胆固醇氧化酶的稳定化方法

摘要

本发明提供胆固醇氧化酶的稳定化方法、胆固醇氧化酶的保存方法及胆固醇氧化酶的稳定化组合物。一种胆固醇氧化酶的稳定化方法及胆固醇氧化酶的保存方法，其特征在于，使α‑酮酸在水性介质中与胆固醇氧化酶共存；一种胆固醇氧化酶的稳定化组合物，其特征在于，使α‑酮酸在水性介质中与胆固醇氧化酶共存。本发明的胆固醇氧化酶的稳定化方法、胆固醇氧化酶的保存方法及胆固醇氧化酶的稳定化组合物在代谢综合征等的临床诊断中有用。

权利要求

1.α-酮酸或其盐的用于稳定化胆固醇氧化酶的应用，其特征在于，使α-酮酸或其盐在水性介质中与胆固醇氧化酶共存。

2.如权利要求1所述的应用，其中，α-酮酸为选自由丙酮酸、α-酮戊二酸和草酰乙酸组成的组中的α-酮酸。

3.α-酮酸或其盐的用于保存胆固醇氧化酶的应用，其特征在于，使α-酮酸或其盐在水性介质中与胆固醇氧化酶共存。

4.如权利要求3所述的应用，其中，α-酮酸为选自由丙酮酸、α-酮戊二酸和草酰乙酸组成的组中的α-酮酸。

说明书

胆固醇氧化酶的稳定化方法

技术领域

[0001] 本发明涉及胆固醇氧化酶的稳定化方法、胆固醇氧化酶的保存方法及胆固醇氧化酶的稳定化组合物。

背景技术

[0002] 胆固醇氧化酶是以胆固醇和氧分子作为底物的氧化还原酶。临床检查中，经常进行使用胆固醇氧化酶的胆固醇的测定。临床检查中使用通过比色法来测定样本中的胆固醇
的方法等，该比色法中，使胆固醇氧化酶作用于样本中的胆固醇而生成过氧化氢，使生成的过氧化氢在过氧化物酶存在下与氧化显色型色原体反应而生成色素，并测定生成的色素的
吸光度。

[0003] 胆固醇的测定中使用的胆固醇氧化酶是不稳定的，在含有胆固醇氧化酶的测定试剂的保存中失活，存在测定试剂的性能变差的问题。

[0004] 针对该问题，已知如下方法：向含有胆固醇氧化酶的溶液中添加碱金属的氯化物和/或碱土金属的氯化物的胆固醇氧化酶的稳定化方法(参考专利文献1)、通过与选自牛血
清白蛋白、葡聚糖、聚乙二醇中的水溶性载体发生化学键合而使溶液状态下的胆固醇氧化
酶稳定化的方法(参考专利文献2)、通过向含有胆固醇氧化酶的溶液中添加牛血清白蛋白
和赖氨酸而使胆固醇氧化酶稳定化的方法(参考专利文献3)、通过与蛋白质分解物共存而
使干燥状态的胆固醇氧化酶稳定化的方法(参考专利文献4)等。

[0005] 现有技术文献

[0006] 专利文献

[0007] 专利文献1：日本特开昭52-143285号公报

[0008] 专利文献2：日本特开平6-062846号公报

[0009] 专利文献3：日本特开平8-187095号公报

[0010] 专利文献4：日本特开2005-114368号公报

发明内容

[0011] 发明所要解决的问题

[0012] 本发明的目的在于提供适于长期保存的胆固醇氧化酶的稳定化方法、胆固醇氧化酶的保存方法及胆固醇氧化酶的稳定化组合物。

[0013] 用于解决问题的手段

[0014] 本发明人为了解决该问题而反复进行了深入研究，结果发现了通过使α-酮酸或其盐在水性介质中与胆固醇氧化酶共存而使胆固醇氧化酶保持稳定的见解，从而完成了本发
明。即，本发明涉及下述[1]～[6]项。

[0015] [1]一种胆固醇氧化酶的稳定化方法，其特征在于，使α-酮酸或其盐在水性介质中与胆固醇氧化酶共存。

[0016] [2]如[1]所述的稳定化方法，其中，α-酮酸为选自由丙酮酸、α-酮戊二酸和草酰乙酸组成的组中的α-酮酸。

[0017] [3]一种胆固醇氧化酶的保存方法，其特征在于，使α-酮酸或其盐在水性介质中与胆固醇氧化酶共存。

[0018] [4]如[3]所述的保存方法，其中，α-酮酸为选自由丙酮酸、α-酮戊二酸和草酰乙酸组成的组中的α-酮酸。

[0019] [5]一种胆固醇氧化酶的稳定化组合物，其特征在于，使α-酮酸或其盐在水性介质中与胆固醇氧化酶共存。

[0020] [6]如[5]所述的稳定化组合物，其中，α-酮酸为选自由丙酮酸、α-酮戊二酸和草酰乙酸组成的组中的α-酮酸。

[0021] 发明效果

[0022] 根据本发明，提供适于长期保存的胆固醇氧化酶的稳定化方法、胆固醇氧化酶的保存方法及胆固醇氧化酶的稳定化组合物。

具体实施方式

[0023] 本发明的胆固醇氧化酶的稳定化方法是特征在于使α-酮酸或其盐在水性介质中与胆固醇氧化酶共存的方法。

[0024] 本发明的胆固醇氧化酶的保存方法是特征在于使α-酮酸或其盐在水性介质中与胆固醇氧化酶共存的方法。

[0025] 本发明的胆固醇氧化酶的稳定化组合物是特征在于使α-酮酸或其盐在水性介质中与胆固醇氧化酶共存的组合物。

[0026] 在本发明中，“稳定”是指即使将胆固醇氧化酶长期保存也可维持胆固醇氧化酶的酶活性，具体而言是指，将胆固醇氧化酶的水溶液在5℃下保存2周，在5℃下保存2周后的胆固醇氧化酶活性为胆固醇氧化酶水溶液刚制备后的胆固醇氧化酶活性的75％以上。胆固醇氧化酶活性例如可以通过以下的方法来测定。

[0027] 制备含有胆固醇和检测用试剂的胆固醇氧化酶活性评价用试剂。作为检测用试剂，可以使用例如含有过氧化物酶和后述的氧化显色型色原体的试剂。向样本A(xμL)中添加胆固醇氧化酶活性评价用试剂(yμL)，在37℃下进行5分钟反应，测定反应5分钟后的反应液的吸光度E1A。进一步在37℃下进行5分钟反应，测定反应10分钟后的反应液的吸光度E2A，算出从E2A中减去E1A而得到的吸光度差ΔE’A。除了使用蒸馏水代替样本A作为样本以外，通过同样的方法测定在37℃下反应5分钟后的反应液的吸光度E1O，进一步在37℃下进行5分
钟反应，测定反应10分钟后的反应液的吸光度E2O，算出从E2O中减去E1O而得到的吸光度差ΔEO。从ΔE’A中减去ΔEO，得到关于样本A的吸光度差ΔEA。由该吸光度差ΔEA算出胆固醇氧化酶的活性。在使用4-氨基安替比林(4-AA)与N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-琥珀酰乙二胺
(EMSE)的组合作为氧化显色型色原体的情况下，通过以下的式(I)算出胆固醇氧化酶的活
性。

[0028] 胆固醇氧化酶活性(U/mL)＝ΔEA/16.9×(x+y)/x   (I)

[0029] 由上述式(I)可知，胆固醇氧化酶活性与ΔEA成比例，因此，可以使用ΔEA作为胆固醇氧化酶活性的指标。

[0030] 胆固醇氧化酶的稳定化可以通过例如以下的方法来评价。作为含有胆固醇氧化酶的样本，对于向缓冲液中添加胆固醇氧化酶和α-酮酸而制备的样本A而言，制备刚制备后的样本A(刚制备后)和将样本A(刚制备后)在5℃下保存2周后的样本A(保存后)。另外，对于向缓冲液中仅添加胆固醇氧化酶而制备的、不含α-酮酸的样本a而言，制备刚制备后的样本a(刚制备后)和将样本a(刚制备后)在5℃下保存2周后的样本a(保存后)。使用样本A(刚制备后)作为样本，在37℃下进行5分钟的样本A(刚制备后)与胆固醇氧化酶活性评价用试剂的反应，测定反应液的吸光度E1A(刚制备后)，进一步在37℃下进行5分钟反应，测定反应10分钟后的反应液的吸光度E2A(刚制备后)，算出从
E2A(刚制备后)中减去E1A(刚制备后)而得到的吸光度差ΔE’A(刚制备后)。除了使用蒸馏水代替样本A(刚制备后)作为样本以外，通过同样的方法测定在37℃下反应5分钟后的反应液的吸光度E10，进一步
在37℃下进行5分钟反应，测定反应10分钟后的反应液的吸光度E2O，算出从E2O中减去E1O而得到的吸光度差ΔEO。从ΔE’A(刚制备后)中减去ΔEO，得到关于样本A(刚制备后)的吸光度差ΔEA(刚制备后)。

[0031] 除了使用样本A(保存后)代替样本A(刚制备后)作为样本以外，通过与上述同样的方法算出关于样本A(保存后)的吸光度差ΔEA(保存后)。同样地，使用样本a(刚制备后)代替样本A(刚制备后)作为样本，算出关于样本a(刚制备后)的吸光度差ΔEa(刚制备后)，使用样本a(保存后)代替样本A(刚制备后)作为样本，算出关于样本a(保存后)的吸光度差ΔEa(保存后)。样本A中的胆固醇氧化酶的残留率通过以下的式(II)算出。

[0032] 残留率(％)＝ΔEA(保存后)/ΔEA(刚制备后)×100   (II)

[0033] 同样地，样本a中的胆固醇氧化酶的残留率通过以下的式(III)算出。

[0034] 残留率(％)＝ΔEa(保存后)/ΔEa(刚制备后)×100   (III)

[0035] 在通过上述式(II)算出的样本A中的胆固醇氧化酶的残留率为75％以上且高于通过上述式(III)算出的样本a中的胆固醇氧化酶的残留率的情况下，可以评价为胆固醇氧化
酶利用α-酮酸得到了稳定化。

[0036] 本发明中的胆固醇氧化酶是分类为EC1.1.3.6的酶，为催化以下的反应的酶。

[0037] 胆固醇+O2→胆甾-4-烯-酮+H2O2

[0038] 作为催化上述反应的胆固醇氧化酶，可以列举例如：来源于动物、植物或微生物的胆固醇氧化酶、以及通过基因工程方法制造的胆固醇氧化酶等，也可以使用胆固醇氧化酶(CHODI，龟甲万公司制造)、胆固醇氧化酶(CHO-PEWL，龟甲万公司制造)、胆固醇氧化酶
(CHO-CE，龟甲万公司制造)、胆固醇氧化酶(COO-321，东洋纺织公司制造)等市售品。

[0039] 本发明中，作为水性介质，只要是能够稳定保持胆固醇氧化酶的水性介质则没有特别限制，可以列举例如去离子水、蒸馏水、缓冲液等，优选缓冲液。本发明中的胆固醇氧化酶在水性介质中的浓度通常为0.01～300U/mL。作为缓冲液，优选在能够稳定保持胆固醇氧化酶的pH范围内具有缓冲能力的缓冲剂，可以列举例如磷酸缓冲液、硼酸缓冲液、Good’s缓冲液等。作为Good’s缓冲液中使用的Good’s缓冲剂，可以列举例如：2-吗啉代乙烷磺酸
(MES)、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、双(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷(Bis-Tris)、N-(2-乙酰胺)亚氨基二乙酸(ADA)、哌嗪-N,N’-双(2-乙烷磺酸)(PIPES)、N-(2-乙酰胺)-2-氨基乙烷磺酸(ACES)、N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙烷磺酸(BES)、3-吗啉代丙烷磺酸(MOPS)、N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙烷磺酸(TES)、2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙烷磺酸
(HEPES)、哌嗪-N,N’-双(2-羟基丙烷磺酸)(POPSO)、N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸
(Tricine)、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸
(TAPS)、N-环己基-2-氨基乙烷磺酸(CHES)、N-环己基-3-氨基-2-羟基丙烷磺酸(CAPSO)、N-环己基-3-氨基丙烷磺酸(CAPS)等。

[0040] 本发明中，胆固醇氧化酶通常在pH为5～9的水性介质中保存，优选在pH为6～8的水性介质中保存。

[0041] 本发明中的α-酮酸只要是使胆固醇氧化酶稳定化的α-酮酸则没有特别限制，可以列举例如丙酮酸、α-酮戊二酸、草酰乙酸等。本发明中，α-酮酸可以为盐，作为盐，可以列举例如锂盐、钠盐、钾盐、铵盐、钙盐、镁盐等。

[0042] 本发明中的α-酮酸在水性介质中的浓度只要是使胆固醇氧化酶稳定化的浓度则没有特别限制，通常为0.05～40mmol/L。

[0043] 本发明的胆固醇氧化酶的保存方法是使α-酮酸或其盐在水性介质中与胆固醇氧化酶共存来保存的方法。本发明的胆固醇氧化酶的保存方法中使用的胆固醇氧化酶及其浓
度以及α-酮酸及其浓度可以列举与上述胆固醇氧化酶稳定化方法同样的物质及其浓度。本发明的胆固醇氧化酶的保存方法中的保存期间只要是胆固醇氧化酶得到稳定保存的期间
则没有特别限制，通常为1～2年。另外，本发明的胆固醇氧化酶的保存方法中的保存温度只要是胆固醇氧化酶得到稳定保存的温度则没有特别限制，通常为-5～45℃，优选0～30℃，特别优选2～10℃。

[0044] 本发明的胆固醇氧化酶的保存方法中，除了α-酮酸或其盐以外，还可以使表面活性剂、防腐剂、蛋白质等与胆固醇氧化酶共存。作为表面活性剂，可以列举例如非离子性表面活性剂、阳离子性表面活性剂、阴离子性表面活性剂、两性表面活性剂等。作为防腐剂，可以列举例如叠氮化物、螯合剂等。作为叠氮化物，可以列举例如叠氮化钠等。作为螯合剂，可以列举例如乙二胺四乙酸(EDTA)或其盐等。作为盐，可以列举例如钠盐、钾盐等。作为蛋白质，可以列举例如白蛋白等，作为白蛋白，可以列举例如牛血清白蛋白(BSA)等。

[0045] 本发明的胆固醇氧化酶的稳定化组合物中，除了含有胆固醇氧化酶和α-酮酸或其盐以外，还可以含有基于过氧化氢测定体系的测定对象成分的测定方法中使用的试剂和试
剂盒中通常含有的构成要素。作为测定对象成分，可以列举总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白中的胆固醇(HDL-C)、中间密度脂蛋白中的胆固醇(IDL-C)、低密度脂蛋白中的胆固醇(LDL-
C)、超低密度脂蛋白中的胆固醇(VLDL-C)、残粒样脂蛋白中的胆固醇(RLP-C)、小而密低密度脂蛋白中的胆固醇(sdLDL-C)、HDL亚级分中的胆固醇(HDL2-C、HDL3-C)、游离型胆固醇
(FC)等。

[0046] 例如，在胆固醇(TC、HDL-C、LDL-C、IDL-C、VLDL-C、RLP-C、sdLDL-C、HDL2-C、HDL3-C、FC)的测定方法中使用的试剂和试剂盒中，除了含有胆固醇氧化酶以外，还含有胆固醇酯酶、过氧化物酶、氧化显色型色原体等。

[0047] 作为氧化显色型色原体，可以列举无色型色原体、氧化耦合型色原体等。

[0048] 无色型色原体具有在过氧化物酶的存在下与过氧化氢反应而单独生成色素的功能。作为无色型色原体，可以列举例如：四甲基联苯胺、邻苯二胺、10-N-羧甲基氨甲酰基-3,
7-双(二甲氨基)-10H-吩噻嗪(CCAP)、10-N-甲基氨甲酰基-3,7-双(二甲氨基)-10H-吩噻嗪
(MCDP)、N-(羧甲基氨基羰基)-4,4’-双(二甲氨基)二苯胺钠盐(DA-64)、10-N-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨基)-10H-吩噻嗪钠盐(DA-67)、4,4’-双(二甲氨基)二苯胺、双[3-双(4-氯苯基)甲基-4-二甲氨基苯基]胺(BCMA)等。

[0049] 氧化耦合显色型色原体具有在过氧化物酶的存在下与过氧化氢反应而生成色素的功能。在该生成色素的反应中，使用一对氧化耦合显色型色原体的组合。作为一对氧化耦合显色型色原体的组合，可以列举：耦合剂与苯胺类的组合、耦合剂与酚类的组合。

[0050] 作为耦合剂，可以列举例如4-氨基安替比林(4-AA)、3-甲基-2-苯并噻唑啉酮肼(3-メチル-2-ベンゾチアゾリノンヒドラジン)等。

[0051] 作为苯胺类，可以列举：N-(3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(2-羟
基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOPS)、N-
(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N,N-二甲基-3-甲基苯胺、N,N-二(3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)苯
胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、N-(3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-琥珀酰乙二胺(EMSE)、N-乙基-N-
(3-甲基苯基)-N’-乙酰基乙二胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-4-氟-3,5-二甲氧基苯胺(F-DAOS)等。

[0052] 作为酚类，可以列举苯酚、4-氯苯酚、3-甲基苯酚、3-羟基-2,4,6-三碘苯甲酸(HTIB)等。

[0053] 本发明的胆固醇氧化酶的稳定化组合物中，可以含有上述的表面活性剂、防腐剂、蛋白质等。

[0054] 以下，通过实施例更详细地对本发明进行说明，但本发明的范围不受这些实施例的任何限定。另外，在本实施例、比较例和试验例中，使用下述制造商的试剂和酶。

[0055] MOPS(同仁化学研究所公司制造)、EMSE(ダイトーケミックス公司制造)、4-AA(アクテック公司制造)、バイオエース(KI化成公司制造)、PGM-50(聚氧化乙烯辛基苯基醚，和光纯药工业公司制造)、胆酸钠(ナカライテスク公司制造)、胆固醇(纯正化学公司制造)、2-丙醇(和光纯药工业公司制造)、トリトンX-100(西格玛公司制造)、丙酮酸钠(关东化学公司制造)、α-酮戊二酸二钠(MPバイオメディカル公司制造)、草酰乙酸(关东化学公司制造)、过氧化物酶(东洋纺织公司制造)、CHO-CE(胆固醇氧化酶，龟甲万公司制造)。

[0056] 实施例1

[0057] 通过以下的方法，对由α-酮酸带来的胆固醇氧化酶的稳定化效果进行研究。

[0058] (1)样本

[0059] 制备包含下述组成的样本A(样本A0～A3)和样本B(样本B0～B3)。

[0060] ＜样本A(样本A0～A3)＞

[0061] MOPS(pH7.0)       20mmol/L

[0062] CHO-CE            2kU/L

[0063] α-酮酸(参考表1，样本A0为未添加)

[0064] ＜样本B(样本B0～B3)＞

[0065] MOPS(pH7.0)       20mmol/L

[0066] トリトンX-100        1％

[0067] CHO-CE            2kU/L

[0068] α-酮酸(参考表1，样本B0为未添加)

[0069] (2)胆固醇氧化酶活性测定用试剂

[0070] 制备包含下述组成的试剂A和试剂B。

[0071] ＜试剂A＞

[0072]

[0073] ＜试剂B＞

[0074] 胆固醇的2-丙醇溶液(5mg/mL)

[0075] 向试剂A(50mL)中添加试剂B(2mL)，充分搅拌，制成胆固醇氧化酶活性测定用试剂。

[0076] (3)关于刚制备后的样本的吸光度差

[0077] 向反应皿中添加刚制备后的样本A1(2.4μL)和上述(2)的胆固醇氧化酶活性测定用试剂(225μL)，在主波长546nm、副波长800nm下测定在37℃下加热5分钟后的反应液的吸光度E1A1(刚制备后)，进一步在37℃下加热5分钟，在主波长546nm、副波长800nm下测定反应10分钟后的反应液的吸光度E2A1(刚制备后)，从E2A1(刚制备后)中减去E1A1(刚制备后)，得到ΔE’A1(刚制备后)。

[0078] 使用蒸馏水作为样本，进行同样的反应，从反应10分钟后的反应液的吸光度E2O中减去反应5分钟后的反应液的吸光度E1O，得到ΔEO。从ΔE’A1(刚制备后)中减去ΔEO，得到关于刚制备后的样本A1的吸光度差ΔEA1(刚制备后)。

[0079] (4)关于在5℃下保存2周后的样本的吸光度差

[0080] 除了使用在5℃下保存2周后的样本A1代替刚制备后的样本A1以外，通过与上述(3)同样的方法，确定关于在5℃下保存2周后的样本A1的吸光度差ΔEA1(保存后)。

[0081] (5)在5℃下保存2周后的样本中的胆固醇氧化酶的残留率

[0082] 由上述(3)中确定的ΔEA1(刚制备后)和(4)中确定的ΔEA1(保存后)，通过上述式(II)确定在5℃下保存2周后的样本中的胆固醇氧化酶相对于刚制备后的样本中的胆固醇氧化酶的残
留率。将结果示于表1中。

[0083] 除了使用样本A2、样本A3和样本B1～B3各样本代替样本A1作为样本以外，通过与上述(1)～(5)同样的方法确定在5℃下保存2周后的各样本中的胆固醇氧化酶相对于刚制
备后的各样本中的胆固醇氧化酶的残留率。将结果示于表1中。

[0084] 此外，使用样本A0和样本B0代替样本A1，并使用上述式(III)代替上述式(II)，除此以外，通过与上述(1)～(5)同样的方法确定在5℃下保存2周后的各样本中的胆固醇氧化
酶相对于刚制备后的各样本中的胆固醇氧化酶的残留率。将结果示于表1中。

[0085] 表1

[0086]样本 α-酮酸(浓度) 残留率(％)
A0 - 61
A1 丙酮酸钠(0.5g/L) 88
A2 α-酮戊二酸二钠(0.5g/L) 91
A3 草酰乙酸(0.5g/L) 80
B0 - 71
B1 丙酮酸钠(0.5g/L) 95
B2 α-酮戊二酸二钠(0.5g/L) 85
B3 草酰乙酸(0.5g/L) 79

[0087] 由表1可知，无论是在使用不含表面活性剂的样本(A0～A3)的情况下还是在使用含有表面活性剂的样本(B0～B3)的情况下，与未共存α-酮酸时相比，胆固醇氧化酶的残留率在共存有α-酮酸时均更高，为75％以上。与此相对，在未共存α-酮酸或其盐时，残留率低，低于75％。因此可知，通过使α-酮酸或其盐在水性介质中与胆固醇氧化酶共存，可使胆固醇氧化酶稳定化。

[0088] 产业上的可利用性

[0089] 根据本发明，提供胆固醇氧化酶的稳定化方法、胆固醇氧化酶的保存方法及胆固醇氧化酶的稳定化组合物。本发明的胆固醇氧化酶的稳定化方法、胆固醇氧化酶的保存方
法及胆固醇氧化酶的稳定化组合物在代谢综合征等的临床诊断中有用。