ALT1蛋白及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了一种ALT1蛋白及其编码基因与应用。本发明公开一种蛋白，为如下(1)或(2)所示：(1)SEQ ID No.4所示的蛋白；(2)将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。本发明证明ALT1基因的表达抑制可以显著提高植物的耐碱能力。

权利要求

1.一种提高植物耐碱能力的方法，是抑制植物中SEQ ID No.4所示的蛋白的编码基因的转录或表达；

所述抑制植物中SEQ ID No.4所示的蛋白的编码基因的转录或表达的方法为将所述SEQ ID No.4所示的蛋白的编码基因的干扰载体导入所述植物中；

所述干扰载体按照如下(1)或(2)所述的方法制备：

(1)将SEQ ID No.7所示的DNA分子反向插入到出发载体pZH2Bi的XbaI位点，得到中间载体；将SEQ ID No.7所示的DNA分子正向插入到中间载体的SpeI位点，即得；

(2)将SEQ ID No.7中自5’末端起第7位至第373位核苷酸所示的DNA分子反向插入到出发载体pZH2Bi的XbaI位点，得到中间载体；将SEQ ID No.7中自5’末端起第7位至第373位核苷酸所示的DNA分子正向插入到中间载体的SpeI位点，即得；

所述正向是指所述SEQ ID No.7所示的DNA分子或SEQ ID No.7中自5’末端起第7位至第373位核苷酸所示的DNA分子的方向与所述载体上的Ubiquitin启动子启动转录的方向相同；

所述反向是指所述SEQ ID No.7所示的DNA分子或SEQ ID No.7中自5’末端起第7位至第373位核苷酸所示的DNA分子的方向与所述载体上的Ubiquitin启动子启动转录的方向相反；

所述植物为水稻。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述SEQ ID No.4所示的蛋白的编码基因为SEQ ID No.3所示的DNA分子。

3.一种DNA分子在提高植物耐碱能力中的应用；

所述DNA分子的核苷酸序列为如下(1)或(2)所示：

(1)SEQ ID No.7所示的DNA分子；

(2)SEQ ID No.7中自5’末端起第7位至第373位核苷酸所示的DNA分子；

所述植物为水稻。

4.一种干扰载体在提高植物耐碱能力中的应用；

所述干扰载体按照如下(1)或(2)所述的方法制备：

(1)将SEQ ID No.7所示的DNA分子反向插入到出发载体pZH2Bi的XbaI位点，得到中间载体；将SEQ ID No.7所示的DNA分子正向插入到中间载体的SpeI位点，即得；

(2)将SEQ ID No.7中自5’末端起第7位至第373位核苷酸所示的DNA分子反向插入到出发载体pZH2Bi的XbaI位点，得到中间载体；将SEQ ID No.7中自5’末端起第7位至第373位核苷酸所示的DNA分子正向插入到中间载体的SpeI位点，即得；

所述正向是指所述SEQ ID No.7所示的DNA分子或SEQ ID No.7中自5’末端起第7位至第373位核苷酸所示的DNA分子的方向与所述载体上的Ubiquitin启动子启动转录的方向相同；

所述反向是指所述SEQ ID No.7所示的DNA分子或SEQ ID No.7中自5’末端起第7位至第373位核苷酸所示的DNA分子的方向与所述载体上的Ubiquitin启动子启动转录的方向相反；

所述植物为水稻。

说明书

ALT1蛋白及其编码基因与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种ALT1蛋白及其编码基因与应用，属于生物技术领域。

背景技术

[0002] 干旱、盐碱、低温、重金属等非生物胁迫会导致植物细胞内ROS增加。由于ROS的过量积累会产生氧化胁迫，因此，植物为了应对复杂的外界环境，在进化过程中形成了复杂的ROS平衡调控机制。

[0003] 在正常外界环境条件下，氧分子处于不太活泼的氧化状态。但是，当植物遭受病虫、干旱、盐碱、重金属、UV等生物或非生物胁迫时，植物体内电子传递和氧化还原动态平衡2-
被破坏，细胞内产生的电子很容易使氧化态的氧转变为还原态的氧，产生超氧阴离子(O )、羟自由基(·OH)、单线态氧(1O2)和过氧化氢(H2O2)等物质，这些物质被统称为活性氧(reactive oxygen species,ROS)。

[0004] 植物对非生物胁迫的耐性与自身的抗氧化胁迫能力密切相关，水稻中一些基因通过调控ROS的平衡在应对外界环境胁迫中发挥重要的作用。例如,DST通过调节与H2O2平衡相关基因的表达调控体内H2O2的积累。DST功能的丧失抑制了H2O2清除相关基因的表达，导致H2O2在保卫细胞中积累，促使气孔关闭，减少干旱胁迫下水分的流失，从而提高耐旱性。Ning等的研究发现，DSM1可能参与了ROS平衡的调控。甲基紫精(methyl viologen,MV)胁迫处理和3,3’－二氨基联苯胺(3,3’-diaminobenzidine,DAB)染色结果都表明dsm1对氧化胁迫更加的敏感。由此可以推测DSM1可能是通过调节ROS的清除而在水稻的耐旱性中发挥作用。Du等研究表明DSM2主要通过调控叶黄素的循环和ABA的合成在水稻耐旱和抗氧化胁迫中发挥功能。用DAB染色观察sik1、RNAi和过量表达的转基因株系在盐胁迫后的H2O2积累情况，发现sik1和RNAi株系受到的氧化伤害程度显著高于过量表达的转基因株系,表明SIK1主要通过增强植株的抗氧化胁迫能力在水稻耐盐中发挥作用。

[0005] 水稻是一种对盐碱胁迫中度敏感的作物。因此，从分子水平上改良水稻的耐盐碱性是使其更好地适应盐碱化土壤的最佳途径。然而，水稻耐盐碱性的分子改良是水稻非生物胁迫研究领域的一个难点。这是由于土壤盐碱化产生的是一种综合胁迫，既有离子胁迫、渗透胁迫、还有高pH胁迫。鉴于盐碱胁迫的复杂性及盐胁迫和碱胁迫之间可能存在相互的作用，为了阐明水稻耐盐碱的分子机理以改良水稻的耐盐碱性，研究人员通常把盐胁迫和碱胁迫分开研究。到目前为止，水稻耐盐研究已经取得一定的进展，一些耐盐重要功能基因如SKC1、DST、RSS1等已经被克隆。与耐盐性研究相比，水稻耐碱研究进展相对缓慢，目前仅初步定位了一些与耐碱性状相关的QTLs。虽然也有耐碱突变体筛选的相关报道，但到目前为止还没有任何与水稻耐碱直接相关的基因被克隆。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种ALT1蛋白及其编码基因与应用。

[0007] 本发明提供一种蛋白，为如下(1)或(2)所示：

[0008] (1)SEQ ID No.4所示的蛋白；

[0009] (2)将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。

[0010] 上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

[0011] 上述编码基因中，所述编码基因为如下中至少一种：

[0012] 1)SEQ ID No.3所示的DNA分子；

[0013] 2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

[0014] 3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述蛋白质的DNA分子。

[0015] 含有上述任一所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

[0016] 一种提高植物耐碱能力的方法也属于本发明的保护范围，是抑制植物中所述蛋白的编码基因的转录或表达。

[0017] 上述方法中，所述抑制植物中所述蛋白的编码基因的转录或表达的方法为将所述蛋白的编码基因的干扰载体导入所述植物中；

[0018] 所述干扰载体按照如下(1)或(2)所述的方法制备：

[0019] (1)将SEQ ID No.7所示的DNA分子反向插入到出发载体pZH2Bi的XbaI位点，得到中间载体；将SEQ ID No.7所示的DNA分子正向插入到中间载体的SpeI位点，即得；

[0020] (2)将SEQ ID No.7中自5’末端起第7位至第373位核苷酸所示的DNA分子反向插入到出发载体pZH2Bi的XbaI位点，得到中间载体；将SEQ ID No.7中自5’末端起第7位至第373位核苷酸所示的DNA分子正向插入到中间载体的SpeI位点，即得；

[0021] 所述正向是指所述SEQ ID No.7所示的DNA分子或SEQ ID No.7中自5’末端起第7位至第373位核苷酸所示的DNA分子的方向与所述载体上的Ubiquitin启动子启动转录的方向相同；

[0022] 所述反向是指所述SEQ ID No.7所示的DNA分子或SEQ ID No.7中自5’末端起第7位至第373位核苷酸所示的DNA分子的方向与所述载体上的Ubiquitin启动子启动转录的方向相反；

[0023] 所述植物具体为水稻。

[0024] 一种DNA分子也属于本发明的保护范围，该分子的核苷酸序列为如下(1)或(2)所示：

[0025] (1)SEQ ID No.7所示的DNA分子；

[0026] (2)SEQ ID No.7中自5’末端起第7位至第373位核苷酸所示的DNA分子。

[0027] 一种干扰载体也属于本发明的保护范围，该干扰载体按照如下(1)或(2)所述的方法制备：

[0028] (1)将SEQ ID No.7所示的DNA分子反向插入到出发载体pZH2Bi的XbaI位点，得到中间载体；将SEQ ID No.7所示的DNA分子正向插入到中间载体的SpeI位点，即得；

[0029] (2)将SEQ ID No.7中自5’末端起第7位至第373位核苷酸所示的DNA分子反向插入到出发载体pZH2Bi的XbaI位点，得到中间载体；将SEQ ID No.7中自5’末端起第7位至第373位核苷酸所示的DNA分子正向插入到中间载体的SpeI位点，即得；

[0030] 所述正向是指所述SEQ ID No.7所示的DNA分子或SEQ ID No.7中自5’末端起第7位至第373位核苷酸所示的DNA分子的方向与所述载体上的Ubiquitin启动子启动转录的方向相同；

[0031] 所述反向是指所述SEQ ID No.7所示的DNA分子或SEQ ID No.7中自5’末端起第7位至第373位核苷酸所示的DNA分子的方向与所述载体上的Ubiquitin启动子启动转录的方向相反。

[0032] 上述蛋白、上述任一所述的编码基因作为靶点在提高植物耐碱能力中的应用也属于本发明的保护范围；

[0033] 或，

[0034] 上述DNA分子和/或上述干扰载体在提高植物耐碱能力中的应用也属于本发明的保护范围。

[0035] 上述任一所述的应用中，所述植物为水稻。

[0036] 本发明证明ALT1基因的表达抑制可以显著提高植物的耐碱能力。

附图说明

[0037] 图1为ALT1-RNAi转基因植株的耐碱性分析。

具体实施方式

[0038] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0039] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0040] 水稻空育131(Oryza sativa L.ssp.Japonica)在文献“董德龙，霍志军，潘晓琳，黄玉福.空育131不同密度对产量关系的影响。《农业与技术》，2008年第5期.”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

[0041] pEASY-Blunt Simple购自TRANSGENE公司，产品目录号为CB111-01。

[0042] pZH2Bi载体在文献“Yao,S.-G.,Ohmori,S.,Kimizu,M.,and Yoshida,H.(2008)Unequal genetic redundancy of rice PISTILLATA orthologs,OsMADS2 and OsMADS4,in lodicule and stamen development.Plant and Cell Physiology,49:853-857.”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

[0043] 配制水培营养液时，每升水中加入表1所示的母液I和II各1mL，用盐酸调pH值至5.0-6.0，搅拌混匀。

[0044] 表1 水培营养液的配方

[0045]母液 配制体积(1L)
I液 (NH4)2SO424.1g，MgSO4·7H2O67.5g，KNO39.25g，KH2PO412.4g，K2SO47.95gII液 Ca(NO3)2.4H2O43.1g，EDTA铁钠盐15g

[0046] 表1中各溶液的余量为水。

[0047] 配制NaHCO3-NaOH缓冲液(碱液)时，在每升水中加入表1所示的母液I和II各1mL，同时加入表2所示对应质量的NaHCO3和NaOH，搅拌混匀。

[0048] 表2 碱液基本配方

[0049]

[0050] 实施例1、ALT1基因的获得

[0051] 一、设计并合成如下引物

[0052] 上游引物：5’-atggaggaagcggcggcggcgg-3’ (SEQ ID No.1)

[0053] 下游引物：5’-ctaaaccataaacaaatagttca-3’ (SEQ ID No.2)

[0054] 二、提取空育131的总RNA，并反转录为cDNA，以cDNA为模板，以步骤一的上游引物和下游引物为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即为ALT1的编码基因序列，如SEQ ID No.3所示，ALT1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

[0055] 实施例2、ALT1-RNAi载体的构建

[0056] 一、提取空育131的总RNA，反转录成cDNA，以RNAi-F和RNAi-R为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

[0057] RNAi-F：5’-TCTAGATCGACCTGTCACAGTGTCACGGT-3’ (SEQ ID No.5)[0058] (下划线所示的序列为XbaI酶切识别位点)

[0059] RNAi-R：5’-ACTAGTCTGATGAGTTGCCACTTGCACGGAG-3’ (SEQ ID No.6)[0060] (下划线所示的序列为SpeI酶切识别位点)

[0061] PCR扩增产物的序列如SEQ ID No.7所示，该PCR扩增产物中自5’末端起第7位至第373位为ALT1基因3’-UTR区域的一个长度为367bp的片段。

[0062] 二、将SEQ ID No.7所示的DNA分子克隆到pEASY-Blunt Simple载体，得到重组质粒，将重组质粒测序，结果正确。

[0063] 三、XbaI和SpeI双酶切步骤二得到的重组质粒，得到基因片段；用XbaI单酶切pZH2Bi载体并去磷酸化，得到载体大片段1；将基因片段反向连接到载体大片段1，得到中间载体1；

[0064] XbaI和SpeI双酶切步骤二得到的重组质粒，得到基因片段；用SpeI单酶切中间载体1并去磷酸化，得到载体大片段2；将基因片段正向连接到载体大片段2，得到重组质粒，并将其命名为ALT1-RNAi。

[0065] (上述正向是指基因片段的方向与载体大片段上的Ubiquitin启动子启动转录的方向相同，正向是指基因片段的方向与载体大片段上的Ubiquitin启动子启动转录的方向相反。)

[0066] 实施例3、ALT1-RNAi转基因植株的构建

[0067] 一、将ALT1-RNAi导入EHA105农杆菌，得到重组农杆菌，将重组农杆菌转染空育131，得到转ALT1-RNAi水稻。

[0068] 二、将转ALT1-RNAi水稻和对照水稻的愈伤组织转移到选择培养基N6/HC2上，在光照培养箱中进行两轮筛选(每轮10天)后，再将愈伤组织转移到分化培养基R/HC中，在R/HC中进行三轮(每轮10天)的分化培养，得到分化苗；将分化苗转移到HF/H培养基中生长15天后，以水培营养液培育15天；大田移栽，常规方法栽培管理，得到阳性T0代转ALT1-RNAi水稻和对照水稻。

[0069] 表3 培养基的配制

[0070]

[0071]

[0072] 将阳性T0代转ALT1-RNAi水稻种植，收获得到T1代种子，将其种植得到T1代植株；收获T1代水稻的种子为T2代种子，将其种植得到T2代幼苗；将水培至一叶一心期的T2代幼苗转移到含有浓度为50mg/L的潮霉素水溶液中，3天后观察幼苗的存活情况，存活的株系即为T2代纯合转ALT1-RNAi水稻株系。

[0073] 实施例4、转ALT1-RNAi水稻的耐碱性分析

[0074] 一、将3个T2代纯合转ALT1-RNAi水稻株系(RNAi-8、RNAi-9和RNAi-7)和野生型植株(空育131)进行碱胁迫处理：将两叶一心期的RNAi-8、RNAi-9和RNAi-7、野生型植株幼苗转移至pH9.5的NaHCO3-NaOH缓冲液(碱液，配方如表1和表2所示)中，为保持碱处理pH值的稳定性，对pH9.5的碱液每3天更换一次。

[0075] 结果如图1A所示。

[0076] 图1中，对照代表野生型植株空育131。

[0077] 图1A为pH9.5的NaHCO3-NaOH缓冲液处理第13天的野生型植株以及RNAi-8、RNAi-9、RNAi-73个T2代纯合转ALT1-RNAi水稻株系的表型和处理前的表型。

[0078] 图1A表明，3个T2代纯合转ALT1-RNAi水稻株系(RNAi-8、RNAi-9和RNAi-7)对高碱胁迫表现了不同程度的反应，具体为RNAi-8株系的耐碱性与野生型植株相比稍强或基本相同，而RNAi-9、RNAi-7株系与野生型植株相比耐碱性显著增强。

[0079] 图1B为野生型植株以及RNAi-8、RNAi-9、RNAi-73个T2代纯合转ALT1-RNAi水稻株系的根长比较。

[0080] 图1B表明，与野生型植株相比，3个T2代纯合转ALT1-RNAi水稻株系(RNAi-8、RNAi-9和RNAi-7)的根长变短，其中根长变短的趋势为：RNAi-7>RNAi-9>RNAi-8。

[0081] 二、提取RNAi-8、RNAi-9、RNAi-7和野生型植株的总RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板，以ALT1-F和ALT1-R为引物进行PCR扩增，检测ALT1基因的表达水平，并以Actin为内参。

[0082] ALT1的引物如下：

[0083] ALT1-F：5’-GTTAAAGGTGGCATTGTGGTGCGA-3’ (SEQ ID No.8)

[0084] ALT1-R：5’-AACCATACGGCTGAAATGCGAAGC-3’ (SEQ ID No.9)

[0085] Actin的引物如下：

[0086] Actin-F：5’-TGACGGAGCGTGGTTACTCATTCA-3’ (SEQ ID No.10)[0087] Actin-R：5’-TCTTGGCAGTCTCCATTTCCTGGT-3’ (SEQ ID No.11)[0088] 结果如图1C所示。

[0089] 图1C表明，与野生型植株相比，RNAi-8、RNAi-9、RNAi-73个株系中ALT1的表达水平得到了不同程度的下调，分别下调了20％、40％和60％。

[0090] 以上结果表明，ALT1的表达水平与株系的耐碱性呈紧密的负相关，即ALT1表达下调程度越高，RNAi株系的耐碱性越强，根长越短，说明ALT1基因在水稻耐碱中发挥一个负向调节因子的作用。