TritonX-100含量的高效液相色谱检测方法

摘要

本发明公开了一种Triton X-100定量检测方法，它是采用高效液相色谱法检测，步骤如下：(1)制备供试品溶液：取待检样品，制成供试品溶液；(2)制备对照品溶液：取标准品Triton X-100，溶于水，制成对照品溶液；(3)检测：采用高效液相色谱法测定，其中，固定相为C18色谱柱，其填料的孔径为，流动相为甲醇-水溶液，二者的体积比为85:15～75:25，检测波长为225nm；(4)以对照品溶液的峰面积为纵坐标，以对照品溶液浓度为横坐标，绘制Triton X-100的标准曲线，根据标准曲线计算供试品中Triton X-100的含量。本发明可以准确检测供试品中Triton X-100含量，克服了本技术领域的技术偏见，方法更为简单、低廉。

权利要求

1.一种Triton X-100定量检测方法，其特征在于：它是采用高效液相色谱法检测，步骤如下：(1)制备供试品溶液：取待检样品，制成供试品溶液；

所述待检样品是生物制品或者Triton X-100水溶液；

(2)制备对照品溶液：取标准品Triton X-100，溶于水，制成对照品溶液；

(3)检测：采用高效液相色谱法测定，其中，固定相为C18色谱柱，其填料的孔径为流动相为甲醇-水溶液，二者的体积比为85:15～75:25，检测波长为225nm；

所述步骤(3)中，色谱柱为Agilent SB 300C18色谱柱，其规格为4.6mm×250mm，其填料的粒径为5μm；

(4)以对照品溶液的峰面积为纵坐标，以对照品溶液浓度为横坐标，绘制Triton X-100的标准曲线，根据标准曲线计算待检样品中Triton X-100的含量。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述生物制品为无细胞百日咳纯化抗原、无细胞百日咳脱毒抗原或吸附无细胞百白破联合疫苗。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述生物制品为吸附无细胞百白破联合疫苗时，采用如下方法制备供试品溶液：将吸附无细胞百白破联合疫苗离心，取上清液，经0.2μm膜过滤，即可。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(2)中，所述对照品溶液按照下述方法配制：将标准品Triton X-100溶解于水中，分别制成浓度为4、8、12、16、20μg/ml的Triton X-100对照品溶液。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中，甲醇与水的体积比为

80:20。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中，所述流动相的流速为

0.8ml/min；测定时，进样量为10μl。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中，色谱柱的柱温为25～

35℃。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：所述色谱柱温为30℃。

说明书

Triton X-100含量的高效液相色谱检测方法

技术领域

[0001] 本发明属于高效液相色谱分析检测领域，具体涉及Triton X-100含量的高效液相色谱检测方法，特别涉及生物制品中Triton X-100残留量的高效液相色谱检测方法。

背景技术

[0002] Triton X-100，中文名：聚乙二醇辛基苯基醚，分子式:C14H22O(C2H4O)n，其中，n为9或10，分子量为603～647，是一种非离子型表面活性剂(或称去污剂)，在生物制品、组织学、清洁剂、电子和光学显微镜等多方面均具有广泛的用途。

[0003] 在高效液相色谱法中，存在下述常识：分析分子量小于2000的化合物应选择孔径在15nm 以下的填料，分析分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填料(中华人民共和国药典，2010年版，二部，附录ⅤD高效液相色谱法)。Triton X-100的分子量为603～647，因此，通常本领域的技术人员在对Triton X-100进行检测时，只会选择填料孔径在15nm 以下的色谱柱。

[0004] 在生物制品领域，通常使用Triton X-100与磷酸三丁酯配伍进行病毒灭活，称S/D法。例如，在生产吸附无细胞百白破联合疫苗时，会使用Triton X-100来去除细菌内毒素。由于大量Triton X-100对人体有害，因此，需要在后续步骤除去Triton X-100，同时要对生物制品成品中Triton X-100的残留量进行检测，以确定生物制品是否合格。

[0005] 基于前述常识，当采用高效液相色谱法检测生物制品中的Triton X-100残留量时，就陷入了两难的境地：

[0006] 一、难以直接检测生物制品中的Triton X-100；

[0007] 由于只能采用孔径15nm以下的色谱柱对Triton X-100进行检测，生物大分子会堵塞色谱柱，因此，为了避免生物大分子对色谱柱造成堵塞，通常需要对检测样品中的生物大分子与Triton X-100进行预先分离(即预处理)，再对Triton X-100进行高效液相色谱检测，例如：用固相提取柱提取待检样品中的Triton X-100；再用高效液相色谱仪检测，在中国专利申请CN 102590427 A中公开的一种抗毒素/抗血清中TritonX-100残留量的测定方法，就是这样一种方法，先采用“固相萃取柱过滤”对供试品进行预处理，提取待检样品中的Triton X-100，再用Aglient1200高效液相色谱仪进行检测。

[0008] 二、将生物制品中的Triton X-100分离后再检测的方法其结果又不准确；

[0009] 由于上述现有技术对生物制品类样品的预处理方法会带来Triton X-100的损失，必然导致检测结果不准确，同时也使得检测方法更加复杂，不易操作，检测成本更高。

[0010] 为此，我们需要寻找一种新的思路和方法方便地对Triton X-100含量进行高效液相色谱检测，进而实现对生物制品中的Triton X-100残留量更为方便、简单、准确的检测。

发明内容

[0011] 本发明的目的在于提供一种简单、准确的新的Triton X-100含量的高效液相色谱检测方法。

[0012] 在本发明中，小分子是指分子量小于2000的化合物。

[0013] 本发明Triton X-100定量检测方法，它是采用高效液相色谱法检测，步骤如下：

[0014] (1)制备供试品溶液：取待检样品，制成供试品溶液；

[0015] (2)制备对照品溶液：取标准品Triton X-100，溶于水，制成对照品溶液；

[0016] (3)检测：采用高效液相色谱法测定，其中，固定相为C18色谱柱，其填料的孔径为流动相为甲醇-水溶液，二者的体积比为85:15～75:25，检测波长为225nm；

[0017] (4)以对照品溶液的峰面积为纵坐标，以对照品溶液浓度为横坐标，绘制Triton X-100的标准曲线，根据标准曲线计算待检样品中Triton X-100的含量。

[0018] 步骤(1)中，所述待检样品是生物制品或者Triton X-100水溶液。

[0019] 进一步，步骤(1)中，所述生物制品为无细胞百日咳纯化抗原、无细胞百日咳脱毒抗原或吸附无细胞百白破联合疫苗。

[0020] 进一步，步骤(1)中，所述吸附无细胞百白破联合疫苗按照下述步骤制成供试品溶液：将吸附无细胞百白破联合疫苗离心，取上清液，经0.2μm膜过滤，即可。

[0021] 步骤(2)中，所述对照品溶液按照下述方法配制：将标准品Triton X-100溶解于水中，分别制成浓度为4、8、12、16、20μg/ml的Triton X-100对照品溶液。

[0022] 所述步骤(3)中，色谱柱为Agilent SB 300C18色谱柱，其规格为4.6mm×250mm，其填料的粒径为5μm。

[0023] 所述步骤(3)中，甲醇与水的体积比为80:20。

[0024] 所述步骤(3)中，所述流动相的流速为0.8ml/min；测定时，进样量为10μl。

[0025] 所述步骤(3)中，测定时，色谱柱温为25～35℃。优选地，所述色谱柱温为30℃。

[0026] 在高效液相色谱法中，分析分子量小于2000的化合物只有选择孔径在15nm以下的填料，才能有效检测(中华人民共和国药典，2010年版，二部，附录ⅤD高效液相色谱法)。Triton X-100的分子量仅603～647，小于2000，应当选孔径小于15nm的色谱柱进行检测，如杨鹏云等就是采用孔径为 的色谱柱对血浆制品中的Triton X-100残留量进行检测(血浆制品中Triton X-100残留量测定方法的建立.中国生物制品学杂志.2003年，第16卷第4期)。

[0027] 然而，发明人却研究发现，在特定条件下，采用填料孔径为30nm的色谱柱也可以有效检测待检样品中Triton X-100的含量，克服了本领域关于“分析分子量小于2000的化合物应当选择孔径在15nm 以下的填料”的技术偏见，为高效液相色谱分析检测分子量小于2000的化合物提供了一种新的思路和方法。

[0028] 从而，当使用本发明方法检测生物制品时，由于大分子蛋白也可以顺利通过这种填料孔径的色谱柱，避免了现有方法的缺陷，即，因大分子蛋白会破坏小孔径的色谱柱，在检测生物制品中的Triton X-100残留量时，必须对待测样品进行预处理，将Triton X-100与大分子蛋白分离，再进行检测，但是预处理过程会发生Triton X-100的损失，从而导致检测结果不准确。

[0029] 采用本发明的方法在检测生物制品时，不需要对待检样品进行预处理，就可以对Triton X-100进行检测，既可以有效避免在预处理过程中发生损失，确保检测结果的准确性，方法也更为简单，操作简便，成本更低，具有良好的工业应用前景。

[0030] 综上，本发明的技术方案，不仅克服了本领域关于Triton X-100含量检测的技术偏见；还进一步解决了现有生物制品领域难以简单有效地检测Triton X-100含量的技术问题。

[0031] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

[0032] 以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

[0033] 图1本发明方法对Triton X-100溶液、无细胞百日咳纯化抗原样品、空白对照纯化水的检测结果。其中，纵坐标表示峰高，横坐标表示检测进行的时 间；A：12μg/ml的Triton X-100溶液；B：无细胞百日咳纯化抗原样品；C：空白对照纯化水。

具体实施方式

[0034] 本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

[0035] 吸附无细胞百白破联合疫苗：购自成都生物制品研究所有限公司。

[0036] 无细胞百日咳纯化抗原或无细胞百日咳脱毒抗原：是制备吸附无细胞百白破联合疫苗的中间产物，百日咳发酵菌体经过层析纯化工艺得到纯化抗原，纯化抗原经过化学脱毒后得到脱毒抗原。

[0037] 实施例1吸附无细胞百白破联合疫苗成品中Triton X-100的高效液相色谱检测[0038] (1)取1ml吸附无细胞百白破联合疫苗成品，10000rpm离心10min，搜集上清液，经0.2μm膜过滤后，作为供试品溶液；

[0039] (2)将标准品Triton X-100溶解于水中，制成每1ml溶液含有4、8、12、16、20μg的Triton X-100的对照品溶液；

[0040] (3)分别取供试品溶液和对照品溶液进行检测，进样量为10μl，HPLC条件：Agilent SB 300C18色谱柱(规格4.6mm×250mm，5μm，孔径 )；流动相为甲醇水溶液，甲醇与水的体积比为80：20，检测波长225nm，色谱柱温30℃，流速0.8ml/min；

[0041] (4)制作Triton X-100浓度与峰面积的标准曲线，根据标准曲线，计算供试品中Triton X-100的含量。

[0042] 实施例2无细胞百日咳纯化抗原中Triton X-100的高效液相色谱检测[0043] (1)取待检无细胞百日咳纯化抗原，其为澄清透明的无色水溶液，无需处理，直接作为供试品溶液；

[0044] (2)将标准品Triton X-100溶解于水中，制成每1ml溶液含有4、8、12、16、20μg的Triton X-100的对照品溶液；

[0045] (3)分别取供试品溶液和对照品溶液进行检测，进样量为10μl，HPLC条件：Agilent SB 300C18色谱柱(规格4.6mm×250mm，5μm，孔径 )；流动相为甲醇-水溶液，甲醇与水的体积比为80：20，检测波长225nm，色谱柱温30℃，流速0.8ml/min；

[0046] (4)制作Triton X-100浓度与峰面积的标准曲线，根据标准曲线，计算供试品中Triton X-100的含量。

[0047] 实施例3无细胞百日咳脱毒抗原中Triton X-100的高效液相色谱检测[0048] (1)取待检无细胞百日咳脱毒抗原，其为澄清透明的无色水溶液，无需 处理，直接作为供试品溶液；

[0049] (2)将标准品Triton X-100溶解于水中，制成每1ml溶液含有4、8、12、16、20μg的Triton X-100的对照品溶液；

[0050] (3)分别取供试品溶液和对照品溶液进行检测，进样量为10μl，HPLC条件：Agilent SB 300C18色谱柱(规格4.6mm×250mm，5μm，孔径 )；流动相为甲醇-水溶液，甲醇与水的体积比为80：20，检测波长225nm，色谱柱温30℃，流速0.8ml/min；

[0051] (4)制作Triton X-100浓度与峰面积的标准曲线，根据标准曲线，计算供试品中Triton X-100的含量。

[0052] 实施例4水溶液中Triton X-100的高效液相色谱检测

[0053] (1)取Triton X-100，溶于水，制成Triton X-100水溶液，作为供试品溶液；

[0054] (2)将标准品Triton X-100溶解于水中，制成每1ml溶液含有4、8、[0055] 12、16、20μg的Triton X-100的对照品溶液；

[0056] (3)分别取供试品溶液和对照品溶液进行检测，进样量为10μl，HPLC条件：Agilent SB 300C18色谱柱(规格4.6mm×250mm，5μm，孔径 )；流动相为甲醇水溶液，甲醇与水的体积比为80：20，检测波长225nm，色谱柱温30℃，流速0.8ml/min；

[0057] (4)制作Triton X-100浓度与峰面积的标准曲线，根据标准曲线，计算供试品中Triton X-100的含量。

[0058] 为了说明本发明的有益效果，本发明提供以下试验例：

[0059] 试验例1对吸附无细胞百白破联合疫苗成品的检测

[0060] 1、检测方法

[0061] (1)取1ml吸附无细胞百白破联合疫苗成品，10000rpm离心10min，搜集约0.8ml上清液，经0.2μm膜过滤后，作为供试品溶液；

[0062] (2)将标准品Triton X-100溶解于水中，制成每1ml溶液含有4、8、12、16、20μg的Triton X-100的对照品溶液；

[0063] (3)分别取供试品溶液和对照品溶液进行检测，进样量为10μl，HPLC条件：Agilent SB 300C18色谱柱(规格4.6mm×250mm，5μm，孔径 )；流动相为甲醇水溶液，甲醇与水的体积比为80：20，检测波长225nm，色谱柱温30℃，流速0.8ml/min；

[0064] (4)制作Triton X-100浓度与峰面积的标准曲线，根据标准曲线，计算供试品中Triton X-100的含量。

[0065] 2、试验结果

[0066] 按照所述条件进样检测，检测结果为未检出Triton X-100，即成品中Triton X-100残留量为0。

[0067] 3、准确度验证

[0068] 向上述未能检出Triton X-100的成品中，等体积分别加入准确配制的10μg/ml、20μg/ml和30μg/ml浓度的Triton X-100溶液，按照上述方法分别测定其含量，每个浓度测定2次，采用的是同一标准曲线，将检测值和理论值比较，按照下述公式计算回收率，检测和计算结果见表1。可接受标准为各浓度下的回收率均应在90.0％至110.0％之间。

[0069] 回收率计算公式：

[0070]

[0071] 标准曲线方程：Y＝10.32054X-3.69795，相关系数R2＝0.99930，其中X代表浓度或含量，Y代表峰面积。

[0072] 表1准确度数据表

[0073]

[0074] 试验结果说明，对吸附无细胞百白破联合疫苗成品中Triton X-100残留量进行检测，其回收率均在95％～105％，表明成品中Triton X-100残留量为0的检测结果是准确的，也说明了本发明方法可以有效、准确地检测吸附无细胞百白破联合疫苗成品的Triton X-100残留量。

[0075] 试验例2对无细胞百日咳纯化抗原的检测

[0076] 1、检测方法

[0077] (1)取待检无细胞百日咳纯化抗原，为澄清透明的无色水溶液，作为供试品溶液；

[0078] (2)将标准品Triton X-100溶解于水中，制成每1ml溶液含有4、8、12、16、20μg的Triton X-100的对照品溶液；

[0079] (3)分别取供试品溶液和对照品溶液进行检测，进样量为10μl，HPLC条件：Agilent SB 300C18色谱柱(规格4.6mm×250mm，5μm，孔径 )；流动相为甲醇水溶液，甲醇与水的体积比为80：20，检测波长225nm，色谱柱温30℃，流速0.8ml/min；

[0080] (4)制作Triton X-100浓度与峰面积的标准曲线，根据标准曲线，计算供试品中Triton X-100的含量。

[0081] 2、试验结果

[0082] 标准曲线方程：Y＝9.86467X-1.97820，相关系数R2＝0.99885，其中X代表浓度或含量，Y代表峰面积。

[0083] 检测结果得到，对6批无细胞百日咳纯化抗原进行了Triton X-100残留量检测，检测结果为0.84至3.54μg/ml。

[0084] 试验结果说明，本发明方法可以有效检测无细胞百日咳纯化抗原中的Triton X-100残留量。

[0085] 试验例3对无细胞百日咳脱毒抗原的检测

[0086] 1、检测方法

[0087] (1)取待检无细胞百日咳脱毒抗原，为澄清透明的无色水溶液，作为供试品溶液；

[0088] (2)将标准品Triton X-100溶解于水中，制成每1ml溶液含有4、8、12、16、20μg的Triton X-100的对照品溶液；

[0089] (3)分别取供试品溶液和对照品溶液进行检测，进样量为10μl，HPLC条件：Agilent SB 300C18色谱柱(规格4.6mm×250mm，5μm，孔径 )；流动相为甲醇水溶液，甲醇与水的体积比为80：20，检测波长225nm，色谱柱温30℃，流速0.8ml/min；

[0090] (4)制作Triton X-100浓度与峰面积的标准曲线，根据标准曲线，计算供试品中Triton X-100的含量。

[0091] 2、试验结果

[0092] 标准曲线方程：Y＝9.86467X-1.97820，相关系数R2＝0.99885，其中X代表浓度或含量，Y代表峰面积。

[0093] 检测结果得到，对6批无细胞百日咳脱毒抗原进行了Triton X-100残留量检测，检测结果为全部未检出。

[0094] 试验结果说明，本发明方法可以有效检测无细胞百日咳脱毒抗原中的Triton X-100残留量。

[0095] 试验例4本发明方法的方法学验证

[0096] 1、线性

[0097] (1)将标准品Triton X-100溶解于水中，制成每1ml溶液含有2、4、8、 12、16、20、30μg的Triton X-100的对照品溶液，采用高效液相色谱法进行测定，分别进样10μl检测，得到Triton X-100浓度与峰面积的标准曲线；

[0098] (2)HPLC条件：Agilent SB 300C18色谱柱(规格4.6mm×250mm，5μm，孔径 )；流动相为甲醇水溶液，甲醇与水的体积比为80：20，检测波长225nm，色谱柱温30℃，流速
0.8ml/min。

[0099] 本试验评估高效液相色谱仪检测的峰面积与供试品中被分析物在一定的浓度范围内的正比例关系。通过绘图评估供试品的检测器反应的线性。制备在理论浓度10％至150％浓度范围内的标准溶液，注入高压液相色谱仪。对所得数据进行回归分析。可接受标准为相关系数(R2)应大于0.99，检测结果见表2，其中，X代表浓度或含量，Y代表峰面积。

[0100] 表2线性数据表(2次试验)

[0101]

[0102] 试验结果说明，本发明方法得到的标准曲线的线性关系好。

[0103] 2、精密度

[0104] 精密度包括重复性和中间精密度两部分试验，按照下述方法进行：

[0105] 分别取对照品溶液与供试品溶液，采用高效液相色谱法(HPLC)进行测定，再通过供试品峰面积与对照品Triton X-100的标准曲线进行外标法计算，得到供试品中Triton X-100的含量，具体步骤如下：

[0106] (1)将标准品Triton X-100溶解于水中，制成每1ml溶液含有4、8、12、16、20μg的Triton X-100的对照品溶液，分别进样10μl检测，得到Triton X-100浓度与峰面积的标准曲线；

[0107] (2)取供试品溶液1ml，进样10μl，检测Triton X-100峰面积，再根据标准曲线计算供试品中Triton X-100浓度；

[0108] (3)HPLC条件：Agilent SB 300C18色谱柱(规格4.6mm×250mm，5μm，孔径 )；流动相为甲醇水溶液，甲醇与水的体积比为80：20，检测波长225nm，色谱柱温30℃，流速
0.8ml/min。

[0109] 2.1重复性

[0110] 试验人1配制Triton X-100含量10μg/ml的Triton X-100溶液6份，按照上述方法分别测定Triton X-100含量。可接受标准为6份溶液Triton X-100含量测定值的相对标准差(RSD)应不大于5.0％。

[0111] 2.2中间精密度

[0112] 三个工作日内，试验人1和试验人2每人每天各自配制6份10μg/mlTriton X-100浓度的供试品溶液，按照上述方法两个试验人员各自测定6份供试品的Triton X-100含量，检测结果分别见表3、表4和表5。可接受标准为：同一工作日不同人员的检测结果均值的RSD应不大于5.0％且同一人员不同工作日的检测结果均值的RSD应不大于5.0％。

[0113] 试验人1第一天：标准曲线方程：Y＝10.3645572X-1.7870643，相关系数R2＝0.99833，其中X代表浓度或含量，Y代表峰面积。

[0114] 试验人1第二天：标准曲线方程：Y＝10.1994636X+1.0647601，相关系数R2＝0.99899，其中X代表浓度或含量，Y代表峰面积。

[0115] 试验人1第三天：标准曲线方程：Y＝11.6061532X-1.3068702，相关系数R2＝0.99978，其中X代表浓度或含量，Y代表峰面积。

[0116] 试验人2第一天：标准曲线方程：Y＝10.6133592X-3.5389382，相关系数R2＝0.99792，其中X代表浓度或含量，Y代表峰面积。

[0117] 试验人2第二天：标准曲线方程：Y＝11.7695239X-3.8188509，相关系数R2＝0.99917，其中X代表浓度或含量，Y代表峰面积。

[0118] 试验人2第三天：标准曲线方程：Y＝11.3135523X+1.1464135，相关系数R2＝0.99931，其中X代表浓度或含量，Y代表峰面积。

[0119] 表3试验人1重复性和中间精密度数据表

[0120]  第一次 第二次 第三次 第四次 第五次 第六次 RSD(n＝6)％
第一天 10.47316 10.35919 10.48203 10.62627 10.40328 10.45720 0.870 第二天 10.23544 10.16874 10.14984 9.88732 10.05395 10.20702 1.27 第三天 9.99279 10.29631 10.47733 10.37635 9.64983 10.22041 2.97 [0121] 表4试验人2重复性和中间精密度数据表

[0122]  第一次 第二次 第三次 第四次 第五次 第六次 RSD(n＝6)％
第一天 9.81869 10.24815 9.95294 9.63243 10.66911 10.32396 3.74 第二天 10.32445 9.71303 10.42332 10.90413 10.50151 10.13887 3.83 第三天 9.94229 10.01128 10.20179 10.12559 9.62173 10.16048 2.13 [0123] 表5同一工作日不同人员的检测结果均值的RSD(％)

[0124]

[0125] 试验结果说明，本发明方法检测结果的重复性和精密度好。

[0126] 3、准确度

[0127] 分别取对照品溶液与供试品溶液，采用高效液相色谱法(HPLC)进行测定，再通过供试品峰面积与对照品Triton X-100的标准曲线进行外标法计算，得到供试品中Triton X-100的含量，具体步骤如下：

[0128] (1)将标准品Triton X-100溶解于水中，制成每1ml溶液含有4、8、12、16、20μg的Triton X-100的对照品溶液，分别进样10μl检测，得到Triton X-100浓度与峰面积的标准曲线；

[0129] (2)取供试品溶液1ml，进样10μl，检测Triton X-100峰面积，再根据标准曲线计算供试品中Triton X-100浓度；

[0130] (3)HPLC条件：Agilent SB 300C18色谱柱(规格4.6mm×250mm，5μm，孔径 )；流动相为甲醇水溶液，甲醇与水的体积比为80：20，检测波长225nm，色谱柱温30℃，流速
0.8ml/min。

[0131] 配制Triton X-100含量为5μg/ml，10μg/ml和15μg/ml三个浓度的Triton X-100溶液各3份，三个浓度共九份溶液分别与等体积的已知Triton X-100含量(3.0076μg/ml，采用相同的上述方法检测得到)的样品混匀，按照上述方法测定含量，每个浓度测定3次，采用的是同一标准曲线，将检测值和理论值比较，按照下述公式计算回收率，检测和计算结果见表6。可接受标准为各浓度下的回收率均应在90.0％至110.0％之间，且各浓度下回收率数据的相对标准差(RSD)应不大于5.0％。

[0132] 回收率计算公式：

[0133]

[0134] 标准曲线方程：Y＝10.6344467X-2.5583496，相关系数R2＝0.99977，其中X代表浓度或含量，Y代表峰面积。

[0135] 表6准确度数据表

[0136]

[0137] 试验结果说明，本发明方法检测结果的准确度高。

[0138] 4、耐用性

[0139] 4.1流动相比例改变：

[0140] 分别取对照品溶液与供试品溶液，采用高效液相色谱法(HPLC)进行测定，再通过供试品峰面积与对照品Triton X-100的标准曲线进行外标法计算，得到供试品中Triton X-100的含量，具体步骤如下：

[0141] (1)将标准品Triton X-100溶解于水中，制成每1ml溶液含有4、8、12、16、20μg的Triton X-100的对照品溶液，分别进样10μl检测，得到Triton X-100浓度与峰面积的标准曲线；

[0142] (2)取供试品溶液1ml，进样10μl，检测Triton X-100峰面积，再根据标准曲线计算供试品中Triton X-100浓度；

[0143] (3)HPLC条件：Agilent SB 300C18色谱柱(规格4.6mm×250mm，5μm，孔径 )；流动相为甲醇水溶液，检测波长225nm，色谱柱温30℃，流速0.8ml/min。

[0144] 配制10μg/ml Triton X-100溶液作为试验样品，进行以下三组试验：

[0145] 试验1：流动相为甲醇：纯化水＝80：20(体积比)，按照上述方法，连续进2针；

[0146] 标准曲线方程：Y＝10.1994636X+1.0647601，相关系数R2＝0.99899，其中X代表浓度或含量，Y代表峰面积。

[0147] 试验2：流动相为甲醇：纯化水＝85：15(体积比)，按照上述方法，连续进2针；

[0148] 标准曲线方程：Y＝11.122527X-0.1003297，相关系数R2＝0.99883，其中X代表浓度或含量，Y代表峰面积。

[0149] 试验3：流动相为甲醇：纯化水＝75：25(体积比)，按照上述方法，连续进2针；

[0150] 标准曲线方程：Y＝10.8616047X+0.1900075，相关系数R2＝0.99827，其中X代表浓度或含量，Y代表峰面积。

[0151] 检测结果见表7，比较6次测定含量结果，要求6次测定含量结果RSD不大于5％。

[0152] 表7耐用性数据表-流动相成分改变对检测结果的影响

[0153]

[0154] 试验结果说明，本发明方法在甲醇与水的体积比为85:15～75:25的条件下均能实施。

[0155] 4.2色谱柱柱温改变：

[0156] 分别取对照品溶液与供试品溶液，采用高效液相色谱法(HPLC)进行测定，再通过供试品峰面积与对照品Triton X-100的标准曲线进行外标法计算，得到供试品中Triton X-100的含量，具体步骤如下：

[0157] (1)将标准品Triton X-100溶解于水中，制成每1ml溶液含有4、8、12、16、20μg的Triton X-100的对照品溶液，分别进样10μl检测，得到Triton X-100浓度与峰面积的标准曲线；

[0158] (2)取供试品溶液1ml，进样10μl，检测Triton X-100峰面积，再根据标准曲线计算供试品中Triton X-100浓度；

[0159] (3)HPLC条件：Agilent SB 300C18色谱柱(规格4.6mm×250mm，5μm，孔径 )；流动相为甲醇水溶液，甲醇与水的体积比为80：20，检测波长225nm，流速0.8ml/min。

[0160] 配制10μg/ml Triton X-100溶液作为试验样品，进行以下三次试验：

[0161] 试验1：按照上述方法，柱温设定为30℃，连续进2针；

[0162] 标准曲线方程：Y＝11.7695239X-3.8188509，相关系数R2＝0.99917，其中X代表浓度或含量，Y代表峰面积。

[0163] 试验2：按照上述方法，柱温设定为35℃，连续进2针；

[0164] 标准曲线方程：Y＝11.2282449X+0.8425231，相关系数R2＝0.99942，其中X代表浓度或含量，Y代表峰面积。

[0165] 试验3：按照上述方法，柱温设定为25℃，连续进2针；

[0166] 标准曲线方程：Y＝11.2029229+1.1494126，相关系数R2＝0.99941，其中X代表浓度或含量，Y代表峰面积。

[0167] 检测结果见表8，比较6次测定含量结果，要求6次测定含量结果RSD不大于5％。

[0168] 表8耐用性数据表-色谱柱柱温改变对检测结果的影响

[0169]

[0170] 试验结果说明，本发明方法在色谱柱温为25～35℃的条件下均能实施。

[0171] 5、专属性

[0172] 分别取对照品溶液与供试品溶液，采用高效液相色谱法(HPLC)进行测定，再通过供试品峰面积与对照品Triton X-100的标准曲线进行外标法计算，得到供试品中Triton X-100的含量，具体步骤如下：

[0173] (1)将标准品Triton X-100溶解于水中，制成每1ml溶液含有4、8、12、16、20μg的Triton X-100的对照品溶液，分别进样10μl检测，得到TritonX-100浓度与峰面积的标准曲线；

[0174] (2)取供试品溶液1ml，进样10μl，检测Triton X-100峰面积，再根据标准曲线计算供试品中Triton X-100浓度；

[0175] (3)HPLC条件：Agilent SB 300C18色谱柱(规格4.6mm×250mm，5μm，孔径 )；流动相为甲醇水溶液，甲醇与水的体积比为80：20，检测波长225nm，色谱柱温30℃，流速
0.8ml/min。

[0176] 配制12μg/ml的Triton X-100溶液，并且以配制Triton X-100溶液使用的纯化水为空白对照，以及无细胞百日咳纯化抗原，按照上述方法，分别检测三者的Triton X-100含量各2次，检测结果见表9和图1。

[0177] 图1中，A：12μg/ml的Triton X-100溶液，Triton X-100出峰时间8.348；B：无细胞百日咳纯化抗原样品，Triton X-100出峰时间8.621；C：空白对照 纯化水，在Triton X-100出峰时刻无峰出现。

[0178] 可接受标准为12μg/ml的Triton X-100溶液和无细胞百日咳纯化抗原的Triton X-100峰能与其他物质完全分离，分离度不小于1.5，两者的Triton X-100峰保留时间相差不超过0.2分钟。空白对照在12μg/ml的Triton X-100溶液和无细胞百日咳纯化抗原的Triton X-100峰时刻应该无峰出现。

[0179] 表9专属性数据表

[0180]

[0181] 试验结果说明，使用该检测方法，可以很好的将供试品中的Triton X-100与其他物质区分开，检测方法对Triton X-100具有良好的专属性。

[0182] 6、定量限

[0183] 分别取对照品溶液与供试品溶液，采用高效液相色谱法(HPLC)进行测定，再通过供试品峰面积与对照品Triton X-100的标准曲线进行外标法计算，得到供试品中Triton X-100的含量，具体步骤如下：

[0184] (1)将标准品Triton X-100溶解于水中，制成每1ml溶液含有4、8、12、16、20μg的Triton X-100的对照品溶液，分别进样10μl检测，得到Triton X-100浓度与峰面积的标准曲线；

[0185] (2)取供试品溶液1ml，进样10μl，检测Triton X-100峰面积，再根据标准曲线计算供试品中Triton X-100浓度；

[0186] (3)HPLC条件：Agilent SB 300C18色谱柱(规格4.6mm×250mm，5μm，孔径 )；流动相为甲醇水溶液，甲醇与水的体积比为80：20，检测波长225nm，色谱柱温30℃，流速
0.8ml/min。

[0187] 将准确配制的4μg/ml Triton X-100溶液稀释为3μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.1μg/ml……每稀释一次按照上述方法测定稀释所得浓度的溶液的Triton X-100峰的信噪比，直至信噪比小于10，再配制6份信噪比大于10且浓度最小的Triton X-100溶液，检测6份溶液的保留时间，检测结果见表10。信噪比大于10且浓度最小的Triton X-100含量值即为定量限，且6份溶液Triton X-100保留时间的RSD不大于5％。

[0188] 表10定量限数据表

[0189]

[0190] 试验结果说明，本发明方法检测Triton X-100的定量限为0.5μg/ml。

[0191] 本发明方法得到的标准曲线的线性关系好，检测结果的重复性和精密度好、准确度高，在甲醇与水的体积比为85:15～75:25、色谱柱温为25～35℃的条件下均能实施，可以很好的将供试品中的Triton X-100与其他物质区分开，检测方法对Triton X-100具有良好的专属性，检测Triton X-100的定量限可以达到0.5μg/ml。

[0192] 综上所述，本发明采用填料孔径为 的色谱柱检测Triton X-100的含量，克服了本领域关于“分析分子量小于2000的化合物应当选择孔径在15nm 以下的填料”的技术偏见，为高效液相色谱分析检测分子量小于2000的化合物提供了一种新的思路和方法。特别是对无细胞百日咳纯化抗原、无细胞百日咳脱毒抗原或吸附无细胞百白破联合疫苗进行Triton X-100含量检测时，无需对供试品进行预处理，可以有效避免预处理过程中Triton X-100发生损失，确保检测结果的准确性，避免检测结果失真，同时本发明方法简便、快速。