鲨肌醇的制造方法

摘要

本发明的课题在于提供一种可采用一步法由葡萄糖等低成本且普遍存在的原料生产鲨肌醇的工业制造方法。进一步提供由该制造方法得到的新颖的鲨肌醇衍生物。鲨肌醇利用保有肌醇‑1‑磷酸合成酶基因、肌醇单磷酸酶基因、肌肉肌醇脱氢酶基因和鲨肌醇脱氢酶基因的转化微生物通过一个步骤由葡萄糖进行发酵生产。通过该发酵还提供与葡萄糖等糖类结合的鲨肌醇衍生物。

权利要求

1.一种鲨肌醇衍生物的制造方法，其包括下述工序：

1)准备转化微生物的工序，该转化微生物保有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇单磷酸酶基因、肌肉肌醇脱氢酶基因和鲨肌醇脱氢酶基因；和

2)在适于所述微生物的生长和/或维持的条件下，使该微生物与葡萄糖或具有葡萄糖单元的二糖类或者多糖类进行接触的工序，所述鲨肌醇衍生物为下述结构式所表示的化合物：[化1]

所述转化微生物具有对功能性肌醇单磷酸酶的过剩生产或肌醇单磷酸酶的活化进行诱导的基因重组或变异。

2.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于，所述转化微生物来源于不具有肌肉肌醇同化能力的微生物。

3.如权利要求1所述的制造方法，其中，所述转化微生物来源于选自由大肠杆菌、芽胞杆菌属细菌、棒状杆菌属细菌、发酵单胞菌属细菌组成的组中的细菌。

4.如权利要求1所述的制造方法，其中，所述肌醇单磷酸酶的过剩生产是通过对所述转化微生物进行以下操作而被诱导的：a)导入外来肌醇单磷酸酶基因；

b)增加内源性肌醇单磷酸酶基因的拷贝数；

c)在内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域导入变异、d)利用高表达诱导性外来调整区域来置换内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域；或者e)使内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域缺失。

5.如权利要求4所述的制造方法，其中，所述肌醇单磷酸酶的过剩生产是通过对所述转化微生物导入外来肌醇单磷酸酶基因而被诱导的。

6.如权利要求1所述的制造方法，其中，所述肌醇单磷酸酶的活化是通过对所述转化微生物进行以下操作而被诱导的：f)在内源性肌醇单磷酸酶基因中导入变异；

g)置换内源性肌醇单磷酸酶基因的一部分或全部；

h)使内源性肌醇单磷酸酶基因的一部分缺失；

i)使降低肌醇单磷酸酶活性的其它蛋白质减少；

j)使降低肌醇单磷酸酶活性的化合物的生成减少。

7.一种鲨肌醇的制造方法，其特征在于，利用能够催化β-糖苷键的水解反应的酶将利用权利要求1所述的制造方法得到的鲨肌醇衍生物分解，生成鲨肌醇。

说明书

鲨肌醇的制造方法

技术领域

[0001] 本发明涉及基因重组技术在鲨肌醇的制造中的应用。特别涉及可采用一步法由葡萄糖等普遍存在的原料生产鲨肌醇的转化体以及利用该转化体的鲨肌醇的工业制造方法。本发明还涉及利用上述转化体生产得到的鲨肌醇衍生物及其制造方法、以及来自该衍生物的鲨肌醇的制造方法。

背景技术

[0002] 鲨肌醇(scyllo-inositol；顺-1,3,5-反-2,4,6-环己六醇)为肌醇的光学惰性异构体之一，是自古以来在动物和植物中发现的化合物。但是，到了近年，鲨肌醇所具有的各种生理活性引起了人们的注意。

[0003] 例如，非专利文献1报告了鲨肌醇具有淀粉样β蛋白聚集抑制作用，该作用暗示鲨肌醇在阿兹海默氏病治疗中的潜在的有用性。此外，专利文献1请求保护以鲨肌醇为有效成分的血糖值降低剂。从而存在对鲨肌醇进行工业生产的明确的必要性。

[0004] 在传统的生产方法中，是从植物体提取鲨肌醇或以肌肉肌醇为原料进行该化合物的化学合成(非专利文献2和3、专利文献2等)。但是，近年来研究了利用天然型微生物或微生物来源的酶更有效地进行鲨肌醇的生产的方法。

[0005] 专利文献3中公开了下述方法：利用含有肌肉肌醇的培养基对属于农杆菌属的微生物进行培养，在培养液中生成肌醇空间异构体；或者使属于农杆菌属的微生物的菌体或菌体处理物作用于肌肉肌醇，生成肌醇空间异构体。通过这些异构体化，肌肉肌醇被转换为鲨肌醇、手性肌醇(chiro-inositol：为D体和L体的混合物)和新肌醇(neo-inositol)的混合物。

[0006] 在专利文献4中记载了使假单胞菌sp.AB10064株(FERMP-18330)或醋酸杆菌sp.AB10253株(FERMP-18868)作用于肌肉肌醇，将肌肉肌醇转换为鲨肌醇单酮(scyllo-inosose)的内容。进一步尝试了通过将由此生成的鲨肌醇单酮利用硼氢化钠进行还原来合成鲨肌醇，但利用该还原处理实质上仅生成了与肌肉肌醇(即，向原料的逆向反应)的混合物的形式的鲨肌醇。因而，在专利文献4所记载的鲨肌醇的制造方法中，需要反复进行利用肌肉肌醇的微生物向鲨肌醇单酮的转换与利用硼氢化钠的还原处理来逐渐增加鲨肌醇的含量。

[0007] 专利文献5中公开了一种鲨肌醇的制造方法，在该制造方法中，使用肌肉肌醇作为原料，在将由肌肉肌醇生成鲨肌醇单酮的肌肉肌醇2-脱氢酶(EC1.1.1.18)、将鲨肌醇单酮+ +立体选择性地还原为鲨肌醇的鲨肌醇脱氢酶、以及NAD或NADP混合得到的溶液中进行将肌肉肌醇转换为鲨肌醇的酶转换反应。该文献中，由肌肉肌醇向鲨肌醇的转换以产率基准计为31％。

[0008] 从而，上述任一文献均涉及的是以肌肉肌醇为起始原料来生产鲨肌醇的方法，对于鲨肌醇的从头生物合成、也即由葡萄糖等普遍存在的原料直接地且利用一步法来生产鲨肌醇的方法却并未教导。

[0009] 特别是，肌肉肌醇本身本来就是极为有用且贵重的生理活性物质。即，肌肉肌醇对多数高等动物来说为必不可缺的物质，因而其作为营养食品、饲料、药品等成分广泛使用。例如，已知肌肉肌醇在脂肪、胆固醇类的代谢中发挥出重要的作用，在高胆固醇血症等的预防、治疗中是特别有效的。

[0010] 因而，实际上，目前就对肌肉肌醇工业规模的制造工艺提出了很多改良。例如，专利文献6中公开了可向菌体外分泌肌肉肌醇的假丝酵母属酵母的表达及其利用。专利文献7和8分别公开了在上述肌肉肌醇分泌性假丝酵母属酵母中导入可赋予针对葡萄糖代谢拮抗物质和抗生素的耐性的突变的内容。另外，在专利文献9、10和11中还分别公开了通过在具有肌肉肌醇生产能力的假丝酵母属酵母中导入可赋予针对叔胺、六氯环己烷和十六烷基三甲基铵盐的耐性的突变来提高肌肉肌醇的收率的内容。专利文献12中同样公开了在具有肌肉肌醇生产能力的假丝酵母属酵母中导入可赋予针对6-卤代-6-脱氧葡萄糖的耐性的突变的内容。在专利文献13中还公开了在具有肌肉肌醇生产能力的假丝酵母属酵母中导入可赋予针对卤化乙酰甲酸的耐性的突变的内容。并且，除此之外，例如专利文献14中公开了下述内容：在一系列的肌肉肌醇生物合成反应中，肌醇-1-磷酸合成酶承担控速反应，在这一恰当推论下，通过单独利用编码上述肌醇-1-磷酸合成酶的DNA对不具有肌肉肌醇分泌能力的假丝酵母属酵母进行转化，对该酵母赋予了肌肉肌醇生产能力；专利文献15中公开了通过将置于甘油-3-磷酸脱氢酶基因的启动子的调节下的编码肌醇-1-磷酸合成酶的DNA单独导入到酵母中来提高该酵母的肌肉肌醇生产率的内容。

[0011] 上述事实均表明，确立肌肉肌醇的有效且经济的生产方法本身在目前依然是重要的技术课题。因而，现有技术中不得不以贵重且昂贵的肌肉肌醇为原料的鲨肌醇制造方法的低效率性、不经济性一目了然。

[0012] 进一步地，在上述任一文献中均未公开或暗示鲨肌醇衍生物、特别是由糖类进行了衍生化的鲨肌醇。

[0013] 现有技术文献

[0014] 专利文献

[0015] 专利文献1：日本特开2003-160478号公报

[0016] 专利文献2：西德专利公开公报第3,405,663号公报

[0017] 专利文献3：日本特开平9-140388号公报

[0018] 专利文献4：日本特开2003-102492号公报

[0019] 专利文献5：日本特开2010-187688号公报

[0020] 专利文献6：日本特开平8-00258号公报

[0021] 专利文献7：日本特开平8-38188号公报

[0022] 专利文献8：日本特开平8-89262号公报

[0023] 专利文献9：日本特开平9-117295号公报

[0024] 专利文献10：日本特开平10-42860号公报

[0025] 专利文献11：日本特开平10-42882号公报

[0026] 专利文献12：日本特开平10-42883号公报

[0027] 专利文献13：日本特开2000-41689公报

[0028] 专利文献14：日本特开平9-220093号公报

[0029] 专利文献15：日本特开平10-271995号公报

[0030] 非专利文献

[0031] 非专利文献1：The Journal of Biological Chemistry,Vol.275,No.24,pp.18495～18502(2000)

[0032] 非专利文献2：药学杂志,89卷,1302～1305页(1969)

[0033] 非专利文献3：Liebigs Ann.Chem.,866～868页(1985)

发明内容

[0034] 发明所要解决的课题

[0035] 因而，本发明的第一课题涉及一种可由葡萄糖等低成本且普遍存在的原料通过一步法生产鲨肌醇的工业制造方法。本发明人进一步在上述研究过程中首次发现了与糖类结合的本发明的鲨肌醇衍生物。该鲨肌醇衍生物与鲨肌醇本来所显示出的水溶性相比，也显示出了格外优异的水溶性。由于例如纤维素二糖(D-吡喃葡萄糖-(β1→4)-D-葡萄糖)显示出了比葡萄糖低的溶解性，因而本发明的技术思想令人吃惊。从而，本发明的第二课题在于提供一种新颖的鲨肌醇衍生物。

[0036] 解决课题的手段

[0037] 如上所述，最近的研究中均主要涉及的是以肌肉肌醇为起始原料通过酶反应转换为鲨肌醇的方法。在上述任一现有文献中，均未成功构建宿主微生物细胞内的功能性鲨肌醇的从头的生物合成体系，也即未成功确立由葡萄糖等普遍存在的原料直接且以一步法进行鲨肌醇的发酵生产的方法。

[0038] 但是，本发明人发现，表达肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇单磷酸酶基因、肌肉肌醇脱氢酶基因和鲨肌醇脱氢酶基因的转化体能够由葡萄糖直接地且以一个步骤进行鲨肌醇的发酵生产。本发明人进一步在这样的转化体的培养物中发现了新颖的鲨肌醇衍生物。

[0039] 因而，本发明的第一方面在于：

[0040] (1)一种鲨肌醇和鲨肌醇衍生物的制造方法，其包括下述工序：

[0041] 1)准备转化微生物的工序，该转化微生物保有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇单磷酸酶基因、肌肉肌醇脱氢酶基因和鲨肌醇脱氢酶基因；和

[0042] 2)在适于上述微生物的生长和/或维持的条件下，使该微生物与葡萄糖或具有葡萄糖单元的二糖类或者多糖类进行接触的工序。

[0043] 更特定地说，上述制造方法为使用转化体的鲨肌醇及其衍生物的制造方法，其特征在于，该转化体表达肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇单磷酸酶基因、肌肉肌醇脱氢酶基因和鲨肌醇脱氢酶基因。

[0044] 上述(1)的培养物中生产的鲨肌醇衍生物为新颖的化合物，在该衍生物中，葡萄糖与鲨肌醇呈β1→4键合。因而，本发明的一个方式为：

[0045] (2)如上述(1)所述的制造方法，其中，上述鲨肌醇衍生物为下述结构式所表示的化合物：

[0046] [化1]

[0047]

[0048] 进一步令人吃惊的是，通过增强这样的转化体的肌醇单磷酸酶活性，鲨肌醇生产能力大幅提高。此外，令人预想不到的是，利用该转化体主要生产的是鲨肌醇，肌肉肌醇的生产极少。在本申请优先权日以前的任一现有文献中均未公开或暗示为了该目的而增强肌醇单磷酸酶活性的内容。因而，本发明的第二方面在于：

[0049] (3)如上述(1)或(2)所述的制造方法，其特征在于，上述转化微生物具有对功能性肌醇单磷酸酶的过剩生产或肌醇单磷酸酶的活化进行诱导的基因重组或变异。

[0050] 对于以大肠杆菌为代表的原核微生物来说，由于其迅速的生长能力以及发酵管理的容易性，因而从工业发酵生产的方面考虑是极富魅力的，同时从应用基因重组技术时的实际成绩、可靠的安全性的方面考虑也具有优点。此外，对于不具有从葡萄糖经肌肉肌醇来生物合成鲨肌醇的通路的多数原核微生物来说，通过使用与基因重组技术联合的合成生物学方法，具有容易调节鲨肌醇生产率的优点。特别是大肠杆菌等原核微生物宿主不具有对作为鲨肌醇生物合成通路中间体的肌肉肌醇的同化能力(分解能力)，因而更容易应用合成生物学的方法。

[0051] 因而，本发明的适宜方式为：

[0052] (4)如上述(1)～(3)的任一项所述的制造方法，其特征在于，上述转化微生物来源于不具有肌肉肌醇同化能力的微生物；以及

[0053] (5)如上述(1)～(4)的任一项所述的制造方法，其中，上述转化微生物来源于选自由大肠杆菌、芽胞杆菌属细菌、棒状杆菌属细菌、发酵单胞菌属细菌组成的组中的细菌。

[0054] 关于上述(3)的适宜方式，无论宿主微生物是否具有内源性肌醇单磷酸酶活性，均可通过肌醇单磷酸酶在该细胞内的过剩生产来增强该细胞的肌醇单磷酸酶活性。可应用各种公知的技术使肌醇单磷酸酶在细胞中过剩生产。因而，本发明包括下式方式：

[0055] (6)如上述(3)～(5)的任一项所述的制造方法，其中，上述肌醇单磷酸酶的过剩生产是通过对上述转化微生物进行下述操作而被诱导的：

[0056] a)导入外来肌醇单磷酸酶基因；

[0057] b)增加内源性肌醇单磷酸酶基因的拷贝数；

[0058] c)在内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域导入变异；

[0059] d)利用高表达诱导性外来调整区域来置换内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域；或者

[0060] e)使内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域缺失；以及

[0061] (7)如上述(6)所述的制造方法，其中，上述肌醇单磷酸酶的过剩生产是通过对上述转化微生物导入外来肌醇单磷酸酶基因而被诱导的。

[0062] 此外，在宿主细胞具有内源性肌醇单磷酸酶基因的情况下，也可利用下述方式来增强该细胞的肌醇单磷酸酶活性。因而，本发明包括下述方式：

[0063] (8)如上述(3)～(5)的任一项所述的制造方法，其中，上述肌醇单磷酸酶的活化是通过对上述转化微生物进行以下操作而被诱导的：

[0064] f)在内源性肌醇单磷酸酶基因中导入变异；

[0065] g)置换内源性肌醇单磷酸酶基因的一部分或全部；

[0066] h)使内源性肌醇单磷酸酶基因的一部分缺失；

[0067] i)使降低肌醇单磷酸酶活性的其它蛋白质减少；

[0068] j)使降低肌醇单磷酸酶活性的化合物的生成减少。

[0069] 此外，本发明还谋求用于上述鲨肌醇及其衍生物的制造方法的转化体。因而，本发明的另一方面在于：

[0070] (9)一种转化微生物，其保有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇单磷酸酶基因、肌肉肌醇脱氢酶基因和鲨肌醇脱氢酶基因。

[0071] 此外，本发明第二方面中记载的事项和方式也适用于本发明上述(9)的转化体。因而它们包括下述方式：

[0072] (10)如上述(9)所述的转化微生物，其特征在于，上述转化微生物进一步具有对功能性肌醇单磷酸酶的过剩生产或肌醇单磷酸酶的活化进行诱导的基因重组或变异；

[0073] (11)如上述(9)或(10)所述的转化微生物，其特征在于，上述转化微生物来源于不具有肌肉肌醇同化能力的微生物；

[0074] (12)如上述(9)～(11)的任一项所述的转化微生物，其中，上述转化微生物来源于选自大肠杆菌、芽胞杆菌属细菌、棒状杆菌属细菌、发酵单胞菌属细菌组成的组中的细菌；

[0075] (13)如上述(10)～(12)的任一项所述的转化微生物，其中，上述肌醇单磷酸酶的过剩生产是通过对上述转化微生物进行下述操作而被诱导的：

[0076] a)导入外来肌醇单磷酸酶基因；

[0077] b)增加内源性肌醇单磷酸酶基因的拷贝数；

[0078] c)在内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域导入变异；

[0079] d)利用高表达诱导性外来调整区域来置换内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域；或者

[0080] e)使内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域缺失；

[0081] (14)如上述(13)所述的转化微生物，其中，上述肌醇单磷酸酶的过剩生产是通过对上述转化微生物导入外来肌醇单磷酸酶基因而被诱导的；以及

[0082] (15)如上述(10)～(12)的任一项所述的转化微生物，其中，上述肌醇单磷酸酶的活化是通过对上述转化微生物进行下述操作而被诱导的：

[0083] f)在内源性肌醇单磷酸酶基因中导入变异；

[0084] g)置换内源性肌醇单磷酸酶基因的一部分或全部；

[0085] h)使内源性肌醇单磷酸酶基因的一部分缺失

[0086] i)使降低肌醇单磷酸酶活性的其它蛋白质减少

[0087] j)使降低肌醇单磷酸酶活性的化合物的生成减少。

[0088] 本发明进一步的方面涉及一种新颖的鲨肌醇衍生物，该鲨肌醇衍生物被发现在上述转化体的培养物中生产出。即，本发明还要求：

[0089] (16)下述结构式所表示的化合物。

[0090] [化2]

[0091]

[0092] 本发明的鲨肌醇衍生物可通过能够催化β-糖苷键的水解反应的酶、例如β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)分解，容易地生成葡萄糖与鲨肌醇。此外，本发明的鲨肌醇衍生物所显示出的高水溶性在这样的酶反应可以是有利的。因而，本发明进一步的其它方面为：

[0093] (17)一种鲨肌醇的制造方法，其特征在于，利用能够催化β-糖苷键的水解反应的酶将上述(16)的化合物的分解，生成鲨肌醇。

[0094] 此外，本发明在于：

[0095] (18)一种组合物，其包含鲨肌醇与上述(16)所述的化合物。

[0096] 发明的效果

[0097] 根据本发明，能够利用微生物培养技术有效实现鲨肌醇的工业生产。此外，本发明提供新颖的鲨肌醇衍生物。该衍生物的水溶性极高，因而在生产工序中可提高每批的生产浓度，在制造相关制品时的处理性优异。此外可提高鲨肌醇的工业生产率。

附图说明

[0098] 图1示出了INO1基因的编码区域(序列编号1)。

[0099] 图2示出了suhB基因的编码区域(序列编号3)。

[0100] 图3示出了iolG基因的编码区域(序列编号5)。

[0101] 图4示出了iolW基因的编码区域(序列编号7)。

[0102] 图5为本发明鲨肌醇衍生物的1H-NMR光谱。图中箭头所示的峰为杂质来源的峰。

[0103] 图6为本发明鲨肌醇衍生物的13C-NMR光谱。

[0104] 图7示出了本发明鲨肌醇衍生物利用β-葡糖苷酶(纤维二糖酶)进行分解的示例。

具体实施方式

[0105] 本发明的第一课题是通过使保有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇单磷酸酶基因、肌肉肌醇脱氢酶基因和鲨肌醇脱氢酶基因的转化微生物在含有葡萄糖或具有葡萄糖单元的二糖类或者多糖类作为碳源的培养基内进行发酵、或者使该转化体与上述碳源接触而得到解决的。即，本发明的转化微生物具有可利用在该微生物内新构建的连续的生物合成通路通过对葡萄糖底物进行一个步骤的发酵而转换为鲨肌醇及其衍生物的能力。

[0106] 代表性地，将葡萄糖底物转换成本发明的鲨肌醇(或同时生产出的鲨肌醇衍生物。下文中，也将这两者一起称为“本发明的鲨肌醇”)的生物合成通路包括将葡萄糖底物转换成作为重要的中间体的肌肉肌醇的部分通路。

[0107] 具体地说，在为原核微生物宿主的情况下，可通过下述催化剂活性的表达而使该微生物内用于肌肉肌醇生物合成的部分通路发挥出功能。

[0108] 活性1：由适当的碳源生成葡萄糖-6-磷酸的活性；

[0109] 活性2：将葡萄糖-6-磷酸转换为肌肉肌醇-1-磷酸的活性、即肌醇-1-磷酸合成酶活性；和

[0110] 活性3：以肌肉肌醇-1-磷酸为底物的磷酸酶活性。

[0111] 但是，由于作为活性1的生成物的葡萄糖-6-磷酸为微生物普遍产生的代谢中间体，因而不必特意对转化体赋予该活性。此外，对于活性3来说，就本发明人所知，大多数适于通过现有的基因重组方法进行工业生产的原核微生物宿主细胞表达内源性肌醇单磷酸酶、或者具有能够以肌肉肌醇-1-磷酸为底物的通用单磷酸酶活性。

[0112] 此外，若对活性2进行观察，则多为原核微生物不具有肌醇-1-磷酸合成酶基因的示例。并且，在肌肉肌醇生物合成反应中，认为肌醇-1-磷酸合成酶承担控速反应(参照专利文献14和15)。因而，为了在原核微生物宿主内构建功能性肌肉肌醇生物合成通路，认为在该细胞中导入外来性肌醇-1-磷酸合成酶基因是十分必要的。

[0113] 但是，在与本申请同时进行的日本国专利申请第2011-248438号中，本发明人发现，通过增强导入了上述外来性肌醇-1-磷酸合成酶基因的转化体中的肌醇单磷酸酶活性，肌肉肌醇生产能力令人预想不到地大幅提高。更令人吃惊地发现：如后述实施例所述，本发明的转化体通过增强该肌醇单磷酸酶活性，可极大量且占优势地进行鲨肌醇的生产，而几乎不生产肌肉肌醇，不仅如此，还生产出实质量的本发明的鲨肌醇衍生物。因而，在本发明的转化体中除了导入上述的外来性肌醇-1-磷酸合成酶基因以外，优选还导入诱导功能性肌醇单磷酸酶的过剩生产或肌醇单磷酸酶的活化的基因重组或变异。

[0114] 例如，无论宿主微生物是否具有内源性肌醇单磷酸酶活性，通过在转化微生物细胞内过剩生产肌醇单磷酸酶，均可增强该转化微生物的肌醇单磷酸酶活性。可适宜地通过在该转化微生物中导入外来性肌醇单磷酸酶基因来诱导肌醇单磷酸酶的过剩生产，但并不限定于此。需要说明的是，在本说明书中，使用“外来”或“外来性”这一术语表示的是，在转化前的宿主微生物不具有要由本发明导入的基因的情况下；在实质上不表达由该基因编码的酶的情况下；以及该酶的氨基酸序列由不同的基因编码、但在转化后不表达相匹配的内源性酶活性的情况下，向宿主中导入基于本发明的基因或核酸序列。

[0115] 接下来，对于本发明的转化体、即具有可对葡萄糖底物进行转换直至为鲨肌醇(或同时生产的鲨肌醇衍生物)的连续生物合成通路的转化微生物赋予下述催化剂活性。

[0116] 活性4：将肌肉肌醇转换为2-酮-肌肉肌醇(肌肉肌醇单酮；2,3,4,5,6-五羟基环己烷-1-酮)的酶活性；和

[0117] 活性5：将2-酮-肌肉肌醇转换为鲨肌醇的酶活性。

[0118] 作为具有上述活性4的酶，例如可以举出在NAD+的存在下对肌肉肌醇进行氧化的肌肉肌醇脱氢酶(酶编号E.C.1.1.1.18)。另外，作为具有上述活性5的酶，例如可以举出在NADP+的存在下对鲨肌醇进行氧化的鲨肌醇脱氢酶。即，可用于本发明的鲨肌醇脱氢酶例如可在NADPH的存在下将2-酮-肌肉肌醇转换为鲨肌醇。这些酶的详细内容如下述。

[0119] 本发明的转化体可使用各种宿主微生物细胞来制作。特别是在以原核微生物为宿主时，由于能够在该宿主细胞内新构建本发明的鲨肌醇的生物合成通路(即，无现有的内源性通路的影响)，因而在合成生物学方法的应用中是极富魅力的。所示例出的原核微生物为埃希氏菌、假单胞菌、芽胞杆菌、地芽胞杆菌、甲烷单胞菌、甲基芽孢杆菌、嗜甲基菌、精朊杆菌、甲基球菌、棒状杆菌、短杆菌、发酵单胞菌和李斯特氏菌属的细菌。在工业发酵生产中适宜的原核微生物的非限定性示例包括大肠杆菌、芽胞杆菌属细菌、棒状杆菌属细菌、发酵单胞菌属细菌。大肠杆菌由于其迅速的生长能力和发酵管理的容易性的原因，为特别优选的宿主微生物的示例。此外，能够作为本发明的宿主细胞使用的细胞株可以为通常含义下的野生型，或者也可以为营养要求性变异株、抗生素耐性变异株。进一步地，能够作为本发明的宿主细胞使用的细胞株可以已经被转化从而使之具有与上述变异相关的各种标记基因。这些变异或基因能够提供对于本发明转化体的制作·维持·管理有益的性质。也优选通过使用对于氯霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、四环素等抗生素显示出耐性的菌株来简便地进行本发明鲨肌醇的生产。

[0120] 如上所述，本发明的转化体应该具有的鲨肌醇生物合成通路包括用于将葡萄糖底物转换成作为重要的中间体的肌肉肌醇的部分通路。进一步地，如上所述，由于肌醇-1-磷酸合成酶被认为在肌肉肌醇的生物合成中承担控速反应，因而在本发明的转化体中，作为第一生物活性，要求表达肌醇-1-磷酸合成酶。特别是由于原核微生物中不具有肌醇-1-磷酸合成酶基因的示例较多，因而通常将外来性肌醇-1-磷酸合成酶基因可表达地导入到本发明的转化体的细胞内。肌醇-1-磷酸合成酶基因为已知的(例如，基因库登录号Nos.AB032073、AF056325、AF071103、AF078915、AF120146、AF207640、AF284065、BC111160、L23520、U32511)，它们均可使用。特别是酵母来源的INO1基因(序列编号1)是广为人知的肌醇-1-磷酸合成酶基因的示例，也能够在本发明中适当地使用。但是，能够在本发明转化体的制作中使用的肌醇-1-磷酸合成酶基因并不限于酵母来源的基因，其可来源于其它真核微生物或此外的生物、也可以为人工合成的基因，只要在上述宿主微生物细胞内能够实质性地表达肌醇-1-磷酸合成酶活性即可。

[0121] 从而，对于能够用于本发明目的的肌醇-1-磷酸合成酶基因，只要在上述转化微生物内能够实质性地表达肌醇-1-磷酸合成酶活性，可以具有能够在自然界发生的全部变异、或者具有人工导入的变异和修饰。例如，已知在编码特定氨基酸的各种密码子中存在冗余密码子(redundancy)。因此，在本发明中也可利用最终可翻译成相同氨基酸的代替密码子。即，由于基因编码的简并，因而编码某一特定氨基酸时可使用2个以上的密码子，因此氨基酸序列可利用任意的1组类似的DNA低聚核苷酸进行编码得到。虽然仅该组唯一的成员与天然型酶的基因序列相同，但即使是不匹配的DNA低聚核苷酸，在适当的严谨条件下(例如，
3xSSC、68℃杂交、2xSSC、0.1％SDS和68℃清洗)也能够与天然型序列杂交，能够对编码天然型序列的DNA进行鉴定、分离，进一步还可将这样的基因用于本发明中。特别是已知大部分生物优选使用特定密码子(最佳密码子)的子集(Gene,Vol.105,pp.61-72,1991等)，因而根据宿主微生物进行“密码子最佳化”是有用的。

[0122] 并且，在本发明的转化体的制作中，也可通过将肌醇-1-磷酸合成酶基因以“表达盒”的形式导入到宿主微生物细胞内来更稳定地得到高水平的肌醇-1-磷酸合成酶活性，这对本领域技术人员来说是可以理解的。在本说明书中，“表达盒”是指含有与表达对象的核酸或表达对象的基因功能性结合的对于转录和翻译进行调节的核酸序列的核苷酸。代表性地，本发明的表达盒以功能性结合的状态在编码序列的5’上游含有启动子序列、在3’下游含有终止子序列、根据情况进一步含有通常的调节元件，在这样的情况下，表达对象的核酸或表达对象的基因被可表达地导入到宿主微生物中。

[0123] 关于启动子，不论是结构性启动子还是调节启动子，均被定义为使RNA聚合酶与DNA结合、引发RNA合成的DNA序列。强启动子是指高频引发mRNA合成的启动子，也适于用于本发明的转化体制作中。可根据该宿主细胞的性质等使用lac系、trp系、TAC或TRC系、λ噬菌体的主要操纵子和启动子区域、fd包覆蛋白质的调节区域、针对糖酵解系酶(例如，3-磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、谷氨酸脱羧酶A、丝氨酸羟甲基转移酶的启动子等。除了启动子和终止子序列以外，可作为其它调节元件的示例举出的序列为选择标记、扩增信号、复制起点等。适宜的调节序列例如记载于“Gene Expression Technology：Methods in Enzymology185”,Academic Press(1990)中。

[0124] 上述说明的表达盒嵌入到例如由质粒、噬菌体、转座子、IS元件、噬粒、粘粒、或者线状或环状DNA等构成的载体中，使其插入到宿主微生物中。优选质粒和噬菌体。这些载体在宿主微生物中可自体复制，也可通过染色体复制。适宜的质粒例如为：大肠杆菌的pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11或pBdCI；杆菌的pUB110、pC194或pBD214；棒状杆菌属的pSA77或pAJ667等。除它们以外，能够使用的质粒等还记载于“Cloning Vectors”,Elsevier,1985中。表达盒向载体中的导入可通过包括利用适当的限制酶切割、克隆化以及连接的惯用方法进行。

[0125] 在构建出上述那样的具有表达盒的载体后，作为将该载体导入到宿主微生物中时能够适用的方法，例如使用共沉淀、原生质体融合、电穿孔、逆转录病毒转染等惯用的克隆化法和转染法。它们的示例记载于“分子生物学的最新实验计划(Current Protocols in Molecular Biology)”，F.Ausubel等，Publ.Wiley Interscience，New York，1997；或Sambrook等，“分子克隆：实验室手册”，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中。

[0126] 接下来，本发明的转化体所应具有的第二生物活性为肌醇单磷酸酶活性。该肌醇单磷酸酶活性也被要求用于将葡萄糖底物转换为中间体肌肉肌醇。但是，如上所述，大多数适于通过现有的基因重组方法进行工业生产的原核微生物宿主细胞表达内源性肌醇单磷酸酶、或者具有能够以肌肉肌醇-1-磷酸为底物的通用单磷酸酶活性，因而多数情况下，不必特意在本发明的转化体中导入该酶活性。但是，进一步特别优选本发明的转化体表现出增强的肌醇单磷酸酶活性。也即，令人预想不到地发现，本发明的鲨肌醇生产性转化体通过增强该肌醇单磷酸酶活性，可极大量且占优势地进行鲨肌醇的生产、同时几乎不生产肌肉肌醇，不仅如此，还显著生产出鲨肌醇衍生物。因而，本发明的适宜方面包括在鲨肌醇生产性转化体内进行肌醇单磷酸酶的过剩生产。

[0127] 对于本发明中谋求的肌醇单磷酸酶，除了对肌醇-1-磷酸显示出高底物特异性以外，还显示出了可作用于广泛的底物的磷酸单酯水解酶活性，从而包括实质上能够水解肌醇-1-磷酸的蛋白质。作为代表性的肌醇单磷酸酶，例如已知有肌醇-1-单磷酸酶，大量生物来源的该基因(suhB基因)在基因库登录号Nos.ZP＿04619988、YP＿001451848等中公布。特别是大肠杆菌来源的suhB基因(序列编号3：AAC75586(MG1655))的使用在以大肠杆菌为宿主细胞的情况下较为便利。

[0128] 本发明的转化体所应具有的第3生物活性为肌肉肌醇脱氢酶活性。该酶代表性地通过以下反应在NAD+的存在下将肌肉肌醇转换为2-酮-肌肉肌醇。

[0129] [化3]

[0130]

[0131] 各种肌肉肌醇脱氢酶基因为已知的、且可进行利用。例如，在日本特开平6-7158号公报中记载了在NAD+的存在下可将肌肉肌醇转换为2-酮-肌肉肌醇的芽胞杆菌属细菌来源的酶(EC.1.1.1.18)及其编码化核酸序列。此外，在专利文献5中还公开了NAD+非依赖性肌肉肌醇脱氢酶，该酶也可用于本发明的转化体的制作。特别是枯草杆菌NBRC13719株来源的iolG基因(下述序列编号5)的使用较为便利。

[0132] [化4]

[0133]

[0134] 本发明的转化体所应具有的第4生物活性为鲨肌醇脱氢酶活性。该酶代表性地通过下述反应在NADP+的存在下将鲨肌醇转换为2-酮-肌肉肌醇，而在NADPH的存在下将2-酮-肌肉肌醇选择性地还原为鲨肌醇。在本发明的转化体内应用后者的反应。

[0135] [化5]

[0136]

[0137] 各种鲨肌醇脱氢酶基因为已知的、且可进行利用。在专利文献5中公开了大肠杆菌、醋酸杆菌属细菌、芽胞杆菌属细菌、农杆菌属细菌、黄单胞菌属细菌的鲨肌醇脱氢酶和相关的氨基酸序列。特别是枯草杆菌NBRC13719株来源的iolW基因(下述序列编号7)的使用较为便利。

[0138] [化6]

[0139]

[0140] 本领域技术人员容易理解，在肌醇-1-磷酸合成酶基因中记载的变异、修饰和密码子最佳化以及表达盒、启动子等调节序列和质粒等以及基于此的转化的说明对于上述肌醇单磷酸酶基因、肌肉肌醇脱氢酶基因和鲨肌醇脱氢酶基因也是全部适用的。因而，本发明的转化体保有包含编码肌醇-1-磷酸合成酶的核酸的表达盒、包含编码肌肉肌醇脱氢酶的核酸的表达盒、以及包含编码鲨肌醇脱氢酶的核酸的表达盒这3个表达盒，这种情况下，本发明的转化体中存在内源性肌醇单磷酸酶基因。本发明的适宜的转化体保有包含具有序列编号1所表示的核苷酸序列的核酸的表达盒、包含具有序列编号5所表示的核苷酸序列的核酸的表达盒、以及包含具有序列编号7所表示的核苷酸序列的核酸的表达盒。

[0141] 上述3个表达盒可以配置在1个载体上被转染至宿主微生物中。或者可以将配置有其中任意2个表达盒的载体与配置有剩下的表达盒的载体共转染至宿主微生物中，还可以将配置有各个表达盒的3个载体共转染至宿主微生物中。进一步地，也可以将上述3个表达盒之中的任意一个以上插入到宿主微生物的基因组中，剩下的表达盒以质粒的形式存在于该转化体内。例如，也可将配置有包含编码肌肉肌醇脱氢酶的核酸的表达盒和包含编码鲨肌醇脱氢酶的核酸的表达盒的质粒转染到通过在染色体上插入包含编码肌醇-1-磷酸合成酶的核酸(INO1)的表达盒而得到的大肠杆菌AKC-017株(于2011年10月25日以FERM P-22180保藏于独立行政法人产品评价技术基础机构专利生物保藏中心。国际保藏编号：FERM BP-11513)中。

[0142] 进一步地，如反复记载的那样，本发明的转化体特别优选显示出增强的肌醇单磷酸酶活性。因而，本发明的转化体除了保有上述3个表达盒以外，还优选保有包含编码肌醇单磷酸酶的核酸的表达盒。因而，作为更适宜的本发明的转化体，可以举出保有下述表达盒的转化体：包含具有序列编号1所表示的核苷酸序列的核酸的表达盒、包含具有序列编号3所表示的核苷酸序列的核酸的表达盒、包含具有序列编号5所表示的核苷酸序列的核酸的表达盒、以及包含具有序列编号7所表示的核苷酸序列的核酸的表达盒。

[0143] 上述4个表达盒可以配置在1个载体上被转染至宿主微生物。或者可以将配置有其中任意2个以上的表达盒的载体与配置有剩下的表达盒的载体共转染至宿主微生物中，还可以将配置有各个表达盒的4个载体共转染至宿主微生物中。进一步地，也可以将上述4个表达盒中的任意之一以上插入到宿主微生物的基因组中，剩下的表达盒以质粒的形式存在于该转化体内。例如，也可将配置有包含编码肌肉肌醇脱氢酶的核酸的表达盒和包含编码鲨肌醇脱氢酶的核酸的表达盒的质粒转染到在染色体上具有包含编码肌醇-1-磷酸合成酶的核酸(INO1)的表达盒和包含编码肌醇单磷酸酶的核酸(suhB)的表达盒这两者的大肠杆菌AKC-018株(于2011年10月25日以FERM P-22181保藏于独立行政法人产品评价技术基础机构专利生物保藏中心。国际保藏编号：FERM BP-11514)。

[0144] 进一步地，与在本发明适宜的转化体中对增强的肌醇单磷酸酶活性进行诱导的方法相关，还可以通过增加内源性肌醇单磷酸酶基因的拷贝数；在内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域导入变异；利用高表达诱导性外来调整区域来置换内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域；和使内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域缺失来诱导该肌醇单磷酸酶的过剩生产。具体地说，为了实现肌醇单磷酸酶的过剩表达，可通过进行下述操作来完成：利用含有内源性肌醇单磷酸酶基因、或者含有在该内源性基因的编码化区域添加了适宜的调整区域的表达盒的构建体对上述宿主微生物进行转化，使该转化体内该肌醇单磷酸酶基因的拷贝数与原来的宿主细胞相比有实质性的增加；或者利用公知的基因重组技术对于具有内源性肌醇单磷酸酶基因的原来的宿主细胞实施染色体的变异、添加和缺失；或者使用诱变剂等在染色体中随机导入变异。可使用公知的SDS-PAGE分析法等对肌醇单磷酸酶的过剩生产进行确认。

[0145] 进一步地，用于增强肌醇单磷酸酶活性的本发明的其它方式包括在本发明的转化体中诱导肌醇单磷酸酶的活化。为完成该目的，可示例出下述这样的方法：1)在内源性肌醇单磷酸酶基因中导入变异；2)置换内源性肌醇单磷酸酶基因的一部分或全部；3)使内源性肌醇单磷酸酶基因的一部分缺失；4)使降低肌醇单磷酸酶活性的其它蛋白质减少；和/或5)使降低肌醇单磷酸酶活性的化合物的生成减少。

[0146] 关于上述用于增强肌醇单磷酸酶活性的1)～5)的方法，具体地说，可在对肌醇单磷酸酶的基因实施变异、添加或缺失后对该基因所编码的肌醇单磷酸酶的活性进行评价，从而得到肌醇单磷酸酶活性增强的肌醇单磷酸酶。

[0147] 对于如上得到的转化体，为了进行本发明的鲨肌醇的生产，可在适于上述转化体的生长和/或维持的条件下进行培养和维持。来源于各种宿主微生物细胞的转化体所用的适宜的培养基组成、培养条件、培养时间对于本领域技术人员为已知的。

[0148] 培养基可以为含有1种以上的碳源、氮源、无机盐、维生素以及必要时的微量元素或维生素等微量成分的天然、半合成、合成培养基。但是，不消说所使用的培养基必须适当满足所要培养的转化微生物的营养要求。进一步地，为了容易地利用本发明的转化体进行鲨肌醇的从头生物合成和鲨肌醇衍生物的生物合成，可用于本发明的培养基中要含有葡萄糖或具有葡萄糖单元的二糖类或者多糖类。有很多具有葡萄糖单元的二糖类或者多糖类对本领域技术人员是已知的。作为它们的非限定性示例，可以举出蔗糖、麦芽糖、乳糖、淀粉、纤维素。此外，由于它们在米糠、废糖密、玉米分解液或纤维素分解液等生物物质中大量含有，因而使用以这些天然资源为碳源的培养基是适宜的。进而，在转化体表达有用的附加性状的情况下、例如在具有针对抗生素的耐性标记的情况下，培养基也可以含有相应的抗生素。由此使发酵中的杂菌所致的污染风险降低。需要说明的是，在宿主微生物无法同化纤维素等碳源的情况下，可通过实施在该宿主微生物中导入外来基因等公知的基因工程方法使其适应于使用这些碳源的鲨肌醇及其衍生物的生产中。作为外来基因，可以举出例如纤维酶基因或淀粉酶基因等。

[0149] 培养可以为分批式也可以为连续式。并且，在任一情况下，均可为在适当的培养时刻补给所追加的上述碳源等的形式。此外，培养应在维持适宜的温度、氧浓度、pH等的条件下继续进行。来源于一般的微生物宿主细胞的转化体的适宜培养温度通常为15℃～45℃、优选为25℃～37℃的范围。宿主微生物为好氧性的情况下，为了确保发酵中的适当的氧浓度，需要进行振荡(烧瓶培养等)、搅拌/通气(发酵罐培养等)。这些培养条件可由本领域技术人员容易地设定。

[0150] 由上述培养物精制鲨肌醇或其衍生物的方法中，可将本领域技术人员公知的精制手段进行适当组合。在为原核微生物宿主细胞的转化体的情况下，本发明的鲨肌醇在培养上清中或菌体内存在，必要时可也由培养菌体进行提取。在由培养菌体提取的情况下，例如可对培养物进行离心分离、将上清与菌体分离，利用均质器并同时利用表面活性剂、有机溶剂、酶等破坏菌体。作为由培养上清以及必要时还由菌体提取液来精制鲨肌醇及其衍生物的代表性的方法，可以举出实施下述精制工序的方法：利用通过pH调整等进行的蛋白质沉淀的除蛋白处理、通过利用活性炭的杂质吸附进行的去除、利用离子交换树脂等的色谱法等。进一步地，可将利用色谱法分离并对级分进行干燥得到的固体由例如水-乙醇系中进行再结晶。当然也可以根据制品的目的纯度省略部分工序、或者实施追加的色谱法或再结晶等，这自不言说。

[0151] 本发明的第二课题所涉及的鲨肌醇衍生物具有葡萄糖残基与鲨肌醇残基藉由β1→4键进行键合而成的结构，由下述结构式表示。

[0152] [化7]

[0153]

[0154] 上述化合物为新颖的，也可被称为1-O-β-D-吡喃葡萄糖-鲨肌醇。

[0155] 如后述实施例所述，本发明的鲨肌醇衍生物可被能够催化β-糖苷键的水解反应的酶、例如β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)容易地分解，容易地生成葡萄糖与鲨肌醇。因而，可通过使该酶作用于本发明的鲨肌醇衍生物来进行鲨肌醇的生产。

[0156] 特别是，如下文所述，与原来的鲨肌醇相比，本发明的鲨肌醇衍生物显示出至少4倍以上(25℃、W/V)的水溶性。于是，由于本发明的鲨肌醇衍生物能够在水性液中以高浓度进行生产和处理，因而在得到本发明的鲨肌醇衍生物、通过对其进行上述酶处理来进行鲨肌醇的生产时的优点较多，因此这样的方法为本发明鲨肌醇衍生物的适宜利用方法之一。

[0157] 在为了进行上述鲨肌醇的生产而将本发明的鲨肌醇衍生物利用β-葡糖苷酶等进行酶分解时，例如可向由水和/或缓冲液(乙酸缓冲液、磷酸缓冲液等)制备的本发明的鲨肌醇衍生物的溶液中添加适当量的酶，利用适于该酶反应的条件和时间对该溶液进行培养。能够在这样的目的中有利地使用的β-葡糖苷酶有市售，它们均可使用，例如可利用曲霉属的霉来源的纤维二糖酶(SIGMA社)。所添加的酶量可参考制造商的指示同时基于本发明的鲨肌醇衍生物在溶液中的浓度等来适当确定。此外，反应时的pH通常为pH4.0～9.0的范围，但必要时也可以为所使用的酶的最佳pH。另外，反应时的温度也可为所使用的酶的最佳温度范围，例如可为约20℃～50℃左右的范围。关于反应时间，可定量追踪本发明鲨肌醇衍生物的分解率，使其为大致全部的本发明鲨肌醇衍生物转换为鲨肌醇的时刻。其后可通过再结晶等从反应液中分离出鲨肌醇。

[0158] 需要说明的是，如后述实施例所述，将本发明的转化体在生产鲨肌醇的同时还生产实质量的本发明的鲨肌醇衍生物的条件下进行培养时，可直接利用上述酶对该转化体的培养物进行处理、或者在通过除蛋白处理或活性炭处理的程度对该培养物进行粗精制后进行酶处理，从而进一步提高鲨肌醇的生产率。

[0159] 此外，将本发明的鲨肌醇衍生物作为药品、食品、化妆品等的有效成分或功能性成分使用也是其潜在用途之一。即，由于如上所述明确了鲨肌醇的生理活性；并且由于本发明的鲨肌醇衍生物容易经酶分解而生成鲨肌醇，因而期待本发明的鲨肌醇衍生物在生物体内经酶分解而产生鲨肌醇，将本发明的鲨肌醇衍生物本身添加到药品等中的做法是本发明颇令人感兴趣的利用方式。

[0160] 了解到以上说明的本领域技术人员可充分实施本发明。下面出于进一步说明的目的提供实施例，因而本发明并不限于该实施例。需要说明的是，只要没有特别说明，本说明书中的核苷酸序列被记载为从5’向3’方向。

[0161] 实施例

[0162] 实施例1：利用肌醇单磷酸酶活性未增强的转化体所进行的鲨肌醇的从头生产[0163] 在本实施例中，制作保有包含编码肌醇-1-磷酸合成酶的核酸的表达盒、包含编码肌肉肌醇脱氢酶的核酸的表达盒和包含编码鲨肌醇脱氢酶的核酸的表达盒这3个表达盒的本发明的转化微生物，对于基于该微生物的鲨肌醇的生产能力进行研究。

[0164] 1-a)肌醇-1-磷酸合成酶表达盒

[0165] 从分离出的酿酒酵母培养液中回收菌体，使用Nucleo Spin Tissue(产品名、MACHEREY-NAGEL社制造)提取基因组DNA。将所提取的基因组DNA用于模板，利用下述引物进行PCR扩增(PrimeSTAR Max DNA聚合酶(产品名，Taraka-Bio制造)反应条件：98℃10sec，55℃5sec，72℃20sec，28循环)，克隆INO1基因的编码区域(序列编号1)。

[0166] [化8]

[0167] 正向：a t g a c a g a a g a t a a t a t t g c t c(序列编号9)[0168] 反向：t t a c a a c a a t c t c t c t t c g(序列编号10)

[0169] 接下来，将所得到的ino1编码区域可转录地插入到下述序列的启动子的下游。

[0170] [化9]

[0171]

[0172] 即，在质粒pNFP-A51(于2011年10月25日以FERM P-22182保藏在独立行政法人产品评价技术基础机构专利生物保藏中心。国际保藏编号：FERM BP-11515)的多克隆位点插入终止子序列和上述启动子序列。在所导入的启动子序列的下游连接上述克隆的ino1编码区域，构建pNFP-D78。将所构建的pNFP-D78利用氯化钙法(参照羊土社遺伝子工学実験ノート(基因工程实验笔记)上田村隆明著)转染至大肠杆菌AKC-016株(于2011年4月20日以FERM P-22104、保藏在独立行政法人产品评价技术基础机构专利微生物保藏中心。国际保藏编号：FERM BP-11512)。通过SDS-PAGE确认到肌醇-1-磷酸合成酶在该大肠杆菌的可溶性级分中的高表达。

[0173] 1-b)肌肉肌醇脱氢酶表达盒

[0174] 在LB培养基中(2ml)中于30℃对枯草杆菌(NBRC13719)进行振荡培养。培养终止后，从培养液中回收菌体，使用Nucleo Spin Tissue(产品名、MACHEREY-NAGEL社制造)提取基因组DNA。将所提取的基因组DNA用于模板，利用下述引物进行PCR扩增(PrimeSTAR Max DNA聚合酶(产品名、Taraka-Bio制造)反应条件：98℃10sec，55℃5sec，72℃20sec，28循环)，克隆iolG基因的编码区域(序列编号5)。

[0175] [化10]

[0176] 正向：a t g a g t t t a c g t a t t g g c g t a a(序列编号12)[0177] 反向：t t a g t t t t g a a c t g t t g t a a a a g a t t g(序列编号13)

[0178] 将所得到的iolG编码区域可转录地插入到序列编号11的启动子的下游。即，在上述pNFP-A51的多克隆位点插入终止子序列和上述启动子序列。在所导入的启动子序列的下游连接上述克隆的iolG编码区域，构建pNFP-J22。将所构建的pNFP-J22利用氯化钙法(参照羊土社遺伝子工学実験ノート上田村隆明著)转染至大肠杆菌株FERM P-22104。通过SDS-PAGE确认到肌肉肌醇脱氢酶在该大肠杆菌的可溶性级分中的高表达。

[0179] 1-c)鲨肌醇脱氢酶表达盒

[0180] 在LB培养基中(2ml)中于30℃对枯草杆菌(NBRC13719)进行振荡培养。培养终止后，从培养液中回收菌体，使用Nucleo Spin Tissue(产品名、MACHEREY-NAGEL社制造)提取基因组DNA。将所提取的基因组DNA用于模板，利用下述引物进行PCR扩增(PrimeSTAR Max DNA聚合酶(产品名、Taraka-Bio制造)反应条件：98℃10sec，55℃5sec，72℃20sec，28循环)，克隆iolW基因的编码区域(序列编号7)。

[0181] [化11]

[0182] 正向：a t g a t a a c g c t t t t a a a g g g g(序列编号14)

[0183] 反向：t t a g t g c t c c a g c a t a a t g g(序列编号15)

[0184] 将所得到的iolW编码区域可转录地插入到序列编号11的启动子的下游。即，在上述pNFP-A51的多克隆位点插入终止子序列和上述启动子序列。在所导入的启动子序列的下游连接上述克隆的iolW编码区域，构建pNFP-J36。将所构建的pNFP-J36利用氯化钙法(参照羊土社遺伝子工学実験ノート上田村隆明著)转染至大肠杆菌株FERM P-22104。通过SDS-PAGE确认到鲨肌醇脱氢酶在该大肠杆菌的可溶性级分中的高表达。

[0185] 1-d)用于转化的质粒的构建

[0186] 将pNFP-D78利用SalI消化，进行平滑末端化和5’末端脱磷酸化。将pNFP-J22中的iolG表达盒和pNFP-J36中的iolW表达盒克隆化，将两表达盒与pNFP-D78连接。得到iolG表达盒和iolW表达盒与pNFP-D78中的INO1表达盒顺方向地连接而成的质粒。

[0187] 1-e)利用经含有表达盒的质粒转染的转化体所进行的鲨肌醇的生产

[0188] 使用氯化钙法(参照羊土社遺伝子工学実験ノート上田村隆明著)将按照上述过程构建的质粒转染至大肠杆菌AKC-016株(于2011年4月20日以FERM P-22104保藏在独立行政法人产品评价技术基础机构专利微生物保藏中心。国际保藏编号：FERM BP-11512)。

[0189] 将所得到的转化体在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB微板上于37℃培养一天，形成菌落。将含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB培养基2mL装入15mL容量的试管中，利用白金耳从上述微板进行菌落的植菌，在37℃于180rpm进行3～5小时的培养，直至OD(600nm)为0.5左右，将其作为主培养所用的前培养液。

[0190] 在150mL容量的烧瓶中加入含有2g/L的葡萄糖和100mg/L的氨苄青霉素的LB培养基30mL，添加0.6mL的前培养液进行主培养(鲨肌醇生产试验)。培养条件如下：培养温度32℃；搅拌180rpm；培养时间16.5h。

[0191] 将上述培养液在4℃进行10,000g×10分钟的离心分离，回收上清，测定培养上清的鲨肌醇浓度。具体地说，将KS-G(保护柱)、Sugar KS-801和Sugar KS-802(均为商品名、昭和电工株式会社制造)联结进行HPLC(检测器：RI、柱温度：70℃、流速：1mL/min)，从而对培养上清中的鲨肌醇浓度进行定量。定量结果表明，鲨肌醇在培养上清中以0.15g/L生产出，葡萄糖被完全消耗。该结果表示，保有包含编码肌醇-1-磷酸合成酶的核酸的表达盒、包含编码肌肉肌醇脱氢酶的核酸的表达盒和包含编码鲨肌醇脱氢酶的核酸的表达盒这3个表达盒、具有内源性肌醇单磷酸酶基因(即，肌醇单磷酸酶未被增强)的本发明的转化微生物直接地且利用一步法由葡萄糖生产出了鲨肌醇。

[0192] 实施例2：利用肌醇单磷酸酶活性增强的转化体所进行的鲨肌醇的从头生产[0193] 在本实施例中，制作保有包含编码肌醇-1-磷酸合成酶的核酸的表达盒、包含编码肌醇单磷酸酶的核酸的表达盒、包含编码肌肉肌醇脱氢酶的核酸的表达盒和包含编码鲨肌醇脱氢酶的核酸的表达盒这4个表达盒的本发明的转化微生物，对于基于该微生物的鲨肌醇的生产能力进行研究。

[0194] 2-a)肌醇单磷酸酶表达盒

[0195] 在LB培养基中(2ml)中于37℃对大肠杆菌株W3110(NBRC12713)进行振荡培养。培养终止后，从培养液中回收菌体，使用Nucleo Spin Tissue(产品名、MACHEREY-NAGEL社制造)提取基因组DNA。将所提取的基因组DNA用于模板，利用下述引物进行PCR扩增(PrimeSTAR Max DNA聚合酶(产品名、Taraka-Bio制造)反应条件：98℃10sec，55℃5sec，72℃20sec，28循环)，克隆suhB基因的编码区域(序列编号3)。

[0196] [化12]

[0197] 正向：a t g c a t c c g a t g c t g a a c(序列编号16)

[0198] 反向：t t a a c g c t t c a g a g c g t c g(序列编号17)

[0199] 所得到的suhB编码区域可转录地插入到下述序列的启动子的下游。

[0200] [化13]

[0201]

[0202] 即，在上述pNFP-A51的多克隆位点插入终止子序列和序列编号18的启动子序列。在所导入的启动子序列的下游连接上述克隆的suhB编码区域，构建pNFP-A54。将所构建的pNFP-A54利用氯化钙法(参照羊土社遺伝子工学実験ノート上田村隆明著)转染至大肠杆菌株FERM P-22104。通过SDS-PAGE确认到肌醇单磷酸酶在该大肠杆菌的可溶性级分中的高表达。

[0203] 2-b)用于转化的质粒的构建

[0204] 将实施例1中制作的pNFP-D78利用SalI消化，进行平滑末端化和5’末端脱磷酸化。将pNFP-A54中的suhB表达盒克隆化，与pNFP-D78连接。得到suhB表达盒与pNFP-D78中的INO1表达盒顺方向地连接而成的pNFP-G22。接下来，将pNFP-G22利用SalI消化，进行平滑末端化和5’末端脱磷酸化。将实施例1中制作的pNFP-J22中的iolG表达盒和pNFP-J36中的iolW表达盒克隆化，将两表达盒与pNFP-G22连接。得到iolG表达盒和iolW表达盒与pNFP-G22中的INO1表达盒和suhB表达盒顺方向地连接而成的质粒。

[0205] 2-c)利用经含有表达盒的质粒转染的转化体所进行的鲨肌醇生产

[0206] 使用氯化钙法(参照羊土社遺伝子工学実験ノート上田村隆明著)将按照上述过程构建的质粒转染至大肠杆菌AKC-016株(于2011年4月20日以FERM P-22104保藏在独立行政法人产品评价技术基础机构专利微生物保藏中心。国际保藏编号：FERM BP-11512)。

[0207] 将所得到的转化体在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB微板上于37℃培养一天，形成菌落。将含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB培养基2mL装入15mL容量的试管中，利用白金耳从上述微板进行菌落的植菌，在37℃于180rpm进行3～5小时的培养，直至OD(600nm)为0.5左右，将其作为主培养所用的前培养液。

[0208] 在150mL容量的烧瓶中加入含有2g/L的葡萄糖和100mg/L的氨苄青霉素的合成培养基(表1)30mL，添加0.6mL的前培养液进行主培养(鲨肌醇生产试验)。培养条件如下：培养温度32℃；搅拌180rpm；培养时间16.5h。

[0209] [表1]

[0210] 合成培养基组成

[0211]

[0212] 使用8N KOH，将pH调整为6.7

[0213] 将上述培养液在4℃进行10,000g×10分钟的离心分离，回收上清，测定培养上清的鲨肌醇浓度。具体地说，将KS-G(保护柱)、Sugar KS-801和Sugar KS-802(均为商品名、昭和电工株式会社制造)联结进行HPLC(检测器：RI、柱温度：70℃、流速：1mL/min)，从而对培养上清中的鲨肌醇浓度进行定量。定量结果表明，鲨肌醇在培养上清中以0.09g/L生产出，葡萄糖被完全消耗。另一方面，在利用主合成培养基的鲨肌醇生产条件下，在培养时间16.5h的时刻，在肌醇单磷酸酶活性非增强株中，在培养上清中未检测出鲨肌醇峰。

[0214] 由此判断出，本发明的转化微生物中，肌醇单磷酸酶活性增强是有利的。

[0215] 2-d)利用经含有表达盒的质粒转染的转化体并使用罐状培养槽进行的鲨肌醇的生产

[0216] 将上述2-c)中的转化体在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB微板上于37℃培养一天，形成菌落。将含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB培养基30mL装入150mL容量的烧瓶中，利用白金耳从上述微板进行菌落的植菌，在37℃于180rpm进行3～5小时的培养，直至OD(600nm)为0.5左右，将其作为主培养所用的前培养液。

[0217] 在1000mL容量的罐状培养装置(丸菱Bioengineering社制造)中加入含有1g/L的葡萄糖和100mg/L的氨苄青霉素的下述合成培养基(表2)300mL，添加6mL的前培养液进行主培养(使用罐状培养装置的鲨肌醇生产试验)。培养条件如下：培养温度32℃；培养pH6.0〔下限〕；碱添加28％(重量/容量)氨水；搅拌850rpm；通气1vvm。作为原料的葡萄糖添料溶液(表3)按照培养液中的葡萄糖浓度为0～5g/L进行适宜添加。

[0218] [表2]

[0219] 合成培养基组成

[0220]

[0221] 使用8N KOH，将pH调整为6.3

[0222] [表3]

[0223] 葡萄糖添料溶液

[0224]

[0225] 在培养时间68h后，将上述培养液在4℃进行10,000g×10分钟的离心分离，回收上清，测定培养上清的鲨肌醇浓度。具体地说，将KS-G(保护柱)、Sugar KS-801和Sugar KS-802(均为商品名、昭和电工株式会社制造)进行HPLC(检测器：RI、柱温度：70℃、流速：1mL/min)，从而对培养上清中的鲨肌醇浓度进行定量。

[0226] 定量结果为，在培养上清中生产了浓度为12.4g/L的鲨肌醇，该浓度迄今为止并无先例。另一方面，在精制工序成问题的肌肉肌醇在培养上清中几乎不存在，其浓度为0.1％以下。

[0227] 实施例3：鲨肌醇衍生物的分离和结构确定

[0228] 在上述实施例2中，进一步利用HPLC(柱：Shodex Asahipak NH2P-504E(商品名：昭和电工株式会社制造)、移动相：水/乙腈＝25/75、流速：0.8mL/min、柱温度40℃、检出：RI)对使用罐状培养装置进行鲨肌醇的生产试验所得到的培养上清进行分析，结果在培养上清中生产了12.4g/L的鲨肌醇、同时生产了1.4g/L的鲨肌醇衍生物。分取该鲨肌醇衍生物的峰，用于下述实验。

[0229] 通过下述NMR分析对分取的化合物进行结构确定。

[0230] 装置：Avance600(Bruker Biospin社制造)

[0231] 探针：低温探针(13C高灵敏度)

[0232] 测定温度：18℃(为了防止试样劣化以及在1H-NMR时使水信号移动，全部为291K(18℃))

[0233] 溶剂：D2O(ALDRICH社制造)

[0234] 内部标准：TSP

[0235] 1H观测频率：600.13MHz

[0236] 13C观测频率：150.92MHz

[0237] 测定结果和峰的归属如下。需要说明的是，表中，峰编号的“GH-1”表示葡萄糖残基的1位氢。另外，“IH-1”表示鲨肌醇残基的1位氢。其它也是同样的。

[0238] [化14]

[0239]

[0240] [表4]

[0241] 1H-NMR

[0242]

[0243] [表5]

[0244] 13C-NMR

[0245]峰编号 δC(ppm)
GC-1 105.74
GC-2 76.35
GC-3 78.43
GC-4 72.40
GC-5 78.89
GC-6 63.51
IC-1 84.92
IC-2 76.30
IC-3 76.09
IC-4 76.17
IC-5 76.17
IC-6 74.86

[0246] 上述的1H-NMR和13C-NMR分别示于图5和图6。另外，峰的归属通过COSY、CH-COSY、HMBC、二维J分解NMR进行了确认。

[0247] 实施例4：鲨肌醇衍生物的酶分解

[0248] 将实施例3中得到的化合物利用属于曲霉属霉来源的β-葡糖苷酶的纤维二糖酶(SIGMA社)进行分解。具体地说，将实施例3中得到的化合物以6mg/ml的浓度溶解在400μL的150mM Bis-Tris缓冲液(pH＝7.0)中。向该溶液中加入25U/mL的纤维二糖酶100μL，在40℃培养直至20小时(1200rpm、Bioshaker M·BR022、TAITEC社)，使其反应。在反应第0小时、3小时、20小时对反应液进行采样，利用HPLC(柱：Shodex Asahipak NH2P-504E(商品名：昭和电工株式会社制造)、移动相：水/乙腈＝25/75、流速：0.8mL/min、柱温度40℃、检出：RI)确认反应状况。

[0249] 根据图7所示的结果，在从反应开始的第3小时，实施例3中得到的化合物、即本发明的鲨肌醇衍生物大部分发生分解，生成相应量的葡萄糖与鲨肌醇。此外，在反应开始20小时后，本发明的鲨肌醇衍生物完全分解。由此判断出，本发明的鲨肌醇衍生物容易被β-葡糖苷酶分解。并且，由该酶实验也确认到本发明鲨肌醇衍生物的结构确定的正确性。

[0250] 工业实用性

[0251] 本发明可用于鲨肌醇的工业发酵生产。本发明的新颖的鲨肌醇衍生物在鲨肌醇的工业生产中也是有用的。

[0252] 关于本说明书中提及的质粒和微生物，在它们被保藏和记载的情况下，均保藏于(保藏机关的名称)“IPOD独立行政法人产品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(IPOD，NITE)”；(保藏机关的地址)“日本邮政编码305-8566茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6”。