分离方法和分离基质转让专利
申请号 : CN201380021764.2
文献号 : CN104245078B
文献日 : 2016-07-06
发明人 : J.汉斯森 , G.罗德里戈 , T.E.塞德曼
申请人 : 通用电气健康护理生物科学股份公司
摘要 :
权利要求 :
1.一种将生物分子与液体中的至少一种其它组分分离的方法,所述方法包括使所述液体与包含固体载体和与所述固体载体结合的聚合物链的分离基质接触的步骤,其中所述聚合物链包含从结构CH2=CH-L-X的第一个单体衍生的单元,其中L是共价键或包含2-6个碳原子的烷基醚或羟基取代的烷基醚链,和X是磺酸根或膦酸根基团,其中所述聚合物链是共聚物链且还包含从第二个非荷电单体衍生的单元,其中第二个非荷电单体是N-乙烯基酰胺。
2.权利要求1的方法,其中所述生物分子是蛋白、肽或核酸。
3.权利要求1或2的方法,其中所述生物分子是免疫球蛋白、免疫球蛋白片段或含免疫球蛋白的蛋白。
4.权利要求3的方法,其中所述生物分子是抗体、抗体片段、抗体缀合物或抗体融合蛋白。
5.权利要求1或2的方法,其中所述至少一种其它组分是蛋白。
6.权利要求5的方法,其中所述蛋白是宿主细胞蛋白;蛋白A;或免疫球蛋白、免疫球蛋白片段或含免疫球蛋白的蛋白的聚集体。
7.权利要求1或2的方法,其中所述液体是来自先前的色谱步骤的洗脱液。
8.权利要求7的方法,其中所述色谱步骤为亲和步骤、离子交换步骤、多峰步骤或疏水相互作用步骤。
9.权利要求1或2的方法,其中所述液体是来自分离基质的流通液。
10.权利要求9的方法,其中所述分离基质是离子交换基质或疏水相互作用基质。
11.权利要求9的方法,其中所述分离基质是多峰基质。
12.权利要求1或2的方法,其中所述生物分子是免疫球蛋白、免疫球蛋白片段或含免疫球蛋白的蛋白,且其中至少1%的所述生物分子呈聚集体的形式。
13.权利要求12的方法,其中所述生物分子是抗体、抗体片段、抗体缀合物或抗体融合蛋白。
14.权利要求12的方法,其中至少5%的所述生物分子呈聚集体的形式。
15.权利要求12的方法,其中至少10%的所述生物分子呈聚集体的形式。
16.权利要求1或2的方法,还包括用洗脱缓冲液从所述分离基质洗脱所述生物分子的步骤。
17.权利要求1或2的方法,还包括用清洗液清洗所述分离基质的步骤。
18.权利要求17的方法,其中所述清洗液是包含至少0.1 mol/l NaOH的碱性清洗液。
19.权利要求17的方法,其中所述清洗液是包含0.5-2 mol/l NaOH的碱性清洗液。
20.权利要求1或2的方法,其中所述第二个非荷电单体选自N-乙烯基吡咯烷酮、N-乙烯基己内酰胺、N-乙烯基甲酰胺和N-乙烯基乙酰胺。
21.权利要求1或2的方法,其中L是共价键或-CH2-O-L’-,其中L’是C2-C4或C3-C4亚烷基链,其任选地被至少一个羟基取代。
22.权利要求1或2的方法,其中所述第一个单体选自乙烯基磺酸盐、乙烯基膦酸盐和烯丙氧基羟基丙基磺酸盐。
23.权利要求1或2的方法,其中在所述共聚物链中,从第一个单体衍生的单元与从第二个单体衍生的单元的摩尔比是0.05至5。
24.权利要求23的方法,其中所述摩尔比为0.10至2。
25.权利要求23的方法,其中所述摩尔比为0.5至2。
26.一种分离基质,其包含固体载体和与所述固体载体结合的共聚物链,其中所述共聚物链包含从以下单体衍生的单元:a) 结构CH2=CH-L-X的第一个单体,其中L是共价键或包含2-6个碳原子的烷基醚或羟基取代的烷基醚链,和X是磺酸根或膦酸根基团;和b) 第二个非荷电单体,
其中所述第二个非荷电单体是N-乙烯基酰胺。
27.权利要求26的分离基质,其中L是共价键或-CH2-O-L’-,其中L’是C2-C4或C3-C4亚烷基链,其任选地被至少一个羟基取代。
28.权利要求26或27的分离基质,其中所述第一个单体选自乙烯基磺酸盐、乙烯基膦酸盐和烯丙氧基羟基丙基磺酸盐。
29.权利要求26或27的分离基质,其中所述第二个非荷电单体选自N-乙烯基吡咯烷酮、N-乙烯基己内酰胺、N-乙烯基甲酰胺和N-乙烯基乙酰胺。
30.权利要求26或27的分离基质,其中在所述共聚物链中,从第一个单体衍生的单元与从第二个单体衍生的单元的摩尔比是0.05至5。
31.权利要求30的分离基质,其中所述摩尔比为0.10至2。
32.权利要求30的分离基质,其中所述摩尔比为0.5至2。
33.权利要求26或27的分离基质,其中所述基质的离子容量是20-300微摩尔/ml。
34.权利要求33的分离基质,其中所述基质的离子容量是20-200微摩尔/ml。
35.权利要求33的分离基质,其中所述基质的离子容量是20-80微摩尔/ml。
36.权利要求26或27的分离基质,其中固体载体包含多羟基聚合物。
37.权利要求36的分离基质,其中所述多羟基聚合物是多糖。
38.权利要求26或27的分离基质,其中固体载体包含琼脂或琼脂糖。
39.权利要求26或27的分离基质,其中固体载体是交联的。
40.权利要求39的分离基质,其中所述固体载体与羟基烷基醚交联。
41.权利要求26或27的分离基质,其中固体载体是多孔的。
42.权利要求41的分离基质,其中所述固体载体呈多孔珠或多孔膜的形式。
43.权利要求26或27的分离基质,其中固体载体具有对应于0.5-0.9的KD值的孔径,所述KD值用Mw 110 kDa的葡聚糖作为探针分子测量。
44.权利要求43的分离基质,其中所述KD值为0.6-0.8。
45.权利要求26或27的分离基质,其中基质具有对应于0.1-0.8的KD值的孔径,所述KD值用Mw 110 kDa的葡聚糖作为探针分子测量。
46.权利要求45的分离基质,其中所述KD值为0.2-0.6。
47.一种制备权利要求26-46中任一项的分离基质的方法,包括以下步骤:a) 提供包含具有可共聚的C=C双键的部分或易于形成游离基的部分的固体载体;
b) 使固体载体与包含第一和第二个单体的混合物接触;和c) 引发基团聚合。
48.权利要求47的方法,其中步骤c)在使得实现以下的条件下进行:形成包含从所述第一和第二个单体衍生的单元的共聚物链,并通过用所述C=C双键的共聚合作用或者通过引发或从易于游离基形成的所述部分的链转移而共价连接至固体载体。
49.权利要求47或48的方法,还包括在步骤a)之前,用包含可共聚的C=C双键的部分或易于形成游离基的部分衍生所述固体载体的步骤。
50.权利要求47或48的方法,其中所述包含可共聚的C=C双键的部分是烯丙基。
51.权利要求50的方法,其中所述部分是烯丙基醚基或烯丙基羟基丙基醚基。
52.权利要求47或48的方法,其中所述易于形成游离基的部分包含i)链转移基团或ii)引发基团。
53.权利要求52的方法,其中所述链转移基团为硫醇基或羟基的α位上的氢。
54.权利要求52的方法,其中所述引发基团为过氧化物、过硫酸盐或偶氮化合物。
55.权利要求52的方法,其中所述引发基团为氢过氧化物。
说明书 :
分离方法和分离基质
需要例如从宿主细胞和可能的细胞碎片、其它宿主细胞蛋白、DNA、RNA和源自发酵或细胞培
养液的任何其它化合物中分离。由于其对目标化合物通用性和灵敏性,在许多当前使用的
生物技术纯化方案中,色谱作为至少一个步骤被包括在内。术语色谱包括一系列密切相关
的分离方法,所有这些方法均基于使两个相互不混溶的相接触这一原理。更具体地,目标化
合物被引入流动相,所述流动相与固定相接触。然后目标化合物在其被流动相携带通过系
统时,将经历固定相和流动相之间的一系列相互作用。相互作用利用样品组分的物理或化
学特性的差异。
色谱方法通常按照分离化合物所利用的相互作用原理命名。例如,离子交换色谱是基于电
荷-电荷的相互作用;疏水相互作用色谱(HIC)利用疏水相互作用;和亲和色谱是基于特异
性的生物亲和性。
子交换剂(其中荷负电的色谱基质用于吸附荷正电的目标化合物)和阴离子交换剂(其中荷
正电的色谱基质用于吸附荷负电的目标化合物)。术语"强"离子交换剂用于在广泛的pH间
隔内荷电的离子交换剂,而"弱"离子交换剂在某些pH值下是可荷电的。一种通常使用的强
阳离子交换剂包括磺酸根(sulphonate)配体,称为S基团。在某些情况下,这样的阳离子交
换剂按照由官能团及其连接于载体的接头形成的基团命名;例如SP阳离子交换剂,其中S基
团通过丙基连接于载体。
EP2412435)描述了荷电单体如何才能接枝聚合到支持材料上,以形成其中配体存在于与支
持物共价连接的悬挂接枝聚合物链(pendant graft polymer chains)上的离子交换剂。然
而,特别是在生物加工领域,对分离基质的需求不断增加,因此存在着对进一步开发基质,
特别是关于提供改进的选择性和容量以及在碱性清洗过程中的稳定性的基质的需求。
的免疫球蛋白之间的高选择性一起获得。另外的优点是在升高的离子强度下的高结合容
量、快速的物质传输/结合动力学和高碱稳定性 –允许在基质必须被更换之前进行很多次
循环 – 可得以实现。
乙基酯(HEMA)和乙烯基膦酸(VPA)。
体结合的聚合物链,其中聚合物链包含从结构CH2=CH-L-X的第一个单体衍生的单元,其中L
是 i) 共价键或 ii) 烷基醚或羟基取代的烷基醚链(其任何一个包含2-6个碳原子),和X
是磺酸根或膦酸根基团。聚合物链中的这些单元的结构是:
基质和液体混合在容器中的分批吸附进行。分离可通过将生物分子或其它组分吸附到基质
上而发生。接触步骤中的pH可例如是4-7,例如4.5-6或4.75-5.5,并且离子强度可以是例如
10-100 mM,例如20-60 mM。液体可以是含水缓冲液并可包含缓冲组分例如乙酸盐、磷酸盐、
柠檬酸盐、琥珀酸盐等和诸如碱金属氯化物、碱金属硫酸盐、硫酸铵等盐。它也可包含添加
剂如去垢剂、氨基酸、水-可混溶的溶剂、水溶性聚合物、离液剂、cosmotrope等。
而肽的实例可以是胰岛素等。生物分子也可以是疫苗抗原,包括病毒颗粒、病毒蛋白、细菌
多糖和细菌蛋白。
白融合蛋白是一类重要的生物药物,本发明的方法特别适合于从这些物质中除去污染物。
体、三聚体和/或更高级的多聚体。本发明的方法特别适合于蛋白-蛋白分离,例如从免疫球
蛋白和相关物质中除去宿主细胞蛋白、蛋白A、聚集体、荷电变体(charge variants)、错折
叠蛋白等。这些污染物的有效清除在生物药物的生产中是必需的,因为它们可引起免疫原
性和其它不需要的副作用。其它组分还可以是例如在细胞培养期间加入的抗生素、内毒素、
病毒或溶剂和为灭活病毒所加入的去垢剂。其它组分还可以是用于形成缀合物的反应物,
例如,抗体-药物缀合物的药物组分或在PEG-化蛋白的情况下的PEG。
合于除去存在于例如从先前的色谱步骤洗脱的蛋白溶液中残留的污染物。先前的步骤可以
是捕获步骤例如蛋白A或蛋白L色谱步骤,并且残余的污染物可以是例如宿主细胞蛋白、聚
集体、沥出的蛋白A或L或病毒。
中的蛋白A步骤后应用的阴离子交换或多峰阴离子交换流通步骤之后应用。
至少10%的所述生物分子呈聚集体的形式,例如二聚体、三聚体和更高级的多聚体。方法特
别用于除去聚集体,所述聚集体可在细胞培养期间或者在处理期间产生,例如当免疫球蛋
白在洗脱蛋白A柱期间或在病毒灭活期间暴露于低pH时产生。
之后用洗脱缓冲液洗脱。其它组分可在流通液中通过基质,或它们可结合至某种程度并分
别地从生物分子中洗脱。可随着缓冲液组成或pH的梯级变化、一系列的梯级变化或者通过
缓冲液组成或pH的梯度进行洗脱。所述方法还可包括使用洗涤缓冲液的洗涤步骤。该步骤
用于除去非结合或松散结合的其它组分的目的,并可例如在接触步骤之后和洗脱步骤之前
应用。洗脱和洗涤缓冲液可包含缓冲物质如乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、三羟甲基
氨基甲烷(Tris)、甘氨酸等。它们还可包含中性盐、易溶盐、去垢剂、氨基酸、水-可混溶的溶
剂、水溶性聚合物、离液剂、cosmotrope和其它添加剂。
buffer)除去吸附的其它组分。
0.5-2 mol/l NaOH或KOH溶液,例如约1 M NaOH的水溶液。除了碱金属氢氧化物外,该溶液
还可包含离液剂、溶剂、去垢剂、盐等以改进清洗效率。本发明方法的特定优点是可使用碱
性清洗而不引起对基质的降解。包括用碱性清洗液(例如1 M NaOH)清洗步骤的方法可重复
许多次,例如至少10、至少50、10-100或50-100次。这允许在很多次循环中重复使用基质,这
对于良好的处理经济性是重要的。
接膜过滤,例如超滤。
具有非-荷电单元的一个优点是可控制链的局部电荷密度,其能够改进结合容量和选择性。
通过掺入非-荷电的共聚单体,还可能在基质的生产期间增加缓慢聚合的荷电共聚单体的
掺入。
CH2=CH-L-X单体组合提供有利的链结构,并且聚合物为对碱性降解有高度抗性的。
合物的主链),并且当L是-CH2-O-L’-时,单体将是烯丙基醚。这些结构不含羰基且赋予聚合
物优越的碱稳定性。还显示形成的聚合物有利于提供好的选择性和结合容量。
个单体是N-乙烯基酰胺,例如N-乙烯基吡咯烷酮。这些单体的组合给出特别的碱稳定聚合
物,以及单体显示出有利的共聚合行为,以致可以制备具有合适量的接枝聚合物和合适的
离子容量的基质。
规结构,但它们也可以是交替或分段的。本发明的基质的实施方案适用于上述分离方法。
选择性。
乙烯基内酰胺)。
或为乙烯基磺酸盐,和第二个单体是N-乙烯基酰胺,例如N-乙烯基吡咯烷酮。这些单体的组
合给出特别对碱稳定的聚合物,和所述单体显示出有利的共聚合行为,以致可以制备具有
合适量的接枝聚合物、接枝聚合物的合适组成和合适的离子容量的基质。这些共聚物的碱
稳定性高于如例如在US20100181254中所描述的丙烯酰胺或(甲基)丙烯酸酯聚合物,并且
虽然单体像乙烯基磺酸盐通常被认为是缓慢聚合或难以聚合的,但发明人的结果表明接枝
聚合的性能是令人吃惊地良好且它们有效地与例如乙烯基吡咯烷酮共聚,以生产具有高的
碱稳定性和好的色谱性质的接枝基质。
且它也可从离子容量和共聚物链的总含量计算出(见下文)。如果硫或磷仅存在于第一个单
体中和氮仅存在于第二个单体中,摩尔比也可从元素分析数据确定。
磷仅存在于酸性基团中,离子容量也可从元素分析数据计算。约30-70微摩尔/ml的离子容
量可提供高蛋白容量和高单体-聚集选择性二者,但也可能使用最高可达至少200微摩尔/
ml的离子容量,特别是当需要高蛋白容量时。
为在制备基质期间的重量添加(weight add-on)。相对低的含量(例如2-20 mg/ml)对于单
体-聚合的选择性是有利的,而较高的含量(例如20-80 mg/ml)可提供更高的蛋白结合容
量。
乙烯基醇、聚缩水甘油等。多羟基聚合物载体的优点包括它们的亲水性(其可消除或减少非
特异性相互作用)、它们的碱稳定性和它们形成具有大的表面区域和快速的物质传输的多
孔结构的倾向性。
体为市售可获得的,例如以Sepharose和Capto的商标名(GE Healthcare Bio-Sciences
AB)且它们可例如如在Hjertén等(Biochim Biophys Acta 79, 393-398 (1964))中所述制
备。载体的孔径可受生产它们所用的琼脂糖溶液浓度控制,并通过交联条件控制至某种程
度。在乳液(或气溶胶)形成期间,通过输入机械能可控制珠的粒度,并且通过筛分制备多分
散性珠材料的部分也是可能的。
相互作用。这样的交联可例如通过使用表卤醇(epihalohydrins)、双环氧化物
(diepoxides)和烯丙基卤化物/烯丙基缩水甘油醚作为交联剂产生。例如通过在US6602990
或US7396467中描述的方法制备的高刚性交联琼脂糖可有利地用作固体载体。
性。在溶胀材料如琼脂糖和其它多糖凝胶中,孔径最好通过逆尺寸排阻(inverse size
exclusion)色谱方法估算,其中测定探针分子例如Mw 110 kDa的葡聚糖可达到的体积分数
Kd。这种方法在例如L Hagel等: J Chromatogr A 743, 33-42 (1996)中描述。
且由于所述材料经接枝加入到固体载体中,因此在大多数情况下,基质(含接枝聚合物)的
Kd值将低于在接枝前的固体载体的对应值。0.2和0.6之间或0.2和0.4之间的Kd值提供良好
的聚集体去除并提供高容量。
何一个可如下述引入。基团聚合的引发可通过照射或者通过使用许多已知的引发系统例如
过氧化物引发剂、偶氮引发剂、过硫酸盐、过氧化氢、铈(IV)盐、光引发剂、氧化还原系统、
ATRP等中的一种的热/化学引发来实现。
形成游离基的部分的链转移而共价连接于固体载体。
与烯丙基化试剂如烯丙基卤化物或烯丙基缩水甘油醚反应而引入。引入C=C双键的方法的
其它实例包括羟基与亲电子试剂如缩水甘油(甲基)丙烯酸酯、乙烯基苄基氯等的反应。易
于形成游离基的部分可以是例如a)引发剂物质,例如氢过氧化物(其通过在氧存在下,经γ
或E-束照射而形成)或偶氮引发剂(通过与例如偶氮双氰基戊酸反应而形成);或b)链转移
基团,例如硫醇基(可例如通过使环氧-活化的载体与二硫醇或硫化物离子反应而引入)。
地在与N-乙烯基酰胺单体例如乙烯基吡咯烷酮的组合中是特别有利的,这是因为总的共聚
合率是完全匹配的。
枝聚合物的量,可控制离子容量。技术人员应认识到,将需要某些常规实验以用给定的起始
原料达到特定值。
实施例
排干的凝胶加入到预称重的用5*20 ml丙酮洗涤的玻璃滤器中。然后将玻璃滤器放入105℃
的烘箱中经24 h,然后测量干重(4位数)。测量一式两份样品。
胶,并当出现干燥表面时,将凝胶吸干另外30 s。然后将1 ml排干的凝胶与20ml蒸馏水一起
加入到40ml烧杯中。然后通过滴定测定1 ml凝胶的氢离子容量。
真空配置的250 ml e-烧瓶中。然后在真空抽吸下,用磁力搅拌器搅拌悬浮液,同时加入饱
和的溴水至悬浮液中。然后在真空抽吸下搅拌混合物以除去过量的溴30 min,然后将混合
物加入到30ml滴定杯中。然后使用硝酸银,滴定该混合物中的溴离子。
至50℃达30分钟。此后,以产生依据表2的AGE/反应物体积比的量加入烯丙基缩水甘油醚
(AGE),并于50℃将反应继续过夜17小时。然后过滤出珠并用乙醇(5 x 300 ml)洗涤,然后
用蒸馏水(5 x 300ml)洗涤。
检测器(RID-bA)连接于AKTATM系统以检测葡聚糖样品。采用以下条件:流速:0.2ml/min;流
动相: 0.2M NaCl;样品体积:100微升。依据本领域熟知的方法评价葡聚糖峰。然后将Kd值
如下计算为有效孔隙表面的量度:Kd = (Ve - V0)/(Vc - V0 - V凝胶基质) = (Ve -
V0)/(Vt - V0)。Ve = 洗脱的葡聚糖的保留体积(ml),V0 = 空隙体积(原料葡聚糖空隙标
记的保留) (ml), Vc = 计算的柱体积(床高(cm) x 柱表面积(cm2) ) (ml),Vt = 总液体
体积(NaCl的保留体积) (ml)。
料顶部封闭,然后放入一个加热的震摇设备中,其中小瓶于室温下震摇5min,然后将温度上
升至55℃。聚合反应进行17h过夜,然后将颗粒在玻璃滤器上用8个凝胶体积(GV)的蒸馏水、
8 GV的99.5%乙醇、然后8 GV的水洗涤。
G2* 45 1,75 0,962 55 62
G3 20 2,55 0,962 55 62
G4 13 2,55 0,962 55 70
S50-G1-A25 0.25 0,5 41 22 3 27
S50-G2-A200 2 0,5 41 31 - 75
S50-G3-A25 0,25 0,5 41 19 - 28
S50-G4-A200 2 0,5 41 31 - 76
S67-G1-A450 4,5 0,67 51 44 - 73
S67-G1-A200 2 0,67 51 31 - 47
S67-G1-A100 1 0,67 51 21 - 24
S77-G1-A450 4,5 0,77 64 38 12 60
S77-G1-A200 2 0,77 64 25 6 39
S80-G1-A200 2 0,8 65 31 3 37
测器100系统上,用Unicorn 5.11作为控制软件进行。原型和参照媒介用相同的起始缓冲液
和洗脱缓冲液测试,以获得相同梯度长度和斜率。因此,起始缓冲液(乙酸盐和磷酸盐二者)
补充有10 mM NaCl,以减少可能的非惯例行为。
钟)。将10微升的各样品施用于柱。在ÄKTA探测器10系统上,用Unicorn 5.11作为控制软件
进行分析。
Workstation LIF (Gyros AB)。
量作图时,获得如图2中的曲线,图2描绘了理想化曲线,其中大多数聚集体以高单体得率除
去。实验曲线(在图2中用虚线说明)一般将显示,原型的累计得率越低和选择性越好,对于
各个累计聚集体值的累计得率值将越高。在呈现的选择性曲线中,从Fractogel® EMD SE
Hicap (Merck)衍生的数据已被用作参照曲线。该阳离子交换基质的磺基乙基位于接枝聚
合物链上,并且该基质被推荐用于去除抗体处理中的聚集体。
Capto® SP ImpRes (GE Healthcare)和Fractogel® EMD SE Hicap (Merck)。在较高pH下
单体与聚集体的分离是更佳的。而且,第三个峰,被认为是由沉淀的抗体组成,在pH 5.25时
几乎不存在。因此,所有的媒介从50 mM乙酸钠 + 10 mM NaCl (pH 5.25)至50 mM乙酸钠 +
500 mM NaCl (pH 5.25)的梯度液中运行。包括NaCl以减少/排除非惯例行为。
可接受的标准为0.8和1.5之间的不对称值。
280 nm的色谱计算DBC (Qb 10%)。
S50-G1-A50 81
S50-G1-A25 60
S50-G2-A200 70
S50-G3-A25 86
S50-G4-A200 121
S67-G1-A450 138
S67-G1-A200 125
S67-G1-A100 70
S77-G1-A450 124
S77-G1-A200 96
S80-G1-A200 90
Fractogel EMD SE Hicap 119
(trade-off )。基质孔径的增加具有正面效果,并且用具有对Mw 110 kDa的葡聚糖的0.67-
0.80的Kd的载体获得特别好的结果。
具有对应于Mw 110 kDa的葡聚糖的0.63 Kd值的孔径。依据在US6420028中描述的方法对所
述珠进行羟基化,依据以上的方法烯丙基化,得到2的AGE比率并且最后依据配方G4用乙烯
基吡咯烷酮(VP)和乙烯基磺酸(VSA)接枝,得到66微摩尔/ml的离子容量。对这些珠的聚集
体去除结果示于图11和12。
起加入到烧瓶中。于65℃开始聚合并搅拌约17h。用蒸馏水充分洗涤凝胶。
最后一次平衡后,用离心除去缓冲液。
280、290和310 nm)的吸光度。校准曲线通过稀释起始溶液之一制得。每mL凝胶结合的样品
的量使用辅助软件计算。
入到烧瓶中。通过于65℃震摇约17h开始聚合。然后用蒸馏水充分洗涤凝胶。合成条件、接枝
聚合物的量和离子容量列出于表7中,并且多克隆IgG对原型的静态结合容量列出于表8中。
后放入一个加热的震摇设备中,其中小瓶于室温下震摇5min,然后将温度上升至55℃。聚合
反应进行17h过夜,然后将颗粒放置在玻璃滤器上,用8 x凝胶体积的蒸馏水、8 x凝胶体积
的99.5%乙醇、然后8 x凝胶体积的水洗涤。合成条件、接枝聚合物的量和离子容量列出于表
9中,并且多克隆IgG对原型的静态结合容量列出于表10中。
C,这用在图13 a)所示的参照媒介SP Sepharose HP (GE Healthcare)是不可能的。原型
VPA2给出与VPA1极其相似的选择性。在选择性试验中,注入试验蛋白质溶菌酶、细胞色素C
和核糖核酸酶A的混合物并用盐梯度液洗脱。单克隆抗体也单独注入并在相同的条件下洗
脱。
可专利性范围由权利要求书限定,并可包括本领域技术人员想到的其它实施例。如果这样
的其它实施例具有不同于权利要求书的文字语言的结构要素,或如果它们包括与权利要求
书的文字语言无实质性差别的等效结构要素,意欲使它们在权利要求书的范围内。应该注
意到,可合并来自不同的实施方案和方面的特征,以建立进一步的实施方案。