靶向中枢神经系统的纳米药物载体

摘要

本发明公开了一种靶向中枢神经系统的纳米药物载体，包括纳米胶束、纳米脂质体、纳米粒等，其以暴露于载体表面的蜂毒明肽或肽链C端未酰胺化的蜂毒明肽衍生物为靶向配基，可携带小分子化学药物跨越血脑屏障和血脊髓屏障，实现中枢神经系统靶向给药。

权利要求

1.靶向中枢神经系统的纳米药物载体，其特征在于，以蜂毒明肽或其衍生物为靶向配基，所述蜂毒明肽衍生物为肽链C端未酰胺化的蜂毒明肽，蜂毒明肽或其衍生物暴露于纳米药物载体的表面；所述纳米药物载体为纳米胶束、纳米脂质体或纳米粒，由靶向材料和组装材料组成，所述靶向材料由蜂毒明肽或其衍生物与两亲性聚合物偶联而得，所述组装材料包括两亲性聚合物；所述靶向材料与组装材料的摩尔比不小于0.1:99.9；所述纳米药物载体的平均粒径不大于200nm。

2.根据权利要求1所述的靶向中枢神经系统的纳米药物载体，其特征在于，所述纳米药物载体为纳米胶束或纳米脂质体，所述靶向材料由蜂毒明肽或其衍生物与聚乙二醇修饰磷脂偶联而得，所述组装材料包括单甲氧基聚乙二醇修饰磷脂。

3.根据权利要求2所述的靶向中枢神经系统的纳米药物载体，其特征在于，所述靶向材料由蜂毒明肽或其衍生物通过N端的α-氨基和/或4位赖氨酸残基中的ε-氨基与琥珀酰亚胺基功能化的聚乙二醇修饰磷脂反应制得。

4.根据权利要求3所述的靶向中枢神经系统的纳米药物载体，其特征在于，所述聚乙二醇修饰磷脂为聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺即PEG-DSPE、聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺即PEG-DPPE、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰胆碱即PEG-DSPC和聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰胆碱即PEG-DPPC中的任一种或多种；所述单甲氧基聚乙二醇修饰磷脂为单甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺即mPEG-DSPE、单甲氧基聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺即mPEG-DPPE、单甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰胆碱即mPEG-DSPC和单甲氧基聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰胆碱即mPEG-DPPC中的任一种或多种。

5.根据权利要求4所述的靶向中枢神经系统的纳米药物载体，其特征在于，所述聚乙二醇修饰磷脂为聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，其中聚乙二醇的重均分子量为3400；所述单甲氧基聚乙二醇修饰磷脂为单甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，其中单甲氧基聚乙二醇的重均分子量为2000。

6.根据权利要求2所述的靶向中枢神经系统的纳米药物载体，其特征在于，纳米胶束的组装材料为单甲氧基聚乙二醇修饰磷脂，纳米脂质体的组装材料为磷脂、胆固醇和单甲氧基聚乙二醇修饰磷脂。

7.根据权利要求1所述的靶向中枢神经系统的纳米药物载体，其特征在于，所述纳米药物载体为纳米粒，所述靶向材料为蜂毒明肽或其衍生物与聚乙二醇-聚丙交酯偶联而得，所述组装材料为单甲氧基聚乙二醇-聚丙交酯。

8.根据权利要求7所述的靶向中枢神经系统的纳米药物载体，其特征在于，所述靶向材料由N端添加1个半胱氨酸的蜂毒明肽或其衍生物通过N端的巯基与马来酰亚胺基功能化的聚乙二醇-聚丙交酯反应制得。

说明书

靶向中枢神经系统的纳米药物载体

技术领域

[0001] 本发明属于医药领域，涉及一种具有靶向性的纳米药物载体。

背景技术

[0002] 神经系统疾病严重威胁人类健康，尽管基于化疗为主的常规治疗手段在过去几十年间取得了阶段性的成果，但仍然存在疗效有限、毒副作用较严重等问题。为此，多年来，针对神经系统疾病发病机理、相关靶点以及特异性治疗药物的研究一刻也未停止。由于血脑屏障和血脊髓屏障是阻碍药物进入中枢神经系统的主要障碍，因此，研究和开发可以携带药物穿透血脑屏障和血脊髓屏障的靶向递药系统具有重大意义。

[0003] 蜂毒明肽（Apamin）是蜂毒中一种主要的多肽，占蜂毒干量的3%，系高度碱性的十八肽酰胺，含有两个链内二硫键，可透过血脑屏障，阻断钙离子激活的钾离子通道，抑制中枢神经系统。1975年，Jean-Pierre Vincent等人首次通过实验证明蜂毒明肽的作用位点主要位于腰椎脊椎背侧，在神经中枢系统其他部位也有一定分布，而在其他组织器官只有痕量分布。

[0004] 纳米药物载体是指粒径大小在10～1000nm的一类新型载体，通常由天然或合成高分子材料制成。它是以纳米颗粒作为药物载体，将药物分子包裹在纳米颗粒之中或吸附在其表面，通过靶向分子与细胞表面特异性受体结合，在细胞摄取作用下进入细胞内，实现安全有效的靶向药物输送。依照制备工艺和材料的不同，纳米药物载体可分为纳米粒、纳米胶束、纳米脂质体、固体脂质纳米粒、纳米乳、纳米混悬液等。

发明内容

[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种靶向中枢神经系统的纳米药物载体，可以携带药物穿透血脑屏障和血脊髓屏障，实现靶向中枢神经系统递药。

[0006] 经过研究，本发明提供如下技术方案：

[0007] 1.靶向中枢神经系统的纳米药物载体，以蜂毒明肽（氨基酸序列为CNCKAPETALCA-RRCQQH-NH2，肽链C端酰胺化）或其衍生物为靶向配基，所述蜂毒明肽衍生物为肽链C端未酰胺化的蜂毒明肽（氨基酸序列为CNCKAPETALCARRCQQH-OH），蜂毒明肽或其衍生物暴露于纳米药物载体的表面。

[0008] 优选的，所述纳米药物载体为纳米胶束、纳米脂质体或纳米粒，由靶向材料和组装材料组成，所述靶向材料由蜂毒明肽或其衍生物与两亲性聚合物偶联而得，所述组装材料包括两亲性聚合物。

[0009] 作为一种优选技术方案，所述纳米药物载体为纳米胶束或纳米脂质体，所述靶向材料由蜂毒明肽或其衍生物与聚乙二醇修饰磷脂偶联而得，所述组装材料包括单甲氧基聚乙二醇修饰磷脂。

[0010] 优选的，纳米胶束的组装材料为单甲氧基聚乙二醇修饰磷脂；纳米脂质体的组装材料由磷脂（如氢化大豆磷脂等）、胆固醇和单甲氧基聚乙二醇修饰磷脂组成。

[0011] 聚乙二醇修饰磷脂中所述聚乙二醇的重均分子量优选在2000～10000Da范围内；所述磷脂的两条脂肪酸链可以相同或不同，每条脂肪酸链所含碳原子数优选在12～20范围内。优选的，所述聚乙二醇修饰磷脂为聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（PEG-DSPE）、聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺（PEG-DPPE）、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰胆碱（PEG-DSPC）和聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰胆碱（PEG-DPPC）中的任一种或多种混合物。

[0012] 单甲氧基聚乙二醇修饰磷脂中所述单甲氧基聚乙二醇的重均分子量优选在2000～10000Da范围内；所述磷脂的两条脂肪酸链可以相同或不同，每条脂肪酸链所含碳原子数优选在12～20范围内。优选的，所述单甲氧基聚乙二醇修饰磷脂为单甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（mPEG-DSPE）、单甲氧基聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺（mPEG-DPPE）、单甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰胆碱（mPEG-DSPC）和单甲氧基聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰胆碱（mPEG-DPPC）中的任一种或多种混合物。

[0013] 蜂毒明肽或其衍生物与聚乙二醇修饰磷脂的偶联发生在蜂毒明肽或其衍生物与聚乙二醇之间，文献报道的多肽的聚乙二醇化修饰方法均适用于本发明。聚乙二醇分子的末端醇羟基不活泼，为了实现多肽与聚乙二醇的有效稳定连接，需要先对聚乙二醇分子进行活化，即采用不同的化学反应使聚乙二醇分子的末端羟基连接上不同的活化官能团。聚乙二醇分子活化的常用方法是在末端羟基上引入氨基、羧基、琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺基等。活化的聚乙二醇分子可与多肽分子主链或侧链上的各种化学官能团反应而与多肽相连接。其中，亲核性官能团为主要反应位点，包括巯基、氨基、羧基等。

[0014] 蜂毒明肽分子中含有2个游离氨基，分别为肽链N端的α-氨基和4位赖氨酸残基中的ε-氨基。因此，优选的，所述靶向材料由蜂毒明肽或其衍生物通过肽链N端的α-氨基和/或4位赖氨酸残基中的ε-氨基与琥珀酰亚胺基功能化的聚乙二醇修饰磷脂偶联而得。具体的，所述靶向材料可由氨基未保护的蜂毒明肽或其衍生物与琥珀酰亚胺-聚乙二醇-磷脂反应制得；或者，由肽链N端α-氨基被保护或4位赖氨酸残基中ε-氨基被保护的蜂毒明肽或其衍生物与琥珀酰亚胺-聚乙二醇-磷脂反应，再脱去氨基保护基制得。

[0015] 更优选的，所述靶向材料由蜂毒明肽或其衍生物通过N端的α-氨基和/或4位赖氨酸残基中的ε-氨基与琥珀酰亚胺-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（NHS-PEG-DSPE）反应制得，其中PEG的重均分子量为3400；所述组装材料包括mPEG-DSPE，其中mPEG的重均分子量为2000。采用PEG分子量大于mPEG分子量的方式，可以确保作为靶向配基的蜂毒明肽或其衍生物暴露于纳米药物载体的表面，便于其发挥中枢神经系统靶向作用。

[0016] 所述靶向材料与组装材料的摩尔比优选为不小于0.1:99.9，更优选为0.1:99.9～10:90。

[0017] 所述纳米胶束和纳米脂质体的平均粒径优选为不大于200nm，更优选为50～200nm。

[0018] 作为另一种优选技术方案，所述纳米药物载体为纳米粒，所述靶向材料由蜂毒明肽或其衍生物与聚乙二醇-聚丙交酯（PEG-PLA）偶联而得，所述组装材料为单甲氧基聚乙二醇-聚丙交酯（mPEG-PLA）。

[0019] 蜂毒明肽或其衍生物与聚乙二醇-聚丙交酯的偶联发生在蜂毒明肽或其衍生物与聚乙二醇之间，文献报道的多肽的聚乙二醇化修饰方法均适用于本发明。如前所述，聚乙二醇分子的末端醇羟基不活泼，为了实现多肽与聚乙二醇的有效稳定连接，需要先对聚乙二醇分子进行活化，即采用不同的化学反应使聚乙二醇分子的末端羟基连接上不同的活化官能团。聚乙二醇分子活化的常用方法是在末端羟基上引入氨基、羧基、琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺基等。活化的聚乙二醇分子可与多肽分子主链或侧链上的各种化学官能团反应而与多肽相连接。其中，亲核性官能团为主要反应位点，包括巯基、氨基、羧基等。

[0020] 优选的，所述靶向材料由N端添加1个半胱氨酸的蜂毒明肽（氨基酸序列为SH-C-CNCKAPETALCARRCQQH-NH2）或其衍生物（氨基酸序列为SH-C-CNCKAPETALCARR-CQQH-OH）通过肽链N端的巯基与马来酰亚胺基功能化的聚乙二醇修饰磷脂偶联而得。具体的，所述靶向材料可由N端添加1个半胱氨酸、肽链中4个半胱氨酸残基的巯基均被保护的蜂毒明肽或其衍生物与马来酰亚胺-聚乙二醇-聚丙交酯（Mal-PEG-PLA）反应，再脱去全部巯基保护基制得。

[0021] 所述靶向材料与组装材料的摩尔比优选为不小于0.1:99.9，更优选为0.1:99.9～10:90。

[0022] 所述纳米粒的平均粒径优选为不大于200nm，更优选为50～200nm。

[0023] 本发明的纳米药物载体可用于携带小分子化学药物。包括但不限于：姜黄素、紫杉醇、阿霉素和人参皂苷等促进中枢神经细胞修复及再生的药物，银杏内酯等治疗神经退行性疾 病的 药物 ，以 及 DiR（1 ,1 ’-d io c tad e cy l- 3 ,3 ,3 ’,3’-tetramethylindotricarbocyanine Iodide）、异硫氰酸荧光素（FITC）等可作为体内示踪剂的荧光染料。

[0024] 本发明的有益效果在于：本发明的靶向中枢神经系统的纳米药物载体包括纳米胶束、纳米脂质体、纳米粒等，其以暴露于载体表面的蜂毒明肽或肽链C端未酰胺化的蜂毒明肽衍生物为靶向配基，可携带小分子化学药物跨越血脑屏障和血脊髓屏障，实现中枢神经系统靶向给药。

附图说明

[0025] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

[0026] 图1为以不同修饰位点的蜂毒明肽-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺为靶向材料的载药纳米胶束在小鼠体内的分布情况，A为给药后2h活体荧光成像结果，B为给药后12h活体荧光成像结果，C为脑相对肝脏中荧光强度-时间分布曲线，D为脊髓相对肝脏中荧光强度-时间分布曲线；a、b、c分别为Apamin-PEG-DSPE-DiR组、Apamin1-PEG-DSPE-DiR组、Apamin4-PEG-DSPE-DiR组。

[0027] 图2为不同粒径大小的载药纳米胶束Apamin-PEG-DSPE-DiR在小鼠体内的分布情况，A、B分别为给药后4h、12h活体荧光成像结果，C、D分别为给药后4h、12h各器官的荧光半定量结果。

[0028] 图3为不同靶向材料比例的载药纳米胶束Apamin-PEG-DSPE-DiR在小鼠体内的分布情况，A为给药后4h活体荧光成像结果，B为脑相对肝脏中荧光强度-时间分布曲线，C为脊髓相对肝脏中荧光强度-时间分布曲线；a、b、c、d、e分别为受体饱和对照组、无靶头对照组、靶向材料比例0.1%组、1%组、10%组。

[0029] 图4为不同给药方式的载药纳米胶束Apamin-PEG-DSPE-DiR在小鼠体内的分布情况，A为给药后8h活体荧光成像结果，B为脑相对肝脏中荧光强度-时间分布曲线，C为脊髓相对肝脏中荧光强度-时间分布曲线；a、b、c、d、e分别为静脉注射组、肌肉注射组、灌胃组、腹腔注射组、皮下注射组。

具体实施方式

[0030] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

[0031] 实施例1、不同修饰位点的蜂毒明肽-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的制备[0032] 取Apamin（CNCKAPETALCARRCQQH-NH2）0.2μmol，与琥珀酰亚胺-聚乙二醇3400-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（NHS-PEG3400-DSPE）按照摩尔比为1:1.2溶于新蒸二甲基甲酰胺（DMF）中，室温孵化48h，所得反应混合液置分子量为3500Da的透析袋中，以去离子水为介质透析48h，冻干，制得Apamin-PEG3400-DSPE。

[0033] 取肽链N端α-氨基被Fmoc（芴甲氧羰基）保护的Apamin（Fmoc-CNCKAPETALCA-RRCQQH-NH2）0.2μmol，用DMF溶解，再与NHS-PEG3400-DSPE按照摩尔比为1:1.2溶于新蒸DMF中，室温孵化48h，反应混合液置分子量为3500Da的透析袋中，以去离子水为介质透析48h，冻干，制得Fmoc-Apamin1-PEG3400-DSPE。将Fmoc-Apamin1-PEG3400-DSPE用20%(v/v)哌啶的DMF溶液溶解，室温搅拌0.5h脱去Fmoc保护基，所得反应液置分子量为3500Da的透析袋中，以去离子水为介质透析48h，冻干，制得Apamin1-PEG3400-DSPE。

[0034] 取肽链4位赖氨酸ε-氨基被Dde（1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己亚基)乙基）保护的Apamin（CNCK(Dde)APETALCARRCQQH-NH2）0.2μmol，用DMF溶解，与NHS-PEG3400-DSPE按照摩尔比为1:1.2溶于新蒸DMF中，室温孵化48h，反应混合液置分子量为3500Da的透析袋中，以去离子水为介质透析48h，冻干，制得Dde-Apamin4-PEG3400-DSPE。将Dde-Apamin4-PEG3400-DSPE用10%(v/v)水合肼的二氯甲烷溶液溶解，室温搅拌0.5h脱去Dde保护基，所得反应液置分子量为3500Da的透析袋中，以去离子水为介质透析48h，冻干，制得Apamin4-PEG3400-DSPE。

[0035] 实施例2、以不同修饰位点的蜂毒明肽-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺为靶向材料的载药纳米胶束的制备及体内分布试验

[0036] 1、载药纳米胶束的制备

[0037] 以近红外荧光染料DiR为模型药物。将Apamin-PEG3400-DSPE、Apamin1-PEG3400-DSPE、Apamin4-PEG3400-DSPE分别与mPEG2000-DSPE按照摩尔比为10:90混合，用氯仿0.5mL溶解，再加入DiR的甲醇溶液，混合均匀，37℃减压蒸发成薄膜，真空干燥1.5h，再加入PBS（pH7.4）0.2mL，涡旋10min，37℃振荡1.5h，用孔径为0.22μm的滤膜过滤，滤液再经微型匀质机乳匀，分别制得平均粒径为50nm的载药纳米胶束Apamin-PEG-DSPE-DiR、Apamin1-PEG-DSPE-DiR、Apamin4-PEG-DSPE-DiR。

[0038] 2、体内分布试验

[0039] 将SPD级昆明种小鼠随机分为3组，分别尾静脉注射载药纳米胶束Apamin-PEG-DSPE-DiR、Apamin1-PEG-DSPE-DiR、Apamin4-PEG-DSPE-DiR，在给药后0.5、1、2、4、8、12、24h分别取1只小鼠，异氟烷气体麻醉，用活体成像仪（in-vivoImaging System，FX Pro，Burker，USA）检测样品在小鼠体内的分布；然后尾静脉注射空气致死小鼠，取出心、肝、脾、肺、肾、脑和脊髓，用活体成像仪检测不同脏器的纳米胶束分布量。

[0040] 结果如图1所示，载药纳米胶束Apamin-PEG-DSPE-DiR、Apamin1-PEG-DSPE-DiR和Apamin4-PEG-DSPE-DiR均可以穿过血脑屏障和血脊髓屏障到达脑和脊髓，其中Apamin1-PEG-DSPE-DiR在体内可迅速分布到中枢神经系统，而Apamin4-PEG-DSPE-DiR在给药4h后中枢神经系统有大量分布且持续时间长，表现出一定的缓释作用。

[0041] 实施例3、不同粒径大小的载药纳米胶束的制备及体内分布试验

[0042] 1、载药纳米胶束的制备

[0043] 将Apamin-PEG3400-DSPE与mPEG2000-DSPE按照摩尔比为10:90混合，用氯仿0.5mL溶解，再加入DiR的甲醇溶液，混合均匀，37℃减压蒸发成膜，真空干燥1.5h，再加入PBS（pH7.4）0.2mL，涡旋10min，37℃振荡1.5h，用孔径0.45μm的滤膜过滤，滤液经微型匀质机乳匀，制得平均粒径分别为50、100、200、400nm的载药纳米胶束Apamin-PEG-DSPE-DiR。

[0044] 2、体内分布试验

[0045] 将SPD级昆明种小鼠随机分为4组，分别尾静脉注射平均粒径为50、100、200、400nm的载药纳米胶束Apamin-PEG-DSPE-DIR，在给药后4、12h分别取1只小鼠，异氟烷气体麻醉，用活体成像仪检测样品在小鼠体内的分布；然后尾静脉注射空气致死小鼠，取出心、肝、脾、肺、肾、脑和脊髓，用活体成像仪检测不同脏器的纳米胶束分布量。

[0046] 结果如图2所示，当平均粒径不大于200nm时，载药纳米胶束Apamin-PEG-DSPE-DiR表现出较好的脑和脊髓靶向性。

[0047] 实施例4、不同靶向材料比例的载药纳米胶束的制备及体内分布试验

[0048] 1、载药纳米胶束的制备

[0049] 将Apamin-PEG3400-DSPE与mPEG2000-DSPE分别按照摩尔比为0.1:99.9、1:99、10:90混合，用氯仿0.5mL溶解，再加入DiR的甲醇溶液，混合均匀，37℃减压蒸发成薄膜，真空干燥1.5h，再加入PBS（pH7.4）0.2mL，涡旋10min，37℃振荡1.5h，用孔径为0.22μm的滤膜过滤，滤液经微型匀质机乳匀，控制胶束平均粒径为50nm，制得靶向材料比例分别为0.1%、1%、10%的载药纳米胶束Apamin-PEG-DSPE-DiR。

[0050] 同时，以NHS-PEG3400-DSPE替代Apamin-PEG3400-DSPE，按照上述相同方法，制得无靶头对照。

[0051] 2、体内分布试验

[0052] 将SPD级昆明种小鼠随机分为5组，分别尾静脉注射无靶头对照，靶向材料比例为0.1%、1%、10%的载药纳米胶束Apamin-PEG-DSPE-DiR，剩余1组（受体饱和对照组）提前2h尾静脉注射蜂毒明肽使小鼠体内的蜂毒明肽受体饱和，再尾静脉注射靶向材料比例为10%的载药纳米胶束Apamin-PEG-DSPE-DiR。各组在给药后0.5、1、2、4、8、12、24h分别取1只小鼠，异氟烷气体麻醉，用活体成像仪检测样品在小鼠体内的分布；然后尾静脉注射空气致死小鼠，取出心、肝、脾、肺、肾、脑和脊髓，用活体成像仪检测不同脏器的纳米胶束分布量。

[0053] 结果如图3所示，当靶向材料比例不小于1%时，载药纳米胶束Apamin-PEG-DSPE-DiR表现出较好的脑和脊髓靶向性。

[0054] 实施例5、不同给药方式的载药纳米胶束的体内分布试验

[0055] 将SPD级昆明种小鼠随机分为5组，分别以尾静脉注射、肌肉注射、灌胃、腹腔注射、背部皮下注射5种方式给予实施例2制得的载药纳米胶束Apamin-PEG-DSPE-DiR，在给药后0.5、1、2、4、8、12、24h分别取1只小鼠，异氟烷气体麻醉，用活体成像仪检测样品在小鼠体内的分布；然后尾静脉注射空气致死小鼠，取出心、肝、脾、肺、肾、脑和脊髓，用活体成像仪检测不同脏器的纳米胶束分布量。

[0056] 结果如图4所示，不同给药方式的载药纳米胶束Apamin-PEG-DSPE-DiR在小鼠体内的分布有明显差异，以尾静脉注射、背部皮下注射、灌胃方式给药的载药纳米胶束在小鼠脑和脊髓中有较大量分布，尤以尾静脉注射的效果最佳，且该载药纳米胶束对脊髓的靶向性较脑部更强；而以肌肉注射和腹腔注射方式给药的载药纳米胶束主要潴留在注射部位。

[0057] 实施例6、以Apamin-PEG3400-DSPE为靶向材料的载药纳米脂质体的制备及其体内分布试验

[0058] 1、载药纳米脂质体的制备

[0059] 以近红外荧光染料DiR为模型药物。将氢化大豆磷脂、胆固醇、mPEG2000-DSPE、Apamin-PEG3400-DSPE按照摩尔比为52:45:2:1溶于氯仿，再加入DiR的甲醇溶液，混合均匀，减压蒸馏除去氯仿，得均匀脂质膜，真空干燥24h，再加入0.155mol/L硫酸铵溶液适量，60℃水浴震荡2h，得脂质体混悬液，再在60℃水浴中经微型匀质机乳匀，制得平均粒径为
50nm的载药纳米脂质体Apamin-PEG-DSPE-DiR。

[0060] 同时，以NHS-PEG3400-DSPE替代Apamin-PEG3400-DSPE，按照上述相同方法，制得无靶头对照。

[0061] 2、体内分布试验

[0062] 将SPD级昆明种小鼠随机分为2组，分别尾静脉注射无靶头对照和载药纳米脂质体Apamin-PEG-DSPE-DiR，两组在给药后0.5、1、2、4、8、12、24h分别取1只小鼠，异氟烷气体麻醉，用活体成像仪检测样品在小鼠体内的分布；然后尾静脉注射空气致死小鼠，取出心、肝、脾、肺、肾、脑和脊髓，用活体成像仪检测不同脏器的纳米脂质体分布量。

[0063] 结果显示，载药纳米脂质体Apamin-PEG-DSPE-DiR可以穿过血脑屏障和血脊髓屏障到达脑和脊髓，而无靶头对照不能穿过血脑屏障和血脊髓屏障到达中枢神经系统。

[0064] 实施例7、蜂毒明肽-聚乙二醇-聚丙交酯（Apamin-PEG-PLA）的制备

[0065] 取肽链N端添加1个半胱氨酸、肽链中4个半胱氨酸残基的巯基全部被Acm（乙酰氨基甲基）保护的Apamin（SH-C-C(Acm)NC(Acm)KAPETALC(Acm)ARRC(Acm)QQH-NH2）0.2μmol，与马来酰亚胺-聚乙二醇-聚丙交酯（Mal-PEG-PLA、Mw6000Da）按照摩尔比为1:1.5溶于新蒸DMF中，调节pH8.0，室温孵化48h，所得反应混合液置分子量为3500Da的透析袋中，以去离子水为介质透析48h，冻干，制得Apamin(4Acm)-PEG-PLA。将Apamin(4Acm)-PEG-PLA溶于甲醇，加入适量柠檬酸溶液和1mol/L盐酸溶液，再逐滴加入碘甲醇溶液使混合液保持微黄色持续反应，反应结束后加入适量抗坏血酸溶液使混合液褪去微黄色，再将反应液透析除去盐类，冷冻干燥，制得Apamin-PEG-PLA。

[0066] 实施例8、以Apamin-PEG-PLA为靶向材料的载药纳米粒的制备及其体内分布试验[0067] 1、载药纳米粒的制备

[0068] 以近红外荧光染料DiR为模型药物。将Apamin-PEG-PLA与mPEG-PLA（Mw4300Da）按照摩尔比为10:90溶于氯仿，再加入DiR的甲醇溶液，混合均匀，旋转蒸发，成膜后加入PBS（pH7.4）水化，再通过高压乳匀机乳化成乳剂，控制平均粒径为50nm，制得载药纳米粒Apamin-PEG-PLA-DiR。

[0069] 同时，以Mal-PEG-PLA替代Apamin-PEG-PLA，按照上述相同方法，制得无靶头对照。

[0070] 2、体内分布试验

[0071] 将SPD级昆明种小鼠随机分为2组，分别尾静脉注射无靶头对照和载药纳米粒Apamin-PEG-PLA-DiR，两组在给药后0.5、1、2、4、8、12、24h分别取1只小鼠，异氟烷气体麻醉，用活体成像仪检测样品在小鼠体内的分布；然后尾静脉注射空气致死小鼠，取出心、肝、脾、肺、肾、脑和脊髓，用活体成像仪检测不同脏器的纳米粒分布量。

[0072] 结果显示，载药纳米粒Apamin-PEG-PLA-DiR可以穿过血脑屏障和血脊髓屏障到达脑和脊髓并且在给药后6h达到最大分布量，而无靶头对照给药后在脑和脊髓没有明显分布。

[0073] 最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。