用于治疗骨关节炎的基于腺病毒的生物递送和表达系统

摘要

本发明涉及基于腺病毒的生物递送和表达系统，用于通过人或哺乳动物白介素-1受体拮抗剂(Il-1Ra)基因在滑液细胞中的长期诱导表达来治疗或预防人或哺乳动物关节的骨关节炎，该系统包含含有编码人或哺乳动物白介素-1受体拮抗剂(Il-1Ra)的核酸序列、左反向末端重复和右反向末端重复(L ITR和R ITR)、腺病毒包装信号以及非病毒非编码填充核酸序列的辅助依赖性腺病毒载体，其中通过炎症诱导启动子调控人或哺乳动物白介素-1受体拮抗剂(Il-1Ra)基因在滑液细胞中的表达。

权利要求

1.基于腺病毒的生物递送和表达系统，其包含含有编码人或哺乳动物白介素-1受体拮抗剂(Il-1Ra)的核酸序列、左反向末端重复和右反向末端重复(L ITR和R ITR)、腺病毒包装信号以及非病毒的非编码的填充核酸序列的辅助依赖性腺病毒载体，其中通过炎症诱导启动子调控所述人或哺乳动物白介素-1受体拮抗剂(Il-1Ra)基因在滑液细胞内的表达，所述炎症诱导启动子位于编码人或哺乳动物白介素-1受体拮抗剂(Il-1Ra)的核酸序列的阅读框的上游，且由上升水平的免疫刺激物质特异性激活。

2.如权利要求1所述的基于腺病毒的生物递送和表达系统，其中所述炎症诱导启动子选自NF-кB启动子、白介素6(Il-6)启动子、白介素-1(Il-1)启动子、肿瘤坏死因子(TNF)启动子、环氧酶2(COX-2)启动子、补体因子3(C3)启动子、血清淀粉样蛋白A3(SAA3)启动子、巨噬细胞炎症蛋白-1α(MIP-1α)启动子或以上的杂合结构。

3.如权利要求1或2所述的基于腺病毒的生物递送和表达系统，其中所述辅助依赖性腺病毒载体包含SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3示出的核酸序列或其生物学有效部分。

4.如前述权利要求1或2所述的基于腺病毒的生物递送和表达系统，其中所述哺乳动物白介素-1受体拮抗剂(Il-1Ra)选自鼠Il-1Ra、马Il-1Ra、犬Il-1Ra、猫Il-1Ra、兔Il-1Ra、仓鼠Il-1Ra、牛Il-1Ra、骆驼Il-1Ra或其在其它哺乳动物物种中的同源物。

5.如前述权利要求1或2所述的基于腺病毒的生物递送和表达系统，其中所述辅助依赖性腺病毒载体还包含允许监控载体基因组的标记基因。

6.如前述权利要求1或2述的基于腺病毒的生物递送和表达系统，其中所述辅助依赖性载体包含SEQ ID NO 1示出的核酸序列或其的编码相同氨基酸的保守序列。

7.如前述权利要求1或2所述的基于腺病毒的生物递送和表达系统，其中所述辅助依赖性载体与SEQ ID NO 1示出的核酸序列具有至少50％的序列同源性。

8.如前述权利要求7所述的基于腺病毒的生物递送和表达系统，其中所述辅助依赖性载体与SEQ ID NO 1示出的核酸序列具有至少60％的序列同源性。

9.如前述权利要求7所述的基于腺病毒的生物递送和表达系统，其中所述辅助依赖性载体与SEQ ID NO 1示出的核酸序列具有至少80％的序列同源性。

10.如前述权利要求7所述的基于腺病毒的生物递送和表达系统，其中所述辅助依赖性载体与SEQ ID NO 1示出的核酸序列具有至少90％的序列同源性。

11.药物组合物，其包含含有编码人或哺乳动物白介素-1受体拮抗剂(Il-1Ra)的核酸序列、左反向末端序列和右反向末端序列(L ITR和R ITR)、腺病毒包装信号以及非病毒的非编码的填充核酸序列的辅助依赖性腺病毒载体，其中通过炎症诱导启动子调控人或哺乳动物白介素-1受体拮抗剂(Il-1Ra)基因的表达，所述炎症诱导启动子位于编码人或哺乳动物白介素-1受体拮抗剂(Il-1Ra)的核酸序列的阅读框的上游，且由上升水平的免疫刺激物质特异性激活。

12.如权利要求11所述的药物组合物，其中所述炎症诱导启动子选自NF-кB启动子、白介素6(Il-6)启动子、白介素-1(Il-1)启动子、肿瘤坏死因子(TNF)启动子、环氧酶2(COX-2)启动子、补体因子3(C3)启动子、血清淀粉样蛋白A3(SAA3)启动子、巨噬细胞炎症蛋白-1α(MIP-1α)启动子或以上的杂合结构。

13.如权利要求11或12所述的药物组合物，其中所述辅助依赖性腺病毒载体包含SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3示出的核酸序列或其生物学有效部分。

14.如前述权利要求11或12所述的药物组合物，其中所述哺乳动物白介素-1受体拮抗剂(Il-1Ra)选自鼠Il-1Ra、马Il-1Ra、犬Il-1Ra、猫Il-1Ra、兔Il-1Ra、仓鼠Il-1Ra、牛Il-

1Ra、骆驼Il-1Ra或其在其它哺乳动物物种中的同源物。

15.如前述权利要求11或12所述的药物组合物，其中所述辅助依赖性腺病毒载体还包含允许监控载体基因组的标记基因。

16.如前述权利要求11或12所述的药物组合物，其中所述辅助依赖性载体包含SEQ ID NO 1示出的核酸序列或其的编码相同氨基酸的保守序列。

17.如前述权利要求11或12所述的药物组合物，其中所述辅助依赖性载体与SEQ ID NO 

1示出的核酸序列具有至少50％的序列同源性。

18.如前述权利要求17所述的药物组合物，其中所述辅助依赖性载体与SEQ ID NO 1示出的核酸序列具有至少60％的序列同源性。

19.如前述权利要求17所述的药物组合物，其中所述辅助依赖性载体与SEQ ID NO 1示出的核酸序列具有至少80％的序列同源性。

20.如前述权利要求17所述的药物组合物，其中所述辅助依赖性载体与SEQ ID NO 1示出的核酸序列具有至少90％的序列同源性。

21.权利要求1所述的基于腺病毒的生物递送和表达系统在滑液细胞中体外表达白介素-1受体拮抗剂(Il-1Ra)的用途。

22.权利要求1所述的基于腺病毒的生物递送和表达系统在制备用于治疗或预防人或哺乳动物关节的骨关节炎或骨关节炎病症的药物中的用途。

说明书

用于治疗骨关节炎的基于腺病毒的生物递送和表达系统

发明领域

[0001] 本发明涉及基因工程领域，并提供基于腺病毒的生物递送和表达系统，其用于通过滑液细胞中人或哺乳动物白介素-1受体拮抗剂(Il-1Ra)的长期基因表达来治疗人或哺乳动物关节的骨关节炎。

[0002] 背景技术详述

[0003] 骨关节炎(OA)是人或哺乳动物关节中发生的退行性关节病，且其构成了严重的经济和医学问题(Matthews,G.L.,and Hunter,D.J.(2011).Emerging drugs for osteoarthritis(用于骨关节炎的新药物).Expert Opin.Emerging Drugs 1-13.；Brooks PM.Impact of osteoarthritis on individuals and society:how much disability？Social consequences and health economic implications(骨关节炎对个体和社会的影响：有多少残疾？社会后果和健康对经济的影响).Curr Opin Rheumatol 2002；14:573-577)。软骨是覆盖关节中骨端部的坚韧结缔组织。其提供硬骨之间的相对无摩擦且高度润滑的表面，并允许平稳的运动。OA发展期间，由于异常或过度磨损，软骨部分或完全损失，导致暴露的骨端部互相摩擦，引起炎症、疼痛、肿胀或丧失运动能力。到目前为止，导致OA的最初的软骨损失的具体原因尚不清楚，但发病率和年龄、肥胖以及关节的过度使用如过度体育运动之间具有高度相关性。因此，不仅在人类中还在许多哺乳动物中，特别是对于参加赛马和场地障碍赛的马，OA都是主要问题。

[0004] 特别是在马中，OA构成具有巨大经济影响的重大问题，马几乎一生都在用腿，并且用于竞技目的的马还额外经受过度训练。因此，竞技马的大部分关节过度使用严重，常常导致跛行。跛行的马占不能参加赛马或场地障碍赛的马案例中的约70％。这些案例中约60％与OA直接有关(Caron JP,Genovese,RL.Principals and practices of joint disease treatment(关节病治疗的原理和实践).In:Ross MW And Dyson S,eds.Diagnosis and Management of Lameness in the Horse(马跛行的诊断和处理).1st ed.Philadelphia:Saunders,2003:746-764)。因此，OA是马不能参加赛马比赛或表演最常见的原因。

[0005] 无论是对于马和人还是任何其它哺乳类动物物种的OA，目前都没有有效的根治疗法。医学治疗大多旨在使用止痛药减轻症状，而不是构建磨损的软骨。止痛治疗通常涉及数十年来在OA治疗中已显示疗效的类固醇和非类固醇抗炎药物(NSAID)。然而，在这些药物可抑制关节炎症的同时，已知其中的许多药物对软骨有恶化作用，其进一步恶化OA发展的基本进程。例如，还已广泛使用修复关节粘弹性和润滑性的透明质酸。另外，注射进关节的或者肌内注射的多硫酸化葡糖氨基葡聚糖以及口服给药的葡萄糖胺和硫酸软骨素已表现出一定疗效，然而其作用机制尚不完全清楚。因此，目前使用的疗法在OA治疗方面仅具有有限的疗效，并且其成功常常取决于病例的严重程度。而且，这些药物必须频繁给药，有时甚至相互联用。然而，频繁将药物注射进关节很费力，要承受感染的风险，会引起对马的压力，并且很昂贵。另外，手术一般已示出对马疗效低，并且通常仅对严重晚期个体进行。由此得出，存在明确的且还未满足的对更有效且持续的治疗的医疗需求，同时该治疗从长远而言具有成本效益。

[0006] OA期间，白介素-1(Il-1)起到炎症的主要介导作用(Dinarello CA.Interleukin-1family(白介素-1家族).In:Thomson AW,Lotz MT(eds).The Cytokine 
Handbook.Academic Press:London,2003,pp 643-668.；)。此外，Il-1通过软骨强烈抑制基质合成，并且在高浓度时，引发基质分解(Evans,C.H.,Gouze,J.N.,Gouze,E.,Robbins,P.D.,and Ghivizzani,S.C.(2004).Osteoarthritis gene therapy(骨关节炎基因疗法).Gene Ther 11,379-389)。为了抵消Il-1对滑膜炎的作用，使用白介素-1受体拮抗剂(Il-
1Ra)的治疗构成可能用于治疗感染骨关节炎的关节的构思(Evans,C.H.,Gouze,J.N.,Gouze,E.,Robbins,P.D.,and Ghivizzani,S.C.(2004).Osteoarthritis gene therapy(骨关节炎治疗).Gene Ther 11,379-389.；Caron JP et al.Chondroprotective effect of intraarticular injections of interleukin-1receptor antagonist in experimental osteoarthritis.Suppression of collagenase-1expression(骨关节炎实验中关节内注射白介素-1受拮抗剂的软骨保护作用。抑制胶原酶-1表达).Arthritis Rheum 1996；39:1535-1544)。在核酸水平上，Il-1Ra在哺乳类动物中是相当保守的。例如人Il-1Ra的cDNA序列(保藏号：NM_173842)与鼠变体(保藏号：NM_031167)共有82％的同源性，与马变体(保藏号：NM_001082525)共有84％的同源性，与犬变体(保藏号：NM_001003096)共有84％的同源性，与兔(lapine)变体(保藏号：NM_001082770)共有84％的同源性，与牛变体(保藏号：NM_174357)共有82％的同源性。

[0007] 已经确立使用基因疗法治疗关节炎的基本构思(Evans CH,Robbins PD.Gene therapy for arthritis,In:Wolff JA(ed.).Gene Therapeutics:Methods and Applications of Direct Gene Transferm(基因疗法：直接基因转移的方法和应用).Birkhauser:Boston,1994,pp 320-343)。在最接近的现有技术中，已描述了通过使用腺病毒介导的基因转移在体内递送马白介素-1受体拮抗剂基因来治疗马骨关节炎(D.D.Frisbie,S.C.Ghivizzani,P.D.Robbins,C.H.Evans,C.W.Mcllwraith,Gene Ther 9,12-20(2002))。用于表达马Il-1Ra DNA的腺病毒载体是一代腺病毒载体，其被证明会产生具有生物活性的马Il-1Ra。虽然在该研究中马的临床检验说明治疗性Il-1Ra的表达显著减轻了以跛行程度衡量的关节痛症状，但具有生物活性的马Il-1Ra转基因的递送和表达的作用仅仅是短期的。通过关节内注射各种量的带有Il-1Ra的载体，用马Il-1Ra治疗马后30天，关节中马Il-1Ra的表达降至正常水平。US 2003/0091536A1描述了用于治疗关节病的编码白介素-1受体拮抗剂的腺病毒颗粒，在其中也检测到相似的结果。使用的腺病毒颗粒是一代腺病毒载体。

[0008] 已描述了双组分表达系统，其由在老鼠的多关节胶原诱导性关节炎(CIA)模型中具有结构型巨细胞病毒(CMV)启动子的C3-人免疫缺陷病毒/转录反式激活因子[C3-Tat/HIV]组成(BAKKER A C ET AL:"C3-Tat/HIV-regulated intraarticular human interleukin-1receptor antagonist gene therapy results in efficient inhibition of collagen-induced arthritis superior to cytomegalovirus-regulated expression of the same transgene."(C3-Tat/HIV调控的关节内人白介素-1受体拮抗剂基因疗法有效抑制胶原诱导性关节炎，优于巨细胞病毒调控的相同转基因的表达),ARTHRITIS AND RHEUMATISM JUN 2002LNKD-PUBMED:12115199,vol.46,no.6,June 2002(2002-6),pages 1661-1670)。该文献具体涉及作为慢性渐进自身免疫性疾病的风湿性关节炎(RA)。其示出可以用高全身(high-systemic)剂量的Il-1Ra或使用离体方法局部产生Il-1Ra来抑制胶原诱导性关节炎(CIA)。

[0009] 辅助依赖性腺病毒(HDAd)，又称为裸腺病毒或高容量腺病毒，是腺病毒载体的最新代(Mitani,K.,Graham,F.L.,Caskey,C.T.&Kochanek,S.Rescue,propagation,and partial purification of a helper virus-dependent adenovirus vector(辅助病毒依赖性腺病毒载体的解救、增殖和部分纯化).Proc Natl Acad Sci USA 92,3854-3858(1995)；Parks,R.J.et al.A Helper-dependent adenovirus vector system:removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal(辅助依赖性腺病毒载体系统：通过Cre介导切除病毒包装信号除去辅助病毒).Proc Natl Acad Sci USA 93,13565-13570(1996)；Parks,R.J.Improvements in adenoviral vector technology:overcoming barriers for gene therapy(腺病毒载体技术的改进：克服基因疗法的障碍).Clin.Genet.58,1-11(2000))。这些载体缺少所有病毒序列，并且与更多致免疫性一代腺病毒相比能介导基因在多种组织中的长期表达(例如在肝中介导7年的基因表达)(Brunetti-Pierri,N.et al.Multi-Year Transgene Expression in Nonhuman Primates Following Hepatic Transduction with Helper-Dependent Adenoviral Vectors(用辅助依赖性腺病毒载体进行肝转导后非人灵长类的多年转基因表达).American Society of Gene&Cell Therapy,Annual Meeting 2011Molecular Therapy Volume 19,Supplement 1,May 2011)。然而，迄今为止，还没有评估过关节中辅助依赖性腺病毒介导的基因表达的寿命。

[0010] 也已描述过其他辅助依赖性腺病毒载体系统和其子代(PALMER DONNA ET AL:"Improved system for helper-dependent adenoviral vector production."(用于辅助依赖性腺病毒载体生产的改进系统),MOLECULAR THERAPY:THE JOURNAL OF THE AMERICAN SOCIETY OF GENE THERAPY NOV 2003LNKD-PUBMED:14599819,vol.8,no.5,November 2003(2003-11),pages 846-852,TOILEATTA GABRIELLE ET AL:"Generation of helper-dependent adenoviral vectors by homologous recombination."(通过同源重组产生辅助依赖性腺病毒载体),MOLECULAR THERAPY:THE JOURNAL OF THE AMERICAN SOCIETY OF GENE THERAPY FEB 2002LNKD-PUBMED:11829528,vol.5,no.2,February 2002(2002-02),pages 204-210)。

[0011] 专利US5747072A描述并请求保护重组腺病毒载体，其具有可操作地连接至编码抗炎多肽、核糖酶或反义RNA分子的基因的表达控制序列。对关节施用治疗有效量的重组一代腺病毒载体导致治疗个体的关节中炎症应答下降。再者，在其它研究中，Il-1Ra的长期表达是受限的。

发明内容

[0012] 因此本发明的目的是提供改进的递送和表达系统，其允许生物活性重组白介素-1受体拮抗剂(Il-1Ra)在人或哺乳动物关节的滑液细胞中长期表达，以治疗和预防骨关节炎。通过具有权利要求1中所述特征的基于腺病毒的生物递送和表达系统，提供了该问题的解决方案。本发明的优选实施方案是从属权利要求的主题。

[0013] 本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统是以含有编码人或哺乳动物白介素-1受体拮抗剂(Il-1Ra)的核酸序列、左反向末端重复和右反向末端重复(L ITR和R ITR)、腺病毒包装信号以及非病毒非编码填充核酸序列的辅助依赖性腺病毒载体为基础。而且，人或哺乳动物白介素-1受体拮抗剂(Il-1Ra)的基因由炎症诱导的启动子控制。用于本发明的优选炎症调控启动子是NF-кB启动子、白介素6(Il-6)启动子、白介素-1(Il-1)启动子、肿瘤坏死因子(TNF)启动子、环氧酶2(COX-2)启动子、补体因子3(C3)启动子、血清淀粉样蛋白A3(SAA3)启动子、巨噬细胞炎症蛋白-1α(MIP-1α)启动子或以上的杂合结构(construct)。启动子序列是位于克隆的Il-1Ra基因的阅读框的上游。具体是通过增加免疫刺激物质如革兰氏阴性细菌外细胞膜的主要成分的脂多糖(LPS)的水平来激活本发明的炎症调控启动子。
骨关节炎期间，释放多种免疫刺激物质和细胞因子，导致高水平的启动子激活物质。例如，一种成分是调控NF-κΒ启动子的NF-κΒ。因此，释放这类骨关节炎特异性活化子允许控制人或哺乳动物关节中的基因表达以治疗或预防骨关节炎病症。

[0014] 使用炎症诱导启动子提供对Il-1Ra基因在骨关节炎组织细胞中表达的特异性控制。只有受疾病影响的细胞会表达并分泌Il-1Ra基因产物，而未受影响的细胞保持静默。最优选使用用于炎症依赖性基因表达的NF-κB5-ELAM启动子。然而，在本发明的背景下可以使用引起Il-1Ra基因产物在骨关节炎组织中特异性表达的任何其它炎症依赖性启动子。

[0015] 本发明中使用的辅助依赖性腺病毒载体使宿主的免疫应答最小化，并且赋予人或哺乳动物Il-1Ra基因在被骨关节炎影响的关节中的长期表达。

[0016] 为获得最佳疗效，将本发明的辅助依赖性腺病毒载体优选以单注射剂量直接注射进骨关节炎个体的关节中。关节内注射后，Il-1Ra基因被递送至滑液细胞(synovial cell)如滑膜细胞(synoviocyte)。受炎症影响的滑液细胞在炎症诱导启动子如NF-κB启动子的控制下开始产生重组Il-1Ra蛋白。然后高含量的Il-1Ra被分泌进关节空间，其中Il-1Ra能通过阻断滑液细胞以及嵌入软骨的细胞的表面的白介素-1受体来抑制炎症并停止软骨降解。最重要的是，局部浓度高的重组Il-1Ra没有表现出任何副作用。

[0017] 因此，如以下实施例中示出的，使用本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统有效地抑制了疼痛、炎症和软骨降解。获得局部含量高且全身含量低的治疗性蛋白Il-1Ra，实现OA治疗的最大疗效同时没有副作用或副作用最小。进一步例证了含有本发明的辅助依赖性腺病毒载体的细胞在至少一年的延长期内能产生重组Il-1Ra。因此，将显著减轻了与已知的短期治疗中所需的频繁关节注射有关的医疗和经济负担。具体而言，由于其软骨保护作用，可以通过使用本发明的辅助依赖性腺病毒载体避免常用类固醇的严重的长期副作用。因此，使与OA治疗有关的常见并发症最小，并且从长远来看，将保持关节健康，从而持续改善治疗的动物或人的健康。

[0018] 另外，本发明载体的炎症依赖性Il-1Ra的产生允许预防骨关节炎病症的发展，因为在缺乏能激活NF-кB5-ELAM启动子或任何其它炎症依赖性启动子的免疫刺激物质的情况下，被本发明腺病毒载体感染的滑液细胞保持静默。只有骨关节炎病症开始时，由于炎症启动子才会被激活，并且之后产生并分泌Il-1Ra。因此，通过使用本发明的腺病毒递送和表达系统，该机制允许在早期预防骨关节炎的发展。

[0019] 本发明载体的炎症依赖性Il-1Ra的产生还可以被视为安全性特征，从而确保当例如骨关节炎病症治愈或已消失时，不再产生Il-1Ra。

[0020] 除了左和右反向末端重复(ITR)以及腺病毒包装信号之外，本发明中使用的辅助依赖性腺病毒载体不携带任何病毒序列。本发明中待用的优选辅助依赖性腺病毒载体是基于由Palmer和Ng(Palmer,D.,and Ng,P.(2003).Improved system for helper-dependent adenoviral vector production(用于辅助依赖性腺病毒载体产生的改进系统).Mol Ther 8,846-852.)和Toietta等(Toietta,G.,Pastore,L.,Cerullo,V.,Finegold,M.,Beaudet,A.L.,and Lee,B.(2002).Generation of helper-dependent adenoviral vectors by homologous recombination(通过同源重组生成辅助依赖性腺病毒载体).Mol Ther 5,
204-210.)研发的辅助病毒和辅助依赖性骨架系统的载体。本发明的优选的腺病毒递送和表达系统包含SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3示出的核酸序列或其生物学有效部分。SEQ ID NO 2示出的核酸序列记载了鼠辅助依赖性腺病毒载体，SEQ ID NO 3示出的序列记载了马辅助依赖性腺病毒载体，两者分别携带鼠Il-1Ra基因和马Il-1Ra基因。优选地，本发明的系统与SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3示出的载体具有至少50％、60％、70％、80％、90％的序列同源性。

[0021] 本发明背景下的“生物学有效的”意思是该腺病毒递送和表达系统的基因产物包含具有抵消Il-1对滑膜炎的作用的关节内活性的Il-1Ra的全部或部分多肽序列。

[0022] 本发明的辅助依赖性腺病毒载体优选含有由炎症诱导启动子控制的Il-1Ra的cDNA序列。尽管Il-1Ra含有种属特异性核酸序列，但腺病毒载体仍能从任何哺乳类动物或人表达白介素-1受体拮抗剂(Il-1Ra)。优选地，用于克隆的哺乳动物白介素-1受体拮抗剂(Il-1Ra)的cDNA是选自鼠Il-1Ra、马Il-1Ra、犬Il-1Ra、猫Il-1Ra、兔Il-1Ra、仓鼠Il-1Ra、牛Il-1Ra、骆驼Il-1Ra的cDNA或其在其它哺乳动物物种中的同源物。

[0023] 为了监控滑液细胞中基因载体序列的存在，本发明的辅助依赖性腺病毒载体优选还包含视觉可视或仪器可测的标记基因。优选的标记基因是例如绿色荧光蛋白(GFP)或荧光素酶。

[0024] 例如，在SEQ ID NO 1的序列表中示出了本发明使用的鼠Il-1Ra的核酸序列。如上所述，任何哺乳动物或人类物种的产生生物活性Il-1Ra蛋白的任何核酸序列均可用于本发明的背景中。另外，编码相同氨基酸、多肽或蛋白的保守型核酸序列也落入本发明的范围内。如现有技术中阐明的，多种物种的Il-1Ra基因相互之间共有高同源性。优选地，本发明的辅助依赖性腺病毒载体含有与SEQ ID NO 1中示出的核酸序列具有至少50％、60％、80％、90％的序列同源性的Il-1Ra的核酸序列(例如cDNA)。除了Il-1Ra的全长核酸序列外，本发明还包括Il-1Ra的生物活性核酸序列或其片段。

[0025] 本发明还包括用于治疗或预防骨关节炎的药物组合物，其包含含有编码人或哺乳动物白介素-1受体拮抗剂(Il-1Ra)的核酸序列、左反向末端重复和右反向末端重复(L ITR和R ITR)、包装信号以及非病毒非编码填充核酸序列的辅助依赖性腺病毒载体，其中通过炎症诱导启动子调控人或哺乳动物白介素-1受体拮抗剂(Il-1Ra)基因在滑液细胞中的表达。本发明背景中使用的优选启动子是NF-кB启动子、白介素6(Il-6)启动子、白介素-1(Il-1)启动子、肿瘤坏死因子(TNF)启动子、环氧酶2(COX-2)启动子、补体因子3(C3)启动子、血清淀粉样蛋白A3(SAA3)启动子、巨噬细胞炎症蛋白-1α(MIP-1α)启动子或以上的杂合结构。

[0026] 当关节内给药时，该腺病毒递送和表达系统特异性地定位于关节中是本发明的一大优势。最重要的是，在用本发明的腺病毒系统处理的小鼠的肝中未检出可测量浓度的载体序列。因此，在用本发明的载体注射的关节中，Il-1Ra浓度有望是最高的，而在任何其它器官中没有明显副作用。

[0027] 在下面的实施例中将进一步说明本发明。实施例

[0028] 在用本发明的辅助依赖性腺病毒载体(HDAd)感染的滑液细胞上清液中测量到高水平的Il-1Ra。如下所示，与未诱导的样品相比，用脂多糖(LPS)诱导的炎症引起Il-1Ra浓度急剧增加。在未感染的样品(模拟样品)或用对照载体(HDAd-GFP)感染的样品中未检测到Il-1Ra。实验证明用HDAd-mIl-1Ra感染的细胞可产生高水平的Il-1Ra。其还示出那些细胞有效地分泌Il-1Ra，以及炎性病症激活引起Il-1Ra水平增加的NF-кB5-ELAM启动子。

[0029] 本发明的辅助依赖性腺病毒载体的产生

[0030] 图1示出本发明HDAd载体的基因图。SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3中示出载体全序列。两种载体之间的唯一差异是GQ-201携带马Il-1Ra变体，而HDAd-mIl-1Ra带有鼠Il-1Ra变体。两种载体都含有位于SEQ IDNO 1的Il-1Ra cDNA的上游的炎症诱导NF-кB5-ELAM启动子，以及反向末端重复(ITR)和腺病毒包装信号。按照以下策略通过标准酶切/连接反应来克隆该载体。用NcoI和NheI切割pNifty-luc中的荧光素酶cDNA，即含有由NF-кB5-ELAM启动子驱动的荧光素酶cDNA的质粒，并将马或鼠Il-1Ra的cDNA连接到该位置。用NotI和PacI或EcoRI和PacI切割NF-кB5-ELAM启动子—鼠Il-1Ra或NF-кB5-ELAM启动子—马Il-1Ra盒(cassette)，将其钝化(blunt)并插入已用SalI线性化并钝化的pLPBL穿梭质粒中。然后用位于多克隆位点两侧的AscI切割NF-кB5-ELAM启动子—鼠Il-1Ra或NF-кB5-ELAM启动子—马Il-1Ra盒，并将其连接入AscI线性化的ρΔ28质粒中(Toietta,G.,Pastore,L.,Cerullo,V.,Finegold,M.,Beaudet,A.L.,and Lee,B.(2002).Generation of helper-dependent adenoviral vectors by homologous recombination(通过同源重组生成辅助依赖性腺病毒载体).Mol Ther 5,204-210.)，其产生基因质粒pΔ28-mIl-1Ra和pΔ28-eqIl-1Ra。用PmeI酶切这些质粒以使载体线性化，释放反向末端重复并切割细菌耐药基因。使用辅助病毒AdNG163R-2和116细胞工厂如前所述解救并扩增载体(Palmer,D.,and Ng,P.(2003).Improved system for helper-dependent adenoviral vector production(辅助依赖性腺病毒载体生产的改进系统).Mol Ther 8,846–852；Suzuki,M.,Cela,R.,Clarke,C.,Bertin,T.K., S.,and Lee,B.(2010).Large-scale production of high-quality helper-dependent adenoviral vectors using adherent cells in cell factories.(使用细胞工厂中的粘连细胞大规模生产高质量辅助依赖性腺病毒载体)Hum Gene Ther 21,120–126.)。

[0031] HDAd介导标记基因在关节中的长期表达

[0032] 为了测定基因在关节中多达一年的长期表达，给小鼠关节内注射本发明的辅助依赖性腺病毒载体(HDAd)，以及在CMV启动子的控制下表达萤火虫荧光素酶(luc)的一代腺病毒(Ad)载体，用于比较。使用体内生物发光成像跟踪luc随时间的表达。注射两种载体三天后检测到强的起始luc信号(图2A)。其后，两种载体的表达降低，一个月后，未检测到一代载体Ad-luc的表达(图2B)。然而，HDAd-luc荧光素酶在第10天时稳定表达并且在该水平稳定380天。

[0033] 关节内注射后HDAd转导(transduce)滑液细胞

[0034] 为了详细评价小鼠关节中HDAd的转导，给小鼠关节内注射LacZ表达HDAd。滑膜中观察到LacZ强表达，但软骨细胞中没有观察到表达(图3)。本发明人还对这些动物的肝进行分析以评估病毒是从关节逃出的还是在注射时溢出的。最重要的是，相对于背景，通过定量PCR没有测量到可检测的载体浓度(数据未示出)。因此，该载体特异性地定位于关节中并保持在那儿，这在治疗或预防骨关节炎病症中非常有利，因为这意味着最小的副作用。

[0035] 感染HDAd-Il-1Ra的细胞分泌Il-1Ra

[0036] 在炎症诱导NF-кB5-ELAM启动子的控制下生成HDAd表达Il-1Ra，并在体外测试其功能性。第3天时,在感染HDAd-Il-1Ra的细胞上清液中测量到高水平的Il-1Ra(图4)。与未诱导的样品相比，用脂多糖(LPS)诱导的炎症引起Il-1Ra浓度急剧增加。在未感染的样品(模拟样品)或用对照载体(HDAd-GFP)感染的样品中未检测到Il-1Ra。

[0037] HDAd-Il-1Ra预防小鼠OA的发展

[0038] 为了评价HDAd表达Il-1Ra是否能预防OA的发展，对小鼠膝关节关节内注射HDAd-Il-1Ra或GFP表达对照载体(HDAd-GFP)。注射两天后，进行十字韧带横切以诱导OA发展。Brendan Lee博士的研究团队开发了该骨关节模型，并在一些实验中进行验证(Ruan,Z.,Dawson,B.,Jiang M.M.,Gannon,F.,Heggeness,M.,Lee,B.(2012).Quantitative volumetric imaging of murine osteoarthritic cartilage by phase contrast micro-computed tomography,submitted(由相衬微计算机断层扫描对鼠骨关节炎软骨的定量体积成像))。该模型涉及横切膝关节的前交叉韧带和后交叉韧带，这导致了严重OA的发展。OA诱导一个月后牺牲小鼠，并组织学地制备关节，并用番红O染色。盲性(blinded)病理学家根据OARSI(国际骨关节炎研究会)标准(按标尺1-6设置分数，1：完全没有OA症状，6：
最大限度的OA)对OA的发展评分。HDAd-Il-1Ra治疗的关节具有比HDAd-GFP治疗的或未治疗的关节明显更低的OA分数，表明HDAd-Il-1Ra预防OA的发展(图5)。对照载体HDAd-GFP似乎对OA的发展没有任何影响，因为平均OA分数与未治疗组的相当。

[0039] HDAd-mIl-Ra治疗鼠疾病模型的OA

[0040] 用上述的鼠疾病模型评价HDAd-mIl-1Ra在OA治疗中的疗效。使用该模型评价HDAd-Il1-Ra能否有效治疗OA。因此通过交叉韧带横切诱导OA(除了未横切组)，并让OA发展两周。然后注射HDAd-Il-1Ra、对照载体(HDAd-GFP)或媒介(vehicle)，又6周之后牺牲小鼠以对关节进行分析。经HDAd-GFP处理的和未注射的小鼠的OA发展到相同程度，平均分数大约为4.5(图6A)。然而，经HDAd-Il-1Ra处理的小鼠与经HDAd-GFP和模拟样品处理的小鼠相比具有显著更低的OA分数。HDAd-Il-1Ra处理的和未横切的(无OA)小鼠之间未发现显著差异，表明HDAd-Il-1Ra有效治疗或预防了疾病。在该实验中，本发明人通过微计算机断层(μCΤ)进一步分析评价了关节。该技术将高分辨(低至0.5微米)x-射线CT扫描与相衬光学结合，使得在小的动物关节中软骨可视化。可以使用关节的三维重建和计算组织分析工具定量一些软骨参数如体积和表面积。经HDAd-Il-1Ra处理的关节与经HDAd-GFP和模拟样品处理的关节相比显示明显更大的软骨体积(图6B)。HDAd-Il-1Ra组和未横切的(无OA)组之间没有观察到显著差异。另外，经HDAd-Il-1Ra处理的小鼠的软骨表面积与HDAd-GFP组和模拟样品组的相比，明显更大(图6C)，而HDAd-Il-1Ra组与未横切的组的(无OA)关节之间没有观察到显著差异。

[0041] 附图简要说明附图说明：

[0042] 图1

[0043] 该图示出本发明的辅助依赖性腺病毒载体的基本基因图。该载体骨架由左和右反向末端重复(ITR)、腺病毒包装信号(Ψ)和非编码非病毒填充序列组成(ITR之间保留未标记序列)。在使用的腺病毒载体的病毒左和右ITR之间克隆鼠Il-1Ra的cDNA。由炎症诱导NF-кB5-ELAM启动子控制Il-1Ra基因。

[0044] 图2

[0045] A.辅助依赖性腺病毒载体和一代腺病毒载体介导相同水平的标记基因表达。对小鼠关节内注射108个荧光素酶表达辅助依赖性(HDAd-luc)或各自的一代(Ad-luc)腺病毒载体的病毒颗粒(VP)。三天后，使用IVIS200系列成像系统(Caliper Life Sciences,Hopkintom MA)为小鼠成像。在用HDAd-luc和Ad-luc腺病毒载体注射的关节中都检测到强生物发光信号。对每组四只小鼠的膝关节都进行注射；示出每组两只小鼠的典型图像。

[0046] B.辅助依赖性腺病毒载体介导标记基因在关节中的长期表达。通过反复的生物发光成像跟踪A中描述的小鼠的荧光素酶表达，并使用Living Image 2.5软件(Caliper Life Sciences)定量。表达降低，并且30天时未检出用一代腺病毒载体(Ad-luc)组的表达。用辅助依赖性腺病毒载体(HDAd-luc)组的表达也会下降，但在第10天达到稳定，并且380天内大致稳定在该水平。

[0047] 图3

[0048] 辅助依赖性腺病毒载体有效地感染滑膜细胞。对小鼠关节内注射108个LacZ表达HDAd的VP。一天后，牺牲小鼠，并在切片的关节上进行LacZ染色。滑膜中观察到强表达(深蓝色染色)，而软骨细胞中没有观察到染色。右图是左图(5x)中方框区域的较高倍放大图(40x)。

[0049] 图4

[0050] 用HDAd-Il-1Ra感染的细胞产生大量的Il-1Ra。用100VP/细胞的HDAd-Il-1Ra、HDAd-GFP或模拟样品感染人胚肾细胞(HEK293)。两天后，用细胞培养上清液进行Il-1Ra ELISA。HDAd-Il-1Ra感染的细胞中测得浓度为大约700pg/ml，而在HDAd-GFP或模拟样品感染的细胞的上清液中没有检测到Il-1Ra。为了诱导炎性反应，将脂多糖(LPS，100μg/ml)加入一半样品中，一天后(第4天)再次测定Il-1Ra浓度。HDAd-Il-1Ra样品中的Il-1Ra水平增加至大约1600pg/ml，而与前一天的相比，未诱导细胞产生较少的Il-1Ra。对照样品(HDAd-GFP和模拟样品)中的任一个都没有检出Il-1Ra表达。

[0051] 图5

[0052] HDAd-Il-1Ra预防OA的发展。对小鼠向膝关节关节内注射108个HDAd-Il-1Ra、HDAd-GFP或模拟样品的VP，并且两天后通过交叉韧带横切诱导OA。4周后牺牲小鼠，并组织学地制备关节，切片并用番红O染色。盲性病理学家根据OARSI(国际骨关节炎研究会)标准(按标尺1-6设置分数，1：完全没有OA症状，6：最大限度的骨关节炎)对OA的发展评分。用HDAd-Il-1Ra处理的小鼠与用HDAd-GFP和模拟样品处理的相比具有明显较低的OA分数。(*表示显著性差异：p<0.05，单向方差分析；n＝每组10个关节)

[0053] 图6

[0054] HDAd-Il-1Ra有效地治疗小鼠的OA。

[0055] A.经HDAd-Il-1Ra处理的关节相对于对照具有明显更低的OA分数。通过交叉韧带横切在小鼠膝关节中诱导OA，并且使该疾病发展。横切两周后，对小鼠关节内注射108个HDAd-Il-1Ra、HDAd-GFP或模拟样品的VP。6周后牺牲小鼠，并组织学地制备关节，切片并用番红O染色。盲性病理学家根据OARSI(国际骨关节炎研究会)标准(按标尺1-6设置分数，1：完全没有OA症状，6：最大限度的骨关节炎)对OA的发展评分。用HDAd-Il-1Ra处理的小鼠与用HDAd-GFP和模拟样品处理的相比具有明显较低的OA分数。HDAd-Il-1Ra组和年龄相当的未横切(无OA诱导)的小鼠之间没有发现显著差异。(*表示显著性差异：p<0.05，单向方差分析；n＝每组8个关节)

[0056] B.经HDAd-Il-1Ra处理的关节相对于对照显示显著更大的软骨体积。将用与以上描述的相同的方式处理的小鼠的整个膝关节固定在电镜固定剂中，并嵌入石蜡。使用X-radia microXCT扫描仪(Xradia，普莱森顿，加拿大、美国)扫描样品，并于4微米分辨率下使其可视化。进行关节的计算3D重建，并使用TRI BON软件(RATOC系统工程，东京，日本)半自动定量软骨体积和表面积。与对照相比，在经HDAd-Il-1Ra处理的关节中测量到显著更大的软骨体积。HDAd-Il-1Ra组的关节具有与未横切的(健康)关节相近的体积。(*表示显著差异性：p<0.05，单向方差分析；n＝6个关节/每组)。

[0057] C.经HDAd-Il-1Ra处理的关节相对于对照显示显著更大的软骨表面积。按上面描述的测量软骨表面积。与对照相比，HDAd-Il-1Ra处理导致显著更大的软骨表面积。HDAd-Il-1Ra处理的关节的表面积与未横切(健康)的对照的表面积相近。(*表示显著差异性：p<0.05，单向方差分析；n＝6个关节/每组)。