本发明涉及一种使用pH选择性二甲基化标记和一级二级谱结合定量的蛋白质定量方法。包括：选择性二甲基化标记、使用mascot distiller软件对一级谱肽段定量、使用“force-find”程序对二级谱肽段定量。蛋白质样品首先使用胰蛋白酶进行酶解；酶解产物先于酸性条件下在反相捕集柱上进行选择性的N-端氨基二甲基化标记；然后在碱性条件下在反相捕集柱上对肽段侧链氨基进行二甲基化标记；以精氨酸结尾的肽段使用mascot distiller进行定量；以赖氨酸结尾的肽段使用“force-find”程序进行定量。本发明的优点是与传统的基于b,y离子的两端标记二级谱定量方法相比，其操作较为简单，标记效率高，标记选择性好，定量精密度、准确度、覆盖度高。
1.一种蛋白质定量方法，其是使用pH选择性二甲基化标记和一级质谱二级质谱结合定量的蛋白质定量方法，包括：蛋白质的胰蛋白酶酶解产物先在反相柱上于酸性条件下二甲基化标记肽段末端氨基，然后在反相柱上于碱性条件下二甲基化标记肽段侧链氨基；将标记完成的肽段使用B相为80％ACN+0.1％-5％FA+20％H2O洗脱下来进行质谱分析，对质谱分析得到的结果文件进行数据库搜索，使用mascot distiller软件对一级质谱肽段定量、使用“force-find”程序对二级质谱肽段定量；结合一级质谱信息和二级质谱信息对蛋白进行定量分析；具体过程如下：将两份蛋白质样品分别采用胰蛋白酶酶切；酶解产物分别上样到两个C18反相捕集柱上，在pH 2.8～3.2下通入体积浓度4％的CH2O和0.6M的NaBH3CH的混合溶液，使肽段末端的氨基被二甲基化，标记完通入A相除去过量标记试剂，A相为2％ACN+
0.1％FA+98％H2O；然后在pH 7.5～8.0分别通入4％的CD2O和0.6M的NaBH3CH，体积比v/v＝
1:1的混合溶液对肽段侧链氨基进行二甲基化标记；标记完通入A相除去过量标记试剂；通入B相，其中B相为80％ACN+0.1％-5％FA+20％H2O将标记完成的肽段洗脱下来进行后续液质联用分析，液相色谱的分离梯度为90min，质谱采用HCD模式进行离子碎裂；质谱分析所产生的.raw文件使用mascot distiller软件进行搜库分析，搜库结果中以精氨酸结尾的肽段直接使用mascot distiller软件进行定量；以赖氨酸结尾的肽段使用“force-find”程序进行定量。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：在C18捕集柱上进行酸性条件下二甲基标记末端氨基时间为4-10min；碱性条件下二甲基标记侧链氨基的时间为15-20min。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：使用mascot distiller软件对以精氨酸结尾的肽段进行基于一级质谱的定量，对mascot distiller软件所导出的肽段定量结果中，提取出以精氨酸结尾的肽段的结果。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：使用“force-find”程序对以赖氨酸结尾的肽段进行基于二级质谱的定量，“force-find”程序是基于二级质谱上成对的b,y离子的强度信息来进行定量的程序，成对数目4对或6对以上的肽段才给予报告。
一种蛋白质定量方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种使用pH选择性二甲基标记和一级二级谱结合定量的蛋白质定量方法。其操作较为简单，标记效率高，标记选择性好，定量精密度、准确度、覆盖度高。
背景技术
[0002] 定量分析蛋白质组的动态变化，是当前研究蛋白质功能、揭示细胞生物机理、寻找疾病蛋白标记物和药物靶标的迫切需要。在过去的数十年中，基于稳定同位素标记和质谱的蛋白质组定量方法已逐渐取代传统的基于二维凝胶电泳的定量方法。根据用于定量的谱图的不同，可以将基于稳定同位素和质谱的蛋白质组定量方法分为基于一级质谱的定量方法和基于二级质谱的定量方法。
[0003] 基于一级质谱的定量方法是通过比较来自不同样品的轻重标记肽段的一级质谱峰强度或者谱峰面积来获得蛋白的比值信息。它主要包括SILAC、酶促18O标记、ICAT以及二甲基化标记等方法。这些方法都存在如下缺点：1、一级质谱图充满了背景噪音及未归属的谱峰，它们会显著地降低信噪比并限制定量的精度和动态范围；2、来自不同样品的同一肽段经轻重标记后会在一级质谱上会出现成对的两个谱峰，这就大大增加了谱图的复杂程度（Anal Chem 2011;83:6026-33）。
[0004] 相比基于一级质谱的定量方法，基于二级谱的定量方法很好的解决了上述问题，因为采用这种方法，来源于不同样品的轻重标记肽段在一级谱上质荷比相同，在二级谱上出现成对的碎片峰（Anal.Chem.2011,83,4775–4781）。
[0005] 目前，基于二级谱的定量方法主要包括基于低质量端报告离子的iTraq、TMT等方法和基于b,y离子的IPTL、IVTAL、QITL等方法。其中基于b,y离子的方法由于使用的成对离子数更多因而准确度、精密度更好，是近两年兴起的一种受到广泛关注的定量方法。目前，这种方法主要还存在如下缺陷：首先，目前报道的基于b,y离子的二级谱定量方法操作步骤都比较繁琐；其次，目前报道的基于b,y离子的二级谱定量方法定量覆盖度都不高，且存在较严重的低估效应（Chem.Commun.,2012,48,6265-6267）。
[0006] 针对基于b,y离子的二级谱定量方法存在的上述问题，我们开发了一种使用pH选择性二甲基标记和一级二级谱结合定量的蛋白质定量方法。该方法通过优化现有文献报道的成本最低、且操作相对简单的pH选择性二甲基标记方法（Anal.Chem.,2013,85,2478–2485），并将一级二级谱的定量信息进行有机结合，显著降低了操作复杂程度、提高了定量的准确度、精密度和覆盖度。
发明内容
[0007] 本发明发展了一种使用pH选择性二甲基标记和一级二级谱结合定量的蛋白质定量方法，其操作较为简单，标记效率高，标记选择性好，定量精密度、准确度、覆盖度高。
[0008] 为了实现该目的，本发明的技术方案是：
[0009] 1、采用胰蛋白酶酶切蛋白样品，胰蛋白酶能酶切蛋白的精氨酸位点和赖氨酸位点，因此会产生以精氨酸和赖氨酸结尾的肽段。
[0010] 2、将一份酶解后的蛋白样品上样至C18反相捕集柱上，于酸性条件下选择性的对肽段氨基端进行二甲基化标记；使用A相(2%ACN+0.1%FA+98%H2O)冲洗捕集柱后用50mM的磷酸缓冲溶液平衡捕集柱；再于碱性条件下选择性的对酶解产生的赖氨酸上的侧链氨基进行二甲基化标记，最后使用A相(2%ACN+0.1%FA+98%H2O)冲洗捕集柱。
[0011] 3、重复上述步骤对另一份蛋白样品的酶解产物进行标记。
[0012] 4、使用B相(80%ACN+0.1%-5%FA+20%H2O)将标记后的两份蛋白样品洗脱收集下来，出盐蒸干后进行后续的质谱分析。
[0013] 5、对质谱分析得到的结果文件进行数据库搜索，其中鉴定出的以赖氨酸结尾的肽段通过“force-find”程序进行基于二级谱的定量分析；鉴定出的以精氨酸结尾的肽段通过mascot distiller软件进行基于一级谱的定量分析。
[0014] 本发明具有如下优点：
[0015] 1、标记效率高，标记选择性好：使用优化的pH选择性二甲基标记方法，其肽段N端二甲基化和赖氨酸上氨基二甲基化的标记效率和标记选择性都能打到95%以上；
[0016] 2、操作步骤简单：整个标记过程只需要进行两步较为简单的二甲基化标记，无须复杂的除盐蒸干等步骤；
[0017] 3、定量精密度、准确度、覆盖度高：该方法在二级谱和一级谱的定量准确度、精密度上均与文献报道的结果相当，且由于能同时获得基于一级谱和二级谱的定量结果，通过将它们结合能获得更好的定量准确度、精密度以及覆盖度。
附图说明
[0018] 图1本发明方法的总反应流程图
[0019] 图2使用pH选择性二甲基标记对牛血清白蛋白酶解产物进行标记，a:对牛血清白蛋白酶解肽段氨基端进行甲醛标记（+28Da）；b:氨基端甲醛标记的基础上进一步进行肽段侧链氨基氘带甲醛标记（+32Da）；c:对牛血清白蛋白酶解肽段氨基端进行氘带甲醛标记（+32Da）；d:氨基端氘带甲醛标记的基础上进一步进行肽段侧链氨基甲醛标记（+28Da）。
[0020] 图3使用pH选择性二甲基标记对1:1混合的两份酵母酶解产物进行标记，a:1:1混合的两份酵母酶解产物的一张一级质谱图；b:一级质谱图中质荷比为568.34的母离子的二级质谱图。
[0021] 图4 1:1混合的两份酵母酶解产物通过pH选择性二甲基标记和一级二级谱结合定量的蛋白质定量方法所鉴定和定量到的蛋白数目。
具体实施方式
[0022] 实施例1
[0023] 如图1所示，酵母蛋白由胰蛋白酶酶解产生以赖氨酸和精氨酸为羧基端的肽段，其中蛋白质与酶用量的质量比为1/25(w/w)，温度为37℃，pH=7.5，酶解12h。将酶解产物通入C18捕集柱(0.15mm i.d×50mm)，通入2%ACN除盐后。在酸性条件下对肽段的氨基端进行选择性二甲基化标记，其中标记溶液组成为500μL1%醋酸+5μL4%甲醛水溶液+5μL0.6M氰基硼氢化钠溶液(溶于1%醋酸)，流速50μL/min，标记时间10min，标记完成后通入A相(2%ACN+0.1%FA+98%H2O)去除过量标记溶液；再在碱性条件下对肽段的以赖氨酸结尾的羧基端进行标记，其中标记溶液组成为500μL50mM磷酸缓冲液+5μL4%甲醛水溶液+5μL0.6M氰基硼氢化钠溶液(溶于50mM磷酸缓冲液)，流速50μL/min，标记时间10min，标记完成后通入A相(2%ACN+0.1%FA+98%H2O)去除过量标记溶液。最后通入B相(80%ACN+0.1%-5%FA+20%H2O)洗脱并收集标记完成的肽段，进行后续液质联用分析（液相色谱的分离梯度为90min，质谱采用HCD模式进行离子碎裂）。
[0024] 对质谱分析得到的结果.raw文件使用mascot distiller软件进行搜库分析，搜库结果中鉴定出的以赖氨酸结尾的肽段通过“force-find”程序进行基于二级谱的定量分析（对每个鉴定到的以赖氨酸结尾的肽段所对应的二级谱图所匹配的b,y离子对进行比例分析，只有b,y离子对数大于4对的才给出相应谱图的比例结果，谱图比例结果为b,y离子对比例结果的平均值，最后谱图的比例结果取平均值为相应肽段的比例结果）；鉴定出的以精氨酸结尾的肽段通过mascot distiller软件进行基于一级谱的定量分析（在mascot distiller软件所导出肽段比例结果中，筛选出以精氨酸结尾的肽段结果即为相应肽段的最终比例）。
[0025] 实施例2
[0026] 在酸性条件下对肽段的氨基端进行选择性二甲基化标记的标记溶液组成为500μL5mM盐酸+5μL4%甲醛水溶液+5μL0.6M氰基硼氢化钠溶液(溶于5mM盐酸)，其他过程同实施例1。
[0027] 实施例3
[0028] 在碱性条件下对肽段的以赖氨酸结尾的羧基端进行选择性二甲基化标记的标记溶液组成换成500μL50mM NaAc溶液+5μL4%甲醛水溶液+5μL0.6M氰基硼氢化钠溶液(溶于50mM NaAc溶液)，其他过程同实施例1。
[0029] 表1该定量方法的定量准确度、精密度（分析样品为1:1混合的酵母蛋白）[0030]
