基于RAFT策略蛋白质表面分子印迹材料及制备和应用

摘要

本发明涉及一种基于RAFT策略蛋白质分子表面印迹材料，所述的蛋白质分子印迹材料是以修饰了双硫酯官能团的硅胶颗粒为基质，溶菌酶作为模板蛋白，以甲基丙烯酸(MAA)和甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)为单体，甲叉双丙烯酰胺(MBA)作为交联剂，磷酸盐水溶液作为溶剂，采用氧化还原引发聚合反应的方式进行聚合反应。聚合完成后，将形成聚合物当中的模板蛋白洗脱，然后将材料表面的双硫酯官能团还原为巯基，即可得到亲水性的溶菌酶分子印迹核壳结构微球，应用于溶菌酶的特异性识别。本发明的材料通过可逆加成-活性链转移策略实现聚合反应与聚合物链生长的可控性，实现聚合物分布较窄，链长可控，聚合物层分布均匀，形成足够的表面印迹位点。

权利要求

1.基于RAFT策略蛋白质表面分子印迹材料，其特征在于：以修饰了双硫酯官能团的硅胶颗粒为基质，溶菌酶作为模板蛋白，以MAA和HEMA为单体，MBA作为交联剂，磷酸盐水溶液作为溶剂，采用氧化还原引发聚合反应的方式进行聚合反应；聚合完成后，将聚合物当中的模板蛋白洗脱，并将材料表面的双硫酯官能团还原为巯基，即可得到对溶菌酶分子有特异性识别能力的分子印迹核壳结构亲水性微球。

2.一种权利要求1所述蛋白质表面分子印迹材料的制备方法，其特征在于：

1)硅胶基质颗粒表面需要先修饰上双硫酯官能团；

2)溶菌酶于硅胶基质颗粒上的固载；

3)聚合反应：以MAA和HEMA为单体，MBA作为交联剂，磷酸盐水溶液作为溶剂，采用氧化还原引发聚合反应的方式进行聚合反应；

4)模板洗脱：聚合完成后，需要将聚合物表面未反应的聚合溶液洗净，之后将形成聚合物当中的模板蛋白进行洗脱；

5)在聚合反应和模板洗脱完成后，将材料表面的双硫酯官能团还原为巯基。

3.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于：

硅胶基质颗粒表面需要先修饰上双硫酯官能团的过程为；首先在硅胶颗粒表面通过氨丙基三乙氧基硅烷的硅烷化反应在硅胶表面修饰氨基，然后通过1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的酯化反应，将可逆加成-活性链转移试剂(RAFT试剂)共价修饰到硅球基质的表面。

4.按照权利要求3所述的制备方法，其特征在于：

在硅烷化修饰环节，硅胶颗粒与分散剂甲醇的质量比为1:5～1:10，硅烷化试剂与分散剂甲醇的体积比为1:20～1:40；在酯化反应中，EDC和NHS的摩尔比为1:0.8～1:1.2，加入NHS和RAFT试剂的摩尔比为1:0.8～1:1.2，反应温度为18～25℃，反应时间为12～24小时。

5.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于：

溶菌酶于硅胶基质颗粒上的固载过程：溶菌酶溶于溶菌酶磷酸盐溶液中，蛋白浓度为

0.8mg/mL～1.2mg/mL；硅胶颗粒置于聚合溶液中，修饰RAFT试剂的硅胶在溶菌酶磷酸盐溶液当中的静态吸附时间为0.5～1.5小时。

6.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于：

聚合过程：MAA和HEMA的质量比为1:9～9:1，加入单体总和与交联剂MBA的质量比为50:

1～5:1；磷酸盐水溶液为聚合反应所用溶剂，单体和交联剂的质量占聚合溶液总质量的

10％～25％；加入氧化还原引发剂亚硫酸氢钠和过二硫酸铵(APS)的质量分别占聚合溶液总质量的0.2％～0.4％；聚合温度为35～45℃，聚合时间为20～25小时。

7.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于：

模板洗脱过程：聚合完成后用水洗涤形成的聚合物，每次使用1～5mL水/20mg材料，洗涤2～4次；

模板洗脱剂由水、乙腈、甲酸组分组成，其中甲酸比例为15％～25％(v/v)，乙腈比例为

30％～50％(v/v)，余量为水，处理温度为18～25℃，处理时间为3～10分钟；洗脱完成后，用水洗去多余的模板洗脱剂，每次使用1～5mL水/20mg材料，洗涤2～4次。

8.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于：使用有机胺的乙醇溶液作为双硫酯官能团的还原剂，将双硫酯官能团还原成巯基；有机胺的乙醇溶液当中有机胺组分的比例为

5％～15％(v/v)，有机胺的乙醇溶液与待处理聚合物材料的质量比为40:1～60:1，处理温度为18～25℃，处理时间为6～18小时；处理完毕后依次分别用乙醇和水洗去多余的双硫酯还原剂，每次使用1～5mL水或乙醇/20mg材料，洗涤2～4次。

9.一种权利要求1所述的蛋白质表面分子印迹材料在蛋白选择性识别中的应用，其特征在于：其为基于可逆加成-活性链转移策略实现蛋白质分子表面印迹材料，可用于生物样品中高选择性识别和分离目标蛋白。

说明书

基于RAFT策略蛋白质表面分子印迹材料及制备和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及的是蛋白质分子印迹颗粒材料用于目标蛋白的选择性识别，具体地说是一种基于可逆加成-活性链转移(RAFT)策略实现的溶菌酶核-壳结构表面印迹颗粒材料的制备方法以及该材料应用于对生物样品中溶菌酶成分的选择性识别。

背景技术

[0002] 在自然界中，分子识别在生命演变过程中起着重要而特殊的作用。分子印迹的思想起源产生于分子识别当中“锁钥模型”、“抗原一抗体”等概念，是一种选择性分子识别的新方法和新技术。这一方法是通过制备含有对目标分子互补性孔穴的分子印迹聚合物(MIP)，实现对某一特定的目标分子的高选择识别。与天然抗体相比，具有原料易于获取、制备成本较低、可重复性使用等优势(Biosens.and Bioelectron.2007,22,1131–1137)。近年来，蛋白质印迹方法的研究取得了一定的进展，并开始用于人造酶抑制剂(J.Am.Chem.Soc.2009,131,14699–14702)、色谱固定相(J.Sep.Sci.2010,33,2757-2761)以及生物传感器(Nature Nanotechnology 2010,5,597-601)等领域。目前以整个蛋白作为模板的常用印迹方法主要分为本体印迹法和表面印迹法。其中采用表面印迹法制备得到的印迹识别位点形成于印迹材料的表面。因此相对本体印迹法制备的材料，不仅具有传质速率快 、模板 易于 洗 脱等 优点 ，而且 能够 较 大限 度地 保持 模 板的 构象(Biotechnol.Progr.2006,22,1474-1489；Anal.Bioanal.Chem.2012,403,2173-2183)。

[0003] 然而，目前表面印迹策略也存在一些不足有待改进。目前分子印迹材料制备最常用的仍然是传统自由基聚合方法，反应的可控性较差，分子量分布宽，得到的材料表面形貌不容易控制。由于有效印迹位点的形成与形成聚合物的链长密切相关，因而发展一种基于可控聚合的分子印迹制备方法十分必要。

[0004] 可逆加成-断裂链转移聚合方法(reversible addition fragmentation chain transfer,RAFT)是一种新型的活性-可控自由基聚合方法，1998年由Rizzaro及其同事等人发现并提出该方法的主要聚合机理(Macromolecules 1998,31,5559-5562)。这一方法兼具自由基聚合与活性聚合的优点，与传统的自由基聚合相比，该方法具有适用单体种类多、聚合所需条件较为温和、形成聚合物分子量分布窄、反应可控性强等诸多优势。基于以上优点，这种聚合方法应用于诸多领域(Polymer.2008,49,5636-5642；J.Sep.Sci.2010,33,587–593；Macromolecules 2011,44,2524-2530；J.Phys.Chem.C.2011,115,3304–3312)，实现了聚合反应的可控。

[0005] 目前的研究当中，RAFT方法已经成功应用于针对小分子识别的印迹材料制备(Chem.Mater.2006,18,1773-1779；Macromolecules 2007,40,1395–1400；J.Sep.Sci.2008,31,1694–1701；Biosens.and Bioelectron.2009,25,306–312；
Nanoscale,2011,3,280–287)。不过，对于蛋白质分子印迹制备而言，这一方法的应用报道还很少(International Journal of Biological Macromolecules.2011,48,432-438)。这可能由于在蛋白质印迹材料制备的条件较为苛刻，目前应用于小分子印迹材料制备的RAFT策略主要是在油相体系内使用热引发方式进行的，而对于蛋白质而言，高浓度的有机溶剂和较高的温度(通常≥60℃)都会使蛋白质空间构象发生较大的变化，从而不容易得到有效的印迹位点。因此，发展一种在水相条件和较低温度下的RAFT聚合策略并将其应用于蛋白质印迹是非常必要的。

发明内容

[0006] RAFT方法兼具自由基聚合与活性聚合的优点，与传统的自由基聚合相比，该方法具有适用单体种类多、聚合所需条件较为温和、形成聚合物分子量分布窄、反应可控性强等诸多优势。

[0007] 本发明的目的是提供一种基于RAFT策略实现蛋白质分子表面印迹材料的制备方法，制备出聚合物层活性/可控的核壳结构表面印迹识别材料，用于目标蛋白的高选择性识别。

[0008] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

[0009] 基于RAFT策略蛋白质表面分子印迹材料，以修饰了双硫酯官能团的硅胶颗粒为基质，溶菌酶作为模板蛋白，以MAA和HEMA为单体，MBA作为交联剂，磷酸盐水溶液作为溶剂，采用氧化还原引发聚合反应的方式进行聚合反应。聚合完成后，将聚合物当中的模板蛋白洗脱，并将材料表面的双硫酯官能团还原为巯基，即可得到对溶菌酶分子有特异性识别能力的分子印迹核壳结构亲水性微球。

[0010] 所述蛋白质表面分子印迹材料的制备方法，

[0011] 1)硅胶基质颗粒表面需要先修饰上双硫酯官能团；

[0012] 2)溶菌酶于硅胶基质颗粒上的固载；

[0013] 3)聚合反应：以MAA和HEMA为单体，MBA作为交联剂，磷酸盐水溶液作为溶剂，采用氧化还原引发聚合反应的方式进行聚合反应；

[0014] 4)模板洗脱：聚合完成后，需要将聚合物表面未反应的聚合溶液洗净，之后将形成聚合物当中的模板蛋白进行洗脱；

[0015] 5)在聚合反应和模板洗脱完成后，将材料表面的双硫酯官能团还原为巯基。

[0016] 硅胶基质颗粒表面需要先修饰上双硫酯官能团的过程为；首先在硅胶颗粒表面通过氨丙基三乙氧基硅烷的硅烷化反应在硅胶表面修饰氨基，然后通过在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的酯化反应，将可逆加成-活性链转移试剂(RAFT试剂)共价修饰到硅球基质的表面。

[0017] 在硅烷化修饰环节，硅胶颗粒与分散剂甲醇的质量比为1:5～1:10，硅烷化试剂与分散剂甲醇的体积比为1:20～1:40；在酯化反应中，EDC和NHS的摩尔比为1:0.8～1:1.2，加入NHS和RAFT试剂的摩尔比为1:0.8～1:1.2，反应温度为18～25℃，反应时间为12～24小时。

[0018] 溶菌酶于硅胶基质颗粒上的固载过程：溶菌酶溶于溶菌酶磷酸盐溶液中，蛋白浓度为0.8mg/mL～1.2mg/mL；硅胶颗粒置于聚合溶液中，修饰RAFT试剂的硅胶在溶菌酶磷酸盐溶液当中的静态吸附时间为0.5～1.5小时。

[0019] 聚合过程：MAA和HEMA的质量比为1:9～9:1，加入单体总和与交联剂MBA的质量比为50:1～5:1；磷酸盐水溶液为聚合反应所用溶剂，单体和交联剂的质量占聚合溶液总质量的10％～25％；加入氧化还原引发剂亚硫酸氢钠和过二硫酸铵(APS)的质量分别占聚合溶液总质量的0.2％～0.4％；聚合温度为35～45℃，聚合时间为20～25小时。

[0020] 模板洗脱过程：聚合完成后用水洗涤形成的聚合物，每次使用1～5mL水/20mg材料，洗涤2～4次；

[0021] 模板洗脱剂由水、乙腈、甲酸组分组成，其中甲酸比例为15％～25％(v/v)，乙腈比例为30％～50％(v/v)，余量为水，处理温度为18～25℃，处理时间为3～10分钟；洗脱完成后，用水洗去多余的模板洗脱剂，每次使用1～5mL水/20mg材料，洗涤2～4次。

[0022] 使用有机胺的乙醇溶液作为双硫酯官能团的还原剂，将双硫酯官能团还原成巯基；有机胺的乙醇溶液当中有机胺组分的比例为5％～15％(v/v)，有机胺的乙醇溶液与待处理聚合物材料的质量比为40:1～60:1，处理温度为18～25℃，处理时间为6～18小时；处理完毕后依次分别用乙醇和水洗去多余的双硫酯还原剂，每次使用1～5mL水或乙醇/20mg材料，洗涤2～4次。

[0023] 所述基于RAFT方法溶菌酶表面印迹材料的制备，具体步骤如下：

[0024] (1)双硫酯官能团修饰硅胶颗粒的制备：首先通过氨丙基三乙氧基硅烷在分散剂甲醇中改性硅胶颗粒硅胶颗粒与分散剂甲醇的质量比为1:5～1:10，加入硅烷化试剂与分散剂甲醇之间的体积比为1:20～1:40，本步骤反应时间为20～28小时。得到的氨基硅球在EDC和NHS催化下，氨基和与RAFT试剂的末端羧基发生酯化反应，从而修饰到硅球基质的表面，其中EDC和NHS的摩尔比为1:0.8～1:1.2，加入NHS和带有羧基的双硫酯试剂4-cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic acid(CPCP)的摩尔比为1:0.8～1:1.2。这一反应的温度为18～25℃，反应时间为12～24小时。

[0025] (2)溶菌酶的固载：将制备得到的修饰了RAFT试剂的硅球用磷酸盐缓冲液洗涤，然后与溶菌酶浓度为0.8mg/mL～1.2mg/mL的磷酸盐水溶液混合，静态吸附时间为0.5～1.5小时。然后离心去除上清液，用磷酸盐缓冲液洗涤掉未吸附在硅胶基质表面的溶菌酶。

[0026] (3)聚合环节：单体MAA和HEMA的质量比为1:9～9:1，加入单体总和与交联剂MBA的质量比为50:1～5:1。磷酸盐水溶液为聚合反应所用溶剂，单体和交联剂的质量占聚合溶液总质量的10％～25％(w/w)。预聚合溶液混匀后用氮气脱气以去除溶解氧。然后加入氧化还原引发剂引发聚合反应，其质量占聚合溶液总质量的0.2％～0.4％(w/w)。聚合温度为35～45℃，聚合时间为20～25小时。

[0027] (4)模板洗脱：聚合完成后用水洗涤形成的聚合物，每次使用1～5mL水，洗涤2～4次。模板洗脱剂由水、乙腈、甲酸组分组成，其中甲酸比例为15％～25％(v/v)，乙腈比例为30％～50％(v/v)。处理温度为18～25℃，处理时间为3～10分钟。洗脱完成后，用水洗去多余的模板洗脱剂，每次使用1～5mL水，洗涤2～4次。

[0028] (5)最后，将材料表面的双硫酯官能团还原为巯基。有机胺的乙醇溶液当中有机胺组分的比例为5％～15％(v/v)，有机胺的乙醇溶液与待处理聚合物材料的质量比为40:1～60:1，处理温度为18～25℃，处理时间为6～18小时。处理完毕后用乙醇和水洗去多余的RAFT试剂还原剂，每次使用1～5mL水，洗涤2～4次。

[0029] 以上所制备溶菌酶表面印迹颗粒材料用于选择性吸附和识别样品中的目标蛋白溶菌酶。

[0030] 所述的蛋白质分子表面印迹材料在蛋白选择性识别中的应用，其为基于可逆加成-活性链转移策略实现蛋白质分子表面印迹材料，可用于生物样品中高选择性识别和分离目标蛋白。

[0031] 本发明具有如下优点：

[0032] 1.本发明中的材料采取核壳型结构的设计，在包覆的壳层上形成对溶菌酶具有选择性识别能力的分子印迹识别位点，制备得到的这些位点位于材料的表面，具有传质速率快和识别效率高的优势。

[0033] 2.本发明采用RAFT策略实现了聚合物链段的活性/可控。

[0034] 3.本发明采用了亲水性单体MAA、HEMA和亲水性的交联剂MBA，使得形成的聚合物层具有良好的亲水性和较低的非特异性吸附。

[0035] 4.制备的材料对于目标蛋白具有优良的选择性识别能力。

[0036] 本发明为一种基于可逆加成-活性链转移(RAFT)策略实现蛋白质分子表面印迹材料制备的方法。所述的蛋白质分子印迹材料是以修饰了双硫酯官能团的硅胶颗粒为基质，溶菌酶作为模板蛋白，以甲基丙烯酸(MAA)和甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)为单体，甲叉双丙烯酰胺(MBA)作为交联剂，磷酸盐水溶液作为溶剂，采用氧化还原引发聚合反应的方式进行聚合反应。聚合完成后，将形成聚合物当中的模板蛋白洗脱，然后将材料表面的双硫酯官能团还原为巯基，即可得到亲水性的溶菌酶分子印迹核壳结构微球，应用于溶菌酶的特异性识别。本发明的材料通过可逆加成-活性链转移策略实现聚合反应与聚合物链生长的可控性，实现聚合物分布较窄，链长可控，聚合物层分布均匀，可以形成足够的表面印迹位点；采用亲水性的单体甲基丙烯酸和甲基丙烯酸羟乙酯和交联剂甲叉双丙烯酰胺，降低了分子印迹材料对干扰蛋白质的非特异性吸附，从而实现对目标蛋白高容量、高选择性和高特异性的识别和富集。

附图说明

[0037] 图1在硅球表面修饰RAFT试剂以及使用RAFT试剂修饰的硅球为基质制备溶菌酶印迹材料的制备流程图。

[0038] 图2制备得到溶菌酶印迹材料MIP1的扫描电镜图，使用仪器为JSM-6360LV型扫描电镜(JEOL,Hitachi,Japan)，扫描电压20kV,放大倍数为5000倍。

[0039] 图3制备得到溶菌酶印迹材料MIP1的透射电镜图，使用仪器为Tecnai G2型透射电镜(FEI,Eindhoven,Netherlands)，电压120kV,放大倍数为360000倍。

[0040] 图4溶菌酶表面印迹材料MIP1与空白对照材料NIP1的吸附动力学曲线[0041] 图5竞争吸附条件下溶菌酶表面印迹材料MIP1与空白对照材料NIP1洗脱组分当中对各蛋白的结合容量,四种蛋白分别为溶菌酶(Lys),核糖核酸酶B(RNB),猪血清白蛋白(PSA),肌红蛋白(Mb)。

具体实施方式

[0042] 下面通过实施例对本发明提供的方法进行详述，但不以任何形式限制本发明。

[0043] 实施例1

[0044] 1.基于RAFT方法溶菌酶表面印迹材料的制备

[0045] 如图1所示，按如下流程制备：

[0046] 1)RAFT试剂修饰硅胶颗粒的制备：首先在硅胶颗粒表面通过氨丙基三乙氧基硅烷的硅烷化反应在硅胶表面修饰氨基，每一批分别加入硅胶颗粒100mg与甲醇2.0mL，充分匀浆后加入氨丙基三乙氧基硅烷50μL，振荡混匀后反应24h。称取46.17mg EDC，22.60mgNHS，45.50mg双硫酯试剂4-cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic acid(CPCP)，加入
30mL乙醇充分溶解后，称取400mg干燥后的氨基硅球，匀浆后封口反应，反应温度为25℃，反应时间为18小时。反应结束后，依次使用乙腈、乙醇、水洗涤以去除未反应的试剂以及吸附在硅球表面的RAFT试剂。反应结束后将硅球烘干，备用。

[0047] 2)溶菌酶的固载：将制备得到的RAFT试剂修饰的硅球用磷酸盐缓冲液(10mM，pH＝7.4)洗涤，然后与浓度为1.0mg/mL的溶菌酶磷酸盐水溶液混合，静态吸附时间为1.0小时。
然后离心去除上清液，用磷酸盐缓冲液洗涤掉未吸附在硅胶基质表面的溶菌酶。

[0048] 3)聚合环节：称取RAFT试剂修饰的硅球20mg，取单体MAA 0.103mL，HEMA0.200mL，交联剂MBA为9.0mg。加入1.50mL pH＝7.4PBS缓冲液混匀，然后用氮气脱气10分钟以去除溶解氧。然后先后加入质量浓度10％的亚硫酸氢钠与质量浓度10％APS溶液各5μL，引发聚合反应，控制反应温度40℃，反应24小时。

[0049] 4)模板洗脱：反应后用1.0mL 40％的乙腈洗涤2次去除剩余的单体和交联剂，再用1mL洗脱液(20％甲酸+40％乙腈+40％水，v/v)洗脱模板蛋白10min，然后用pH＝7.410mM PBS缓冲液洗涤两次。

[0050] 5)最后，需要将材料表面的双硫酯官能团还原为巯基。将洗脱模板后的印迹球(每份大约20mg)置入10mL离心管中，加入1.0mL乙醇混匀，然后加入0.10mL己胺，25℃下振荡反应12小时。反应后离心去除上清，然后分别用乙醇和水(分别为每次8mL/20mg材料)洗涤材料至材料的黄色完全褪去为止，烘干后可得到溶菌酶表面印迹材料(MIP1)。

[0051] 6)按以上步骤操作，但不加溶菌酶，制备相应的对照材料(NIP1)。

[0052] 2.所制备的分子印迹颗粒材料的扫描电镜图如图2所示

[0053] 3.所制备的分子印迹颗粒材料的透射电镜图如图3所示

[0054] 实施例2

[0055] 为考察以上制备得到的基于RAFT方法溶菌酶表面印迹材料的吸附容量和动力学特性，在不同的吸附时间下分别测定MIP1和NIP1材料对模板蛋白的吸附容量。溶液当中的蛋白浓度由色谱法进行测定。具体测定步骤为，分别取MIP1和NIP1材料，每份10mg，加入0.40mg/mL的溶菌酶0.50mL，在4℃条件下分别静态吸附1，5，15,30与60分钟，然后离心去除上清液，用1.0mL 40％的乙腈洗涤2次去除剩余的单体和交联剂，再用0.5mL洗脱液(20％甲酸+40％乙腈+40％水，v/v)洗脱模板蛋白10min，洗脱液中蛋白浓度由HPLC进行测定。其吸附动力学曲线由图4所示。吸附5分钟就可以达到饱和容量的75％，60分钟可以达到饱和吸附。以上吸附条件下饱和MIP1吸附容量为5.6mg，NIP1吸附容量1.5mg，印迹因子(MIP/NIP)可以达到3.7。这一结果证明印迹材料对模板蛋白有良好的识别能力。

[0056] 实施例3

[0057] 为了考察以上制备得到的基于RAFT方法溶菌酶表面印迹材料MIP1与对照材料NIP1对目标蛋白的选择性以及非特异吸附，进一步进行干扰实验。

[0058] 1.蛋白混合溶液配制

[0059] 分别配制5.0mg/mL的溶菌酶、核糖核酸酶B、猪血清白蛋白和肌红蛋白的磷酸盐溶液(pH＝7.4)。将四种蛋白的溶液等体积加入，然后加入磷酸盐溶液(pH＝7.4)进行稀释，使得最终每种蛋白的浓度均为0.40mg/mL。

[0060] 2.模板蛋白的选择性识别

[0061] 取实施例1制备的制备得到的基于RAFT方法溶菌酶表面印迹材料每份15mg，加入1.0mL buffer进行洗涤，然后每份加入0.4mL的1所述的蛋白混合溶液，混匀后静态吸附
24h。离心取上清，然后用1.0mL 40％ACN进行洗涤三次，最后用0.4mL洗脱液(20％FA+40％ACN+40％水)洗脱，离心取上清。

[0062] 3.HPLC对洗脱液中各蛋白浓度进行测定

[0063] 在高效液相色谱(HPLC)(岛津LC20AD，紫外/可见检测器SPD20A)上对洗脱液中各蛋白浓度进行测定。使用的色谱柱规格为：思谱C8,5μm,150mm×4.6mm I.D.。流动相A：95％水+5％乙腈+0.1％TFA；流动相B：10％水+90％乙腈+0.1％TFA。梯度条件：0-40min，B 20％-90％。流速1.00mL/min，进样量20μL。

[0064] 如图5所示，在MIP1的洗脱组分当中，模板蛋白溶菌酶的量明显高于其他三种具有不同分子量和等电点的干扰蛋白，在竞争吸附条件下，对于模板蛋白而言，印迹因子(MIP/NIP)仍然较高(IF＝2.1)。这一结果证明材料不但具有对模板蛋白的良好选择性，也具有良好的亲水性和对干扰蛋白较低的非特异性吸附的特性。

[0065] 实施例4

[0066] 在聚合环节中称取RAFT试剂修饰的硅球20mg，取单体MAA 0.045mL，HEMA0.260mL，交联剂MBA为9.0mg。其他同实施例1，可得到溶菌酶表面印迹材料(MIP2)以及对照材料(NIP2)。

[0067] 实施例5

[0068] 在聚合环节中称取RAFT试剂修饰的硅球20mg，取单体MAA 0.260mL，HEMA0.040mL，交联剂MBA为9.0mg。其他同实施例1，可得到溶菌酶表面印迹材料(MIP3)以及对照材料(NIP3)。

[0069] 实施例6

[0070] 在聚合环节中称取RAFT试剂修饰的硅球20mg，取单体MAA 0.103mL，HEMA0.200mL，交联剂MBA为7.0mg。其他同实施例1，可得到溶菌酶表面印迹材料(MIP4)以及对照材料(NIP4)。

[0071] 实施例7

[0072] 在聚合环节中称取RAFT试剂修饰的硅球20mg，取单体MAA 0.103mL，HEMA0.200mL，交联剂MBA为45.0mg。其他同实施例1，可得到溶菌酶表面印迹材料(MIP5)以及对照材料(NIP5)。