一种从植物中提取和测定血红素的方法

摘要

本发明公开一种从植物中提取和测定血红素的方法，包括以下步骤：步骤一、采用丙酮与蒸馏水的混合溶液离心分离，去除叶绿素，然后用盐酸、丙酮与蒸馏水的混合溶液离心分离，得到混合提取液，然后再用乙醚进行萃取，浓缩干燥得到干燥的植物血红素，备用；步骤二、采用紫外分光光度计测定574.5nm处的吸光度；步骤三、将步骤二得到的平均吸光度A代入线性回归方程：A=2.6814496C+0.07506221，计算得到稀释倍数C，再根据Ci=0.5C mg/ml，计算出植物叶片中血红素的浓度Ci。本发明提供的从植物中提取和测定血红素的方法能够准确测定植物中的血红素含量，在叶绿素代谢调控机制的研究中发挥重要作用。

权利要求

1.一种从植物中提取和测定血红素的方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一、植物血红素的提取

a.准确称取待测植物的新鲜叶片1g，置于预冷的研钵中，加液氮研磨至粉末状，然后转移至离心管中，加入丙酮与蒸馏水的混合溶液Ⅰ，震荡均匀后离心，弃去上清液，重复向离心产物中加入丙酮与蒸馏水的混合溶液Ⅰ、震荡和离心操作，直至得到的离心产物为无色，得到初级产物，备用；再向得到的初级产物中加入丙酮与蒸馏水的混合溶液Ⅱ，震荡均匀后离心，弃去上清液，重复向离心产物中加入丙酮与蒸馏水的混合溶液Ⅱ、震荡和离心操作，直至得到的离心产物为无色，得到次级产物，备用；

所述混合溶液Ⅰ中丙酮所占的比例大于混合溶液Ⅱ中的比例；

b.在步骤a得到的次级产物中加入盐酸、丙酮与蒸馏水的混合溶液，震荡均匀后离心，收集上清液，备用；然后向离心得到的沉淀中再次加入盐酸、丙酮与蒸馏水的混合溶液，震荡均匀后离心，收集上清液，合并两次上清液，得到混合提取液，备用；

c.向步骤b得到的混合提取液中加入乙醚，混合均匀后加入到分液漏斗中，将分液漏斗多次倒置后静置分层，收集上层溶液，备用；并向下层溶液中再次加入乙醚，混合均匀后加入到分液漏斗中，静置分层后收集上层溶液，合并两次得到的上层溶液，置于分液漏斗中，然后加入与合并的上层溶液等体积的蒸馏水进行洗涤，静置分层后取乙醚层，加入到旋转蒸发仪中浓缩，再将浓缩产物倒入离心管中，用氮气吹干，即得到干燥的植物血红素，备用；

步骤二、植物血红素含量测定

向步骤一得到的干燥的植物血红素中加入7.44ml蒸馏水和0.48ml 5N NaOH，搅拌至植物血红素溶解后再加入12 ml蒸馏水和4.08 ml 吡啶，再次混合均匀，采用紫外分光光度计测定574.5nm处的吸光度，测量时在样品中加入几滴二硫酸盐和50mmol/L的铁氰化物，取独立的三株以上的植物的叶片进行测定，多次测定求平均值，得到平均吸光度A，备用；

步骤三、植物血红素浓度的计算

将步骤二得到的平均吸光度A代入线性回归方程：A=2.6814496C+0.07506221，计算得到稀释倍数C，再根据Ci = 0.5C mg/ml，计算出植物叶片中血红素的浓度Ci。

2.如权利要求1所述的一种从植物中提取和测定血红素的方法，其特征在于：步骤a所述的震荡均匀所需的时间为10-25min，离心条件为离心力4000g、离心时间8-20min。

3.如权利要求1所述的一种从植物中提取和测定血红素的方法，其特征在于：步骤a所述的丙酮与蒸馏水的混合溶液Ⅰ中丙酮和蒸馏水的体积比99：1，混合溶液Ⅰ每次加入量为

10ml。

4.如权利要求1所述的一种从植物中提取和测定血红素的方法，其特征在于：步骤a所述的丙酮与蒸馏水的混合溶液Ⅱ中丙酮和蒸馏水的体积比80:20，混合溶液Ⅱ每次加入量为5ml。

5.如权利要求1所述的一种从植物中提取和测定血红素的方法，其特征在于：步骤b所述的盐酸、丙酮与蒸馏水的混合溶液中盐酸、丙酮和蒸馏水的体积比为5：80：15，每次加入量为5ml。

6.如权利要求1所述的一种从植物中提取和测定血红素的方法，其特征在于：步骤b所述的震荡时间为10-25min，离心条件为离心力4000g、离心时间8-20min。

7.如权利要求1所述的一种从植物中提取和测定血红素的方法，其特征在于：步骤c中的乙醚每次的加入量为10ml。

说明书

一种从植物中提取和测定血红素的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种色素的提取及测定方法，主要涉及一种从植物中提取和测定血红素的方法。

背景技术

[0002] 血红素是一类重要的四吡咯卟啉类化合物，广泛分布于动物的血液、肌肉以及一些植物组织中。在动物中，血红素主要存在于血液中的红细胞中，与珠蛋白结合在一起共同构成了血红蛋白；在植物中，血红素作为细胞色素酶、过氧化物酶的辅基参与了电子传递。目前，动物中的血红素提取研究较多，也较成熟，已经有了比较完整的体系，可以实现批量生产。从动物血液中提取的血红素被广泛运用于药物和保健食品，用于治疗营养性贫血、恶性肿瘤、肝炎等。在植物中，血红素的结构和叶绿素非常相似，都是由四个吡咯环化形成的卟啉化合物，血红素的卟啉环中螯合了一个铁离子，如图1所示，而叶绿素卟啉环中螯合了一个镁离子，如图2所示。在生物合成的前期阶段，从ALA合成到Proto IX合成都是血红素和叶绿素所共有的，如图3所示。血红素分子还能作为信号因子调控谷氨酸-tRNA还原酶（叶绿素合成过程中的第一个关键的限速酶，该酶可直接影响整个叶绿素合成过程）以及光合作用相关的核基因的表达。因此，准确测定植物中的血红素含量对研究叶绿素代谢调控机制非常重要。动物血液中的血红素含量很高，研究很多，提取也较简便，技术也较成熟；植物组织中的血红素含量很低，研究得较少，提取比较困难，也没有比较便宜且可信的测定方法，成为叶绿素代谢研究工作中的一个瓶颈。

发明内容

[0003] 本发明的目的是针对植物中血红素提取比较困难的问题，提供一种从植物中提取和测定血红素的方法，该方法能够准确测定植物中的血红素含量，在叶绿素代谢调控机制的研究中发挥重要作用。

[0004] 本发明实现上述目的采用的技术方案是：一种从植物中提取和测定血红素的方法，包括以下步骤：

[0005] 步骤一、植物血红素的提取

[0006] a.准确称取待测植物的新鲜叶片1g，置于预冷的研钵中，加液氮研磨至粉末状，然后转移至离心管中，加入丙酮与蒸馏水的混合溶液Ⅰ，震荡均匀后离心，弃去上清液，重复向离心产物中加入丙酮与蒸馏水的混合溶液Ⅰ、震荡和离心操作，直至得到的离心产物为无色，得到初级产物，备用；再向得到的初级产物中加入丙酮与蒸馏水的混合溶液Ⅱ，震荡均匀后离心，弃去上清液，重复向离心产物中加入丙酮与蒸馏水的混合溶液Ⅱ、震荡和离心操作，直至得到的离心产物为无色，得到次级产物，备用；

[0007] 所述混合溶液Ⅰ中丙酮所占的比例大于混合溶液Ⅱ中的比例；

[0008] b.在步骤a得到的次级产物中加入盐酸、丙酮与蒸馏水的混合溶液，震荡均匀后离心，收集上清液，备用；然后向离心得到的沉淀中再次加入盐酸、丙酮与蒸馏水的混合溶液，震荡均匀后离心，收集上清液，合并两次上清液，得到混合提取液，备用；

[0009] c.向步骤b得到的混合提取液中加入乙醚，混合均匀后加入到分液漏斗中，将分液漏斗多次倒置后静置分层，收集上层溶液，备用；并向下层溶液中再次加入乙醚，混合均匀后加入到分液漏斗中，静置分层后收集上层溶液，合并两次得到的上层溶液，置于分液漏斗中，然后加入与合并的上层溶液等体积的蒸馏水进行洗涤，静置分层后取乙醚层，加入到旋转蒸发仪中浓缩，再将浓缩产物倒入离心管中，用氮气吹干，即得到干燥的植物血红素，备用；

[0010] 步骤二、植物血红素含量测定

[0011] 向步骤一得到的干燥的植物血红素中加入7.44ml蒸馏水和0.48ml 5N NaOH，搅拌至植物血红素溶解后再加入12 ml蒸馏水和4.08 ml 吡啶，再次混合均匀，采用紫外分光光度计测定574.5nm处的吸光度，测量时在样品中加入几滴二硫酸盐和50mmol/L的铁氰化物，取独立的三株或者三株以上的植物的叶片进行测定，多次测定求平均值，得到平均吸光度A，备用；

[0012] 步骤三、植物血红素浓度的计算

[0013] 将步骤二得到的平均吸光度A代入线性回归方程：A=2.6814496C+0.07506221，计算得到稀释倍数C，再根据Ci = 0.5C mg/ml，计算出植物叶片中血红素的浓度Ci。

[0014] 步骤a所述的震荡均匀所需的时间为10-25min，离心条件为离心力4000g、离心时间8-20min。

[0015] 步骤a所述的丙酮与蒸馏水的混合溶液Ⅰ中丙酮和蒸馏水的体积比99：1，混合溶液Ⅰ每次的加入量为10ml。

[0016] 步骤a所述的丙酮与蒸馏水的混合溶液Ⅱ中丙酮和蒸馏水的体积比80:20，混合溶液Ⅱ每次的加入量为5ml。

[0017] 步骤b所述的盐酸、丙酮与蒸馏水的混合溶液中盐酸、丙酮和蒸馏水的体积比为5：80：15，每次的加入量为5ml。

[0018] 步骤b所述的震荡时间为10-25min，离心条件为离心力4000g、离心时间8-20min。

[0019] 步骤c中的乙醚每次的加入量为10ml。

[0020] 有益效果

[0021] 其一、本发明提供的从植物中提取和测定血红素的方法能成功的从植物组织中提取血红素，提取效果很稳定，可以在叶绿素合成调控机制的研究工作中发挥重要作用，解决了目前动物血红素的提取研究得比较深入，已经可以实现规模化，产业化，而植物中的血红素含量很低，提取困难，研究较少的问题。

[0022] 本发明仅采用一些常见试剂及紫外分光光度计，就可以测定植物样本中的血红素含量，且结果比较可靠，完全可以满足实验室中的研究需要，不仅成本低，适宜推广应用，也充分克服了目前植物中的血红素测定没有廉价且可靠的方法的技术问题。

附图说明

[0023] 图1为血红素的分子结构示意图；

[0024] 图2为叶绿素的分子结构示意图；

[0025] 图3为血红素和叶绿素生物合成途径示意图；

[0026] 图4为不同浓度的血红素标准供试溶液用紫外分光光度计在350-600nm 范围内扫描的情况；

[0027] 图5为SPSS软件分析的血红素的标准曲线图。

具体实施方式

[0028] 一种从植物中提取和测定血红素的方法，包括以下步骤：

[0029] 步骤一、植物血红素的提取

[0030] a.准确称取待测植物的新鲜叶片1g，置于预冷的研钵中，加液氮研磨至粉末状，然后转移至离心管中，加入丙酮与蒸馏水的混合溶液Ⅰ，震荡均匀后离心，弃去上清液，重复向离心产物中加入丙酮与蒸馏水的混合溶液Ⅰ、震荡和离心操作，直至得到的离心产物为无色，得到初级产物，备用；再向得到的初级产物中加入丙酮与蒸馏水的混合溶液Ⅱ，震荡均匀后离心，弃去上清液，重复向离心产物中加入丙酮与蒸馏水的混合溶液Ⅱ、震荡和离心操作，直至得到的离心产物为无色，得到次级产物，备用；

[0031] 所述混合溶液Ⅰ中丙酮所占的比例大于混合溶液Ⅱ中的比例；

[0032] b.在步骤a得到的次级产物中加入盐酸、丙酮与蒸馏水的混合溶液，震荡均匀后离心，收集上清液，备用；然后向离心得到的沉淀中再次加入盐酸、丙酮与蒸馏水的混合溶液，震荡均匀后离心，收集上清液，合并两次上清液，得到混合提取液，备用；

[0033] c.向步骤b得到的混合提取液中加入乙醚，混合均匀后加入到分液漏斗中，将分液漏斗多次倒置后静置分层，收集上层溶液，备用；并向下层溶液中再次加入乙醚，混合均匀后加入到分液漏斗中，静置分层后收集上层溶液，合并两次得到的上层溶液，置于分液漏斗中，然后加入与合并的上层溶液等体积的蒸馏水进行洗涤，静置分层后取乙醚层，加入到旋转蒸发仪中浓缩，再将浓缩产物倒入离心管中，用氮气吹干，即得到干燥的植物血红素，备用；

[0034] 步骤二、植物血红素含量测定

[0035] 向步骤一得到的干燥的植物血红素中加入7.44ml蒸馏水和0.48ml 5N NaOH，搅拌至植物血红素溶解后再加入12 ml蒸馏水和4.08 ml 吡啶，再次混合均匀，采用紫外分光光度计测定574.5nm处的吸光度，测量时在样品中加入几滴二硫酸盐和50mmol/L的铁氰化物，取独立的三株或者三株以上的植物的叶片进行测定，多次测定求平均值，得到平均吸光度A，备用；

[0036] 步骤三、植物血红素浓度的计算

[0037] 将步骤二得到的平均吸光度A代入线性回归方程：A=2.6814496C+0.07506221，计算得到稀释倍数C，再根据Ci = 0.5C mg/ml，计算出植物叶片中血红素的浓度Ci。

[0038] 步骤a所述的震荡均匀所需的时间为10-25min，离心条件为离心力4000g、离心时间8-20min。

[0039] 步骤a所述的丙酮与蒸馏水的混合溶液Ⅰ中丙酮和蒸馏水的体积比99：1，混合溶液Ⅰ每次的加入量为10ml。

[0040] 步骤a所述的丙酮与蒸馏水的混合溶液Ⅱ中丙酮和蒸馏水的体积比80:20，混合溶液Ⅱ每次的加入量为5ml。

[0041] 步骤b所述的盐酸、丙酮与蒸馏水的混合溶液中盐酸、丙酮和蒸馏水的体积比为5：80：15，每次加入量为5ml。

[0042] 步骤b所述的震荡时间为10-25min，离心条件为离心力4000g、离心时间8-20min。

[0043] 步骤c中的乙醚每次的加入量为10ml。

[0044] 测量方法可靠性检测

[0045] （1）精密称取0.012克血红素标准品置于小烧杯中，加入7.44 ml蒸馏水，0.48 ml 5N的NaOH，搅拌至血红素溶解后再加入12 ml蒸馏水，4.08 ml 吡啶，再次搅拌均匀后配成标准供试溶液；

[0046] （2）将配置好的血红素标准供试溶液分别稀释为4×10-2，5×10-2，1×10-1，1.5×10-1，2×10-1，3×10-1，4×10-1以及5×10-1倍，然后分别加入几滴二硫酸盐和50mmol/L的铁氰化物，在350-600nm范围内扫描并记录最大吸光度，结果如表1所示：

[0047] 表1：不同浓度血红素标准溶液的吸光度

[0048]

[0049] *浓度C代表血红素标准溶液的稀释倍数。

[0050] （3）标准曲线结果：结果如图4所示，所有浓度的血红素标准品溶液都在大约574.5nm处有一个特征的吸收峰，且由图4可知，血红素浓度越高，吸收峰就越明显。以血红素相对浓度为横坐标，574.5nm处的最大吸光度为纵坐标作图，得到图5，并进行统计学分析。标准曲线数据用SPSS软件进行分析，

[0051] （4）由图5可以看出，吸光度A与相对浓度C即稀释倍数呈线性关系，而且二者的相关性非常高，R2=0.989。以上结果说明本发明中所使用的血红素测定方法是很可靠的。在以后的检测中，均使用574.5nm处的吸光度值来衡量植物中的血红素含量。

[0052] 用最小二乘法进行线性回归，则：

[0053] ∑Ci=0.04+0.05+0.1+0.15+0.2+0.3+0.4+0.5=1.74

[0054] ∑Ai=5.26622

[0055] ∑Ci2=0.5991，∑Ai2=5.25538733，∑CiAi=1.7370647（，i=1，2，3，4，5，6，7，8）[0056] 建立回归方程式：A=bC+a，

[0057] ∑Ci2∑Ai-∑Ci∑CiAi

[0058] 其中，a=---------------------------=0.07506221

[0059] n∑Ci2-(∑Ci)2

[0060] n∑CiAi-∑Ci∑Ai

[0061] b=------------------------------=2.6814496

[0062] n∑Ci2-(∑Ci)2

[0063] 因此，回归方程式为：A=2.6814496C+0.07506221。

[0064] A为吸光度，C为标准溶液稀释倍数。标准溶液浓度为0.0005 g/ml，因此待测样品中的血红素实际含量为：Ci=0.0005C g/ml，即0.5C mg/ml。测量样品在574.5nm处的吸光度值A，可由回归方程推算出C，再进一步换算出样品中的血红素实际含量Ci。

[0065] 以下结合具体实施例对本发明做进一步说明：

[0066] 实施例1：

[0067] 一种从羽衣甘蓝白鸽中提取和测定血红素的方法，包括以下步骤：

[0068] 步骤一、羽衣甘蓝白鸽血红素的提取

[0069] a.准确称取羽衣甘蓝白鸽的新鲜叶片1g，置于预冷的研钵中，加液氮研磨至粉末状，然后转移至离心管中，加入10ml体积比99：1的丙酮与蒸馏水的混合溶液Ⅰ，震荡均匀后离心，离心条件为离心力4000g、离心时间8-20min，弃去上清液，重复向离心产物中加入丙酮与蒸馏水的混合溶液Ⅰ、震荡和离心操作，直至得到的离心产物为无色，得到初级产物，备用；再向得到的初级产物中加入5ml体积比80:20的丙酮与蒸馏水的混合溶液Ⅱ，震荡均匀后离心，离心条件为离心力4000g、离心时间8-20min，弃去上清液，重复向离心产物中加入丙酮与蒸馏水的混合溶液Ⅱ、震荡和离心操作，直至得到的离心产物为无色，得到次级产物，备用；

[0070] b.在步骤a得到的次级产物中加入5ml体积比为5：80：15盐酸、丙酮与蒸馏水的混合溶液，震荡均匀后离心，震荡时间为10-25min，离心条件为离心力4000g、离心时间8-20min，收集上清液，备用；然后向离心得到的沉淀中再次加入盐酸、丙酮与蒸馏水的混合溶液，震荡均匀后离心，震荡时间为10-25min，离心条件为离心力4000g、离心时间8-20min，收集上清液，合并两次上清液，得到混合提取液，备用；

[0071] c.向步骤b得到的混合提取液中加入10ml乙醚，混合均匀后加入到分液漏斗中，将分液漏斗多次倒置后静置分层，收集上层溶液，备用；并向下层溶液中再次加入10ml乙醚，混合均匀后加入到分液漏斗中，静置分层后收集上层溶液，合并两次得到的上层溶液，置于分液漏斗中，然后加入与合并的上层溶液等体积的蒸馏水进行洗涤，静置分层后取乙醚层，加入到旋转蒸发仪中浓缩，再将浓缩产物倒入离心管中，用氮气吹干，即得到干燥的羽衣甘蓝白鸽血红素，备用；

[0072] 步骤二、羽衣甘蓝白鸽血红素含量测定

[0073] 向步骤一得到的干燥的羽衣甘蓝白鸽血红素中加入7.44ml蒸馏水和0.48ml 5N NaOH，搅拌至羽衣甘蓝白鸽血红素溶解后再加入12 ml蒸馏水和4.08 ml 吡啶，再次混合均匀，采用紫外分光光度计测定574.5nm处的吸光度，测量时在样品中加入几滴二硫酸盐和50mmol/L的铁氰化物。取独立的三株羽衣甘蓝白鸽的叶片进行测定，多次测定求平均值，得到平均吸光度A为0.188833，结果如表2所示，备用；

[0074] 表2：羽衣甘蓝白鸽样品的吸光度A

[0075]

[0076] 步骤三、羽衣甘蓝白鸽血红素浓度的计算

[0077] 将步骤二得到的平均吸光度A代入线性回归方程：A=2.6814496C+0.07506221，计算得到稀释倍数C为0.04243，再根据Ci = 0.5C mg/ml，计算出羽衣甘蓝白鸽叶片中血红素的浓度Ci为0.021215 mg/ml。

[0078] 实施例2：

[0079] 一种从小白菜中提取和测定血红素的方法，包括以下步骤：

[0080] 步骤一、小白菜血红素的提取

[0081] a.准确称取小白菜的新鲜叶片1g，置于预冷的研钵中，加液氮研磨至粉末状，然后转移至离心管中，加入10ml体积比99：1的丙酮与蒸馏水的混合溶液Ⅰ，震荡均匀后离心，离心条件为离心力4000g、离心时间8-20min，弃去上清液，重复向离心产物中加入丙酮与蒸馏水的混合溶液Ⅰ、震荡和离心操作，直至得到的离心产物为无色，得到初级产物，备用；再向得到的初级产物中加入5ml体积比80:20的丙酮与蒸馏水的混合溶液Ⅱ，震荡均匀后离心，离心条件为离心力4000g、离心时间8-20min，弃去上清液，重复向离心产物中加入丙酮与蒸馏水的混合溶液Ⅱ、震荡和离心操作，直至得到的离心产物为无色，得到次级产物，备用；

[0082] b.在步骤a得到的次级产物中加入5ml体积比为5：80：15盐酸、丙酮与蒸馏水的混合溶液，震荡均匀后离心，震荡时间为10-25min，离心条件为离心力4000g、离心时间8-20min，收集上清液，备用；然后向离心得到的沉淀中再次加入盐酸、丙酮与蒸馏水的混合溶液，震荡均匀后离心，震荡时间为10-25min，离心条件为离心力4000g、离心时间8-20min，收集上清液，合并两次上清液，得到混合提取液，备用；

[0083] c.向步骤b得到的混合提取液中加入10ml乙醚，混合均匀后加入到分液漏斗中，将分液漏斗多次倒置后静置分层，收集上层溶液，备用；并向下层溶液中再次加入10ml乙醚，混合均匀后加入到分液漏斗中，静置分层后收集上层溶液，合并两次得到的上层溶液，置于分液漏斗中，然后加入与合并的上层溶液等体积的蒸馏水进行洗涤，静置分层后取乙醚层，加入到旋转蒸发仪中浓缩，再将浓缩产物倒入离心管中，用氮气吹干，即得到干燥的小白菜血红素，备用；

[0084] 步骤二、小白菜血红素含量测定

[0085] 向步骤一得到的干燥的小白菜血红素中加入7.44ml蒸馏水和0.48ml 5N NaOH，搅拌至干燥的小白菜血红素溶解后再加入12 ml蒸馏水和4.08 ml 吡啶，再次混合均匀，采用紫外分光光度计测定574.5nm处的吸光度，测量时在样品中加入几滴二硫酸盐和50mmol/L的铁氰化物。取独立的三株小白菜的叶片进行测定，多次测定求平均值，得到平均吸光度A为0.102403，结果如表3所示，备用；

[0086] 表3：小白菜样品的吸光度A

[0087]

[0088] 步骤三、小白菜血红素浓度的计算

[0089] 将步骤二得到的平均吸光度A代入线性回归方程：A=2.6814496C+0.07506221，计算得到稀释倍数C为0.010196，再根据Ci = 0.5C mg/ml，计算出小白菜叶片中血红素的浓度Ci为0.005098mg/ml。

[0090] 实施例3：

[0091] 一种从乌塌菜中提取和测定血红素的方法，包括以下步骤：

[0092] 步骤一、乌塌菜血红素的提取

[0093] a.准确称取乌塌菜的新鲜叶片1g，置于预冷的研钵中，加液氮研磨至粉末状，然后转移至离心管中，加入10ml体积比99：1的丙酮与蒸馏水的混合溶液Ⅰ，震荡均匀后离心，离心条件为离心力4000g、离心时间8-20min，弃去上清液，重复向离心产物中加入丙酮与蒸馏水的混合溶液Ⅰ、震荡和离心操作，直至得到的离心产物为无色，得到初级产物，备用；再向得到的初级产物中加入5ml体积比80:20的丙酮与蒸馏水的混合溶液Ⅱ，震荡均匀后离心，离心条件为离心力4000g、离心时间8-20min，弃去上清液，重复向离心产物中加入丙酮与蒸馏水的混合溶液Ⅱ、震荡和离心操作，直至得到的离心产物为无色，得到次级产物，备用；

[0094] b.在步骤a得到的次级产物中加入5ml体积比为5：80：15盐酸、丙酮与蒸馏水的混合溶液，震荡均匀后离心，震荡时间为10-25min，离心条件为离心力4000g、离心时间8-20min，收集上清液，备用；然后向离心得到的沉淀中再次加入盐酸、丙酮与蒸馏水的混合溶液，震荡均匀后离心，震荡时间为10-25min，离心条件为离心力4000g、离心时间8-20min，收集上清液，合并两次上清液，得到混合提取液，备用；

[0095] c.向步骤b得到的混合提取液中加入10ml乙醚，混合均匀后加入到分液漏斗中，将分液漏斗多次倒置后静置分层，收集上层溶液，备用；并向下层溶液中再次加入10ml乙醚，混合均匀后加入到分液漏斗中，静置分层后收集上层溶液，合并两次得到的上层溶液，置于分液漏斗中，然后加入与合并的上层溶液等体积的蒸馏水进行洗涤，静置分层后取乙醚层，加入到旋转蒸发仪中浓缩，再将浓缩产物倒入离心管中，用氮气吹干，即得到干燥的乌塌菜血红素，备用；

[0096] 步骤二、乌塌菜血红素含量测定

[0097] 向步骤一得到的干燥的乌塌菜血红素中加入7.44ml蒸馏水和0.48ml 5N NaOH，搅拌至干燥的乌塌菜血红素溶解后再加入12 ml蒸馏水和4.08 ml 吡啶，再次混合均匀，采用紫外分光光度计测定574.5nm处的吸光度，测量时在样品中加入几滴二硫酸盐和50mmol/L的铁氰化物。取独立的三株乌塌菜的叶片进行测定，多次测定求平均值，得到平均吸光度A为0.149113，结果如表4所示，备用；

[0098] 表4：乌塌菜样品的吸光度A

[0099]

[0100] 步骤三、乌塌菜血红素浓度的计算

[0101] 将步骤二得到的平均吸光度A代入线性回归方程：A=2.6814496C+0.07506221，计算得到稀释倍数C为0.02762，再根据Ci = 0.5C mg/ml，计算出乌塌菜叶片中血红素的浓度Ci为0.01381mg/ml。