本发明名为“一种新的转基因枯草芽孢杆菌检测试剂盒及其检测方法”，涉及转基因微生物检测技术领域，本发明通过巧妙地设计针对转基因枯草芽孢杆菌特异序列的带标记引物和探针，结合PCR扩增和核酸试纸条检测技术，实现了转基因枯草芽孢杆菌的高效快速检测。该方法特异性强，灵敏度高和稳定性好，对于提高转基因枯草芽孢杆菌的准确性、缩短检测时间具有非常显著的作用。本检测试剂盒使用方便快捷，节约成本和时间，原理和操作简单，可用于快速检测转基因枯草芽孢杆菌。
1.两套用于转基因枯草芽孢杆菌NZ-B.sub检测的特异性引物和探针，其特征在于，序列为：上游引物1： Spo-F-bio：5’biotin —CTGCATCGGGCTGGAAAATGAC—3’下游引物1： Spo-R：5’— ATCCCCAGTCCCAAACCGATGC—3’探针1：Spo-P-fitc： 5’ fitc—AACCTGCACCTGAGAGATCC—3’上游引物2： NprE-F-bio：5’biotin—CTGGGAAGTCTCGACGGT—3’下游引物2： NprE-R：5’— TAATTCTGGATGCCGAAAGC—3’探针2：NprE-P-fitc： 5’ fitc—AATACCCGAATACGTCAGAG—3’。
2.一种用于检测转基因枯草芽孢杆菌NZ-B.sub的试剂盒，其特征在于，包括如下成分：（1）阳性对照转基因枯草芽孢杆菌NZ-B.sub的DNA模板和阴性对照野生型枯草芽孢杆菌DNA模板（2）转基因枯草芽孢杆菌NZ-B.sub Spo、NprE特异序列上下游特异引物和探针上游引物1： Spo-F-bio：5’biotin —CTGCATCGGGCTGGAAAATGAC—3’下游引物1： Spo-R：5’—ATCCCCAGTCCCAAACCGATGC—3’探针1：Spo-P-fitc： 5’ fitc—AACCTGCACCTGAGAGATCC—3’上游引物2： NprE-F-bio：5’biotin—CTGGGAAGTCTCGACGGT—3’下游引物2： NprE-R：5’—TAATTCTGGATGCCGAAAGC—3’探针2：NprE-P-fitc： 5’fitc—AATACCCGAATACGTCAGAG—3’（3）10×Taq PCR Buffer ,ddH2O ,2.5mM dNTP ,5U/μl Taq酶（4）生物素（Biotin）、异硫氰酸荧光素（Fitc）抗原标记的薄膜层析试纸条。
3.一种转基因枯草芽孢杆菌NZ-B.sub的快速检测方法，包括如下步骤：（1）PCR反应体系1： 2.5μl 10×Taq Buffer，1μl 2.5mM dNTP ，1μl 10μM Spo-F-bio
5’biotin—CTGCATCGGGCTGGAAAATGAC—3’，1μl 10μM Spo-R5’—ATCCCCAGTCCCAAACCGATGC—3’， 1μl模板DNA ，0.25μl 5U/μl Taq酶，18.25μl ddH2O，总体积共25μl，PCR反应条件：94 ℃ 预变性 1 min，94 ℃变性30 s，60.8 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，30个循环，72 ℃延伸5 min（2）探针1杂交：扩增结束后，加入2 μl 10μM探针Spo-P-fitc 5’fitc—AACCTGCACCTGAGAGATCC—3’，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s（3）PCR反应体系2：2.5μl 10×Taq Buffer，1μl 2.5mM dNTP ，1μl 10μM NprE-F-bio
5’biotin—CTGGGAAGTCTCGACGGT—3’，1μl 10μM NprE-R 5’—TAATTCTGGATGCCGAAAGC—
3’， 1μl模板DNA ，0.25μl 5U/μl Taq酶，18.25μl ddH2O，总体积共25μl，PCR反应条件：94 ℃ 预变性 1 min，94 ℃变性30 s，60.8 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，30个循环，72 ℃延伸5 min（4）探针2杂交：扩增结束后，加入2 μl 10μM探针NprE-P-fitc 5’fitc—AATACCCGAATACGTCAGAG—3’，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s（5）试纸条检测：取4 μL扩增、杂交产物加到试纸条的样品垫上，然后滴加2-3滴缓冲液，5 min后判读并记录结果（6）判定结果：用Spo、NprE两套特异引物、探针分别进行扩增、杂交，产物用试纸条检测，两套引物、探针控制线正常，检测线都呈现阳性时，则说明该样品含有转基因枯草芽孢杆菌NZ-B.sub，若有一套或两套引物、探针试纸条检测结果显示为阴性，则判定样品中没有转基因枯草芽孢杆菌NZ-B.sub。
一种新的转基因枯草芽孢杆菌检测试剂盒及其检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及转基因微生物检测技术领域，提供了一种利用PCR扩增和核酸试纸条技术相结合的快速检测转基因枯草芽孢杆菌的试剂盒，适用于转基因枯草芽孢杆菌的快速检测。
背景技术
[0002] 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是芽孢杆菌属的一种，是细菌中的一个常见种，广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。有的菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌。
[0003] 目前在酶制剂产品中的转基因微生物检测的技术还是主要依靠传统分离培养的形态学检测方法，检测灵敏度低，而且检测周期需要几天时间。近些年来，随着分子生物学检测技术的快速发展，PCR技术成了微生物快速检测的常用手段，但是扩增产物需要凝胶电泳，紫外凝胶成像，步骤多，耗时长，而且存在核酸染色剂环境污染的问题。
[0004] 本研究通过巧妙地设计针对转基因枯草芽孢杆菌的带标记的特异性引物和探针，应用PCR扩增和核酸试纸条检测技术，实现了转基因枯草芽孢杆菌的高效快速准确检测。该方法特异性强，灵敏度高和稳定性好，对于转基因枯草芽孢杆菌检测的准确性、检测效率的提高具有重要的作用。
发明内容
[0005] 本发明需要解决的技术问题是提供用于检测转基因枯草芽孢杆菌的两套特异性引物和探针。
[0006] 本发明需要解决的另一问题是提供包含上述引物的核酸试纸条检测试剂盒。
[0007] 本发明用于检测转基因枯草芽孢杆菌的两套PCR引物及探针序列为：
[0008] 上游引物1： Spo-F-bio：5’biotin —CTGCATCGGGCTGGAAAATGAC—3’[0009] 下游引物1： Spo-R：5’— ATCCCCAGTCCCAAACCGATGC—3’
[0010] 探针1：Spo-p-fitc： 5’ fitc—AACCTGCACCTGAGAGATCC—3’
[0011] 上游引物2： NprE-F-bio：5’biotin—CTGGGAAGTCTCGACGGT—3’
[0012] 下游引物2： NprE-R：5’— TAATTCTGGATGCCGAAAGC—3’
[0013] 探针2：NprE-P-fitc： 5’ fitc—AATACCCGAATACGTCAGAG—3’。
[0014] 本发明的转基因枯草芽孢杆菌检测试剂盒，包括以下成分：
[0015] （1）转基因枯草芽孢杆菌DNA模板和阴性对照野生型枯草芽孢杆菌DNA模板[0016] （2）转基因枯草芽孢杆菌带标记的上、下游引物和探针
[0017] 上游引物1： Spo-F-bio：5’biotin —CTGCATCGGGCTGGAAAATGAC—3’[0018] 下游引物1： Spo-R：5’— ATCCCCAGTCCCAAACCGATGC—3’
[0019] 探针1：Spo-P-fitc： 5’ fitc—AACCTGCACCTGAGAGATCC—3’
[0020] 上游引物2： NprE-F-bio：5’biotin—CTGGGAAGTCTCGACGGT—3’
[0021] 下游引物2： NprE-R：5’— TAATTCTGGATGCCGAAAGC—3’
[0022] 探针2：NprE-P-fitc： 5’ fitc—AATACCCGAATACGTCAGAG—3’
[0023] （3）10×Taq PCR Buffer ,DDH2O,2.5mM dNTP ,5U/μl Taq酶
[0024] 分别用上述方法对待测样品DNA进行PCR扩增、探针杂交，产物用试纸条检测，如果两套引物探针的检测结果显示，控制线正常、检测线呈现阳性，则说明该样品含有转基因枯草芽孢杆菌，若有一套引物探针或两套引物探针检测线呈现阴性，则说明该样品中不含有转基因枯草芽孢杆菌。
[0025] 与现有技术相比，本发明的进步在于：无需琼脂糖凝胶电泳、紫外凝胶成像，从而大幅降低检测仪器投入，检测速度明显优于凝胶电泳成像，而且该检测方法特异性强，灵敏度高，稳定性好。
附图说明
[0026] 图1为Spo试纸条特异性检测，图2为NprE试纸条特异性检测，1为转基因枯草芽孢杆菌，2、3、4、5、6、7为野生型枯草芽孢杆菌，8为DDH2O，从图1、图2 可以看出使用本试剂盒能准确地检测出转基因枯草芽孢杆菌。
具体实施方式
[0027] 第一套Spo特异引物探针设计(下划线位置):
[0028] 1 CTGCATCGGG CTGGAAAATG ACGGAGATCC GATTACCCTG CTTGATCAAA TCGCTGACAA[0029] Spo-F
[0030] 61 CTCAGAAGAA AAATGGTTTG ACAAAATTGC GCTGAAAGAA GCGATCAGCG ATTTGGAGGA[0031] 121 AAGGGAAAAA CTAATCGTCT ATCTCAGATA TTATAAAGAC CAGACACAGT CCGAGGTGGC[0032] 181 TGAGCGGCTC GGGATCTCTC AGGTGCAGGT TTCCAGGCTT GAAAAGAAAA TATTAAAACA[0033] Spo-P
[0034] 241 GATCAAGGTT CAAATGGATC ATACGGATGG CTAGTCTGCA GTGCAGGCTA GCTTTTTTGT[0035] 301 GCAAAAGCGT GGTAATTTAT GGTCTTTTCG AGCGGATGAA TGAGAACAAA ATCGAACCAC[0036] 361 ATACTACATA TATAACCACC GAAAGATGGT GATCAATGAT GGAACGACGA ATATTTATCC[0037] 421 GGCTTCGCCA CCGAGTGCTG GCACATCCAG GGGATATTAT TACCGTTGGA GATGCCGCGC[0038] 481 AAATAGAAGG GCAGCTTCAG CTGAAAAAGA AACTTTCGGC TATGCCGCTT TATCAGGTGA[0039] 541 GCGAAAAAGA TAAAAATATC GTAATTCTGG ATATCATACA AGTCCTCAGA GCCATTCATT[0040] 601 TACAAGACCC GACAATTGAT GTTCAAACCG TAGGCGGAGC AGAAACCATT GTTGAAATTC[0041] 661 AGTATCGAAA GCGAAATTTA TCAACGGTTC TATTTATCGG TGTCTGGCTG CTTCTGTTTA[0042] 721 TTGGATCGTG TCTTGCCATC ATGAACTTTC ATGAGGATGT AAGCATGAGA GATGTTCATA[0043] 781 TCGCACTATA TGAAATCATA ACCGGAGAGA GGAATGACTA TCCATATTTG CTTCAAATCC[0044] 841 CATACAGCAT CGGTTTGGGA CTGGGGAT
[0045] Spo-R
[0046] 第二套NprE引物探针设计:
[0047] 1 CTGGGAAGTC TCGACGGTTC ATTCTTCTCT CCGCTTTCCG GCTCATTAGA TGTGACAGCG[0048] NprE-F
[0049] 61 CATGAAATGA CACATGGCGT CACCCAAGAA ACAGCCAACT TGATTTATGA AAATCAGCCA[0050] 121 GGTGCATTAA ACGAGTCTTT CTCTGACGTA TTCGGGTATT TTAACGATAC AGAAGACTGG[0051] NprE-P
[0052] 181 GACATCGGTG AAGACATTAC GGTCAGCCAG CCTGCTCTTC GCAGCCTGTC CAACCCTACA[0053] 241 AAATACAACC AGCCTGACAA TTACGCCAAT TACCGAAACC TTCCAAACAC AGATGAAGGC[0054] 301 GATTATGGCG GTGTACACAC AAACAGCGGA ATTCCAAACA AAGCCGCTTA CAACACCATC[0055] 361 ACAAAACTTG GTGTATCTAA ATCACAGCAA ATCTATTACC GTGCGTTAAC AACGTACCTC[0056] 421 ACGCCTTCTT CCACGTTCAA AGATGCCAAG GCAGCTCTCA TTCAGTCTGC CCGTGACCTC[0057] 481 TACGGCTCAA CTGATGCCGC TAAAGTTGAA GCAGCCTGGA ATGCTGTTGG ATTGTAATAT[0058] 541 TAGGAAAAGC CTGAGATCCC TCAGGCTTTT ATTGTTACAT ATCTTGATTT CTCTCTCAGC[0059] 601 TGAAACGACG AAAAGATGCT GCCATGAGAC AGAAAACCGC TCCTGATTTG CATAAAGAGG[0060] 661 GATGCAGCCG CAAGTGCGCA TTTTATAAAA GCTAATGATT CAGTCCACAT AATTGATAGA[0061] 721 CGAATTCTGC TACAGGTCAC GTGGCTATGT GAAGGATCGC GCGTCCAGTT AAGAGCAAAA[0062] 781 ACATTGACAA AAAAATTTAT TTATGCTAAA ATTTACTATT AATATATTTG TATGTATAAT[0063] 841 AAGATTCTCC TGGCCAGGGG AATCTTATTT TTTGTGGAGG ATCATTTCAT GAGGAAAAAT[0064] 901 GAGTCCAGCT TAACGTCTCT AATTTCAGCT TTTGCCCGTG CATATCACAG CCGATATGAC[0065] 961 ACACCTCTTA TTTTTGATGA TTTTATCGCA AAAGATCTCA TTAACGAAAA AGAGTTTATC[0066] 1021 GACATCAGTA AAAATATGAT TCAAGAAATA TCGTTTTTCA ACAAAGAGAT CGCCGAACGT[0067] 1081 CTTCAAAATG ATCCTGAAAA AATATTAAAA TGGGTTGCAC AAATCCAGCT GTCTCCAACG[0068] 1141 CCCCTAGCAC GTGCTTCTTA TTGTGAAAAA GTCTTGCACA ACGAATTAAT CCTGGGGGCA[0069] 1201 AAACAGTATG TCATTCTTGG AGCGGGACTG GATACTTTCT GCTTTCGGCA TCCAGAATTA[0070] NprE-R[0071] 根据转基因枯草芽孢杆菌的重组DNA序列，利用引物设计软件设计两组引物、探针（下划线位置），分别在上游引物5’标记生物素（biotin）、探针5’标记荧光素（fitc），引物探针序列如下：
[0072] 上游引物1： Spo-F-bio：5’biotin —CTGCATCGGGCTGGAAAATGAC—3’[0073] 下游引物1： Spo-R：5’— ATCCCCAGTCCCAAACCGATGC—3’
[0074] 探针1：Spo-P-fitc： 5’ fitc—AACCTGCACCTGAGAGATCC—3’
[0075] 上游引物2： NprE-F-bio：5’biotin—CTGGGAAGTCTCGACGGT—3’
[0076] 下游引物2： NprE-R：5’— TAATTCTGGATGCCGAAAGC—3’
[0077] 探针2：NprE-P-fitc： 5’ fitc—AATACCCGAATACGTCAGAG—3’’
[0078] 标本来源
[0079] 本实验测试了来源不同的7种枯草芽孢杆菌，其中包括1种转基因枯草芽孢杆菌,6种野生型枯草芽孢杆菌，见下表：
[0080]
[0081] 实施例1、转基因枯草芽孢杆菌的检测
[0082] DNA提取：采用Qiagen DNeasy plant mini kit试剂盒，按步骤提取枯草芽孢杆菌基因组DNA溶于100uL TE中，-20℃保存备用。
[0083] PCR扩增：分别以NZ-B.sub、B.sub1、B.sub2、B.sub3、B.sub4、B.sub5、B.sub6和基因组DNA和ddH2O作为模板，进行PCR扩增。
[0084] PCR反应体系：
[0085] 10×Taq Buffer 2.5μl
[0086] dNTP（2.5mmol/L） 1μl
[0087] 上游引物（10μmol/L） 1μl
[0088] 下游引物（10μmol/L） 1μl
[0089] 模板DNA 1μl
[0090] Taq酶(5U/μl) 0.25μl
[0091] ddH2O 18.25μl
[0092]
[0093] 25μl
[0094] PCR反应条件：94℃ 预变性 1 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸 30 s，30个循环，72℃延伸5 min。
[0095] 探针杂交：扩增结束后，加入探针（10μmol/L） 1 μl，94℃变性30 s，53℃退火30 s。
[0096] 试纸条检测：分别取4 μL扩增、杂交产物加到试纸条的样品垫上，然后滴加2-3滴缓冲液，5 min后判读并记录结果,结果如图1、图2， 1：NZ-B.sub；2：B.sub1；3：B.sub2；4：B.sub3；5：B.sub4；6：B.sub5；7：B.sub6；8 ddH2O：。
[0097] 结果表明，图1、图2的1号转基因枯草芽孢杆菌在检测线出现特异性红色条带，其余阴性对照枯草芽孢杆菌及空白对照水均无条带出现，且控制线显示正常，只有两套引物、探针检测线同时显示特异性条带时，表明检测物中含有转基因枯草芽孢杆菌成分。
[0098] 序列表
[0099] SEQUENCE LISTING
[0100] <110> 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心
[0101] <120> 一种新的转基因枯草芽孢杆菌检测试剂盒及其检测方法
[0102] <160> 6
[0103] <210> 1
[0104] <211> 22
[0105] <212> DNA
[0106] <213> 人工序列
[0107] <400> 1
[0108] ctgcatcggg ctggaaaatg ac 22[0109] <210> 2
[0110] <211> 22
[0111] <212> DNA
[0112] <213> 人工序列
[0113] <400> 2
[0114] atccccagtc ccaaaccgat gc 22[0115] <210> 3
[0116] <211> 20
[0117] <212> DNA
[0118] <213> 人工序列
[0119] <400> 3
[0120] aacctgcacc tgagagatcc 20[0121] <210> 4
[0122] <211> 18
[0123] <212> DNA
[0124] <213> 人工序列
[0125] <400> 4
[0126] ctgggaagtc tcgacggt 18[0127] <210> 5
[0128] <211> 20
[0129] <212> DNA
[0130] <213> 人工序列
[0131] <400> 5
[0132] taattctgga tgccgaaagc 20[0133] <210> 6
[0134] <211> 20
[0135] <212> DNA
[0136] <213> 人工序列
[0137] <400> 6
[0138] aatacccgaa tacgtcagag 20
