一种吲唑磺菌胺及其代谢物IT-4残留量的检测方法

摘要

本发明提供了一种吲唑磺菌胺及其代谢物IT-4残留量的检测方法，包括以下步骤：(1)标准溶液的配制：称取标准品，用有机溶剂溶解定容，制成标准储备液，将标准储备液逐级稀释，配制成系列浓度标准工作液；(2)提取样品中残留；(3)净化：量取步骤(2)中提取液于离心管中，然后加入吸附剂，离心，取上清液；(4)超高效液相色谱-串联质谱法(UHPLC-MSMS)检测；(5)建立标准曲线；(6)结果分析。本发明的检测方法能够快速、灵敏、准确的测定吲唑磺菌胺及其代谢物IT-4残留量，为新型杀菌剂吲唑磺菌胺及其代谢物的检测提供了一种新的检测技术。

权利要求

1.一种吲唑磺菌胺及其代谢物IT-4残留量的检测方法，其特征在于包括以下步骤：(1)标准溶液的配制：称取标准品，用有机溶剂溶解定容，制成标准储备液，将标准储备液逐级稀释，配制成系列浓度标准工作液；

(2)提取：称取样品于离心管中，加入乙腈，涡旋振荡，加入盐包、涡旋振荡、离心，取上清液；

(3)净化：量取步骤(2)中提取液于离心管中，然后加入吸附剂，涡旋、离心，取上清液；

(4)仪器检测：待仪器状态稳定后，用步骤(1)中的系列浓度标准工作液进样，UHPLC-MS/MS检测，在此基础上，对步骤(3)收集的净化样品进行UHPLC-MS/MS检测；

(5)标准曲线的建立：采用峰面积定量，以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；

(6)结果分析：按以下公式计算试样中农药的含量R—样品中所含农药残留量，单位mg/kg；

C标—标准溶液浓度，单位mg/L；

V标—标准溶液进样体积，单位μL；

S样—样品溶液中被测农药的峰面积；

V终—样品溶液最终定容体积，单位mL；

V样—样品溶液进样体积，单位μL；

S标—标准溶液中被测农药的峰面积；

W—样品称样重量，单位g；

所述步骤(4)中UHPLC-MS/MS选用Thermo Scientific TSQ Quantum Ultra；色谱柱选用Thermo Hypersil GOLD C18色谱柱；

色谱检测条件：

柱温：25℃；

流动相：A相为甲醇，B相为0.1％甲酸水溶液；

梯度洗脱条件为:0～0.5min，保持20％A；0.5～1.5min，20％～90％A；1.5～

6.0min，保持90％A；6.0～7.5min，90％～20％A；7.5～10.0min，保持20％A；

流速：0.25mL/min；

进样量：10μL；

质谱条件：

离子源：电喷雾离子源ESI；

扫描方式：正离子源/负离子源；

喷雾电压：3200V/2800V；

毛细管温度：350℃；

鞘气压力：45Arb；

辅助气压力：15Arb；

检测方式：多重反应监测；

所述步骤(2)中盐包是指无水硫酸镁，氯化钠，柠檬酸钠和柠檬酸氢二钠的混合物，使用量无水硫酸镁0.4g/mL提取液，氯化钠0.1g/mL提取液，柠檬酸钠0.1g/mL提取液，柠檬酸氢二钠0.05g/mL提取液；

所述步骤(3)中的吸附剂，用于检测吲唑磺菌胺残留量时为无水硫酸镁与PSA、GCB的组合，用于检测吲唑磺菌胺代谢物IT-4残留量时为无水硫酸镁与GCB的组合，无水硫酸镁使用量为0.15g/mL提取液，PSA和GCB使用量均为0.05g/mL提取液。

2.根据权利要求1所述吲唑磺菌胺及其代谢物IT-4残留量的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中称取标准品的重量为0.01g±0.2mg；有机溶剂采用色谱甲醇。

3.根据权利要求1所述吲唑磺菌胺及其代谢物IT-4残留量的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中标准储备液是指制成100mg/L储备液。

4.根据权利要求1所述吲唑磺菌胺及其代谢物IT-4残留量的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中乙腈使用量为2mL/g试样。

5.根据权利要求1所述吲唑磺菌胺及其代谢物IT-4残留量的检测方法，其特征在于：所述步骤(5)中进样浓度为0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0mg/L。

6.根据权利要求1所述吲唑磺菌胺及其代谢物IT-4残留量的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中的样品是指水果、蔬菜、粮食作物样品或环境样品。

说明书

一种吲唑磺菌胺及其代谢物IT-4残留量的检测方法

技术领域

[0001] 本发明属于痕量分析技术领域，具体涉及一种吲唑磺菌胺及其代谢物IT-4残留量的检测方法。

背景技术

[0002] 吲唑磺菌胺是日本日产化学公司创制的三唑磺酰胺类杀菌剂，结构新颖独特，其最早于2003年报道。该药剂主要对卵菌和变形菌类有效。其持效性强，耐雨水冲淋，对多种病害有稳定的效果，是一种前景较好的杀菌剂。作为一种新型药剂，吲唑磺菌胺在农业生产中使用还存在较大的盲目性。由于国内外对吲唑磺菌胺的相关研究较少，所以需对吲唑磺菌胺的检测方法及残留行为等方面开展深入和广泛的研究，为规范用药，保障农业生产和人民健康给予技术上的支持。

[0003] 吲唑磺菌胺主要代谢为IT-4。研究表明，IT-4毒性远高于其母体。在分析吲唑磺菌胺的同时，需要特别关注其代谢物的产生和含量变化。目前对吲唑磺菌胺及其有毒代谢物IT-4的残留分析国内外尚未见相关报道，在国内外还处于空白阶段。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种操作较简单、对目标物干扰少，准确 检测吲唑磺菌胺及其代谢物IT-4残留的检测方法。该方法具有简便迅速、准确可靠的特点，对指导吲唑磺菌胺的安全合理使用，控制食品和作物中吲唑磺菌胺残留具有重要价值。

[0005] 本发明是通过以下技术方案实现的：

[0006] 一种吲唑磺菌胺及其代谢物IT-4残留量的检测方法，包括以下步骤：

[0007] (1)标准溶液的配制：称取吲唑磺菌胺及其代谢物IT-4标准品，用有机溶剂溶解定容，制成标准储备液，将标准储备液逐级稀释，配制成系列浓度标准工作液；

[0008] (2)提取：称取样品于离心管中，加入乙腈，涡旋振荡，加入盐包、涡旋振荡、离心，取上清液；

[0009] (3)净化：量取步骤(2)中提取液于离心管中，然后加入吸附剂，涡旋、离心，取上清液；

[0010] (4)仪器检测：待仪器状态稳定后，用步骤(1)中的系列浓度标准工作液进样，超高效液相色谱-串联质谱法(UHPLC-MSMS)检测，在此基础上，对步骤(3)收集的净化样品进行UHPLC-MS/MS检测；

[0011] (5)标准曲线的建立：采用峰面积定量，以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；

[0012] (6)结果分析：按以下公式计算试样中农药的含量

[0013]

[0014] R—样品中所含农药残留量，单位mg/kg；

[0015] C标—标准溶液浓度，单位mg/L；

[0016] V标—标准溶液进样体积，单位μL；

[0017] S样—样品溶液中被测农药的峰面积；

[0018] V终—样品溶液最终定容体积，单位mL；

[0019] V样—样品溶液进样体积，单位μL；

[0020] S标—标准溶液中被测农药的峰面积；

[0021] W—样品称样重量，单位g；

[0022] 进一步地，所述步骤(1)中称取标准品的重量为0.01g±0.2mg；有机溶剂采用色谱甲醇。

[0023] 进一步地，所述步骤(1)中标准储备液是指制成100mg/L储备液。

[0024] 进一步地，所述步骤(2)中乙腈使用量为2mL/g试样；

[0025] 进一步地，所述步骤(2)中盐包是指无水硫酸镁，氯化钠，柠檬酸钠和柠檬酸氢二钠的混合物。使用量无水硫酸镁0.4g/mL提取液、氯化钠0.1g/mL提取液、柠檬酸钠0.1g/mL提取液、柠檬酸氢二钠0.05g/mL提取液。

[0026] 进一步地，所述步骤(3)中的吸附剂为无水硫酸镁与N-丙基乙二胺(PSA)、C18、石墨化炭黑(GCB)中的一种或者两种组合。无水硫酸镁使用量为0.15g/mL提取液；PSA、C18和GCB使用量均为0.05g/mL提取液。

[0027] 进一步地，所述步骤(4)中UPLC-MS/MS选用Thermo Scientific TSQ Quantum Ultra；色谱柱选用Thermo Hypersil GOLD C18色谱柱(2.1×100mm,3.0μm)；

[0028] 色谱检测条件：

[0029] 柱温：25℃；

[0030] 流动相：A相为甲醇，B相为0.1％甲酸水溶液；

[0031] 梯度洗脱条件为:0～0.5min，保持20％A；0.5～1.5min，20％～90％A；1.5～6.0min，保持90％A；6.0～7.5min，90％～20％A；7.5～10.0min，保持20％A；

[0032] 流速：0.25mL/min；

[0033] 进样量：10μL；

[0034] 质谱条件：

[0035] 离子源：电喷雾离子源ESI；

[0036] 扫描方式：正离子源/负离子源；

[0037] 喷雾电压：3200V/2800V；

[0038] 毛细管温度：350℃；

[0039] 鞘气压力：45Arb；

[0040] 辅助气压力：15Arb；

[0041] 检测方式：多重反应监测(MRM)。

[0042] 进一步地，所述步骤(5)中进样浓度为0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0mg/L。

[0043] 进一步地，所述步骤(2)中的样品是指水果、蔬菜、粮食作物 及环境样品，环境样品指土壤、水。

[0044] 与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：

[0045] 1、本发明采用乙腈提取、吸附剂净化。与单一的液液萃取或SPE小柱相比，不仅操作简便，而且净化效果更好，能够有效去除基质中杂质。不仅提高了检测的准确性，而且能够有效减小杂质对色谱柱和检测器的污染，提高仪器的使用寿命。

[0046] 2、本发明通过UHPLC-MS/MS检测吲唑磺菌胺及其代谢物，不仅干扰小，而且准确度高，能够准确方便、快速的检测吲唑磺菌胺及其代谢物IT-4含量，其吲唑磺菌胺最小检出量为6.7×10-12g、IT-4最小检出量为7.0×10-13g，最低检出浓度均为0.005mg/kg。

[0047] 本发明的检测方法能够快速、灵敏、准确的测定吲唑磺菌胺及其代谢物IT-4残留量，为新型杀菌剂吲唑磺菌胺及其代谢物的检测提供了一种新的检测技术。

附图说明

[0048] 图1是吲唑磺菌胺标准色谱图；

[0049] 图2是实施例1的黄瓜空白样品色谱图；

[0050] 图3是实施例1的添加吲唑磺菌胺的黄瓜样品色谱图；

[0051] 图4是吲唑磺菌胺代谢物IT-4标准色谱图；

[0052] 图5是实施例2的土壤空白样品色谱图；

[0053] 图6是实施例2的添加吲唑磺菌胺代谢物IT-4的土壤样品色谱图；

[0054] 其中，图1、3中的色谱峰代表吲唑磺菌胺；4、6中的色谱峰代表IT-4。

具体实施方式

[0055] 下面分别以黄瓜中吲唑磺菌胺及土壤中吲唑磺菌胺代谢物IT-4残留量检测为例，并结合附图详述本发明的技术方案，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变更或改进，均属于本发明的保护范围。

[0056] 实施例1：黄瓜中吲唑磺菌胺残留量的检测

[0057] (1)提取

[0058] 称取5.0g黄瓜样品于50mL具盖离心管中，移取10mL乙腈到该离心管中，于漩涡混合振荡器上震荡提取1min，加入4g无水硫酸镁，1g氯化钠，1g柠檬酸钠和0.5g柠檬酸氢二钠，立即于漩涡混合振荡仪振荡2min，然后以4000r/min离心5min。

[0059] (2)净化

[0060] 移取1mL提取液于1.5mL离心管中，加入150mg无水硫酸镁、50mg PSA、50mg GCB吸附剂，于漩涡混合振荡仪上漩涡振荡2min，以6000r/min离心2分钟。吸取上清液，过0.22μm滤膜，待测。

[0061] (3)UHPLC-MS/MS检测

[0062] UHPLC检测条件为：

[0063] Thermo Scientific TSQ Quantum Ultra；

[0064] 色谱柱：Thermo Hypersil GOLD C18(2.1×100mm,3.0μm)；

[0065] 柱温：25℃；

[0066] 流动相：A相为甲醇，B相为0.1％甲酸水溶液。梯度洗脱条件为:0～0.5min，保持20％A；0.5～1.5min，20％～90％A；1.5～6.0min，保持90％A；6.0～7.5min，90％～20％A；7.5～10.0min，保持20％A；

[0067] 流速：0.25mL/min；

[0068] 进样量：10μL；

[0069] 质谱条件：

[0070] 离子源：电喷雾离子源ESI；

[0071] 扫描方式：正离子源/负离子源；

[0072] 喷雾电压：3200V/2800V；

[0073] 毛细管温度：350℃；

[0074] 鞘气压力：45Arb；

[0075] 辅助气压力：15Arb；

[0076] 检测方式：多重反应监测(MRM)如下表：

[0077]

[0078] 在上述条件下所得的标准色谱图见图1。保留时间为4.7min。

[0079] (4)标准曲线的建立

[0080] 称取0.0100g吲唑磺菌胺标准品，用甲醇溶解定容至100mL， 制成100mg/L储备液。将吲唑磺菌胺标准储备液逐级稀释，配制成0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0mg/L的标准工作液。以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。所得标准曲线回归方程为：Y＝5888762X-7048，相关系数r＝0.9999。

[0081] (5)计算公式

[0082]

[0083] R—样品中所含农药残留量，单位mg/kg；

[0084] C标—标准溶液浓度，单位mg/L；

[0085] V标—标准溶液进样体积，单位μL；

[0086] S样—样品溶液中被测农药的峰面积；

[0087] V终—样品溶液最终定容体积，单位mL；

[0088] V样—样品溶液进样体积，单位μL；

[0089] S标—标准溶液中被测农药的峰面积；

[0090] W—样品称样重量，单位g；

[0091] (6)添加回收率试验

[0092] 在黄瓜空白样品中添加0.005～0.5mg/kg吲唑磺菌胺标准品溶液，每个浓度重复5次，按上述方法提取、净化和检测，验证本发明方法的可靠性。结果见表1。结果表明，吲唑磺菌胺在黄瓜中添加浓度为0.005mg/kg、0.05mg/kg、0.5mg/kg时，平均回收率为86.4％～
107.1％，相对标准偏差分别为3.8％～5.3％。回收率和相对标准 偏差均符合农药残留试验的要求。

[0093] 表1 吲唑磺菌胺在黄瓜中添加回收率试验结果

[0094]

[0095] 黄瓜空白样品色谱图见图2；添加吲唑磺菌胺的黄瓜样品色谱图见图3。

[0096] 由图2可以看出，本发明对样品中的杂质净化效果较好，黄瓜空白样品中无杂质峰出现，吲唑磺菌胺本底值为0，对本实验不会形成干扰。由图3可以看出，目标峰峰形良好，邻近几乎无干扰峰，对结果的分析不会产生偏差。

[0097] 实施例2：土壤中吲唑磺菌胺代谢物IT-4残留量的检测

[0098] (1)提取

[0099] 称取10.0g土壤样品于50mL具盖离心管中，加水润湿，移取20mL乙腈到该离心管中，于漩涡混合振荡器上震荡提取1min，加入8g无水硫酸镁，2g氯化钠，2g柠檬酸钠和1.0g柠檬酸氢二钠，立即于漩涡混合振荡仪振荡2min，然后以4000r/min离心5min。

[0100] (2)净化

[0101] 移取1mL提取液于1.5mL离心管中，加入150mg无水硫酸镁、50mg PSA吸附剂，于漩涡混合振荡仪上漩涡振荡2min，以6000 r/min离心2分钟。吸取上清液，过0.22μm滤膜，待测。

[0102] (3)UHPLC-MS/MS检测

[0103] UHPLC检测条件为：

[0104] Thermo Scientific TSQ Quantum Ultra；

[0105] 色谱柱：Thermo Hypersil GOLD C18(2.1×100mm,3.0μm)；

[0106] 柱温：25℃；

[0107] 流动相：A相为甲醇，B相为0.1％甲酸水溶液。梯度洗脱条件为:0～0.5min，保持20％A；0.5～1.5min，20％～90％A；1.5～6.0min，保持90％A；6.0～7.5min，90％～20％A；7.5～10.0min，保持20％A；

[0108] 流速：0.25mL/min；

[0109] 进样量：10μL；

[0110] 质谱条件：

[0111] 离子源：电喷雾离子源ESI；

[0112] 扫描方式：正离子源/负离子源；

[0113] 喷雾电压：3200V/2800V；

[0114] 毛细管温度：350℃；

[0115] 鞘气压力：45Arb；

[0116] 辅助气压力：15Arb；

[0117] 检测方式：多重反应监测(MRM)如下表：

[0118]

[0119] 在上述条件下所得的标准色谱图见图4。保留时间为4.4min。

[0120] (4)标准曲线的建立

[0121] 称取0.0100g IT-4标准品，用甲醇溶解定容至100mL，制成100mg/L储备液。将IT-4标准储备液逐级稀释，配制成0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0mg/L的标准工作液。以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。所得标准曲线回归方程为：Y＝3897980X+15171，相关系数r＝0.9999。

[0122] (5)计算公式

[0123]

[0124] R—样品中所含农药残留量，单位mg/kg；

[0125] C标—标准溶液浓度，单位mg/L；

[0126] V标—标准溶液进样体积，单位μL；

[0127] S样—样品溶液中被测农药的峰面积；

[0128] V终—样品溶液最终定容体积，单位mL；

[0129] V样—样品溶液进样体积，单位μL；

[0130] S标—标准溶液中被测农药的峰面积；

[0131] W—样品称样重量，单位g；

[0132] (6)添加回收率试验

[0133] 在土壤空白样品中添加0.005～0.5mg/kg IT-4标准品溶液，每个浓度重复5次，按上述方法提取、净化和检测，验证本发明方法的可 靠性。结果见表2。结果表明，IT-4在土壤中添加浓度为0.005mg/kg、0.05mg/kg、0.5mg/kg时，平均回收率分别为85.7％～91.0％，相对标准偏差分别为1.7％～5.1％。回收率和相对标准偏差均符合农药残留试验的要求。

[0134] 表2 IT-4在土壤中添加回收率试验结果

[0135]

[0136] 土壤空白样品色谱图见图5；添加IT-4的土壤样品色谱图见图6。由图6可以看出，土壤空白样品中吲唑磺菌胺本底值为0，对本实验不会形成干扰。

[0137] 实施例1和2采用乙腈提取，吸附剂净化，不仅操作简便，而且净化效果更好，能够有效去除基质中杂质，提高了检测的准确性。通过UHPLC-MS/MS检测吲唑磺菌胺及其代谢物来反映基质中吲唑磺菌胺含量，不仅干扰小，而且准确、快速，其吲唑磺菌胺最小检出量为6.7×10-12g、IT-4最小检出量为7.0×10-13g，最低检出浓度均为0.005mg/kg。

[0138] 以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发 明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。