鸡柔嫩艾美尔球虫抗性综合选择指数选择育种方法

摘要

本发明涉及家禽抗病育种领域，具体涉及一种建立鸡柔嫩艾美尔球虫抗性综合选择指数筛选抗性鸡个体的选择育种方法。方法是雏鸡在特定的日龄每只鸡灌饲一定数量的鸡柔嫩艾美尔球虫孢子化卵囊，测定感染后3-5天内的增重，以及感染后第8天鸡血浆中过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）和γ干扰素（IFN-γ）的浓度，将上述6个指标数据转化为标准化Z分值，代入所建综合选择指数公式计算每个个体的综合选择指数值，根据值的大小选留抗性鸡个体。

权利要求

1.鸡柔嫩艾美尔球虫病抗性综合选择指数选择育种方法，其特征在于包括以下步骤：

雏鸡在30日龄时每只鸡灌饲2.5万个鸡柔嫩艾美尔球虫孢子化卵囊，测定感染后3-5天内的增重，以及感染后第8天鸡血浆中过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙二醛和γ干扰素的浓度，将上述6个指标数据转化为标准化Z分值，代入下述综合选择指数公式，计算每个个体的综合选择指数值F，F值越大该个体的鸡球虫病抗性越好；根据留种率确定选留抗性鸡个体；

F＝-0.64zx1+0.31zx2+0.8zx3-0.05zx4-0.08zx5+0.59zx6

其中，zx1是孢子化软囊感染后3-5内增重(g)的标准化Z分值；zx2是感染后第8天鸡血浆中过氧化氢酶浓度(U/L)标准化Z分值；zx3是感染后第8天鸡血浆中超氧化物歧化酶浓度(U/L)标准化Z分值；zx4是感染后第8天鸡血浆中谷胱甘肽过氧化物酶浓度(U/L)标准化Z分值；zx5是感染后第8天鸡血浆中丙二醛浓度(mmol/L)标准化Z分值；zx6是感染后第8天鸡血浆中γ干扰素浓度(ng/L)标准化Z分值。

说明书

鸡柔嫩艾美尔球虫抗性综合选择指数选择育种方法

技术领域

[0001] 本发明涉及家禽育种领域，具体涉及一种建立鸡柔嫩艾美尔球虫抗性综合选择指数筛选抗性鸡个体的选择育种方法。

背景技术

[0002] 鸡球虫病是由一种或多种球虫侵入鸡的肠道上皮细胞而引起的流行性急性寄生虫病，其中以鸡柔嫩艾美尔球虫的危害最为严重。35～60日龄的青年鸡和10～30日龄的雏鸡的致死率和发病率高达80%。病鸡对营养的吸收能力下降，生长受到很大影响，且长期得不到康复。据统计美国因球虫病造成的家禽业经济损失每年超过15亿美元，其中74%是由亚临床鸡生长阻滞和饲料利用率下降造成，24%是由药物预防和治疗所增加的开支。长期以来，控制鸡球虫病的主要手段是使用抗生素类和化学药物，虽然鸡球虫病的防治得益于这些药物，但同时也产生了鸡群的耐药性等问题。此外，抗生素及化学药物的使用最终造成蛋和鸡肉中的药物残留，降低了鸡产品的安全性和质量。另外，尽管球虫病的预防也可以用疫苗进行免疫，但要实施无公害生产就必须研究鸡的球虫抗性，利用鸡的球虫病抗性指标进行选择育种，从而培育鸡球虫病抗病群体用于家禽生产。目前还没有有关鸡柔嫩艾美尔球虫病抗病育种方法的相关研究报道。本发明的目的就是通过建立“鸡柔嫩艾美尔球虫抗性综合选择指数选择育种方法”，筛选鸡球虫病抗性个体，通过选择育种培育球虫病抗性鸡新品种或新品系。

[0003] 目前国内外所用球虫抗性指标分为两类，一类是客观指标，另一类是血液指标。前者是剖检客观指标，主要是盲肠病变记分。后者数量较多，但没有公认的指标，且可以活体采血测定，对选择育种有利。所以有效的鸡球虫抗性血液指标的筛选是抗性育种首先要解决的技术问题。

发明内容

[0004] 针对现有技术存在的问题，本发明筛选了有效的鸡球虫抗性血液指标，在此基础上研究并建立利用抗性指标综合选择指数，对综合选择指数进行有效性评价，进行鸡球虫病抗性综合选育，筛选出鸡球虫病抗性个体，通过选择育种，培育球虫病抗性鸡新品种或新品系。本发明所采用的技术方案是：一种鸡柔嫩艾美尔球虫病抗性综合选择指数选择育种方法，包括以下步骤：雏鸡在30日龄时每只鸡灌饲灌饲2.5万个鸡柔嫩艾美尔球虫孢子化卵囊，测定感染后3-5天内的增重，以及感染后第8天鸡血浆中过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙二醛和γ干扰素的浓度，将上述6个指标数据转化为标准化Z分值，代入下述综合选择指数公式，计算每个个体的综合选择指数值F，F值越大该个体的鸡球虫病抗性越好；根据留种率确定选留抗性鸡个体；

[0005] F=-0.64zx1+0.31zx2+0.8zx3-0.05zx4-0.08zx5+0.59zx6

[0006] 其中，zx1是孢子化软囊感染后3-5内增重（g）的标准化Z分值；zx2是感染后第8天鸡血浆中CAT浓度（U/L）标准化Z分值；zx3是感染后第8天鸡血浆中SOD浓度（U/L）标准化Z分值；zx4是感染后第8天鸡血浆中GSH-PX浓度（U/L）标准化Z分值；zx5是感染后第8天鸡血浆中MDA浓度（mmol/L）标准化Z分值；zx6是感染后第8天鸡血浆中IFN-γ浓度（ng/L）标准化Z分值。

[0007] 本发明方案通过以下研究建立：

[0008] （1）抗性指标确定通过检索国内外有关鸡球虫病抗性研究的参考文献，初步选择15个鸡球虫病抗性指标。他们分别是：30日龄的雏鸡第8天盲肠病变记分，0-8天内粪便卵囊排卵数，感染后0-3天、3-5天、5-8天体增重，以及感染后第8天血浆指标10个，分别是一氧化氮（NO）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、白介素2（IL-2）、白介素16（IL-16）、白介素17（IL-17）、γ干扰素（IFN-γ）、β-胡萝卜素（β-C）。

[0009] （2）抗性指标的筛选选用京海黄鸡为试验动物，在无球虫的环境下，用不含任何球虫和抗球虫活性药物的饲料饲养1日龄的雏鸡至30日龄时，人工感染不同剂量的鸡柔能艾美尔球虫孢子化软囊，以感染后9天内没有个体因感染球虫而出现死亡为条件，筛选到最佳攻毒剂量（攻毒后雏鸡出现明显的发病症状，但没有出现死亡或几乎没有出现死亡时的剂量）为每个京海黄鸡个体2.5万孢子化软囊。然后通过攻毒组和非攻毒组（对照组）抗性指标的比较，在15个所选指标中筛选到与鸡球虫病抗性关系密切的抗性指标6个，他们是感染后3-5天内的体增重（g）；感染后第8天血浆中γ干扰素（IFN-γ,ng/L）；丙二醛(MDA,mmol/L)，超氧化物歧化酶（SOD,U/L），谷胱甘肽-过氧化物酶（GSH-PX,U/L），过氧化氢酶（CAT,U/L）的浓度。

[0010] （3）综合选择指数的确定考虑到抗性指标的相关性，用统计软件SPSS中的多元统计主成份分析的程序，求主成分向量，根据主成分的累积贡献率和主成分分析原理，经综合分析判断，确定选择贡献率最大的第一主成分表达式为综合选择指数方程。其表达式为：

[0011] F=-0.64zx1+0.31zx2+0.8zx3-0.05zx4-0.08zx5+0.59zx6。

[0012] （4）综合选择指数的选择育种将每个个体6个抗性指标测定值的标准化Z分值代入综合选择指数方程，计算每个个体的主成份得分，将主成份得分进行排序，由综合选择指数方程所计算的F值越大该个体的鸡球虫病抗性越好；根据留种率确定需淘汰的易感个体。

[0013] 本方法的有益效果体现在。建立了鸡柔能艾美尔球虫综合选择指数公式（其表达式为F=-0.64zx1+0.31zx2+0.8zx3-0.05zx4-0.08zx5+0.59zx6），该综合选择指数公式是通过多元统计主成份分析方法选出的最佳主成份表达式，它综合了6个经试验选择的、有效的血液抗性指标信息，且经与球虫病抗性客观指标进行相关性分析，两者关系密切，相关极显著，表明用本发明建立的方法进行选择育种效果好。而且本方法不需要通过对感染鸡的剖解观察病变的程度来判断个体抗病性，可以降低劳动强度。经40个京海黄鸡每只鸡灌饲2.5万个鸡柔嫩艾美尔球虫孢子化卵囊试验，用建立的综合选择指数计算得到的最高的4个个体的指数值在2.01～5.16之间，最小4个个体的指数在-1.55～-1.84之间。其盲肠解剖特征见附图。附图1～图4、图5～图8和图9～图12分别是指数最大（依次为5.15、
3.20、2.35和2.01）、指数最小（依次为-1.55、-1.68、-1.70和-1.84）和对照组（非攻毒组）的4个个体攻毒后第8天盲肠解剖特征，由图1～图4和对照组图9～图10比较可见，指数在2.00以上个体盲肠解剖特征与对照组几乎没有差别，说明这些个体球虫病抗性强。但指数小于-1.55的个体其盲肠水肿，内容物血芯粗大，说明这些个体抗性差。

附图说明

[0014] 图1是选择指数为5.15个体的盲肠解剖特征。

[0015] 图2是选择指数为3.20个体的盲肠解剖特征。

[0016] 图3是选择指数为2.35个体的盲肠解剖特征。

[0017] 图4是选择指数为2.01个体的盲肠解剖特征。

[0018] 图5是选择指数为-1.55个体的盲肠解剖特征。

[0019] 图6是选择指数为-1.68个体的盲肠解剖特征。

[0020] 图7是选择指数为-1.70个体的盲肠解剖特征。

[0021] 图8是选择指数为-1.84个体的盲肠解剖特征。

[0022] 图9是对照组（非攻毒组）个体1的盲肠解剖特征。

[0023] 图10是对照组（非攻毒组）个体2的盲肠解剖特征。

[0024] 图11是对照组（非攻毒组）个体3的盲肠解剖特征。

[0025] 图12是对照组（非攻毒组）个体4的盲肠解剖特征。

[0026] 图13是SPSS统计软件选择“Descriptves”程序的操作示意图。

[0027] 图14是保存数据标准化后作为变量的操作图。

[0028] 图15是在数据视窗中标准化后变量前加有Z的示意图。

[0029] 图16是SPSS统计软件选择“Factor”程序的操作过程示意图。

[0030] 图17是主成分分析变量选择对话框。

[0031] 图18是主成分分析提取主成分按钮图。

[0032] 图19是主成分分析提取主成分选项对话框。

[0033] 图20是SPSS统计软件双变量相关系数计算程序选择操作过程示意图。

[0034] 图21是相关系数计算有关选项对话框。

[0035] 具体实施方式1、嫩艾美尔球虫孢子化卵囊攻毒剂量的确定

[0036] 2010年5月，1日龄京海黄鸡60只购买于江苏海门集团，未落地前饲养于汽油喷灯火焰消毒的无球虫笼舍中（单笼饲养），所用饲料不含任何球虫和抗球虫活性药物，30日龄时随机分成3组每组20只，第一组每只鸡分别灌饲2.0万个、第二组2.5万个、第三组3.0万个嫩艾美尔球虫孢子化卵囊，攻毒后0-9天内第三组鸡出现了由于球虫病引起的死亡，死亡率为25.0%，而第一、二组没有出现死亡。确定最佳存活攻毒剂量为2.5万/只。

[0037] 2、有效球虫抗性指标的筛选确定

[0038] 2011年11月，1日龄京海黄鸡66只购买于江苏海门集团，未落地前饲养于汽油喷灯火焰消毒的无球虫笼舍中（单笼饲养），所用饲料不含任何球虫和抗球虫活性药物，而且试验鸡在预试期内经粪检无球虫后，用于试验。京海黄鸡66只随机分成两组，试验组44只，对照组22只，30日龄时实验组每只鸡灌饲2.5万柔嫩艾美尔球虫卵囊，对照组灌饲等量生理盐水。分别测定感染后0d、3d、5d、8d每个个体的体重，计算0-3，3-5，5-8和0-8d内的体增重，其他测定指标和统计分析结果见下表1和2。感染后每天观察记录各组鸡的精神、食欲、粪便状况。

[0039] 表1感染后3d试验组和对照组各指标统计分析结果

[0040]指标 对照组 感染组 F值 显著性(P)
0-3d增重（g） 27.13±5.68 26.55±4.98 0.024 0.877
CAT浓度（U/L） 58.45±5.63 55.02±13.82 0.264 0.621
SOD浓度（U/L） 101.36±21.65 114.39±19.09 1.020 0.342
GSH-PX浓度（U/L） 385.96±91.4 451.56±92.63 1.271 0.292
MDA浓度（mmol/L） 4.40±1.14 4.60±0.89 0.095 0.766
IL-2浓度（ng/L） 34.00±2.92 30.80±2.49 3.483 0.099
IL-17浓度（pg/ml） 34.37±4.61 37.99±8.93 0.647 0.444

[0041]IL-16浓度（ng/L） 45.80±10.62 50.00±13.36 0.303 0.597
NO浓度（μmol/L） 50.25±3.09 54.90±6.58 2.045 0.191
IFN-浓度（ng/L） 41.60±6.31 36.00±5.39 2.279 0.170
β胡萝卜素浓度（μmol/L） 61.80±15.59 60.00±16.14 0.032 0.862

[0042] 注：*表示P<0.05,差异显著；**表示P<0.01，差异极显著(下同)。

[0043] 表2感染后8d试验组和对照组各指标统计分析结果

[0044]指标 对照组 感染组 F值 显著性(P)
3-5d增重（g 9.25±2.08 -1.03±0.66 9.375 0.004**
5-8d增重（g） 14.75±10.95 14.78±18.62 0.001 0.995
0-8d增重（g） 51.00±11.31 40.30±20.34 3.880 0.054
NO浓度（μmol/L） 55.49±5.78 54.10±5.32 0.7280 0.398
CAT浓度（U/L） 54.26±10.87 63.28±11.04 7.530 0.008**
SOD浓度（U/L） 106.87±15.43 120.60±18.89 6.544 0.014*
GSH-PX浓度（U/L） 396.31±55.74 455.72±73.05 8.422 0.005**
MDA浓度（mmol/L） 4.75±0.93 5.86±1.00 14.355 0.001**
IL-2浓度（ng/L） 35.31±5.35 33.05±5.77 1.783 0.188
IL-17浓度（pg/ml） 40.78±4.49 38.70±8.10 0.922 0.341
IL-16浓度（ng/L） 47.88±11.22 52.84±7.90 3.392 0.071
IFN-γ浓度（ng/L） 38.88±5.06 35.89±4.61 4.411 0.041*
β胡萝卜素浓度（μmol/L） 60.56±25.96 65.49±26.80 0.384 0.538

[0045] 由表1和表2统计分析结果可知，感染后3-5天内的体增重（g）；感染后第8天血浆中γ干扰素（IFN-γ,ng/L）；丙二醛(MDA,mmol/L)，超氧化物歧化酶（SOD,U/L），谷胱甘肽-过氧化物酶（GSH-PX,U/L），过氧化氢酶（CAT,U/L）的浓度6个指标可以用于衡量鸡球虫抗性。（3）主成份分析及综合选择指数的确定

[0046] 统计软件SPSS主成分分析操作步骤及统计结果

[0047] 一、数据标准化操作步骤：

[0048] 1、打开SPSS软件，在数据编辑视窗中按列输入测定指标；

[0049] 2、按图13指示的方法选择（点击）“Descriptves”程序，在弹出对话框中把需要标准化的变量选入Variable框中，并在下面图14的提示前打钩；

[0050] 3、然后点“OK”；

[0051] 4、数据视窗中，标准化后的变量名前会自动添加”Z”字母（如图15所示的Z盲肠记分下的数据就是标准化的盲肠记分Z分值）。

[0052] 二、主成分分析基本操作

[0053] 1、按图16所示的操作方法选择“Factor”程序；

[0054] 2、选择后弹出如图17的对话框；

[0055] 3、把标准化后的6个抗性变量都选进Variables框中；

[0056] 4、点击右上第二个按钮，也即如图18的按钮；

[0057] 5、弹出如图19所示的对话框；

[0058] 6、在对话框的空白处填0，其他选项默认；

[0059] 7、点击continue按钮；

[0060] 8、返回上个Factor Analysis对话框，点击“OK”，跳出分析结果查看器。

[0061] 三、主成份分析的结果

[0062] 1、各主成份贡献率

[0063] 由表1可知，在解释的总方差中主成份1所占比例最大为24.956%。主成份2、3和4所占比例比较接近，可以用主成份1或2、3、4的方法建立球虫抗性综合选择指数用于育种。

[0064]

[0065] 2、各主成份向量和表达式

[0066] 提取的6个主成份向量见表2中的第2-第7各列。

[0067]

[0068]

[0069] 表3是将上表各主成份向量值作为系数分别和对应的标准化指标相乘并求和后得到的主成份得分计算公式，简称主成份表达式或候选综合选择指数公式。

[0070]

[0071] 四、主成分表达式作为综合选择指数方程的评价

[0072] 1、每个个体综合选择指数值的计算

[0073] 将每个个体测定的6个抗性指标标准化后的zx分值代入F1主成份表达式，计算每个体第一主成份得分。以已建立的主成份表达式作为综合选择指数表达式，则有6组数据，分别用主成份1～6表示。

[0074] 2、相关系数的计算

[0075] 计算不同主成份值（综合选择指数值）与用z值标准化的客观和血浆抗性指标间的相关系数，SPSS软件分析操作步骤如下：

[0076] （1）选择程序，其方法操作步骤如图20所示。

[0077] （2）选择程序后，弹出如图21的对话框，把各个指标和主成分得分都加入variables框内。并在相关系数复选框中选择“pearson”,其他条件默认。点击“OK”[0078] （3）相关系数值及显著性测验结果见表4，表中椭圆内数据是相关显著或极显著的相关系数。

[0079] 表4各主成分与客观和血液生化抗性指标间的相关系数及显著性

[0080]

[0081]

[0082] 3、综合选择指数方程的综合评价和选择

[0083] 由上表4相关性分析结果可知，主成份1所表示的综合选择指数与9个抗性指标相关显著或极显著，特别是与客观指标中的盲肠记分，0-3天、3-5天、5-8天增重的关系密切。而其他5个主成份所代表的综合选择指数只有极少数与客观指标存在显著相关。综合主成份解释总方差的比例以及与抗性客观指标间的相关分析，主成份1所表示的综合选择指数选择效果最好，其他主成份表达式均不适宜作为综合选择指数。

[0084] 4、综合选择指数方程的应用效果

[0085] 经40个京海黄鸡每只鸡灌饲2.5万个鸡柔嫩艾美尔球虫孢子化卵囊试验，用建立的综合选择指数计算得到的最高的4个个体的指数值在2.01～5.16之间，最小4个个体在-1.55～-1.84之间。其盲肠解剖特征和粪便拉血现象照片见附图。图1～4、5～8和9～12分别是指数最大、指数最小和对照组（非攻毒组）的4个个体攻毒后第8天盲肠解剖特征，由图1～图4可见，F值在2.00以上时，盲肠基本和对照组相差无几。图5～图8是F值小于-1.55时，盲肠解剖情况，随着F值的变小，盲肠出现水肿，盲肠内出现血芯，血芯粗大。

[0086] 参考资料：

[0087] Lan(1998)认为只有第一主成分才可以排序评价，因为每一个主成分都有其特定的经济意义，但从综合评价来说，并不是所有的主成分都有评价意义。只有第一主成分才可以用于综合评价。