中压柱快速分离有抑制酪氨酸酶活性的漆黄素的制备方法

摘要

本发明涉及中压柱快速分离有抑制酪氨酸酶活性的漆黄素的制备方法，属于植物提取物、天然药物与化妆品的开发和应用领域。以漆树木粉为原料、经过提取、萃取、中低压色谱和高效液相制备得到95%以上的漆黄素。本发明从漆树中得到具有高效抑制酪氨酸酶活性的成分，在150μg/mL浓度以上时，对酪氨酸酶活性的抑制率达>95%以上。该制备过程快速简单，是开发潜在的天然酪氨酸酶抑制剂的良好来源。

权利要求

1.中压柱快速分离有抑制酪氨酸酶活性的漆黄素的制备方法，其特征在于由以下步骤组成：第一步，脱脂：

漆树木粉干燥，粉碎，采用木粉与石油醚或正己烷按质量体积比1:15-35 g/mL进行脱脂，温度30℃-80℃，时间1-3 h，提取次数1-4次，过滤后得到滤渣，干燥，得到脱脂漆树木粉；

第二步，提取：

将脱脂漆树木粉与30%～100%甲醇水溶液或乙醇水溶液按质量体积比1:15-30 g/mL提取1-4次，提取温度60-80℃，提取时间1-3 h，提取后，过滤，合并滤液，真空浓缩得到漆树粗提取物；

第三步，萃取：

将漆树粗提取物与乙酸乙酯按质量体积比1:15-30 g/mL萃取2-5次，合并乙酸乙酯萃取相，真空浓缩，得到乙酸乙酯萃取物；

第四步，中压柱纯化：

将乙酸乙酯萃取物与中压柱填料按质量比1:15-50吸附，中压柱柱长20-300 cm，柱直径2-30 cm，采用不同比例的洗脱剂进行洗脱，柱压为3-20 MPa , 检测波长280-360 nm，流速2-200 mL/min，富集漆黄素部位，真空浓缩，回收溶剂，浓缩物为漆黄素提取物，经HPLC分析，漆黄素含量70%以上；

第五步，HPLC制备分离：

将70%以上漆黄素提取物进行高效液相制备，得到漆黄素，经HPLC分析，漆黄素含量在

95%以上；

第六步，漆黄素抑制酪氨酸酶活性评价：

HPLC制备得到的漆黄素进行抑制酪氨酸酶活性评价，通过紫外色谱检测多巴色素的生成量，确定当漆黄素甲醇溶液浓度范围在100~200μg/mL，抑制率为60~100%，其IC50值为

69.46 μg/mL。

2.根据权利要求1所述的中压柱快速分离有抑制酪氨酸酶活性的漆黄素的制备方法，其特征在于中压柱填料可选择200-500目的硅胶和氧化铝中的一种或二种任意比，洗脱剂为石油醚、乙醚、正己烷、乙酸乙酯、氯仿和甲醇中的一种或几种的混合溶液。

3.根据权利要求1所述的中压柱快速分离有抑制酪氨酸酶活性的漆黄素的制备方法，其特征在于中压柱填料也可选择孔径为60 A，40-60 µm的ODS C18、C8和Sephedex LH-20材料中的一种，洗脱剂为甲醇、乙醇和水中的一种或几种的混合溶液。

4.根据权利要求1所述的中压柱快速分离有抑制酪氨酸酶活性的漆黄素的制备方法，其特征在于高效液相制备的条件为：色谱柱XB-C18 Φ10 mm×250 mm,5 μm；流动相：甲醇:水=5:5(V/V)，紫外检测器，检测波长为360 nm，流速：5mL/min。

5.根据权利要求1所述的中压柱快速分离有抑制酪氨酸酶活性的漆黄素的制备方法，其特征在于HPLC分析条件为：4.6×250mm,5μm 的RP-18 endcapped 柱, 流动相为体积比为35:65的甲醇-0.5%醋酸水溶液，紫外检测器，检测波长为280和360nm, 流速为1mL/min。

说明书

中压柱快速分离有抑制酪氨酸酶活性的漆黄素的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及中压柱快速分离有抑制酪氨酸酶活性的漆黄素的制备方法，属于植物提取物、天然药物和化妆品技术领域。

背景技术

[0002] 漆 树（Rhus verniciflua stokes），为 漆 树 科（Anacardiaceae）漆 树 属（(Toxicodendron）的一种落叶乔木。中国是漆树的原产地，漆树是我国重要的特用经济林，其主要分布在陕西、四川、重庆、湖北、贵州、甘肃和云南七个省。目前，对漆树的化学利用主要集中在漆树和漆籽两个方面，对漆树木材活性物的研究很少。漆树本身是一种优良的药用木材，漆树的叶、花、根、皮、果实、干漆和木心都可入药，有止咳、消癖、通经、杀虫、消肿等功效。韩国对漆树木质部位活性物质研究较多，大量的研究表明漆树木质部位的黄酮化合物具有优良的抗氧化性、抗肿瘤、抑菌和免疫调节等作用。

[0003] 漆黄素是漆树木质部位多酚化合物中最典型的活性物。漆黄素能有效改善由抗氧化应激引起的视网膜色素上皮细胞损伤，也能抑制紫外线诱导的细胞死亡和氧自由基的产生，从而预防白内障的进一步发展。漆黄素能够够抑制血管内皮生长因子（TNF-、1L-6、1L-8、MCP-1）的产生和表达，对类风湿关节炎有治疗作用。它可以有效的抑制前列腺癌细胞的增生及诱导其凋亡，并且对乳癌、子宫颈癌、血癌等细胞的增生以及促进凋亡。根据已有的报道，从漆树中分离漆黄素主要普遍采用溶剂萃取、硅胶柱或凝胶色谱柱反复分离，过程复杂烦琐。中压柱色谱具有上样量大，高效，快速等优点，是新型的分离纯化技术，广泛应用于天然产物、食品、生物医药等领域。

[0004] 酪氨酸酶[EC 1.14.18.1，Tyrosinase]是一种双核铜离子氧化还原酶，是多酚氧化酶的一种。广泛存在于生物体内、催化黑色素合成的关键限速酶，与生物体的重要生理过程密切相关。自然界的天然植物中存在许多生物活性物质，植物多酚是天然酪氨酸酶抑制剂的主要来源。目前虽然对漆树中的黄酮化合物的活性做了很多评价，但并不以开发天然酪氨酸酶抑制剂为主要目的。

发明内容

[0005] 为实现上述目的，发明了中压柱快速分离有抑制酪氨酸酶活性的漆黄素的制备方法，其特征在于由以下步骤组成：

[0006] 第一步，脱脂：

[0007] 漆树木粉干燥，粉碎，采用木粉与石油醚或正己烷按质量体积比1:15-35 g/mL进行脱脂，温度30℃-80℃，时间1-3 h，提取次数1-4次，过滤后得到滤渣，干燥，得到脱脂漆树木粉；

[0008] 第二步，提取：

[0009] 将脱脂漆树木粉与30%～100%甲醇水溶液或乙醇水溶液按质量体积比1:15-30g/ mL提取1-4次，提取温度60-80℃，提取时间1-3 h，提取后，过滤，合并滤液，真空浓缩得到漆树粗提取物；

[0010] 第三步，萃取：

[0011] 将漆树粗提取物与乙酸乙酯按质量体积比1:15-30（g/ mL）萃取2-5次，合并乙酸乙酯萃取相，真空浓缩，得到乙酸乙酯萃取物；

[0012] 第四步，中压柱纯化：

[0013] 将乙酸乙酯萃取物与中压柱填料按质量比1:15-50吸附，中压柱柱长20-300 cm，柱直径2-30 cm，采用不同比例的洗脱剂进行洗脱，柱压为3-20 MPa ,检测波长280-360 nm，流速2-200 mL/min，富集漆黄素部位，真空浓缩，回收溶剂，浓缩物为漆黄素提取物，经HPLC分析，漆黄素含量70%以上；

[0014] 第五步，HPLC制备分离：

[0015] 将70%以上漆黄素提取物进行高效液相制备，得到漆黄素，经HPLC分析，漆黄素含量在95%以上；本方法中采用醇溶液进行提取，经过萃取，中压柱快速分离得到70%以上的漆黄素，再进一步通过高效液相制备分离得到95%以上的漆黄素；

[0016] 第六步，漆黄素抑制酪氨酸酶活性评价：

[0017] HPLC制备得到的漆黄素进行抑制酪氨酸酶活性评价，通过紫外色谱检测多巴色素的生成量，确定当漆黄素甲醇溶液浓度范围在100~200ug/mL，抑制率为60~100%，其IC50值为69.46μg/mL。

[0018] 本专利中压柱填料可选择200-500目的硅胶和氧化铝中的一种或二种任意比，洗脱剂为石油醚、乙醚、正己烷、乙酸乙酯和氯仿中的一种或几种的混合溶液，也可选择孔径为60 A，40-60 µm的ODS C18、C8和Sephedex LH-20材料，洗脱剂为甲醇、乙醇和水中的一种或几种的混合溶液。

[0019] 本专利HPLC分析条件为：RP-18 endcapped 柱(4.6×250mm,5μm),流动相为体积比为35:65的甲醇-0.5%醋酸水溶液，紫外检测器，检测波长为280和360nm, 流速为1mL/min。高效液相制备的条件为：RP-18 endcapped 柱(4.6×250mm,5μm),流动相为体积比为35:65的甲醇-0.5%醋酸水溶液，紫外检测器，检测波长为280和360nm, 流速为
1mL/min。

[0020] 本发明的有益效果：

[0021] 本发明所提供的中压柱快速分离有抑制酪氨酸酶活性的漆黄素的制备方法，还具有以下特点：

[0022] （1）本发明中压柱制备色谱可以快速有效地制备高含量的漆黄素化合物；

[0023] （2）通过制备色谱可以得到高纯度的漆黄素；

[0024] （3）漆黄素单体具有低浓度抑制酷氨酸酶的活性，对人体无毒害作用；

[0025] （4）本发明工艺操作简单，易实施，纯度高，活性高；

[0026] （5）漆树中的漆黄素对酪氨酸酶具有显著的抑制作用，能够用于美白化妆品、预防和治疗由于人体黑色素过多导致的沉着性疾病。

附图说明

[0027] 图1为中压柱快速分离后化合物的HPLC色谱图；

[0028] 图2为高效液相制备后单体的3D-DAD-HPLC(190–800 nm)色谱图；

[0029] 图3为单体的IR谱图；

[0030] 图4为单体的MS谱图；

[0031] 图5为单体的1H-NMR谱图；

[0032] 图6为单体的13C-NMR谱图；

[0033] 图7 漆黄素对酪氨酸酶的抑制作用；

[0034] 图8 漆黄素对酪氨酸酶催化单酚底物的抑制作用；

[0035] 图9 漆黄素对酪氨酸酶催化二酚底物抑制作用的Lineweaver-Burk 曲线；

[0036] 图10 漆黄素与酪氨酸酶和二价铜的紫外-可见光谱图。

具体实施方式

[0037] 以下实施例为本发明的一些举例，不应被看做是对本发明的限定。

[0038] 实施例1

[0039] 第一步，脱脂：

[0040] 漆树木粉干燥，粉碎，采用石油醚脱脂，木粉质量与石油醚的体积比例为1:15 g/mL，温度30℃，提取3 h，提取4次，过滤后得到滤渣，干燥，得到脱脂的漆树粉末；

[0041] 第二步，提取：

[0042] 将漆树粉末以1 g原料加入15 mL的50%甲醇水溶液或乙醇水溶液提取4次，提取温度60℃，提取时间1 h，提取后，过滤，合并滤液，真空浓缩得到漆树粗提取物；

[0043] 第三步，萃取：

[0044] 将提取物得到的浸膏用乙酸乙酯有机溶剂萃取3次，将乙酸乙酯层浓缩，得到乙酯乙酯萃取物；

[0045] 第四步，中压柱纯化：

[0046] 将乙酯乙酯萃取物与200-500目硅胶按质量比1:15吸附，洗脱剂选自石油醚、乙醚、正己烷、乙酸乙酯和氯仿中的一种或几种的混合溶液，中压柱柱长20 cm，柱直径2-30 cm，柱压为3-20 MPa ,检测波长280 nm，流速3-100 mL/min，富集漆黄素部位，室温真空回收溶剂，经HPLC分析，制备得到70%以上漆黄素； HPLC分析条件为：RP-18 endcapped 柱(4.6×250mm,5μm),流动相为体积比为35:65的甲醇-0.5%醋酸水溶液，紫外检测器，检测波长为280和360nm, 流速为1mL/min；

[0047] 第五步，HPLC制备分离：

[0048] 以中压制备得到的70%以上的漆黄素为原料，采用高效液相进行制备，得到漆黄素单体，经HPLC分析，含量在95%以上；高效液相制备的条件为：RP-18 endcapped 柱(4.6×250mm,5μm),流动相为体积比为35:65的甲醇-0.5%醋酸水溶液，紫外检测器，检测波长为280和360nm, 流速为1mL/min；

[0049] 本方法中采用醇溶液进行提取，经过萃取，中压柱快速分离得到70%以上的化合物，再进一步通过高效液相制备分离得到化合物单体,经过MS、IR、1H-NMR和 13C-NMR鉴定为漆黄素。

[0050] 黄色针状，在紫外灯下显黄色荧光，盐酸-镁粉反应呈阳性，提示该化合物为黄酮类化合物。MS m/z：[M-H]- 285，结合13C NMR谱，确定分子式为C15H10O6。以上数据经与文献[6]对照，基本一致，故鉴定化合物为漆黄素（3,3,4,7-Tetrahydroxyflavone）。红外谱图中，3328 cm-1为羟基的伸缩振动，1416 cm-1和1323 cm-1为羟基的弯曲振动，2968 cm-1和2853 cm-1为化学键CH3的伸缩振动，2924 cm-1为化学键CH2的伸缩振动，1460 cm-1为化学键CH3和化学键CH2的弯曲振动，1597和1507 cm-1为芳烃的骨架振动，1104 cm-1为羟基的C-O伸缩振动,1274 cm-1为醚的伸缩振动。其氢、碳信号归属如下：1H NMR (DMSO，300 MHz)谱中，δ10.8（1H,s, 3-OH）, δ9.32(2H,s, 3’-OH,4’-OH)，δ9.04(1H,s,7-OH)，7.93(1H,d,J=9.3 Hz,H-5)，7.69（1H,d,J=2.1Hz,H-2’），7.55（1H,dd，J=8.5 and 2.1 Hz, H-6’），6.91(3H,m, H-5’,H-6,H-8)。13C NMR (DMSO，300 MHz)谱中，δ 171.9(C-4)，δ 162.7(C-7)，δ 156.2(C-9)，δ 147.2(C-4’)，δ 145.6(C-2)，δ 145.0(C-3’)，δ 137.1(C-3)，δ 126.4(C-5)，δ 122.4(C-1’)，δ 119.6(C-6’)，115.5(C-5’)，
114.9(C-2’)，114.6(C-6)，114.15(C-10)，101.75(C-8)。

[0051] 实施例2

[0052] 第一步，脱脂：

[0053] 漆树木粉干燥，粉碎，采用石油醚、乙醚、正己烷、戊烷和正戊烷有机溶剂脱脂，木粉质量与有机溶剂的体积比例为1:35 g/mL，温度80℃，提取1h，提取1次，过滤后得到滤渣，干燥，得到脱脂的漆树粉末；

[0054] 第二步，提取：

[0055] 将漆树粉末以1 g原料加入30 mL的30%的甲醇水溶液或乙醇水溶液提取1-4次，提取温度680℃，提取时间3 h，提取后，过滤，合并滤液，真空浓缩得到漆树粗提取物；

[0056] 第三步，萃取：

[0057] 将提取物得到的浸膏用乙酸乙酯有机溶剂萃取2次，将乙酸乙酯层浓缩，得到乙酯乙酯萃取物；

[0058] 第四步，中压柱纯化：

[0059] 将乙酯乙酯萃取物与200-500目氧化铝填料按质量比1: 50吸附，洗脱剂选自石油醚、乙醚、正己烷和乙酸乙酯中的一种或几种的混合溶液，中压柱柱长100 cm，柱直径6 cm，柱压为5-10 MPa ,检测波长280-360 nm，流速20-50 mL/min，富集漆黄素部位，室温真空回收溶剂，经HPLC分析，制备得到70%以上漆黄素；

[0060] 第五步，HPLC制备分离：

[0061] 以中压制备得到的70%以上的漆黄素为原料，采用高效液相进行制备，得到漆黄素单体，经HPLC分析，含量在95%以上；

[0062] 本方法中采用醇溶液进行提取，经过萃取，中压柱快速分离得到70%以上的化合物，再进一步通过高效液相制备分离得到化合物单体,经过MS、IR、1H-NMR和 13C-NMR鉴定为漆黄素

[0063] 实施例3

[0064] 第一步，脱脂：

[0065] 漆树木粉干燥，粉碎，采用正己烷脱脂，木粉质量与正己烷的体积比例为1:20 g/mL，温度60℃，提取2 h，提取2次，过滤后得到滤渣，干燥，得到脱脂的漆树粉末；

[0066] 第二步，提取：

[0067] 将漆树粉末以1 g原料加入20 mL的不同浓度的甲醇水溶液或乙醇水溶液提取1-4次，提取温度60-80℃，提取时间1-3 h，提取后，过滤，合并滤液，真空浓缩得到漆树粗提取物；

[0068] 第三步，萃取：

[0069] 将提取物得到的浸膏用乙酸乙酯有机溶剂萃取2-5次，将乙酸乙酯层浓缩，得到乙酯乙酯萃取物；

[0070] 第四步，中压柱纯化：

[0071] 将乙酯乙酯萃取物与60 A，40-60 µm的ODS C18填料按质量比1:30吸附，洗脱剂选自甲醇、乙醇和水中的一种或几种的混合溶液，中压柱柱长50 cm，柱直径4 cm，柱压为3-5 MPa ,检测波长280-360 nm，流速10-20 mL/min，富集漆黄素部位，室温真空回收溶剂，经HPLC分析，制备得到70%以上漆黄素；

[0072] 第五步，HPLC制备分离：

[0073] 以中压制备得到的70%以上的漆黄素为原料，采用高效液相进行制备，得到漆黄素单体，经HPLC分析，含量在95%以上；

[0074] 本方法中采用醇溶液进行提取，经过萃取，中压柱快速分离得到70%以上的化合物，再进一步通过高效液相制备分离得到化合物单体,经过MS、IR、1H-NMR和 13C-NMR鉴定为漆黄素。

[0075] 实施例4

[0076] 1. 中压柱快速分离具有抑制酪氨酸酶活性的漆黄素的制备方法，其特征在于由以下步骤组成：

[0077] 第一步，脱脂：

[0078] 漆树木粉干燥，粉碎，采用正己烷脱脂，木粉质量与正己烷的体积比例为1:15-35 g/mL，温度30℃-80℃，提取1-3 h，提取1-4次，过滤后得到滤渣，干燥，得到脱脂的漆树粉末；

[0079] 第二步，提取：

[0080] 将漆树粉末以1 g原料加入15-30 mL的甲醇或乙醇提取1-4次，提取温度60-80℃，提取时间1-3 h，提取后，过滤，合并滤液，真空浓缩得到漆树粗提取物；

[0081] 第三步，萃取：

[0082] 将提取物得到的浸膏用乙酸乙酯有机溶剂萃取2-5次，将乙酸乙酯层浓缩，得到乙酯乙酯萃取物；

[0083] 第四步，中压柱纯化：

[0084] 将乙酯乙酯萃取物与60 A，40-60 µm的C8填料按质量比1:15-50吸附，洗脱剂选自甲醇、乙醇和水中的一种或几种的混合溶液，中压柱柱长20-300 cm，柱直径2-30 cm，柱压为3-20 MPa ,检测波长280-360 nm，流速2-200 mL/min，富集漆黄素部位，室温真空回收溶剂，经HPLC分析，制备得到70%以上漆黄素；

[0085] 第五步，HPLC制备分离：

[0086] 以中压制备得到的70%以上的漆黄素为原料，采用高效液相进行制备，得到漆黄素单体，经HPLC分析，含量在95%以上；

[0087] 本方法中采用醇溶液进行提取，经过萃取，中压柱快速分离得到70%以上的化合物，再进一步通过高效液相制备分离得到化合物单体,经过MS、IR、1H-NMR和 13C-NMR鉴定为漆黄素。

[0088] 实施例5

[0089] 1. 中压柱快速分离具有抑制酪氨酸酶活性的漆黄素的制备方法，其特征在于由以下步骤组成：

[0090] 第一步，脱脂：

[0091] 漆树木粉干燥，粉碎，采用石油醚脱脂，木粉质量与石油醚的体积比例为1:15-35 g/mL，温度30-80℃，提取1-3 h，提取1-4次，过滤后得到滤渣，干燥，得到脱脂的漆树粉末；

[0092] 第二步，提取：

[0093] 将漆树粉末以1 g原料加入15-30 mL的80%的甲醇水溶液或乙醇水溶液提取1-4次，提取温度60-80℃，提取时间1-3 h，提取后，过滤，合并滤液，真空浓缩得到漆树粗提取物；

[0094] 第三步，萃取：

[0095] 将提取物得到的浸膏用乙酸乙酯有机溶剂萃取2-5次，将乙酸乙酯层浓缩，得到乙酯乙酯萃取物；

[0096] 第四步，中压柱纯化：

[0097] 将乙酯乙酯萃取物与60 A，40-60 µm的Sephedex LH-20填料按质量比1:15-50吸附，洗脱剂选自甲醇、氯仿和水中的一种或几种的混合溶液，中压柱柱长20-300 cm，柱直径2-30 cm，柱压为3-20 MPa ,检测波长280-360 nm，流速2-200 mL/min，富集漆黄素部位，室温真空回收溶剂，经HPLC分析，制备得到70%以上漆黄素；

[0098] 第五步，HPLC制备分离：

[0099] 以中压制备得到的70%以上的漆黄素为原料，采用高效液相进行制备，得到漆黄素单体，经HPLC分析，含量在95%以上；

[0100] 本方法中采用醇溶液进行提取，经过萃取，中压柱快速分离得到70%以上的化合物，再进一步通过高效液相制备分离得到化合物单体,经过MS、IR、1H-NMR和 13C-NMR鉴定为漆黄素。

[0101] 实施例6

[0102] 将不同浓度漆黄素对酪氨酸酶活性的抑制作用如图7所示。从图可以看出，漆黄素对酪氨酸酶活性的抑制作用对浓度呈现依赖性，随着浓度的增大，其抑制率增加，对不同浓度的漆黄素与酪氨酸酶抑制率的变化规律进行线性拟合，可以得到拟合方程为：

[0103] Y = 0.005X + 0.135 （1）

[0104] 式中：Y= 漆黄素对酪氨酸酶活性的抑制率，%；

[0105] X= 漆黄素的质量浓度，μg/mL。

[0106] 该拟合方程（1）的相关系数R² 为 0.983 ，说明，这组数据的线性拟合是有效的。根据方程可以计算乙酸乙酯萃取物的IC50为69.46 μg/mL。

[0107] 实施例7

[0108] 酪氨酸酶催化单酚底物具有迟滞效应，主要是由于酪氨酸酶对单酚底物羟基化时，由于酪氨酸酶的自身特点使该过程受到较大的空间位阻。以L-酪氨酸的浓度为1mmol/L，测定不同浓度的漆黄素对酪氨酸酶单酚酶抑制作用的进程曲线，如图8所示。当增大漆黄素的浓度时，在相同反应时间内，产物生成量降低，当漆黄素的浓度为0.524mmol.L-1时，在30min内，多巴色素的吸光度增加不明显。随着漆黄素浓度的增大，酶反应的迟滞时间延长没有抑制剂存在下迟滞时间为1min，当漆黄素浓度为0.524mmol.L-1时，迟滞时间延长至11.2min。迟滞时间的延长说明高浓度漆黄素的存在使底物更难与酶活性位点结合。因此两者皆可得出漆黄素对酪氨酸酶催化活性表现出较强的抑制作用。

[0109] 实施例8

[0110] 在测定体系中，固定酶的浓度，通过改变底物L-多巴的浓度，测定不同浓度样品对酶活力的影响。采用Lineweaver-Burk即双倒数作图法，以底物浓度的倒数1/[S]为x轴，反应速度的倒数1/V为y轴作图，双倒数曲线如图9所示，从图可以看出随着漆黄素浓度增大，直线纵轴截距基本不变，即Vm不随着浓度发生变化，而Km值增大，符合竞争性可逆抑制类型的特征。

[0111] 实施例9

[0112] 从图10可以看出，漆黄素加入过量的Cu2+后，漆黄素的特征吸收波位置并未发生改变，说明漆黄素不会与Cu2+发生螯合作用。当漆黄素中加入酪氨酸酶时，漆黄素的特征吸收峰360nm发生蓝移分别至340nm，说明，漆黄素与酪氨酸酶发生相互作用使漆黄素的共轭效应减小，导致漆黄素发生蓝移。从分析结果看，漆黄素与酪氨酸酶发生了相互作用，但并没有与酪氨酸酶活性中心的双核铜离子产生螯合作用。