耐辐射奇球菌蛋白酶PprI的酶活性启动和提高方法转让专利
申请号 : CN201410262937.6
文献号 : CN104212782B
文献日 : 2016-03-02
发明人 : 华跃进 , 王云光 , 王梁燕
申请人 : 浙江大学
摘要 :
本发明公开了一种蛋白酶PprI的酶活性启动和提高方法。所述蛋白酶PprI的酶活性启动需要2.0-5.0mM的Mn2+离子。酶切反应缓冲液为150-250mM NaCl、10-50mM Tris-HCl 8.0、1mM DTT、2.0-5.0mM MnCl2。基因dr2574和dr2340启动子片段与底物DdrO结合后，可提高蛋白酶PprI的酶切活性，缩短反应时间，对该酶的今后利用具有积极贡献。
权利要求 :
2+
1.一种耐辐射奇球菌蛋白酶PprI的酶活性启动和提高方法，其特征在于，使用Mn 离子启动所述的蛋白酶PprI的酶活性；使用含150-250 mM NaCl、10-50mM Tris-HCl 8.0、1mM DTT、2.0-5.0 mM MnCl2的反应缓冲液；
使用基因启动子提高所述的蛋白酶PprI的酶活性；
所述的基因启动子为dr2574基因启动子或 dr2340基因启动子。
说明书 :
耐辐射奇球菌蛋白酶PprI的酶活性启动和提高方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种新发现的耐辐射奇球菌蛋白酶PprI，涉及金属离子对酶活性的启动作用、基因启动子对酶切效率的促进作用。
背景技术
[0002] 蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称，可以催化蛋白质中肽键的水解。蛋白酶广泛存在于动物、植物和微生物中。到目前为止，国际市场上商品蛋白酶100种以上。由于动植物资源有限，工业上生产蛋白酶制剂主要来自微生物，利用枯草杆菌、酵母、霉菌、大肠杆菌等微生物提取制备。随着蛋白酶研究的深入，它的工业应用越来越引起了人们的广泛关注。
[0003] 蛋白酶已广泛应用在毛皮、皮革、丝绸、医药、食品、酿造、石油钻井等领域。利用蛋白酶，皮革工业的脱毛软化，既节省时间，又改善劳动卫生条件。蛋白酶还可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清。临床上可作药用，例如用于消化不良、支气管炎、脉管炎等症状的治疗。加入蛋白酶的洗衣粉能高效去除衣物上的血渍和蛋白污物。另外，蛋白酶广泛应用于生化分子实验，作为蛋白质的手术刀，是生命科学研究不可或缺的。
[0004] 耐辐射奇球菌是一种极端环境微生物，以对电离辐射、紫外射线、干燥和氧化压力等极端条件表现极强抗性而著称。它的这种超强抗性有一部分归功于其体内pprI基因（基因名dr_0167，NCBI-GeneID: 1798483）。它是在基因损伤修复中起整体调控作用。pprI基因表达的产物PprI蛋白（NCBI-GI: 15805204）由328个氨基酸组成，含3个功能结构域，分别是锌指-蛋白酶结构域，螺旋-转角-螺旋结构域，GAF结构域。但是至今为止，PprI的蛋白酶活性和酶底物从未被发现。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种耐辐射奇球菌蛋白酶PprI的酶活性启动与提高方法。
[0006] 耐辐射奇球菌蛋白酶PprI的酶活性优化方法，所述的蛋白酶PprI的酶活性启动2+
需要Mn 离子。
需要Mn 离子。
[0007] 所述的Mn2+离子浓度为2.0-5.0 mM。
[0008] 所述的蛋白酶PprI的反应缓冲液含100-200 mM NaCl、10-50mM Tris-HCl 8.0、1mM DTT、2.0-5.0 mM MnCl2。
[0009] 所述的蛋白酶PprI酶活性的提高需要基因启动子。
[0010] 所述的基因启动子为dr2340基因启动子和 dr2574基因启动子。
[0011] 本发明的有益效果：
[0012] 蛋白质的手术刀，是生命科学研究不可或缺的；本发明可以高效提高蛋白酶PprI的酶切活性，缩短反应时间。
附图说明
[0013] 图1是不同金属离子对蛋白酶PprI的酶活性的SDS-PAGE图；
[0014] 其中，从左至右，分别是不加金属离子的对照反应；加EDTA的对照反应；
[0015] 加Ca2+的反应；加Cu2+的反应；加Fe2+的反应；加Mg2+的反应；加Ni2+的反应；
[0016] 加Mn2+的反应；加Zn2+的反应。
[0017] 图2是ddrO基因启动子促进蛋白酶PprI的酶活性的SDS-PAGE图；
[0018] 其中，第1道为不加ddrO基因启动子的对照实验；第2到5道为 ddrO基因启动子的量递增的反应，浓度范围从0.04µM/L到0.32µM/L。
[0019] 图3是recA基因启动子促进蛋白酶PprI的酶活性的SDS-PAGE图。
[0020] 其中，第1道为不加recA基因启动子的对照实验；第2到5道为 recA基因启动子的量递增的反应，浓度范围从0.04µM/L到0.32µM/L。
[0021] 图4是非特异性DNA处理对照实验的SDS-PAGE图；
[0022] 其中，第1道为不加启动子的对照实验；第2道为加非特异性DNA的对照实[0023] 验，浓度为0.32µM/L。
具体实施方式
[0024] 本发明所用的菌株为耐辐射奇球菌（Deinococcus radiodurans，ATCC No.13939）。耐辐射奇球菌是一种极端环境微生物，对电离辐射、紫外射线、干燥和氧化压力等极端条件表现极强抗性。PprI本身和其中锌结合蛋白酶结构域均具有蛋白酶活性，可以2+ 2+
切割底物DdrO蛋白。它们在行使蛋白酶活性时，需要金属离子Mn 的存在。Mn 是该蛋白
2+ 2+ 2+ 2+
酶活性必需的，启动蛋白酶酶切活性。而其他二价离子，如Fe ,Cu ,Ni ,Zn 等，均对蛋白酶活性存在抑制的作用。另外，recA基因和 ddrO基因等启动子均能促进酶切效率。
切割底物DdrO蛋白。它们在行使蛋白酶活性时，需要金属离子Mn 的存在。Mn 是该蛋白
2+ 2+ 2+ 2+
酶活性必需的，启动蛋白酶酶切活性。而其他二价离子，如Fe ,Cu ,Ni ,Zn 等，均对蛋白酶活性存在抑制的作用。另外，recA基因和 ddrO基因等启动子均能促进酶切效率。
[0025] （1）PprI的蛋白酶活性依赖于金属离子Mn2+
[0026] 如图1所示，PprI蛋白在行使蛋白酶活性时，需要金属离子Mn2+的存在，终浓度范2+ 2+
围在2-5mM/L之间。在Mn 终浓度为2mM/L时，活性较佳。在没有Mn 存在时，未表现出
2+
蛋白酶活性。所以，Mn 是蛋白酶活性必需的。而其他二价离子，终浓度大于0.25mM/L,如
2+ 2+ 2+ 2+ 2+
Fe ,Cu ,Ni ,Zn 等，均对蛋白酶活性存在抑制的作用。即使 Mn 存在条件下，加入低浓
2+ 2+ 2+ 2+
度的Fe ,Cu ,Ni ,Zn 等离子，活性都受到阻抑（如图1）。
围在2-5mM/L之间。在Mn 终浓度为2mM/L时，活性较佳。在没有Mn 存在时，未表现出
2+
蛋白酶活性。所以，Mn 是蛋白酶活性必需的。而其他二价离子，终浓度大于0.25mM/L,如
2+ 2+ 2+ 2+ 2+
Fe ,Cu ,Ni ,Zn 等，均对蛋白酶活性存在抑制的作用。即使 Mn 存在条件下，加入低浓
2+ 2+ 2+ 2+
度的Fe ,Cu ,Ni ,Zn 等离子，活性都受到阻抑（如图1）。
[0027] （2）酶切底物ddrO基因启动子和 recA基因启动子均可促进PprI酶切效率[0028] 如图2、3所示，酶切底物蛋白DdrO分别与底物基因启动子和recA基因启动子在反应缓冲液（150mM NaCl,20mM Tris-HCl 8.0,1mM DTT,10mM MgCl2）中反应40分钟。接着，在两反应液中分别加入纯化的PprI蛋白。然后，加入终浓度为2.0mM的 MnCl2启动反应。在40分钟后，终止反应，用 SDS-PAGE电泳检测。从SDS-PAGE胶图分析可见，底物蛋白与自身启动子和recA基因启动子之间的相互作用，均在很大程度上促进PprI酶切效率。如图4所示，对照实验证明上述基因启动子的特异性。
[0029] 实施例1
[0030] （1）PprI的蛋白酶活性依赖于金属离子Mn2+
[0031] PprI蛋白在行使蛋白酶活性时，需要金属离子Mn2+的存在。在Mn2+终浓度为2mM/L时，活性最佳。
[0032] （2）酶切底物基因ddrO启动子可促进PprI酶切效率
[0033] 酶切底物蛋白DdrO与底物基因启动子在反应缓冲液（150mM NaCl,20mM Tris-HCl8.0,1mM DTT,10mM MgCl2）中反应40分钟。接着，在反应液中加入纯化的PprI蛋白。然后，加入终浓度为2.0mM的MnCl2启动反应。在40分钟后，终止反应，用 SDS-PAGE电泳检测。
实验表明，底物蛋白与自身启动子之间的相互作用，可很大程度上促进PprI酶切效率。
实验表明，底物蛋白与自身启动子之间的相互作用，可很大程度上促进PprI酶切效率。
[0034] 实施例2
[0035] （1）PprI的蛋白酶活性依赖于金属离子Mn2+
[0036] PprI蛋白在行使蛋白酶活性时，需要金属离子Mn2+的存在。在Mn2+终浓度为2mM/2+ 2+
L时，活性最佳。其他二价离子，如Ni ,Zn 等，终浓度大于0.25mM/L,均对蛋白酶活性存在抑制的作用。
L时，活性最佳。其他二价离子，如Ni ,Zn 等，终浓度大于0.25mM/L,均对蛋白酶活性存在抑制的作用。
[0037] （2）recA基因启动子可促进PprI酶切效率
[0038] 酶切底物蛋白DdrO与recA基因启动子在反应缓冲液（150mM NaCl,20mM Tris-HCl 8.0,1mM DTT,10mM MgCl2）中反应40分钟。接着，在反应液中加入纯化的PprI蛋白。然后，加入终浓度为2.0mM的MnCl2启动反应。在40分钟后，终止反应，用 SDS-PAGE电泳检测。实验表明，底物蛋白与recA基因启动子之间的相互作用，可很大程度上促进PprI酶切效率。
[0039] 实施例3
[0040] （1）PprI的蛋白酶活性依赖于金属离子Mn2+
[0041] PprI蛋白在行使蛋白酶活性时，需要金属离子Mn2+的存在。在Mn2+终浓度为5mM/2+ 2+
L时，活性仍然存在。其他二价离子，如Fe ,Cu 等，终浓度大于0.25mM/L,均对蛋白酶活性存在抑制的作用。
L时，活性仍然存在。其他二价离子，如Fe ,Cu 等，终浓度大于0.25mM/L,均对蛋白酶活性存在抑制的作用。
[0042] （2）非特异性DNA不可促进PprI酶切效率
[0043] 酶切底物蛋白DdrO与非特异性DNA在反应缓冲液（150mM NaCl,20mM Tris-HCl8.0,1mM DTT,10mM MgCl2）中反应40分钟。接着，在反应液中加入纯化的PprI蛋白。然后，加入终浓度为2.0mM的MnCl2启动反应。在40分钟后，终止反应，用 SDS-PAGE电泳检测。
实验表明，非特异性DNA不可促进PprI酶切效率。
实验表明，非特异性DNA不可促进PprI酶切效率。
[0044] 本发明实施例中所用的菌株为耐辐射奇球菌（Deinococcus radiodurans，ATCC No.13939），耐辐射奇球菌蛋白酶PprI，但是根据本发明的教导和启示，任何人工合成或者其他自然含有的蛋白酶以及衍生物，如具有与耐辐射奇球菌蛋白酶PprI同源的序列和类似的结构和功能，也在本发明的保护范围之内。