焦磷酸测序法检测BCR·ABL融合基因的引物对及试剂盒

摘要

本发明公开了一种焦磷酸测序法检测BCR-ABL融合基因的引物对及包含所述引物对的试剂盒，该试剂盒能够一次性检测BCR-ABL(b3a2)、BCR-ABL(b2a2)、BCR-ABL(e1a2)多种融合基因。通过对BCR-ABL融合基因的mRNA设计引物，经过逆转录PCR后对产物进行测序分析，本试剂盒可以实现BCR-ABL融合基因的快速、准确、高通量的检测。

权利要求

1.一种焦磷酸测序法检测BCR-ABL融合基因的引物对，所述的BCR-ABL融合基因为BCR-ABL b3a2、BCR-ABL b2a2和BCR-ABL e1a2，其特征在于，所述引物对包括针对BCR-ABL b3a2、BCR-ABL b2a2和BCR-ABL e1a2三个融合基因的扩增引物和测序引物，具体为：(1)对于BCR-ABL b3a2基因，扩增引物为：

上游引物：5′-TATGGGTTTCTGAATGTCATCG-3′，下游引物：5′-AACGAAAAGGTTGGGGTCATT-3′，其中下游引物的5′端进行生物素标记；

测序引物为：

5′-CACTGGATTTAAGCAGAGTT-3′；

(2)对于BCR-ABL b2a2基因：扩增引物为：

上游引物：5′-CGCAACGGCAAGAGTTACAC-3′，下游引物：5′-AGCGGCTTCACTCAGACCCT-3′，其中下游引物的5′端进行生物素标记；

测序引物：

5′-CTGACCATCAATAAGGAA-3′；和(3)对于BCR-ABL e1a2基因：扩增引物为：

上游引物：5′-AACTCGCAACAGTCCTTCGAC-3′，下游引物：5′-AGCGGCTTCACTCAGACCCT-3′，其中下游引物的5′端进行生物素标记；

测序引物：

5′-CCTTCCATGGAGACG-3′。

2.一种焦磷酸测序法检测BCR-ABL融合基因的试剂盒，所述的BCR-ABL融合基因为BCR-ABL b3a2、BCR-ABL b2a2和BCR-ABL e1a2，其特征在于，所述试剂盒包含质控品和针对BCR-ABL b3a2、BCR-ABL b2a2和BCR-ABL e1a2三个融合基因的扩增引物和测序引物，具体为：(1)对于BCR-ABL b3a2基因：扩增引物为：

上游引物：5′-TATGGGTTTCTGAATGTCATCG-3′，下游引物：5′-AACGAAAAGGTTGGGGTCATT-3′，其中下游引物的5′端进行生物素标记；

测序引物：

5′-CACTGGATTTAAGCAGAGTT-3′；

(2)对于BCR-ABL b2a2基因：扩增引物为：

上游引物：5′-CGCAACGGCAAGAGTTACAC-3′，下游引物：5′-AGCGGCTTCACTCAGACCCT-3′，其中下游引物的5′端进行生物素标记；

测序引物：

5′-CTGACCATCAATAAGGAA-3′；和(3)对于BCR-AB Le1a2基因：扩增引物为：

上游引物：5′-AACTCGCAACAGTCCTTCGAC-3′，下游引物：5′-AGCGGCTTCACTCAGACCCT-3′，其中下游引物的5′端进行生物素标记；

测序引物：

5′-CCTTCCATGGAGACG-3′。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述质控品包括阳性对照品和阴性对照品，其中，所述的阳性对照品为含有BCR-ABL b3a2、BCR-ABL b2a2和BCR-ABL e1a2的质粒的混合液，所述的阴性对照品为不含BCR-ABL b3a2、BCR-ABL b2a2和BCR-ABL e1a2的质粒溶液。

4.权利要求2所述的试剂盒在制备检测BCR-ABL融合基因的试剂中的应用，其中，所述的BCR-ABL融合基因为BCR-ABL b3a2、BCR-ABL b2a2和BCR-ABL e1a2中的任意一种或几种。

说明书

焦磷酸测序法检测BCR·ABL融合基因的引物对及试剂盒

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种焦磷酸测序法检测BCR-ABL融合基因的引物对，包含所述引物对的试剂盒及该试剂盒的应用。

背景技术

[0002] BCR-ABL融合基因包括BCR-ABL(b2a2)、BCR-ABL(b3a2)、BCR-ABL(e1a2)等多种类型，其中BCR-ABL(b2a2)、BCR-ABL(b3a2)常见于慢性粒细胞白血病(CML)中，而BCR-ABL(e1a2)是急性淋巴细胞性白血病(ALL)中常见的融合基因。

[0003] 当前国内外广泛使用的分子生物学检测BCR-ABL融合基因的方法中，荧光原位杂交技术(FISH)只能进行定性检测、操作复杂；荧光定量PCR存在着检测通量的局限性，所以都还不能真正满足临床诊断检测的需要。传统的固相生物芯片(Biochip)或基因芯片技术存在着可重复性差、灵敏度不够好以及操作繁琐的突出弱点。

[0004] 焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)是新一代DNA序列分析技术，具备同时对大量样品进行测序分析的能力，为高通量、低成本、快速、直观地进行核苷酸分析和临床检验提供了非常理想的技术操作平台。

发明内容

[0005] 发明目的：针对现有技术中存在的技术问题，本发明提出一种焦磷酸测序法检测BCR-ABL融合基因的试剂盒，可以同时检测BCR-ABL(b3a2)、BCR-ABL(b2a2)和BCR-ABL(e1a2)3种融合基因，具有高灵敏度、高特异性、高准确度、检测迅速等优点。

[0006] 技术方案：为实现上述技术目的，本发明提出了一种焦磷酸测序法检测BCR-ABL融合基因的引物对，所述的BCR-ABL融合基因为BCR-ABL(b3a2)、BCR-ABL(b2a2)和BCR-ABL(e1a2)中的任意一种或几种，其特征在于，所述引物对包括：

[0007] (1)对于BCR-ABL(b3a2)基因，

[0008] 扩增引物为：

[0009] 上游引物：5′-TATGGGTTTCTGAATGTCATCG-3′，

[0010] 下游引物：5′-AACGAAAAGGTTGGGGTCATT-3′，

[0011] 其中下游引物的5′端进行生物素标记；

[0012] 测序引物为：

[0013] 5′-CACTGGATTTAAGCAGAGTT-3′；

[0014] (2)对于BCR-ABL(b2a2)基因：

[0015] 扩增引物：

[0016] 上游引物：5′-CGCAACGGCAAGAGTTACAC-3′，

[0017] 下游引物：5′-AGCGGCTTCACTCAGACCCT-3′，

[0018] 其中下游引物的5′端进行生物素标记；

[0019] 测序引物：

[0020] 5′-CTGACCATCAATAAGGAA-3′

[0021] (3)BCR-ABL(e1a2)：

[0022] 扩增引物：

[0023] 上游引物：5′-AACTCGCAACAGTCCTTCGAC-3′，

[0024] 下游引物：5′-AGCGGCTTCACTCAGACCCT-3′，

[0025] 其中下游引物的5′端进行生物素标记；

[0026] 测序引物：

[0027] 5′-CCTTCCATGGAGACG-3′；

[0028] 本发明进一步提出了一种焦磷酸测序法检测BCR-ABL融合基因的试剂盒，所述的BCR-ABL融合基因为BCR-ABL(b3a2)、BCR-ABL(b2a2)和BCR-ABL(e1a2)中的任意一种或几种，其特征在于，所述试剂盒包含质控品和如下引物：

[0029] (1)BCR-ABL(b3a2)：

[0030] 扩增引物：

[0031] 上游引物：5′-TATGGGTTTCTGAATGTCATCG-3′，

[0032] 下游引物：5′-AACGAAAAGGTTGGGGTCATT-3′，

[0033] 其中下游引物的5′端进行生物素标记；

[0034] 测序引物：

[0035] 5′-CACTGGATTTAAGCAGAGTT-3′；

[0036] (2)BCR-ABL(b2a2)：

[0037] 扩增引物：

[0038] 上游引物：5′-CGCAACGGCAAGAGTTACAC-3′，

[0039] 下游引物：5′-AGCGGCTTCACTCAGACCCT-3′，

[0040] 其中下游引物的5′端进行生物素标记；

[0041] 测序引物：

[0042] 5′-CTGACCATCAATAAGGAA-3′；

[0043] (3)BCR-ABL(e1a2)：

[0044] 扩增引物：

[0045] 上游引物：5′-AACTCGCAACAGTCCTTCGAC-3′，

[0046] 下游引物：5′-AGCGGCTTCACTCAGACCCT-3′，

[0047] 其中下游引物的5′端进行生物素标记；

[0048] 测序引物：

[0049] 5′-CCTTCCATGGAGACG-3′。

[0050] 其中，所述质控品包括阳性对照品和阴性对照品，其中，所述的阳性对照品为含有BCR-ABL(b3a2)、BCR-ABL(b2a2)和BCR-ABL(e1a2)的质粒的混合液，所述的阴性对照品为不含BCR-ABL(b3a2)、BCR-ABL(b2a2)和BCR-ABL(e1a2)的质粒溶液

[0051] 本发明还提出了上述试剂盒在制备检测BCR-ABL融合基因的试剂中的应用，其中，所述的BCR-ABL融合基因为BCR-ABL(b3a2)、BCR-ABL(b2a2)和BCR-ABL(e1a2)中的任意一种或几种。

[0052] 有益效果：与现有技术相比，本发明的焦磷酸测序法检测BCR-ABL融合基因的试剂盒能够实现快速、简便、高效、准确的检测BCR-ABL(b3a2)、BCR-ABL(b2a2)、BCR-ABL(e1a2)融合基因，为制备用于检测BCR-ABL(b3a2)、BCR-ABL(b2a2)、BCR-ABL(e1a2)融合基因的试剂提供了理论基础。

具体实施方式

[0053] 实验材料：

[0054] 引物由invitrogen公司合成；Trizol购自invitrogen公司；逆转录cDNA合成试剂盒购置于Fermentas公司；多重PCR试剂盒购置于QIAGEN公司；焦磷酸测序试剂购置于QIAGEN公司。一种焦磷酸测序法检测BCR-ABL融合基因的试剂盒，包括质控品和如下引物：

[0055] (1)BCR-ABL(b3a2)：

[0056] 扩增引物：

[0057] 上游引物：5′-TATGGGTTTCTGAATGTCATCG-3′，

[0058] 下游引物：5′-AACGAAAAGGTTGGGGTCATT-3′，

[0059] 其中下游引物的5′端进行生物素标记；

[0060] 测序引物：

[0061] 5′-CACTGGATTTAAGCAGAGTT-3′，

[0062] (2)BCR-ABL(b2a2)：

[0063] 扩增引物：

[0064] 上游引物：5′-CGCAACGGCAAGAGTTACAC-3′，

[0065] 下游引物：5′-AGCGGCTTCACTCAGACCCT-3′，

[0066] 其中下游引物的5′端进行生物素标记；

[0067] 测序引物：

[0068] 5′-CTGACCATCAATAAGGAA-3′

[0069] (3)BCR-ABL(e1a2)：

[0070] 扩增引物：

[0071] 上游引物：5′-AACTCGCAACAGTCCTTCGAC-3′，

[0072] 下游引物：5′-AGCGGCTTCACTCAGACCCT-3′，

[0073] 其中下游引物的5′端进行生物素标记；

[0074] 测序引物：

[0075] 5′-CCTTCCATGGAGACG-3′，其中下游引物的5′端进行生物素标记。

[0076] 其中，质控品(质控品DNA)包括阳性对照品和阴性对照品，阳性对照品为含有BCR-ABL(b3a2)、BCR-ABL(b2a2)和BCR-ABL(e1a2)的质粒的混合液，所述的阴性对照品为不含BCR-ABL(b3a2)、BCR-ABL(b2a2)和BCR-ABL(e1a2)的质粒溶液

[0077] 检测方法包括如下步骤：

[0078] (一)RNA提取：

[0079] 取15个临床样本，其中，1-10号样本为慢性粒细胞白血病(CML)患者的临床样本，11-15号样本为急性淋巴细胞性白血病(ALL)患者的临床样本。1-15号患者的临床样本分别按照下面的步骤提取RNA：

[0080] (1)淋巴细胞提取：取新鲜全血2ml加1ml 3wt％柠檬酸钠，混匀后在4℃下3000r/min离心10min，取血球层上浅黄色层即为淋巴细胞，得到淋巴细胞液；

[0081] (2)取1个离心管(经DEPC水处理)加入(1)中的淋巴细胞液150μl，然后加1ml Trizol，室温放置5min，使其充分裂解；

[0082] (3)12,000r/min离心5min，取上清；

[0083] (4)向上清中加入200μl氯仿，剧振荡混匀后室温放置15min；

[0084] (5)4℃12,000g下离心15min；

[0085] (6)吸取上层水相，将水相转移至另一离心管中；

[0086] (7)向水相中加入500μl异丙醇混匀，室温放置5～10min；

[0087] (8)4℃12,000g下离心10min，弃上清，RNA沉于管底；

[0088] (9)向步骤(8)的管中加入1ml 75％(v/v)乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；

[0089] (10)4℃8,000g离心5min，尽量弃上清；

[0090] (11)室温晾干或真空干燥5～10min；

[0091] (12)用50ul RNase-free dH2O溶解RNA样品，55～60℃，5～10min；

[0092] (13)测OD值定量RNA浓度。

[0093] 按照上述步骤，分别获得1-15号样本的mRNA。

[0094] (二)多重逆转录PCR扩增：

[0095] 按照如下方法对上述的1-15号样本的mRNA进行多重逆转录PCR扩增：

[0096] (1)cDNA第一链的合成

[0097] ①取一RNase-free的离心管，置于冰上，建立下列反应体系；

[0098] Total RNA                       5～10μg/3μl

[0099] Oligo(dT)18Primer(0.5μg/μl)    1μl

[0100] RNase-free dH2O                 加至12μl

[0101] 轻轻混匀反应液，用冷冻离心机稍微离心收集管壁上的反应液到管底；

[0102] ②离心管于70℃温育5分钟，之后迅速取出置于冰中冷却，用冷冻离心机稍微离心收集管壁上的反应液到管底；

[0103] ③将离心管放置于冰上，按顺序加入以下反应液；

[0104] 5×reaction buffer           4μl

[0105] RNase Inhibitor(20U/μl)      1μl

[0106] 10mM dNTPs Mix               2μl

[0107] 轻轻混匀反应液，用冷冻离心机稍微离心收集管壁上的反应液到管底；

[0108] ④离心管于37℃温育5分钟；

[0109] ⑤加入1μl RevertAidTM Reverse Transcriptase(200U/μl)，终体积为20μl；

[0110] ⑥离心管于42℃反应60分钟；

[0111] ⑦离心管于70℃加热10分钟终止反应，之后迅速取出置于冰中冷却。

[0112] 如此，合成cDNA第一链，即模板cDNA(Template cDNA)。

[0113] (2)多重PCR

[0114] 采用的是QIAGEN公司的Multiplex PCR试剂盒，体系如下

[0115]

[0116] 其中，2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix中含热启动TaqDNA酶、MgCl2和dNTP Mix；10×Primer mix为包含上述三种融合基因引物对的混合物。

[0117] PCR扩增程序：95℃15min；94℃30s，55℃90s，72℃90s，35个循环；72℃10min；4℃保温。

[0118] 通过上述步骤，获得PCR产物。

[0119] (三)焦磷酸测序

[0120] 首先，用微珠固定PCR产物，其主要是将生物素标记的PCR产物固定到链霉亲和素包被的琼脂糖微珠(Streptavidin Sepharose High Performance)上，包括如下步骤：

[0121] (1)轻摇包被链霉亲和素的琼脂糖微珠，直至获得均质溶液；

[0122] (2)在一个试管中混合链霉亲和素包被的琼脂糖微珠总量(2μl/样品)与结合缓冲液(40μl/样品)，添加超纯水至一定体积，该体积与后续所要添加优化好的生物素标记的PCR产物的体积的总和为80μl/孔；

[0123] (3)将(2)中得到的一定体积的溶液添加至24孔PCR孔板中；

[0124] (4)根据孔板设置，添加5～20μl优化好的生物素标记的PCR产物至PCR孔板的每个孔槽，使其中每孔所含溶液为80μl；

[0125] (5)使用孔板条盖密封PCR孔板，确保孔槽之间没有泄漏；

[0126] (6)使用振荡混合器(1400rpm)不断振荡PCR孔板至少5～10分钟。

[0127] 经过上述步骤，生物素标记的PCR产物被固定到链霉亲和素包被的琼脂糖微珠上。

[0128] 接着，开始真空工作站准备工作，包括如下步骤：

[0129] (1)准备以下试剂：大约50ml 70％(v/v)乙醇；大约40ml变性溶液(QIAGEN公司)；大约50ml 1×洗涤缓冲液(QIAGEN公司))；大约50ml超纯水；大约70ml超纯水；

[0130] (2)打开真空泵：打开真空开关，进行测试试验，以确定过滤探针是否正常工作；

[0131] (3)每次使用真空泵前要用超纯水检测过滤探针的通透性，将事先准备好的装好超纯水的离心管插在PCR装置上，将过滤探针降入超纯水中，超纯水如在20秒内被抽空则表明过滤探针正常，可以使用，反之则需更换过滤探针；

[0132] (4)取下振荡好的PCR孔板，将样品放入PCR装置中，小心降下过滤探针至PCR孔板中，停留15秒；确保溶液全部被吸走，以捕获含有固定模板的微珠；

[0133] (5)将真空装置移至含有70％(v/v)乙醇的第一试剂槽，冲洗过滤探针5秒；

[0134] (6)将真空装置移至含有变性溶液的第二试剂槽，冲洗过滤探针5秒；

[0135] (7)将真空装置移至含有洗涤缓冲液的第三试剂槽，冲洗过滤探针10秒；

[0136] (8)抬高真空装置超过90°垂线5秒，从过滤探针中排液；

[0137] (9)握持真空装置到Q24孔板上，关闭装置上的真空开关并悬空停留5秒，让负压散去；

[0138] (10)通过左右轻摇真空装置，释放珠子至含3种测序引物的孔板中；

[0139] (11)在真空装置关闭的情况下将真空装置转移至含有超纯水的第四试剂槽，振荡10秒；

[0140] (12)降下探针至另一个含超纯水的第五试剂槽中并施加真空，清洗探针，用70ml超纯水冲洗过滤探针；

[0141] (13)抬高真空装置超过90°垂线5秒，从过滤探针中排液；

[0142] (14)关闭真空装置上的开关，并将其置于静止(P)位。

[0143] 如此变完成了真空站的准备工作，接着开始分离DNA单链并将样品释放到PyroMark Q24孔板中，具体地包括如下步骤：

[0144] (1)将PyroMark Q24孔板放置在预热的孔板底座上80℃精确加热2分钟；

[0145] (2)从孔板底座上取下孔板，使样本在室温下至少冷却5分钟。

[0146] 经过上述步骤，样品被杯释放到PyroMark Q24孔板中。接着准备PyroMark Q24试剂，按下述步骤进行：

[0147] (1)打开PyroMark Q24试剂盒并取出含有酶和底物冻干粉的小瓶，以及含有核苷酸的试管；

[0148] (2)按照试剂盒说明书用超纯水溶解并分装酶和底物，所有试剂需恢复室温后再使用；

[0149] (3)依照电脑程序计算出的体积，向试剂仓内加入酶、底物和核苷酸A、T、G、C(试剂仓最多使用30次，试剂仓在使用前必须是干燥的)。

[0150] 准备好PyroMark Q24试剂后，在PyroMark Q24仪器上按下述步骤进行测试：

[0151] (1)打开PyroMark Q24软件，点击new assay(新测试)→new AQ assay(新AQ测试)→在sequence to analyze(待分析序列)中输入突变点序列，点击Generate Dispensation Order(产生分配顺序)，点击保存；

[0152] (2)点击new run(新运行)→Instrument method(仪器方法)→007，然后点击要测序的格子，点击保存至U盘；

[0153] (3)将含有运行文件的U盘插入仪器前面的USB端口中；

[0154] (4)把加热好的孔板放到仪器上；

[0155] (5)将试剂仓(酶、底物和核苷酸)的标签面面向自己放入仪器，打开孔板支座架放入孔板，关闭孔板支座架和仪器盖；

[0156] (6)选择Run(运行)，并按OK；

[0157] (7)在进入Run(运行)后，按select(选择)选择要运行的文件；

[0158] (8)仪器运行结束并确认运行文件已保存至U盘后，按close，取出U盘；

[0159] (9)打开仪器，取出试剂仓，并对其进行反复清洗，废弃孔板；

[0160] (10)当仪器不运行时，从主菜单选择shutdown(关机)并按OK；

[0161] (11)当It is now safe to turn offthe instrument(现在可以安全关机)出现时，即可关闭仪器，电源开关位于仪器后面。

[0162] (四)结果分析：

[0163] 打开Pyromark Q24软件，分析BCR-ABL(b3a2)、BCR-ABL(b2a2)、BCR-ABL(e1a2)融合基因的类型，分析结果如下表：

[0164]

[0165] 结果表明，1-5号患者为BCR-ABL(b2a2)融合基因阳性；6-10号患者为BCR-ABL(b3a2)融合基因阳性；11-15号患者为BCR-ABL(e1a2)融合基因阳性。

[0166] 综上，应用本发明的试剂盒能够实现快速、简便、高效、准确的检测BCR-ABL(b3a2)、BCR-ABL(b2a2)、BCR-ABL(e1a2)融合基因。

[0167] 在阅读了以上关于本发明的陈述内容之后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改或变化，其中包括引物的各种变化，这些等价形式同样归属于本申请所附权利要求书中所限定的范围。