颗粒大小与理论大小相符，且均匀一致。图13，14和15显示，这些病毒样颗粒的水化分子动力学半径在30nm左右。

[0194] 另外，通过使用实施例6描述的方法可证实，本发明所获得的HPV45N30C-L1，HPV45N35C-L1，HPV45N40C-L1病毒样颗粒同样具有良好的免疫原性，可在动物体内诱导高滴度的中和抗体，从而可用作预防HPV感染的疫苗。

[0195] 尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。