抗人死亡受体5胞外区的人源化单克隆抗体

摘要

本发明提供了抗人死亡受体5(DR5)胞外区的人源化单克隆抗体，其包括与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列同一性至少为90％的轻链可变区氨基酸序列，与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列同一性至少为90％的重链可变区氨基酸序列，以及人抗体功能IgG1的恒定区。本发明还提供了所属人源化单克隆抗体的编码核苷酸序列，重组真核表达载体，以及所述抗体的生产方法，其组合物以及用途。本发明所述的人源化单克隆抗体在体内外对多种肿瘤细胞具有特异性的凋亡诱导活性，可单独或与DR5的天然配体肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体或其它药物联合使用，用于多种肿瘤和与DR5高表达相关的疾病的治疗。

权利要求

1.一种抗人死亡受体5胞外区的人源化单克隆抗体，其包括轻链可变区与重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO：1，以及所述重链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO：2。

2.根据权利要求1所述的抗人死亡受体5胞外区的人源化单克隆抗体，其中所述人源化单克隆抗体的重链恒定区为人抗体IgG1的恒定区，以及轻链恒定区为人抗体的κ链。

3.根据权利要求1所述的抗人死亡受体5胞外区的人源化单克隆抗体，其重链和轻链的氨基酸序列分别是SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19。

4.根据权利要求1所述的抗人死亡受体5胞外区的人源化单克隆抗体，其重链和轻链的氨基酸序列分别是SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21。

5.根据权利要求1所述的抗人死亡受体5胞外区的人源化单克隆抗体，其重链和轻链的氨基酸序列分别是SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23。

6.一种编码核苷酸，其编码权利要求1至5中任一项所述的抗人死亡受体5胞外区的人源化单克隆抗体。

7.根据权利要求6所述的编码核苷酸，所述编码核苷酸在分别编码重链和轻链的核苷酸之间还包含编码Furin/2A肽的核苷酸。

8.根据权利要求6所述的编码核苷酸，所述编码核苷酸编码SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列。

9.一种重组真核表达载体，其稳定表达权利要求1至5中任一项所述的抗人死亡受体5胞外区的人源化单克隆抗体，其中权利要求7所限定的编码核苷酸有效地连接到真核表达载体中以进行表达。

10.根据权利要求9所述的重组真核表达载体，所述重组真核表达载体带有CAG强启动子和二氢叶酸还原酶筛选标记。

11.根据权利要求9所述的重组真核表达载体，所述真核表达载体为质粒pcDNA3。

12.一种制备权利要求1至5中任一项所述的抗人死亡受体5胞外区的人源化单克隆抗体的方法，其包括以下步骤：A)用权利要求10所述的重组真核表达载体转染HEK293细胞；

B)用特异性的亲和层析法对所表达的人源化单克隆抗体进行纯化。

13.一种组合物，其由以下组成：

权利要求1至5中任一项所述的抗人死亡受体5胞外区的人源化单克隆抗体，以及TRAIL或抗肿瘤药物。

14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述的抗肿瘤药物是表柔比星。

15.选自以下的任一项在制备治疗肿瘤的药物中的用途：权利要求1至5中任一项所述的抗人死亡受体5胞外区的人源化单克隆抗体、和权利要求13所述的组合物；

其中，所述的肿瘤为白血病、肝癌、结肠癌或肺癌。

说明书

抗人死亡受体5胞外区的人源化单克隆抗体

技术领域

[0001] 本发明涉及一种抗人死亡受体5胞外区的人源化单克隆抗体、其编码核苷酸序列、高效表达该人源化单克隆抗体的重组真核表达载体、制备所述人源化单克隆抗体的方法、所述人源化单克隆抗体及其组合物的用途。

背景技术

[0002] 发现于1995年的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，简称TRAIL或Apo2L或TNFSF10)，定位于3号染色体的3q26，属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员，是由281个氨基酸组成的II型跨膜糖蛋白。其C末端在胞外，具有TNF家族的同源性序列。TRAIL受体2(简称TRAIL-R2或死亡受体5或DR5)广泛表达于多种肿瘤细胞表面，而不表达或较少表达于正常细胞表面，其胞外区包含其天然配体TRAIL结合区，胞内区包含死亡结构域(death domain)。DR5与TRAIL或其它激动剂结合后可发生同源三聚化，其死亡结构域募集胞内相关蛋白形成死亡诱导信号复合体(death-inducing signal complex，DISC)，激发下游细胞死亡信号转导，从而特异性地诱导肿瘤细胞死亡。前期研究证明，鼠抗人DR5的激动性单克隆抗体AD5-10能够诱导体外培养的多种肿瘤细胞死亡，在体内高效抑制裸鼠体内人移植瘤的形成和生长，对正常组织和细胞没有毒性(Guo Y et al.，A novel anti-human DR5 monoclonal antibody with tumoricidal activity induces caspase-dependent and caspase-independent cell death.J Biol Chem 2005；280(51)：41940-52；WO2006/017961，ZL200410070093.1)，显示了良好的临床应用前景。但是，鼠源单克隆抗体作为异种免疫球蛋白，应用于人体可被人免疫系统识别而产生人抗鼠抗体(human anti-mouse antibody，HAMA)反应，削弱其治疗效果，并可能对人体器官产生损伤。因此，将鼠源单克隆抗体进行人源化改造，在保持其亲和力和特异性的基础上降低其对人体的免疫原性，是将所述鼠源抗体成功应用于人类疾病治疗的重要途径。

[0003] 第一代抗体的人源化改造是将鼠源抗体的可变区和人源抗体的恒定区相连接，组成人-鼠嵌合抗体。由于嵌合抗体的可变区和恒定区在空间结构上相对独立，虽可较好地保持原鼠源抗体的亲和力，但完整的鼠源抗体可变区仍可能引起HAMA反应。在嵌合抗体的基础上，进一步采用互补决定区(complementarity-determining region，CDR)移植技术，将鼠源单抗可变区中相对保守的骨架区(frame region，FR)替换成人的FR区，只保留与抗原结合的CDR区，构建功能性的人源化单克隆抗体，可以最大限度地减少鼠源抗体分子的免疫原性。同时，由于FR区不仅起到抗体分子的支持骨架作用，还涉及抗原抗体结合时正确构象的形成。因此，对人源化抗体分子FR区中关键的氨基酸残基还要进行回复突变，以最大限度地保持鼠源抗体的亲和力和特异性。

[0004] 此外，由于在人源化抗体分子中，只有重链和轻链可变区中互补决定区(CDR)和框架区(FR)的数个氨基酸残基来源于所免疫动物的种属，其余部分则全来自于人类的同型抗体，可以在保持鼠源单抗特异性和亲和力的基础上，最大限度地减少人抗鼠抗体反应，延长其在体内的半衰期，改善其药代动力学特性。而且，人源化抗体具有抗体依赖的细胞毒反应(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)和补体依赖的细胞毒反应(complement-dependent cellular cytotoxicity，CDCC)等人类抗体的效应功能，更有利于临床应用。

[0005] 哺乳动物细胞表达系统具备完整的转录、翻译和翻译后加工与分泌机制，可以高效产生具有正确的折叠、装配、空间构象和良好生物学效应的完整抗体分子，是人源化抗体最理想的表达体系。因此，真核表达载体的构建对于提高人源化抗体的表达水平非常重要。理想的真核表达载体需要强的启动子和适当的筛选标志，既有利于基因本身的扩增，又有利于阳性细胞的筛选。

[0006] 因此，本发明的技术目的在于制备抗人DR5人源化单克隆抗体及其真核表达载体和所述人源化单克隆抗体在治疗多种肿瘤中的应用。

发明内容

[0007] 本发明的技术目的在于提供一种抗人DR5的人源化单克隆抗体。

[0008] 因此，本发明的第一方面涉及一种抗人死亡受体5胞外区的人源化单克隆抗体，其包括与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列同一性至少为90％的轻链可变区氨基酸序列，与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列同一性至少为90％的重链可变区氨基酸序列，和人抗体的恒定区。

[0009] 优选地，所述人源化单克隆抗体的重链恒定区为人抗体IgG1的恒定区，轻链恒定区为人抗体的κ链。

[0010] 优选地，所述人源化单克隆抗体的轻链可变区CDRL1、CDRL2和CDRL3的氨基酸序列分别为：

[0011] CDRL1：RSSQSLVHSNGNTYLH(SEQ ID NO：3)；

[0012] CDRL2：KVSNRFS(SEQ ID NO：4)；

[0013] CDRL3：FQSTHVPHT(SEQ ID NO：5)；和/或

[0014] 所述人源化单克隆抗体的重链可变区CDRH1、CDRH2和CDRH3的氨基酸序列分别为：

[0015] CDRH1：DFSMN(SEQ IDNO：6)；

[0016] CDRH2：WINTETGEPTYADDFKG(SEQ ID NO：7)；

[0017] CDRH3：IDY(SEQ ID NO：8)。

[0018] 优选地，所述人源化单克隆抗体的轻链可变区的骨架区FRL1、FRL2、FRL3和FRL4的氨基酸序列分别为：

[0019] FRL1：DaVMTQSPLSLPVTPGEPASISC，其中氨基酸a代表I或V(SEQ ID NO：9)；

[0020] FRL2：WYLQKPGQSPQLLIY(SEQ ID NO：10)；

[0021] FRL3：GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYbC，其中氨基酸b代表Y或F(SEQ ID NO：11)；

[0022] FRL3：FGQGTKLEIKR(SEQ ID NO：12)；和/或

[0023] 所述人源化抗体的重链可变区的骨架区FRH1、FRH2、FRH3和FRH4的氨基酸序列分别为：

[0024] FRH1：cdQLVQSGeELKKPGASVKVSCKASGYTFT，其中氨基酸c代表Q或E，氨基酸d代表V或I，氨基酸e代表S或P(SEQ ID NO：13)；

[0025] FRH2：WVRQAPGQGLfWMG，其中氨基酸f代表E或K(SEQ ID NO：14)；

[0026] FRH3：RFghSiDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYjCkR，其中氨基酸g代表V或A，氨基酸h代表F或L，氨基酸i代表L或M，氨基酸j代表Y或F，氨基酸k代表A或V(SEQ ID NO：15)；

[0027] FRH4：WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：16)。

[0028] 优选地，所述人源化单克隆抗体包括与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列同一性至少为91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％的轻链可变区氨基酸序列，和与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列同一性至少为91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％的重链可变区氨基酸序列。优选地，所述人源化单克隆抗体的序列如SEQ ID NO：17所示。

[0029] 优选地，所述人源化单克隆抗体选自AD10、AD14或AD15，其中AD10的重链和轻链氨基酸序列分别如SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19所示，AD14的重链和轻链氨基酸序列分别如SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21所示，AD15的重链和轻链氨基酸序列分别如SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23所示。

[0030] 本发明的第二方面涉及一种如第一方面所述的抗人死亡受体5胞外区的人源化单克隆抗体的编码核苷酸序列，优选地，所述编码核苷酸序列分别是在编码重链可变区、恒定区以及轻链可变区、恒定区组成的人源化单克隆抗体的重链和轻链的核苷酸序列之间加入具有自我剪切功能的Furin/2A肽的编码序列，优选地，所述编码核苷酸序列编码的人源化单克隆抗体的重链、Furin/2A肽和轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示。

[0031] 本发明的第三方面涉及一种稳定表达上述第一方面所述的抗人死亡受体5胞外区的人源化单克隆抗体的重组真核表达载体，其中上述第二方面所述的人源化单克隆抗体的编码核苷酸序列被有效地连接到真核表达载体中以进行表达，优选地，所述重组真核表达载体带有CAG强启动子(a cytomegalovirus immediate early enhancer and a chicken beta-actin promoter)和二氢叶酸还原酶(dhfr)筛选标记，优选地，所述真核表达载体质粒为pcDNA3。

[0032] 本发明的第四方面涉及一种制备如第一方面所述的抗人死亡受体5胞外区的人源化单克隆抗体的方法，其包括以下步骤：

[0033] A)用如第三方面所述的重组真核表达载体转染HEK293细胞；

[0034] B)用特异性的亲和层析法对所表达的人源化单克隆抗体进行纯化。

[0035] 本发明的第五方面涉及一种由活性成分为如第一方面所述的抗人死亡受体5胞外区的人源化单克隆抗体与TRAIL或其它抗肿瘤药物组成的组合物，优选地，所述抗肿瘤药物是表柔比星(epirubicin)。

[0036] 本发明的第六方面涉及一种如第一方面所述的抗人死亡受体5胞外区的人源化单克隆抗体、如第二方面所述的第一方面所述的抗人死亡受体5胞外区的人源化单克隆抗体的编码核苷酸序列、如第三方面所述的稳定表达第一方面所述的抗人死亡受体5胞外区的人源化单克隆抗体的重组真核表达载体或根据第五方面所述的由活性成分为如第一方面所述的抗人死亡受体5胞外区的人源化单克隆抗体与其它化疗药物组成的组合物在制备治疗肿瘤的药物中的用途，优选地，所述肿瘤为白血病、肝癌、结肠癌、肺癌或卵巢癌。

[0037] 换言之，为了完成本发明的目的，本发明提供一种人源化单克隆抗体，其轻链和重链可变区的氨基酸序列包括与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列至少90％相同的轻链可变区(VL)氨基酸序列，优选地，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％相同的轻链可变区(VL)氨基酸序列，和与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列至少90％相同的重链可变区(VH)氨基酸序列，优选地，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％相同的重链可变区(VL)氨基酸序列。

[0038] 所述人源化单克隆抗体的轻链可变区CDRL1、CDRL2和CDRL3的氨基酸序列分别为：

[0039] CDRL1(24位到39位氨基酸)：RSSQSLVHSNGNTYLH(SEQ ID NO：3)，

[0040] CDRL2(55位到61位氨基酸)：KVSNRFS(SEQ ID NO：4)，

[0041] CDRL3(94位到102位氨基酸)：FQSTHVPHT(SEQ ID NO：5)，

[0042] 所述人源化单克隆抗体的重链可变区CDRH1、CDRH2和CDRH3的氨基酸序列分别为：

[0043] CDRH1(31位到35位氨基酸)：DFSMN(SEQ ID NO：6)，

[0044] CDRH2(50位到66位氨基酸)：WINTETGEPTYADDFKG(SEQ ID NO：7)，

[0045] CDRH3(99位到101位氨基酸)：IDY(SEQ ID NO：8)。

[0046] 所述人源化单克隆抗体的轻链可变区的骨架区FRL1、FRL2、FRL3和FR4的氨基酸序列分别为：

[0047] FRL1的1位到23位氨基酸：DaVMTQSPLSLPVTPGEPASISC，其中氨基酸a代表I或V(SEQ ID NO：9)；

[0048] FRL2的40位到54位氨基酸：WYLQKPGQSPQLLIY(SEQ ID NO：10)；

[0049] FRL3的62位到93位氨基酸：GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYbC，其中氨基酸b代表Y或F(SEQ ID NO：11)；

[0050] FRL3的103位到113位氨基酸：FGQGTKLEIKR(SEQ ID NO：12)；和/或

[0051] 所述人源化单克隆抗体的重链可变区的骨架区FRH1、FRH2、FRH3和FRH4的氨基酸序列分别为：

[0052] FRH1的1位到30位氨基酸：cdQLVQSGeELKKPGASVKVSCKA SGYTFT，其中氨基酸c代表Q或E，氨基酸d代表V或I，氨基酸e代表S或P(SEQ ID NO：13)；

[0053] FRH2的36位到54位氨基酸：WVRQAPGQGLfWMG，其中氨基酸f代表E或K(SEQ ID NO：14)；

[0054] FRH3的67位到98位氨基酸：RFghSiDTSVSTAYLQISSLKAEDTA VYjCkR，其中氨基酸g代表V或A，氨基酸h代表F或L，氨基酸i代表L或M，氨基酸j代表Y或F，氨基酸k代表A或V(SEQ ID NO：15)；

[0055] FRH4的102位到112位氨基酸：WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：16)。

[0056] 本发明还提供一种抗DR5胞外区的人源化单克隆抗体的制备方法，该人源化单克隆抗体的轻链和重链可变区的氨基酸序列包括SEQ ID NO：1的轻链可变区(VL)的氨基酸序列和SEQ ID NO：2的重链可变区(VH)的氨基酸序列，其轻链恒定区为人抗体的κ链，重链恒定区亚型为人IgG1。该制备方法包括以下步骤：通过PCR和合成引物拼接PCR分别得到人源化单克隆抗体的重链和轻链可变区cDNA片段，利用同源重组将所得到的可变区cDNA片段通过同源重组到pCP载体中，分别与人IgG1重链恒定区和κ链连接后，再用重叠PCR将人源化单克隆抗体的重链和轻链相连接，并在重链和轻链之间加入具有自我剪切功能的Furin/2A肽的编码序列。

[0057] 以pcDNA3为原始载体，将上述人源化单克隆抗体的基因克隆到此载体，构建一个新的含有CAG启动子和dhff筛选标记的抗人DR5人源化单克隆抗体的真核表达载体。本发明获得的新的表达载体，含有具有自我剪切功能的Furin/2A肽的编码序列，并将人源化单克隆抗体的重链和轻链连接在一个开放阅读框内。具体而言，所述真核表达载体带有CAG强启动子和dhff筛选标记、来自鼠抗人DR5的单克隆抗体(AD5-10)的重链互补决定区和轻链互补决定区与来自人源抗体的重链骨架区和轻链骨架区分别组成的重链可变区和轻链可变区的编码序列、人源IgG1重链恒定区和轻链恒定区κ链的编码序列、以及在重链和轻链之间加入的具有自我剪切功能的Furin/2A肽的编码序列，被有效地连接以高效表达所述的人源化单克隆抗体。优选地，所述鼠抗人DR5的单克隆抗体为AD5-10(Guo Y et al.，A novel anti-human DR5 monoclonal antibody with tumoricidal activity induces caspase-dependent and caspase-independent cell death.J Biol Chem 2005；280(51)：41940-52；WO2006/017961，ZL200410070093.1)。

[0058] 优选地，来自鼠抗人DR5的单克隆抗体AD5-10的重链互补决定区和轻链互补决定区与来自人源抗体的重链骨架区和轻链骨架区分别组成的重链可变区和轻链可变区的编码序列、人IgG1重链恒定区和轻链恒定区κ链、以及在重链(H)和轻链(L)之间加入的具有自我剪切功能的Furin/2A肽(F2A)连接起来的核苷酸序列编码的氨基酸序列(HF2AL)为：

[0059]GSMEFGLSWLFLVAILKGVQCcdQLVQSGeELKKPGASVKVSCKASGYTFTDFSMNWVRQAPGQGLfWMGWINTETGEPTYADDFKGRFghSiDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYjCkRIDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKRKRRAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCDaVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYbCFQSTHVPHTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECZLE(SEQ ID NO：17),

[0060] 其中：斜体的氨基酸序列为F2A，F2A之前的序列为该人源化单克隆抗体的重链，F2A之后的序列为该人源化单克隆抗体的轻链；氨基酸a代表I或V，氨基酸b代表Y或F，氨基酸c代表Q或E，氨基酸d代表V或I，氨基酸e代表S或P，氨基酸f代表E或K，氨基酸g代表V或A，氨基酸代表F或L，氨基酸i代表L或M，氨基酸j代表Y或F，氨基酸k代表A或V。对于上述氨基酸a到k的可选项，其分别代表的是相应的人源抗体的氨基酸或者回复突变回的鼠源抗体的氨基酸。由于这些可选项本身就是抗体框架区的组成氨基酸，因此，虽然由这些可选氨基酸组成的抗体可能会存在活性和/或抗原性的某些差别，但均是本发明所述的抗人DR5人源化单克隆抗体，相互之间无实质性的差别。

[0061] 用抗DR5人源化单克隆抗体的真核表达载体转染HEK293细胞，经亲和层析纯化获得完整的、具有杀伤多种肿瘤细胞活性的抗人DR5人源化单克隆抗体，命名为zaptuzumab。

[0062] 该人源化单克隆抗体和DR5的天然配体TRAIL均可与DR5结合，但其结合位点不同。

[0063] 体外研究表明，该抗DR5人源化单克隆抗体可杀死白血病、肝癌、结肠癌和肺癌等多种肿瘤细胞，杀伤活性呈时间和剂量依赖关系。由于该人源化单克隆抗体通过与DR5结合而发挥其功能，因此，在本发明实施例中证明了其能杀死上述种类的肿瘤细胞后，有理由相信同样高表达DR5的其它恶性肿瘤细胞也可以被杀死，继而实现治疗相应的恶性肿瘤的目的。

[0064] 所述抗DR5人源化单克隆抗体诱导细胞凋亡和自噬性死亡两种不同的细胞死亡形式。

[0065] 体内的研究表明，该抗DR5人源化单克隆抗体能强烈地抑制人结肠癌、肝癌和肺癌等肿瘤细胞在裸鼠体内生长，并且能与TRAIL或表柔比星等抗肿瘤药物联合应用，达到更好的治疗效果。停药后未见明显的反弹现象。组织学分析未见引起小鼠肝脏和肾脏等器官病理性变化。

[0066] 本发明产生的抗DR5人源化单克隆抗体与TRAIL或表柔比星等抗肿瘤药物的组合具有协同杀伤多种肿瘤细胞的作用。

[0067] 本发明还提供本发明所述的人源化单克隆抗体在制备治疗肿瘤药物中的用途。

[0068] 最后，本发明还提供一种所述的人源化单克隆抗体或其至少具有80％同源性的抗体，优选地，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的抗体与药学上可接受的载体重组后获得的重组表达载体在制备治疗肿瘤的抗体基因治疗药物中的应用。

[0069] 由此可见，在本发明中，采用基因工程等现代生物学技术和方法，制备了抗人DR5的人源化单克隆抗体及其真核表载体，进而，将此表达载体转染HEK293细胞，能够大量地表达一种新型的抗DR5的人源化单克隆抗体。在体外，该人源化单克隆抗体具有强烈诱导多种肿瘤细胞凋亡的能力；在体内，该人源化单克隆抗体具有显著抑制人移植瘤细胞在裸鼠体内形成肿瘤和抑制人移植瘤生长的生物学活性；该人源化单克隆抗体可与其它抗癌药物联用，在体内外诱导肿瘤细胞死亡，加强化疗药物的疗效，降低化疗药物的剂量和毒副作用。因此，该人源化单克隆抗体在新型抗肿瘤药物研制与应用中具有重要意义。

[0070] 本发明的优点与效果是获得了前人没有报道的抗DR5人源化单克隆抗体及其真核表达载体。在所述真核表达载体中，所述人源化单克隆抗体的重链和轻链被连接在一个开放阅读框内，能够同时、均衡、匹配地表达人源化单克隆抗体的重链和轻链，并自动组装成功能完整的人源化单克隆抗体分子。

[0071] 该人源化单克隆抗体同DR5结合的位点与TRAIL与DR5结合的位点不同，可与TRAIL及表柔比星等抗肿瘤药物联合作用，协同增强其抗肿瘤的效果。在体外可诱导多种肿瘤细胞凋亡，但对正常细胞无毒副作用。在体内具有强烈的抑制人移植瘤形成和生长的抗肿瘤活性，对正常小鼠的肝脏和肾脏等器官无毒副作用。显示该人源化单克隆抗体可发展为安全、有效的抗肿瘤药物。以编码该人源化单克隆抗体或进一步的人源化改型抗体的核苷酸序列与药学上可接受的载体重组连接获得的重组表达载体也可用于制备治疗肿瘤的抗体基因治疗药物。

[0072] 抗DR5人源化单克隆抗体是利用基因工程技术将鼠源性抗DR5抗体的可变区与人抗体的恒定区相连接，构建成完整的人源化单克隆抗体，可以在保持原单抗特异性和亲和力的基础上，减少人抗鼠抗体反应，延长其半衰期和改善药代动力学特性，并能有效地活化补体和Fc受体相关的免疫应答。

[0073] 本发明在已制备的一株鼠源功能性抗人DR5单克隆抗体(AD5-10)基础上，通过CDR移植策略建立了人源化单克隆抗体，该抗体在体内外对多种肿瘤细胞具有特异性的凋亡诱导活性，对正常细胞和组织没有毒副作用，可单独或与TRAIL或其它抗肿瘤药物联用，用于多种肿瘤和与DR5高表达相关的其他疾病的治疗。

附图说明

[0074] 图1：是带有CAG启动子和dhfr筛选标记的抗DR5人源化单克隆抗体的真核表达载体结构图。ADHFL(1692)表示抗DR5人源化单克隆抗体的重链、Furin/2A肽和轻链的编码核苷酸序列。

[0075] 图2：是该人源化单克隆抗体的真核表达载体转染HEK293细胞后，细胞培养上清经亲和层析纯化获得的抗DR5人源化单克隆抗体的SDS-PAGE分析结果。

[0076] 图3：是使用Biacore系统和CM5芯片测定AD10、AD14和AD15三株该人源化单克隆抗体与其抗原DR5的亲和力。A图的四幅图(从左到右，从上往下)分别对应AD10、AD14、AD15和AD5-10与其抗原DR5亲和力的Biacore测定图谱。B图是根据A图计算出的相应亲和力。

[0077] 图4：是采用CCK-8细胞毒检测试剂盒测定该人源化单克隆抗体在体外杀伤肿瘤细胞的活性。显示以不同浓度的该人源化单克隆抗体AD10、AD14和AD15处理人T淋巴细胞白血病细胞Jurkat、肝癌细胞BEL-7402、肺癌细胞H460和结肠癌细胞HCT116 24小时的细胞存活率。

具体实施方式

[0078] 下面通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。

[0079] 下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。

[0080] 实施例

[0081] 实验例1人源化抗体的设计与高效表达抗DR5人源化单克隆抗体的真核表达载体构建与结果

[0082] 鼠源的AD5-10单克隆抗体(中国专利申请号200410070093.1)的重链和轻链可变区的CDR片段用Kabat numbering system(http：//www.bioinf.org.uk/abs/#kabatnum)找出并标注。重链和轻链可变区CDR片段的规范(canonical)结构预测根据文献(1，Kontermann R，Dübel S(2001)，Humanising Antibodies by CDR Grafting，p579；2，Hwang WY，Almagro JC et al.，(2005)Methods，36∶35-42)进行，选择具有相同规范结构的人抗体序列作为接受框架。

[0083] 人源化抗体重链的设计：将支撑CDR结构及VH/VL界面的氨基酸找出并回复到鼠源抗体序列。经过回复突变的序列与具有相同规范结构的所有人抗体进行比对，选出最相似的人抗体进行CDR移植。然后，与IMGT数据库中所有该类抗体比对，尽量将特殊氨基酸突变成常见氨基酸，以降低免疫原性。N端的第一个氨基酸如果是Q，则改变成E。同时，对通过构建模型选定的关键氨基酸进行回复突变。确认人源化抗体序列没有引进糖基化位点。人源化抗体的J区(J-region)选择完全依据序列的相似程度。

[0084] 人源化抗体的轻链设计采用与上述相同的方法。

[0085] 抗体同源模建：分别用AD10-5的轻链和重链以及BLAST SEARCH来搜索PDB蛋白结构数据库，寻找与其序列相似度最高的已知结构的人抗体。根据BLASTSEARCH的输出结果和序列相似度，将1DLF、1I9J、1NQB和1PLG选作VL模建的模板。将1IAL、1NLB、1A4K和1FJ1选为VH的模板，利用Schrodinger软件包分别对VH和VL做同源模建，分别获得轻链和重链的结构模型。再利用CCP4软件包中的contact程序来对结构模型进行分析，列出与CDR loop有相互作用的轻链和重链框架区的氨基酸残基。根据软件分析的结果和人工检视，发现框架区中的以下氨基酸残基对于维持CDR loop的空间构象较为重要，它们是：轻链的D60、D70、Y49、F71、M4和V2；重链的K46、W47、M48、F67、L69、M71、W102和I2。所设计的人源化抗体的重链、Furin/2A肽和轻链的氨基酸序列(如SEQ ID NO：17所示)。经优选设计的3个人源化抗体AD10、AD14和AD15重链和轻链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：18和19、SEQ ID NO：20和21、SEQ ID NO：22和23所示。

[0086] 以pcDNA3(Invitrogen，A-150228)为原始载体，以pAM/CAG载体(香港大学提供)为模板，以上游引物5’GGCGCAGATCTATTGACG TCAAT3’(SEQ ID NO：24)和下游引物5’GGCAAGCTTAATTCTTT GCCAAAATG 3’(SEQ ID NO：25)扩增CAG启动子序列(a modified cytomegalovirus immediate early enhancer and a chicken beta-actin promoter)。以pSV2-dhfr载体DNA(购自ATCC，67110)为模版，以上游引物5’AATCCCGGGACA GCTCAGGGCTGCG3’(SEQ ID NO：26)和下游引物5’GGCGGCGC TTCGAAAAAGCCAGCAAAAGC TC3’(SEQ ID NO：27)扩增二氢叶酸还原酶(dhfr)基因片段。通过拼接PCR扩增或化学合成人源化单克隆抗体的重链和轻链可变区cDNA片段，利用同源重组技术将得到的可变区cDNA片段整合到线性化的带有人IgG1重链恒定区的通用序列的pCP载体(上海睿智化学有限公司提供)中。利用PCR扩增自我剪切位点Furin/2A肽编码序列(F2A)(引物1：5’
CAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAGGAAGAGGCGAGCACCTGT 3’(SEQ ID NO：28)，引物2：5’GCCCAGCAGCTGGGCGGGCACGCGCATGTCGGGCCCAGGATTGGACT CA3’(SEQ ID NO：29)并插入上述获得的重组质粒中人源化单克隆抗体的重链和轻链编码核苷酸序列之间，从而依次将CAG、该人源化抗体重链(H)、Furin/2A肽(F2A)、该人源化抗体轻链(L)的编码核苷酸序列(表示为HF2AL)和编码dhfr的核苷酸序列组成一个开放阅读框(open reading frame，OPF)。

[0087] 将上述获得的编码OPF核苷酸序列插入原始载体pcDNA3，经测序鉴定正确，获得新的抗DR5的人源化单克隆抗体的真核表达载体(命名为pcDNA3-CAG-HF2AL-dhfr)。所获得的重组表达质粒的图谱如附图1所示。

[0088] 实验例2抗DR5人源化单克隆抗体的表达与纯化

[0089] 用脂质体转染法将构建的真核表达载体pcDNA3-CAG-HF2AL-dhfr转染HEK293细胞(购自ATCC，CRL-9096)，于37℃、5％CO2、120rpm/min振荡培养，使抗DR5人源化单克隆抗体在HEK293真核细胞中表达并分泌到细胞培养液中。转染的细胞培养到细胞活力小于60％时(约需6天)，收集细胞培养上清。制备1ml Protein A亲和层析柱，先用PBS磷酸缓冲液(20mM磷酸盐、300mM氯化钠，pH7.0)平衡，然后加入收集的细胞培养上清，用PBS磷酸缓冲液洗涤，用100mM的柠檬酸(pH 3.0)洗脱。收集的洗脱液立即用1M的Tris-HCl(pH 9.0)调节到pH 8.0，并对PBS缓冲液透析过夜。以SDS-PAGE分析其中的抗DR5人源化单克隆抗体的纯度与分子量，结果见附图2。

[0090] 实验例3抗DR5人源化单克隆抗体与其抗原DR5结合亲和力的测定

[0091] 在Biacore X100系统(GE Healthcare，Uppsala，瑞典)使用的CM5芯片(GE Healthcare，BR-1000-14)上选定空白对照通道和样品通道。首先用按1∶1混合的50mM N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)：200mM碳化二亚胺[1-ethyl-3-3-dimethyl aminopropyl carbodiimide，EDC]以10μl/min的速度注入空白对照通道和样品通道7分钟，进行芯片活化。以5μl/min的速度注入溶在pH 5.5醋酸钠溶液中的抗原DR5(45μg/ml)，包被芯片，直至获得目标值680Ru的信号。将1M乙醇胺以10μl/min的速度注入7分钟，封闭芯片上多余的结合位点。结合动力学测试选用HBS-EP(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％Surfactant P20)缓冲液，将纯化的该人源化单克隆抗体AD10、AD14和AD15稀释为不同浓度，分别以30μl/min的速度注入空白通道和样品通道3分钟。将HBS-EP缓冲液以30μl/min的速度注入5min，进行解离。采用Biacore X100 evaluation 2.0软件进行数据分析和处理，结果见附图3的A图和B图。

[0092] 结果表明该人源化单克隆抗体保留了亲本鼠源抗人DR5单克隆抗体(AD5-10)的抗原亲和力。

[0093] 实验例4抗人DR5人源化单克隆抗体杀伤肿瘤细胞的活性测定

[0094] 在96孔细胞培养板中进行。在生长至对数生长期的人T淋巴细胞白血病细胞Jurkat(ATCC，TIB-152)、结肠癌细胞HCT116(ATCC，CCL-247)、肝癌细胞BEL-7402(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，TCHu 10)和非小细胞肺癌细胞H460(ATCC，HTB-177)中，分别加入不同浓度(0、0.5、1、2、4、8μg/ml)的该抗人DR5人源化单克隆抗体AD10、AD14和AD15，处理24小时，以亲本鼠源抗人DR5单克隆抗体(AD5-10)及其人-鼠嵌合抗体zaptuximab为对照。按照CCK-8细胞毒检测试剂盒(Dojindo，Gaithersburg，MD)操作规程，加入CCK-8试剂，反应2-4小时，在微型酶标板测定仪波长450nm处测定OD值。以无细胞孔的OD值为空白对照“0”。细胞存活率＝处理孔的OD值/未处理孔OD值，结果见附图4。

[0095] 结果表明上述人源化单克隆抗体具有显著的肿瘤细胞杀伤活性。

[0096] 本领域技术人员知晓，在不改变本发明所述人源化单克隆抗体的亲和性和生物活性的前提下，本发明所公开的所述人源化单克隆抗体的具体序列可以被进行适当的改变。例如，所述序列中的部分氨基酸残基可以被删除、添加和替换而不改变所述序列的亲和性和生物活性。例如，本发明所述CDR和FR区的部分氨基酸残基可以被性质类似的氨基酸所替换而不影响其亲和性和生物活性。所述人源化单克隆抗体的编码序列可根据其宿主的密码子偏爱性的不同而进行相应的替换。