用于制备LRRC52多克隆抗体的免疫原

摘要

本发明属于生物技术领域，涉及用于制备LRRC52多克隆抗体的免疫原，为多肽，其氨基酸序列为CQNNRIREVM DYTFI。本免疫原制备的LRRC52多克隆抗体具有效价高、特异性好的优点。其与小鼠或人精子孵育可显著抑制精子钾电流的产生，从而显著影响小鼠和人成熟精子的生理功能。该抗体既能作为研究精子生理调节机制的工具药，也可以作为开发新型男性避孕药的候选分子。

权利要求

1.LRRC52多克隆抗体的制备方法，其特征在于包括如下步骤： （1）合成目的多肽CQNNRIREVM DYTFI，将合成后的多肽溶于乙腈； （2）取体重2 Kg以上的新西兰兔为免疫动物，用400μl 0.01M磷酸缓冲溶液溶解400 μg上述合成多肽，与弗式完全佐剂进行等比例混合，充分震荡乳化，将该乳剂作为免疫原在兔子背部行多点皮下注射，注射20-40个点； （3）首次免疫3周后，将300 μg合成多肽溶于300μl 0.01M磷酸缓冲溶液溶解，与等体积弗式不完全佐剂充分乳化后作为免疫原进行背部皮内注射，作为第一次免疫的加强免疫，注射15-

25个点以上； （4）以后每3~ 4周加强免疫一次，方法与要求同步骤（3）； （5）注射免疫原后的7~10天耳动脉取血ELISA检测抗体效价，共免疫4~ 5次，效价>10000可取血；常规方法收集纯化血清完成抗体制备。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（1）乙腈为50%乙腈。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（5）取血采用心脏取血。

说明书

用于制备LRRC52多克隆抗体的免疫原

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及用于制备LRRC52多克隆抗体的免疫原。

背景技术

[0002] 当前，生育问题已成为全球性重大社会卫生问题。据世界卫生组织公布的数据显示，全球不育症患者人数已达0.8 ~ 1.1亿，并预测21世纪不育不孕将成为仅次于肿瘤和心脑血管病的第三大疾病。中国目前约有15 %的配偶存在生育障碍，其中 50 %的致病因素与男性有关。另一方面，目前全球人口总量已达70亿总人口，且每年仍以7500万人口的速度递增。与此同时，非意愿妊娠对人类健康和经济的损害亦不容忽视。因此，寻找理想的避孕方式以主动控制人口数量具有重大的意义。然而，当前市场中避孕药主要是针对女性生殖生理设计且大多为激素类药物，尚无市场化针对男性生殖生理的避孕药物。基于现有女用避孕药的副作用以及人们生殖伦理观的改变，研发安全、有效、易恢复的男性避孕药具有非常广阔的市场需求。由此可见，在分子水平揭示精子发育、成熟及功能调控的生理机制，对于研究男性不育症的病理生理机制、探索其可能的治疗途径以及开发新型男性避孕药物，均具有重要的社会意义。

[0003] 哺乳动物精子在睾丸曲细精管内发生、发育后，尚须在离子浓度、渗透压和pH值不断变化的微环境（附睾管和雌性生殖道）中进一步成熟并最终获得受精能力。离子通道等膜蛋白是精子与局部微环境或卵子之间交流的工具，依靠膜上多样的膜蛋白（包括离子通道），精子不断调整、适应通向卵子过程中复杂、多变的微环境，最后实现受精这一复杂精细的生命过程。大量研究表明，多种离子通道在精子运动、精子获能、顶体反应和精卵结合等生理过程中扮演着重要角色，是调控精子功能的关键因子。

[0004] 找寻具有调节控制精子功能的关键因子，进一步研究制备精子生理调节机制工具药和制备男性避孕药具有重要意义。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种用于制备LRRC52多克隆抗体的免疫原，该免疫原制备的多克隆抗体多克隆抗体具有效价高、特异性好的优点。该多克隆抗体与小鼠或人精子孵育可显著抑制精子钾电流的产生，从而显著影响小鼠和人成熟精子的生理功能。该抗体既能作为研究精子生理调节机制的工具药，也可以作为开发新型男性避孕药的候选分子。

[0006] 本发明的技术方案如下：

[0007] 用于制备LRRC52（LRRC52：Leucine-Rich-Repeating-Containing protein 52）多克隆抗体的免疫原，为多肽，氨基酸序列为CQNNRIREVM DYTFI；

[0008] 所述的免疫原，还包括弗式完全佐剂等常规试剂；

[0009] 本发明还涉及前述免疫原制备的LRRC52多克隆抗体；

[0010] 所述的LRRC52多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤： （1）合成目的多肽CQNNRIREVM DYTFI，将合成后的多肽溶于50%乙腈； （2）免疫原制备及首次动物免疫：取体重2 Kg以上的新西兰兔为免疫动物，用400μl 0.01M磷酸缓冲溶液溶解400 μg上述合成多肽，与弗式完全佐剂进行等比例混合，充分震荡乳化，将该乳剂作为免疫原在兔子背部行多点皮下注射，注射20-40个点； （3）首次免疫3周后，将300 μg合成多肽溶于300μl 0.01M磷酸缓冲溶液溶解，与等体积弗式不完全佐剂充分乳化后作为免疫原进行背部皮内注射，作为第一次免疫的加强免疫，注射15-25个点以上； （4）以后每3~ 4周加强免疫一次，方法与要求同步骤（3）； （5）注射免疫原后的7~10天耳动脉取血ELISA检测抗体效价，共免疫4~ 5次，效价>10000可取血；常规方法收集纯化血清完成抗体制备；

[0011] 为达到更好的技术效果：

[0012] 步骤（1）乙腈为50%乙腈；

[0013] 于步骤（5）取血采用心脏取血；

[0014] 本发明还涉及所述LRRC52多克隆抗体在制备研究精子生理调节机制工具药和制备男性避孕药中的应用。

[0015] 本发明的有益效果如下：以氨基酸序列（CQNNRIREVM DYTFI）的多肽为抗原设计的高效价、特异性LRRC52多克隆抗体能特异性识别LRRC52，经发明人大量研究发现LRRC52是构成小鼠精子钾通道、介导精子钾电流的重要组分。LRRC52也可能是介导人精子KSper的分子组分，并可能承担着与小鼠精子中类似的生理功能。LRRC52可作为开发调控精子功能化合物和男性避孕药的新型分子靶点。而该多克隆抗体既能作为研究精子生理调节机制的工具药，也可以作为开发新型男性避孕药用途。

附图说明

[0016] 图1、LRRC52多克隆抗体纯度和质谱分析1。

[0017] 图2、LRRC52多克隆抗体纯度和质谱分析2。

[0018] 图3、LRRC52多克隆抗体纯度和质谱分析3。

[0019] 图4、制备的LRRC52多克隆抗体与小鼠精子结合的特异性； A. 小鼠精子与LID1共孵育后出现明显的凝集现象（小鼠精子在添加正常小鼠IgG (A1) 或添加LID1 (B1) 液体里孵育1 h后，光学显微镜下观察不同视野精子的凝集现象。 其中A2和B2分别对应A1和B1的蓝色方框区，放大倍数：×400; B. LID1与小鼠精子蛋白结合的特异性。小鼠附睾精子蛋白在不添加（-）或添加（+）PNGase F反应液中预处理后，利用制备的LID1抗体 (3 µg/mL) 行Western blot检测LRRC52蛋白的表达。箭头对应46 kD和 33 kD条带）。

[0020] 图5、制备的LRRC52多克隆抗体对小鼠精子生理功能的影响1（在电极内液pH为8.0的条件下，给予小鼠精子从-100 mV到+100 mV渐变电压刺激，可记录到精子 IKSper（A，B），并观察加入不同浓度LID1后IKSper的变化。曲线分别表示施加0、10 µg/mL LID1、50 µg/mL LID1和洗脱后。 C为在-100~+150 mV电压下，0或50 µg/mL浓度LID1作用于小鼠精子IKSper的G-V曲线图，同时统计学分析LID1对IKSper的抑制率，显示相邻两组数据无显著差异（D）。n=5，电流值±SEM，t检验，*p<0.05有显著性差异。

[0021] 图6、制备的LRRC52多克隆抗体对小鼠精子生理功能的影响2 将小鼠精子与50 μg/mL LID1或50 μg/mL小鼠IgG共孵育，通过CASA记录分析精子的活率（A）、平均路径速度（VAP，B）、平均曲线速度（VCL，C）、平均直线速度（VSL，D），*：p 0.05, **p 0.01. 配对t检验，n =5）。

[0022] 图7、制备的LRRC52多克隆抗体对小鼠精子生理功能的影响3 B与对照组相比，LID1组诱发性AR率显著下降而自发性AR率无差异 ：p 0.05. t检验；n =5）。

[0023] 图8、制备的LRRC52多克隆抗体对小鼠精子生理功能的影响4 对照组和LID1组2细胞胚胎示意图（A）及比率统计学分析（B）：p 0.05. t检验；n =4）。

[0024] 图9、制备的LRRC52多克隆抗体对人精子生理功能的影响1（ A和B分别为RT-PCR和Western blot检测人精子中LRRC52和SLO3 mRNA和蛋白的表达，箭头为目的条带）。

[0025] 图10、制备的LRRC52多克隆抗体对人精子生理功能的影响2（ B与对照组相比，LID1组自发性和诱发性AR率均下降 ：p 0.05. t检验；n =3）。

[0026] 图11、制备的LRRC52多克隆抗体对人精子生理功能的影响3（将人精子与50 μg/mL LID1或50 μg/mL正常IgG共孵育4 h，通过CASA记录分析精子的活率（A）、平均路径速度（VAP，B）、平均曲线速度（VCL，C）、平均直线速度（VSL，D），与对照组相比，p 0.05，* *p 0.01，配对t检验，n =3；）。

[0027] 图12、制备的LRRC52多克隆抗体对人精子生理功能的影响4（在电极内液pH为8.0的条件下，给予人精子从-100 mV到+100 mV渐变的电压刺激，可记录到精子 IKSpe（r A），并观察不同浓度LID1下IKSper的变化。红色、蓝色、黑色和绿色曲线（从下至上）分别表示施加0、5 g/mL LID1、20 g/mL LID1和洗脱后。 B为+100 mV电压下20 g/mL LID1 hIKSper电流幅度下降n=5，电流值±SEM，t检验，*p< 0.05）。

[0028] 图13 LRRC52蛋白示意图。

具体实施方式

[0029] 实施例1 LRRC52多克隆抗体（LID1）的设计、制备

[0030] 1、由北京信诺晶科生物科技有限公司制备，抗体命名为LID1，制备步骤如下：

[0031] 如图13所示（LRRC52 N端1-244在细胞外，245-265为跨膜区，人C端266-313 (小鼠为266-314)位于细胞质中。图中标记84-98多肽段作为制备兔多克隆抗体的抗原位点。箭头对应人和小鼠该段多肽的具体氨基酸序列以及序列对比结果，显示人和小鼠完全同源；

[0032] 多肽序列的分析与设计：利用DNAstar软件对LRRC52的氨基酸进行抗原表位分析，评估其亲水性、抗原性、表面可能性、柔性区等指数，综合考虑氨基酸类别、分布、结构复杂程度、易氧化难度、合成难度、小鼠与人的同源性等，最终确定LRRC52上84-98位15个氨基酸作为合成多肽的序列，对应序列为CQNNRIREVM DYTFI。采用ACT396全自动多通道多肽合成仪，按照编制好的程序自动合成目的多肽，将合成后的多肽溶于50%乙腈，采用质谱仪进行鉴定和纯度分析；

[0033] 制备的本多克隆抗体纯度为96 %，肽序列为CQNNRIREVM DYTFI，具体见（图1图2图3）。

[0034] （2）免疫原制备及动物免疫：取体重2-2.5 Kg的新西兰兔为免疫动物，用400μl 0.01M磷酸缓冲溶液溶解400 μg上述合成多肽，与弗式完全佐剂进行等比例混合，充分震荡乳化，将该乳剂作为免疫原在兔子背部行多点皮下注射，至少注射20点以上。首次免疫3周后，将300 μg合成多肽溶于300μl 0.01M磷酸缓冲溶液溶解，与等体积弗式不完全佐剂充分乳化后作为免疫原进行背部皮内注射，作为第一次免疫的加强免疫，至少注射15点以上。以后每3~ 4周加强免疫一次，方法与要求同上。注射后的7~10天耳动脉取血ELISA检测抗体效价，约需免疫4~ 5次，如效价>10000可取血。采用心脏取血，标准方法收集纯化血清完成抗体制备。

[0035] 实施例2

[0036] 一、LID1抗体制备如实施例1。

[0037] 二、实验动物及处理

[0038] 本实验选用14~18周龄C57雄性小鼠，购自南京大学模式动物中心。小鼠自由摄食饮水，控制室温20~25 ℃，按白天/黑夜各12 h的规律给予照明。雄鼠颈椎脱臼处死后，暴露腹腔，取出双侧附睾，解剖显微镜下尽量分离脂肪及系膜组织，洗涤2~3次，剪下尾部置于盛有HS培养皿中，划破，置于37 °C 、5 % CO2培养箱中孵育20 min，1600 rpm离心5 min沉淀精子，HS洗涤2次。

[0039] 三、实验方法

[0040] 1、人精子分离

[0041] 采用Percoll非连续梯度离心法，具体为：将等渗Percoll分层液按体积比用PBS稀释为终浓度为45 %和90 %的Percoll液，加3 mL 90 % Percoll液于一个无菌圆锥底试管中，小心轻轻加45 % Percoll液于90 % Peroll液层上面，注意不要打乱两种液体的界面，再将精液小心吸放在90 %~45 % Percoll分离液的表层上，使3个层面清晰，500 g离心20 min。然后将沉降在90 %的液层底部的精子团小心吸取，重新悬浮于10 mL的PBS液中，500 g离心5 min，最后将沉淀物重悬于1 mL人输卵管液（human tubal fluid，HTF）中备用；

[0042] 2、精子凝集反应

[0043] 取小鼠附睾尾部精子，移入含50 g/mL LID1抗体或50 g/mL正常小鼠IgG的HTF液中，置于37 ℃、5 % CO2 培养箱内孵育60 min，取10 µL精子悬液，置于光学显微镜下观察，以头对头、尾对尾、中段对中段等精子簇集团为凝集反应阳性；

[0044] 3、精子膜片钳技术

[0045] 以精子胞质小粒（Cytosolic Droplet）为高阻封接位点，将电极尖端缓慢靠近胞质小粒，通过施加负压形成高阻封接后，采用系统的ZAP功能形成全细胞构型。然后，通过局部灌流系统，将所需溶液灌流至精子细胞周围，以创造局部微环境。在全细胞模式下给予细胞-100 mV~ +100 mV电压刺激，记录相应的IKSper或ICatSper，记录和分析软件系统分别采用Axon公司的Clampex10.0和Clampfit10.0 ；

[0046] 4、精子运动分析

[0047] 精子分为对照组（含50 µg/mL正常IgG）和含50 µg/mL LID1抗体组，于37 ℃、5 % CO2培养箱内孵育60 min后，取 10 µL精子悬液，计算机辅助精子分析系统（computer-aided sperm analysis system, CASA）观察精子运动参数，包括：曲线速度（curvilinear velocity, VCL）、平均路径速度（average path velocity, VAP）、直线速度（straight progressive velocity,VSL）等。以随机不同视野区域至少200个精子计算；

[0048] 5、顶体反应检测

[0049] 以IgG和LID1不同分组小鼠附睾或人精子为基础，又分为添加A23187组（20 µM）和不添加A23187组。37 ℃、5 % CO2培养箱孵育1 h后，取200 µL加入等体积CTC染液，37 ℃、5 % CO2孵育20 min（此步操作尽量避光）。室温500 g离心15 min，弃上清，加入适量4 ％多聚甲醛-PBS重悬精子沉淀，固定10 min。涂片、中性树脂封片，立即于荧光显微镜高倍镜下完整视野计数，至少200个精子计算，以2位观察者读片为准，取平均值。可见精子头部呈3种不同的荧光染色类型，即F型、B型、AR型。F型为未获能精子，其顶体帽完整，整个顶体布满强黄绿色荧光；B型为已获能但未发生顶体反应精子，表现为精子顶体区现强烈的黄绿色荧光，但在顶体后区出现无或暗淡的荧光区带；AR型为完成顶体反应的精子，表现为整个精子头部显示淡绿色或无荧光染色。以AR型所占比率为顶体反应发生率；

[0050] 6、体外受精实验

[0051] 1) 雄鼠处理

[0052] 14~18周龄雄鼠处死后，解剖显微镜下尽量分离脂肪及系膜组织，洗涤2~3次，取出附睾尾置于盛有HTF获能液培养皿中，切开附睾尾，于37 ℃、5 % CO2培养箱中孵育5 min，以便于精子游出，取部分精子用细胞计数板检测精子活力，调节精子密度，转移至平衡后的HTF微滴中，使精子终浓度达到（1~20）×106/mL，置于37 ℃、5 % CO2培养箱中孵育1 h获能；

[0053] 2) 雌鼠处理

[0054] 选6~8周龄成年雌性小白鼠，孕马血清促性腺激素（PMSG） 10 IU腹腔注射，48 h后绒毛膜促性腺激素（hCG）10 IU腹腔注射，13~15 h后，打开腹腔，找到卵巢和输卵管，剪下输卵管，在盛有HTF的培养皿洗涤2次，解剖显微镜下用针头轻轻划破膨大透明的壶腹部，游离卵丘-卵母细胞复合物（COCs），用口吸管小心的将COCs移入其它HTF小滴中，洗涤3~5次，清除输卵管碎片、脂滴及其它杂质；

[0055] 3) 精卵结合实验

[0056] 精子获能转移至HTF受精液中，加入COCs，每100 µL的受精微滴加入10-15枚卵母细胞。精子受精滴共分为两组：LID1（终浓度为50 µg/mL）和对照组（等体积IgG）。置于37 ℃、5 % CO2培养箱中受精4 h后，HTF洗去卵子周围多余的精子，将受精卵转移至200 µL HTF液中培养20 h。计算此时的2-细胞率并以此时的2-细胞率作为体外受精率。

[0057] 四、结果如下：

[0058] 1、LRRC52多克隆抗体与小鼠精子结合的特异性

[0059] 将小鼠精子与LRRC52抗体共孵育，结果发现60 min后，精子悬液发生明显的凝集现象（图4A），说明该抗体能与精子表面抗原特异性结合。为进一步验证抗体结合的特异性，我们提取小鼠附睾精子蛋白，利用LID1行Western blot检测（图4B），结果得到分子量大约为46 kD的蛋白条带，该条带明显大于LRRC52的分子量（33 kD）。由于已有实验表明小鼠睾丸中的LRRC52含有大量糖基，我们进一步验证了去糖基化酶对该条带的影响。结果显示，在添加去糖基肽酶（PNGase F）后，46 kD条带消失，可检测到33 kD的蛋白条带，其与LRRC52目的蛋白大小一致；

[0060] 这些结果既表明LID1抗体能特异性识别LRRC52，也为研究LRRC52作为SLO3的潜在调节亚基提供了生物化学证据。

[0061] 2、 LRRC52多克隆抗体对小鼠精子生理功能的影响

[0062] 我们利用全细胞膜片钳技术记录LID1对小鼠精子钾电流（mouse IKSper, mIKSper）的影响，将含不同浓度LID1溶液灌流至精子细胞周围，所用电极内液pH值为8.0。结果发现，LID1能明显抑制mIKSper，且随着LID1浓度增加抑制作用增大（图5A, B）。我们进一步研究了LID1对mIKSperG-V曲线的影响。结果和预期的结果一致，LID1作用下mIKSper右移（图5C）。此外，我们还进一步比较了不同电压下LID1抑制mIKSper的程度，虽然抑制程度随膜超极化而呈现增加趋势，但总体上电压依赖性较弱，即使在从-100 mV到+150 mV的范围内抑制程度也只从约30 %降到20 %（p> 0.05, 图5D）；

[0063] 随后，我们将小鼠附睾精子与50 µg/mL LID1共孵育1 h后，利用CASA检测分析精子运动各项指标变化。结果（图6）发现，抗体组精子总活力、平均直线速度（VSL）、曲线速度（VCL）和平均路径速度（VAP）等各项运动指标均显著下降（p< 0.01; p< 0.05）；

[0064] 将小鼠附睾精子与50 μg/mL LID1或50 μg/mL正常IgG共孵育，并在此基础进一步分为添加和不加A23187组，CTC染色分析精子获能及顶体反应发生情况。结果（图7）显示，与对照组相比，LID1能显著降低A23187诱发的顶体反应发生率降低（图7B，p< 0.05）而对精子自发顶体反应发生率（未添加A23187组）则无明显影响（图7 B，p> 0.05）；

[0065] 在进行小鼠精卵结合实验时，加入50 μg/mL LID1或50 μg/mL正常IgG，孵育4~6 h后洗卵，20 h后观察2细胞胚胎数，以2细胞胚胎百分率为受精率。结果（图 8）显示，LID1组2细胞胚胎百分率明显降低（p< 0.05）；

[0066] 这些结果提示LRRC52是构成精子钾通道、介导精子钾电流的重要组分。LRRC52在精子生理功能中扮演重要角色，是开发调控精子功能化合物的潜在分子靶点，本多克隆抗体可有效抑制小鼠精子活性与生理功能。

[0067] 3、LRRC52多克隆抗体对人精子生理功能的影响

[0068] 我们利用Trizol法提取人精子RNA和蛋白，利用RT-PCR和Western blot方法分别检测人精子中slo3和lrrc52的基因和蛋白表达情况。RT-PCR均可检出与slo3和lrrc52目的基因一致（分别为196 bp和143 bp）的mRNA条带（图9A），而Western blot亦可检测到与SLO3和LRRC52（糖基化修饰后）目的蛋白大小一致（分别为130 KD和46 KD）的条带（图9B）。说明，在人精子中存在着SLO3和LRRC52的表达；

[0069] 将人精子与50 μg/mL LID1或50 μg/mL正常IgG共孵育4 h，并在此基础进一步分为添加（不加）A23187组，CTC染色分析精子顶体反应发生情况。结果（图10）显示，与对照组相比，LID1作用下精子自发顶体反应发生率和A23187诱发顶体反应发生率均降低（p< 0.05）；

[0070] 将人精子与 50 µg/mL LID1共孵育 4 h后，利用精子分析仪（CASA）检测分析精子运动各项指标变化。结果（图11）发现，抗体组精子总活力明显降低（p< 0.01），平均曲线速度（VCL）亦较正常组下降（p< 0.05），平均路径速度（VAP）和平均直线速度（VSL）无明显改变（p> 0.05）；

[0071] 利用膜片钳技术分别记录pHi8.0时，0、5、20 g/mL LID1作用下人精子IKSper (human IKSper, hIKSper) 变化。结果（图12）发现，20 g/mL LID1组在-100 mV到+100 mV渐变电压刺激下，hIKSper出现明显抑制（P< 0.05），这一结果与LID1对小鼠精子钾电流的影响一致；

[0072] 这些结果提示，本多克隆抗体对人精子活性与生理功能亦有抑制作用。