一种微生物包埋微球连续制备装置及方法

摘要

本发明公开了一种微生物包埋微球连续制备装置及方法。它包括点胶机、步进电机、针筒、漏斗、瓶子、离心管和旋转台，瓶子置于旋转台上，离心管置于瓶中，离心管上部具有胶塞，漏斗的插管穿过胶塞伸入离心管中，漏斗的锥形部分卡于瓶口，在旋转台一侧设有步进电机，步进电机的丝杆竖立于转台一侧，其上的滑块经连杆与针筒相连，针筒竖立于漏斗的上方，针头朝下，针筒尾端开口与点胶机的输出气管相连。本发明制备微球工艺条件简单，设备容易获得，而且制作过程对生物活性物质较温和，得到的微球粒径均一性较高，制备过程可实现自动化。整套制备装置简易，可整体放置于普通超净工作台中，防止杂菌污染。利用该装置和方法可制备包埋微生物细胞的微球。

权利要求

1.一种微生物包埋微球连续制备装置，其特征在于，包括点胶机、步进电机、针筒、漏斗、瓶子、离心管和旋转台，所述的瓶子置于旋转台上，离心管置于瓶中，离心管上部具有胶塞，漏斗的插管穿过胶塞伸入离心管中，漏斗的锥形部分卡于瓶口，在旋转台一侧设有步进电机，步进电机的丝杆竖立于转台一侧，其上的滑块经连杆与针筒相连，针筒竖立于漏斗的上方，针头朝下，针筒尾端开口与点胶机的输出气管相连。

2.根据权利要求1所述的微生物包埋微球连续制备装置，其特征在于，所述的针筒的针头的内径为60-160μm。

3.一种利用权利要求1所述的微生物包埋微球连续制备装置进行微生物细胞微包埋的方法，其特征在于，包括以下步骤：在离心管中加入固化剂水溶液，将套有胶塞的漏斗插入离心管中，使胶塞卡于离心管中，再往漏斗里加入固化剂水溶液到一定高度后，再倒入乳化剂，往针筒内加入混有微生物细胞的包埋材料溶液，再连上点胶机的输出气管，将针筒与步进电机丝杆上的滑块经连杆固定连接，开启旋转台、步进电机和点胶机，针头通过步进电机滑块带入乳化剂相中，在点胶机的脉冲气压作用下挤出微球，随后针头又被滑块带离出乳化剂相，乳化剂相的拖拽力和界面张力将微球从针头剥离，形成的微球在自身重力作用下沉降至固化剂水溶液和乳化剂的两相界面，开始与固化剂水溶液中的固化剂固化，形成包埋微生物细胞的微球；由于旋转台的旋转和步进机的往复，不断的形成微球，至结束时，关闭点胶机、步进电机和旋转台，抽出漏斗，去掉乳化剂相，离心收集固化剂水溶液相中的包埋了微生物细胞的微球，用去离子水清洗微球，再次离心即得微生物包埋微球。

说明书

一种微生物包埋微球连续制备装置及方法

技术领域：

[0001] 本发明属于微生物领域，具体涉及一种微生物包埋微球连续制备装置及方法。背景技术：

[0002] 通过物理或化学方法，将游离微生物固定在限定的空间区域使其保持活性并能繁殖扩增，而这种固定介质又具有良好的通透性，使微生物之间的营养或信号分子等可以得到交流，最终可以富集并分离得到传统分离方法无法获得的微生物物种。国外Ben和Zengler将微包埋与原位环境培养相结合，对海水、海底沉积物、珊瑚共附生微生物进行高通量培养，大大提高了海洋微生物在实验室条件下的可培养性。Eitan将该技术与传统培养技术做了比较，发现该技术获得的可培养微生物提高了10倍以上。Bruns利用微包埋技术对湖水中的浮游微生物多样性进行研究，从中筛选分离到6个亚纲的44株未可培养微生物。国内目前已有针对酶和细胞的包埋微球用于发酵、信号检测、追踪等，这些粒径均一的微球在生物、医药和化工等诸多领域有广泛的应用。

[0003] 目前制备用于包埋的微球通常采用的方法有乳化法、喷雾干燥法、挤出法和微流体法等。乳化法常用机械搅拌法，简单易操作，对设备要求最低，但制作过程中叶片对微生物细胞会造成损伤，微球的粒径均一性也较差。喷雾干燥法制作的微球虽然均一性很高且微球制备速度快，但制备过程中高温会导致温度敏感微生物的死亡，所以这两种微球制备方式都不适合微生物细胞的微包埋。微流体法需要制备微米级管道，制备过程也容易发生堵塞，需要对微米芯片通道进行改造。传统的挤出法制作微球的过程比较简单，但是难以制备粒径小的微球，不能满足微生物共培养后的高通量分选。发明内容：

[0004] 本发明的目的是提供一种能够高效率的连续制备粒径均一的微球，以实现微生物活细胞包埋微球的连续高通量温和制备的微生物包埋微球连续制备装置，可应用于对海洋等环境微生物细胞进行包埋，实现实验室环境中微生物细胞的共培养和后续分选。

[0005] 本发明的微生物包埋微球连续制备装置，其特征在于，包括点胶机、步进电机、针筒、漏斗、瓶子、离心管和旋转台，所述的瓶子置于旋转台上，离心管置于瓶中，离心管上部具有胶塞，漏斗的插管穿过胶塞伸入离心管中，漏斗的锥形部分卡于瓶口，在旋转台一侧设有步进电机，步进电机的丝杆竖立于转台一侧，其上的滑块经连杆与针筒相连，针筒竖立于漏斗的上方，针头朝下，针筒尾端开口与点胶机的输出气管相连。

[0006] 所述的针筒的针头的内径为60-160μm。

[0007] 本发明的第二个目的是提供利用上述微生物包埋微球连续制备装置进行微生物细胞微包埋的方法，其特征在于，包括以下步骤：在离心管中加入固化剂水溶液，将套有胶塞的漏斗插入离心管中，使胶塞卡于离心管中，再往漏斗里加入固化剂水溶液到一定高度后，再倒入乳化剂，往针筒内加入混有微生物细胞的包埋材料溶液，再连上点胶机的输出气管，将针筒与步进电机丝杆上的滑块经连杆固定连接，开启旋转台、步进电机和点胶机，针头通过步进电机滑块带入乳化剂相中，在点胶机的脉冲气压作用下挤出微球，随后针头又被滑块带离出乳化剂相，乳化剂相的拖拽力和界面张力将微球从针头剥离，形成的微球在自身重力作用下沉降至固化剂水溶液和乳化剂的两相界面，开始与固化剂水溶液中的固化剂固化，形成包埋微生物细胞的微球；由于旋转台的旋转和步进机的往复，不断的形成微球，至结束时，关闭点胶机、步进电机和旋转台，抽出漏斗，去掉乳化剂相，离心收集固化剂水溶液相中的包埋了微生物细胞的微球，用去离子水清洗微球，再次离心即得微生物包埋微球。

[0008] 通过改变包埋材料-高分子生物材料(如海藻酸钠、琼脂糖、结冷胶、卡拉胶、壳聚糖、明胶等)的浓度、针头内径、点胶压力和调节点胶时间可以改变微球的粒径。与微球粒径呈正相关的因素有针头孔径、点胶机输出压力和点胶时间，即微球粒径随这三个因素的增大而增大；与微球粒径呈负相关的有高分子生物材料的浓度，当高分子生物材料的浓度提高时制备的微球粒径减小。该方法可制备得到粒径大小90μm-500μm的微球。

[0009] 本发明制备微球工艺条件简单，设备容易获得，而且制作过程对生物活性物质较温和，得到的微球粒径均一性较高，制备过程可实现自动化。整套制备装置简易，可整体放置于普通超净工作台中，制备过程可防止杂菌污染。利用该装置和方法可制备包埋微生物细胞的微球。此外，本发明的装置可作为模型，通过增加针头数目及其相应脉冲气压来成倍提高微生物包埋微球的制备效率。附图说明：

[0010] 图1是本发明的微生物包埋微球连续制备装置的结构示意图；

[0011] 其中1、点胶机；2、步进电机；3、限位开关；4、滑块；5、丝杆；6、针筒；7、玻璃漏斗；8、胶塞；9、离心管；10、三角瓶；11、旋转台。具体实施方式：

[0012] 以下实施例是对本发明进一步说明，而不是对本发明的限制。

[0013] 实施例1：

[0014] 如图1所示，本实施例的微生物包埋微球连续制备装置，包括点胶机1、步进电机2、针筒6、玻璃漏斗7、三角瓶10、离心管9和旋转台11，所述的三角瓶10置于旋转台11上，离心管9置于三角瓶10中，离心管上部具有胶塞8，玻璃漏斗7的插管穿过胶塞伸入离心管中，玻璃漏斗的锥形部分卡于三角瓶口，在旋转台一侧设有步进电机2，步进电机的丝杆5竖立于转台一侧，其上的滑块4经连杆与针筒6相连，滑块被限位开关3卡于丝杆上，其可以在限位开关限制的范围内的丝杆上上下滑动，针筒竖立于漏斗的上方，针头朝下，针筒尾端开口与点胶机1的输出气管相连。所述的针筒的针头采用内径为60-160μm的不锈钢针头，针筒为普通10mL注射针筒规格，玻璃漏斗上缘直径为9cm，高度为5cm。

[0015] 以1％(w/v)天然多聚糖海藻酸钠作为包埋材料，以含1％(v/v)span 80的液体石蜡作为成球乳化剂(油相)，1％(w/v)氯化钙溶液为固化剂水溶液(水相)。

[0016] 将30mL 1％(w/v)氯化钙溶液加入到50mL离心管中。玻璃漏斗穿过胶塞插入到离心管中，套紧胶塞以防止漏气。将1％(w/v)氯化钙溶液加入到漏斗中，到距离漏斗顶端2cm处停止。沿着漏斗边缘加入含1％(v/v)span80的液体石蜡，到距离漏斗顶端0.5cm处停止。油水两相容器小心转移至三角瓶中，再将三角瓶置于旋转平台上，平台转速设置为15rev/min。

[0017] 以绿色荧光酵母细胞(GFP-yeast)为包埋对象，浓度调整为106cells/mL，离心收集细胞后加入1％(w/v)海藻酸钠溶液2mL，震荡混匀后加入到针筒中。将针筒与点胶机的输出气管连接好，固定在滑块上。开启旋转台、步进电机和点胶机，点胶压力设置为0.5kg/cm2，点胶时间为0.1s。针头通过步进电机的滑块带动进入到油相后，在脉冲气压的作用下挤出微球，随后又被滑块带离油相，油相的拖拽力和界面张力将微球从针头剥离。形成的微球在自身重力作用下沉降至两相界面，开始与水相中钙离子交联固化，逐步形成海藻酸钙微球，由于旋转台的旋转和步进机的往复，不断的形成海藻酸钙微球。连续点胶4h后，先关闭点胶机，然后关闭步进电机，微球固化1h后关闭旋转台，取下油水两相容器，快速抽出玻璃漏斗去掉油相，收集水相在4℃，4000rpm条件下离心10min，去上清后用无菌去离子水清洗微球，并再次离心收集微球，即得海藻酸钙微球。制备的海藻酸钙微球平均粒径大小为130μm，均一度85％。