激光阵列编码和光诱导的细胞分离方法

摘要

本发明涉及生物医学领域的细胞分离技术，具体是一种基于激光阵列编码和光诱导微泡析出的细胞分离方法。解决了目前在生物传感、人类功能基因组载体研究、稀有细胞筛选、性犯罪司法取证等领域快速分离和检测目标细胞所包含的丰富信息等问题，本发明成功将现阶段成熟的图像识别技术和自动化控制技术有效结合起来，开展的技术将不仅仅局限在单个微流控阵列或者单用途方面。

权利要求

1.一种激光阵列编码和光诱导的细胞分离方法，其特征在于：具体步骤为1）利用目标细胞的不同特性，对部分靶细胞进行荧光标记；

2）微流控芯片（7）包括集成在微流控芯片（7）上的细胞捕获微孔阵列阱（7.9）；其中细胞捕获微孔阵列阱（7.9）分别与集成在微流控芯片（7）上的样本入口（7.2）、缓冲液入口I（7.1）、缓冲液入口II（7.3）、缓冲液入口 （7.4）、缓冲液入口 （7.5）、样本出口I（7.6）、样本出口II（7.8）和废液出口（7.7）连接；利用微流控芯片（7）上的细胞捕获阱将细胞捕获，混合细胞样品从微流控芯片中的样本入口（7.2）进入，混合细胞流经细胞捕获阱上方时陷落进入细胞捕获阱，进样结束后，将缓冲液入口I（7.1）、缓冲液入口II（7.3）、缓冲液入口III（7.4）和缓冲液入口IV（7.5）同时进缓冲液，将未被捕获的细胞经样本出口II（7.8）收集；

3）目标图像获取，运用高速CCD成像系统（9），使用激光发生器（3）对细胞进行照射，调节使用三维微动载物平台和显微放大成像平台调节至摄到细胞捕获微型阵列阱（7.9）区域及荧光显示的细胞图片；

4）随后进行目标图像处理，将用于微型阵列阱中目标细胞的检测与识别；

5）激光阵列编码和光诱导的细胞分离，所述的细胞捕获微孔阵列阱（7.9）包括若干细胞捕获阱（14），细胞捕获阱（14）底部设有激光基底加热区（17），激光基底加热区（17）下侧设有激光开关（18）；控制激光开关（18），从而控制是否在光纤对应的阱中产生气泡，对应光纤的捕获阱产生气泡，细胞被顶起，然后将缓冲液入口I（7.1）、缓冲液入口II（7.3）、缓冲液入口III（7.4）和缓冲液入口IV（7.5）同时进缓冲液将目标细胞通过样本出口I（7.6）收集，之后将光开关全部打开，将死细胞顶起，通过样本出口II（7.8）收集。

2.根据权利要求1所述的激光阵列编码和光诱导的细胞分离方法，其特征在于：所述的第三步中，激光发生器（3）选用蓝色激发光，波长488nm。

3.根据权利要求1所述的激光阵列编码和光诱导的细胞分离方法，其特征在于：所述第四步， 检测和识别的过程如下：

首先对图片进行分块处理，将栅格区域图片分成4×4的16个小区域，每个图片的宽度和高度为大图的1/4，获得每幅图像的4×4阵列位置信息，并记录二进制的位置信息；

每个小区域中有一个细胞，细胞有两种，一种为黄绿色，一种为红色，对小区域的每个像素进行处理，若图像显示为黄绿色，则RGB值中G的值明显大于R和B的值，对小区域100×

100区域的10000个像素进行挨个判断，统计出其中每个像素RGB值中G的值明显大于R和G的个数Ni，其中i=1,2,3…… 16，Ni 为各个小区域判断为黄绿色的像素个数；

3）计算出每个小区域中绿色像素个数占总的像素个数的百分比M=Ni/10000×100%，若百分比M大于50%，则认为该区域中的细胞为黄绿色细胞，并记录黄绿色区域的位置信息。

说明书

激光阵列编码和光诱导的细胞分离方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医学领域的细胞分离技术，具体是一种基于激光阵列编码和光诱导微泡析出的细胞分离方法。

背景技术

[0002] 现阶段对单细胞的原位可视化无损操作问题迫切需要科研人员从单细胞水平研究新颖的细胞微操作机理，细胞筛选作为现代生物学的重要组成部分，也是细胞研究中的关键步骤之一。通过高通量精准筛选能够获得大量的目标细胞，从而应用于细胞生物学、生物医学、组织工程学、药代动力学、组合化学和司法认定等方面的研究。这些病理或生理行为在很大程度上都受到细胞所处的微环境的调节，而细胞所处的微环境比较复杂，如细胞外基质的生化作用和机械作用、邻近细胞释放的蛋白、各种生化因子的浓度和浓度梯度、细胞所受到的应力，以及细胞与细胞的直接接触等都会对细胞的活性产生影响。活细胞内的实时检测必然要求在检测过程中不影响细胞生物生理功能，即维持细胞“活”的状态。因此，活细胞内的实时检测要求检测方法具有：实时、原位、高灵敏度、高时空分辨率、无损等特点。而传统电阻炉式的焦耳热诱导方式的迟滞和损害性迫切需要探索响应速度块、对细胞活性保护性强、利于自动化控制的细胞诱导方式。

发明内容

[0003] 本发明为了解决目前在生物传感、人类功能基因组载体研究、稀有细胞筛选、性犯罪司法取证等领域快速分离和检测目标细胞所包含的丰富信息等问题，提供了一种基于激光阵列编码和光诱导微泡析出的方法。

[0004] 本发明采取以下技术方案：一种激光阵列编码和光诱导的细胞分离装置，包括上位机、中继器、激光发生器、激光分束器、光开关、高速CCD成像系统、用于细胞操作的微流控芯片、冲洗液配送设备、废液处理设备和智能显微平台，所述的上位机、中继器、激光发生器，激光分束器、光开关依次相连，光开关上设有智能显微平台，智能显微平台上设置有微流控芯片；微流控芯片分别与冲洗液配送设备和废液处理设备连接，微流控芯片上侧设有高速CCD成像系统，高速CCD成像系统与上位机连接。

[0005] 所述的微流控芯片包括集成在微流控芯片上的细胞捕获微孔阵列阱；其中细胞捕获微孔阵列阱分别与集成在微流控芯片上的样本入口、缓冲液入口I、缓冲液入口II、缓冲液入口 、缓冲液入口 、样本出口I、样本出口II和废液出口连接。

[0006] 所述的细胞捕获微孔阵列阱包括若干细胞捕获阱，细胞捕获阱底部设有激光基底加热区，激光基底加热区下侧设有激光开关。

[0007] 所述的高速CCD成像系统包括显微荧光成像系统以及与其连接的液晶屏显示器。

[0008] 所述的智能显微平台包括三维微动载物平台和显微放大成像平台，智能显微平台内置有PC机，PC机中设有显微平台控制模块、图像获取模块和图像分析模块，其中显微平台控制模块用于控制三维微动载物平台和显微放大成像平台，图像获取模块用于从高速CCD成像系统种获取图像，图像分析模块用于分析细胞图像数据。

[0009] 所述的微流控芯片由高聚物材料聚二甲基硅氧烷制成，集成在微流控芯片上的各个部件由微流通道连接。

[0010] 具体操作步骤如下：1）利用目标细胞的不同特性，对部分靶细胞进行荧光标记。

[0011] 2）利用微流控芯片上的细胞捕获阱将细胞捕获，混合细胞样品从微流控芯片中的样本入口进入，混合细胞流经细胞捕获阱上方时陷落进入细胞捕获阱，进样结束后，将缓冲液入口、缓冲液入口II、缓冲液入口 和缓冲液入口 同时进缓冲液，将未被捕获的细胞经样本出口收集。

[0012] 3）目标图像获取，运用高速CCD成像系统，使用激光发生器对细胞进行照射，调节使用三维微动载物平台和显微放大成像平台调节至摄到细胞捕获微型阵列阱区域及荧光显示的细胞图片。

[0013] 4）随后进行目标图像处理，将用于微型阵列阱中目标细胞的检测与识别。

[0014] 5）激光阵列编码和光诱导的细胞分离，每个细胞捕获阱的下面均连有激光基底加热区，控制光开关，从而控制是否在光纤对应的阱中产生气泡，对应光纤的捕获阱产生气泡，细胞被顶起，然后将缓冲液入口I、缓冲液入口II、缓冲液入口 和缓冲液入口 同时进缓冲液将目标细胞通过样本出口收集，之后将光开关全部打开，将死细胞顶起，通过样本出口II收集。

[0015] 所述的第三步中，激光发生器选用蓝色激发光，波长488nm。

[0016] 所述第四步中， 检测和识别的过程如下：1.首先对图片进行分块处理，将栅格区域图片分成4x4的16个小区域，每个图片的宽度和高度为大图的1/4，获得每幅图像的4X4阵列位置信息，并记录二进制的位置信息；2.每个小区域中有一个细胞，细胞有两种，一种为黄绿色，一种为红色，对小区域的每个像素进行处理，若图像显示为黄绿色，则RGB值中G的值明显大于R和B的值，对小区域100x100区域的10000个像素进行挨个判断，统计出其中每个像素RGB值中G的值明显大于R和G的个数Ni，其中i=1,2,3…… 16，Ni 为各个小区域判断为黄绿色的像素个数；3.计算出每个小区域中绿色像素个数占总的像素个数的百分比M=Ni/10000*100%，若百分比M大于50%，则认为该区域中的细胞为黄绿色细胞，并记录黄绿色区域的位置信息。

[0017] 与现有技术相比，在本发明中，微流控芯片系统在多个影响因素中能够以可精确控制的并且可重复的模式对单个细胞进行操作，并且微流控芯片系统需要的样品体积非常小，同时还能极大地降低劳动强度和实验操作出错的可能性。此外，微流控芯片系统可以将细胞研究的相关操作单元，如细胞培养、细胞筛选、细胞裂解，以及与细胞操纵的相关微器件，同时还可以与集成化的分析设备结合起来，在“芯片实验室”或“微全分析系统"的平台上完成细胞的相关研究。微流控芯片系统能应用于细胞研究的另一个主要优势在于能够通过设计合理的微通道结构来精确控制细胞的微环境和流体的流动状态，每种液体都有各自专用的入口，无须转换接口；分离得到的细胞可以分别在不同的出口收集，避免了冲洗的步骤。同时，光纤编码扫描技术已发展的相当成熟。利用其于成熟行业应用的基础上，将上述二者进行有机结合并迁移到生物学领域，开展基于光纤阵源编码及光诱导微泡析出技术的细胞微操作机理装置研制。

[0018] 本发明成功将现阶段成熟的图像识别技术和自动化控制技术有效结合起来，开展的技术将不仅仅局限在单个微流控阵列或者单用途方面。

[0019] 本发明革新了利用光生热的方式来操作细胞技术，避免传统电阻炉式的焦耳热诱导方式来诱发气泡的生长和聚并所带来的迟滞性和用于细胞微操作过程的损害性。同时在操作精度、分离速度、分离的目标细胞纯度等方面有显著的提高。

附图说明

[0020] 图1 本发明示意图；

[0021] 图2微流控芯片结构图；

[0022] 图3 系统工作流程图；

[0023] 图4高速显微成像系统工作原理；

[0024] 图5 激光阵列编码原理；

[0025] 图6单细胞工作原理I；

[0026] 图7单细胞工作原理II；

[0027] 图8多细胞工作原理；

[0028] 图9为获得的目标图像；

[0029] 图10为4X4阵列位置信息十进制位置编码图；

[0030] 图11为4X4阵列位置信息二进制位置编码图；

[0031] 图中1-上位机，2-中继器，3-激光发生器，4-激光分束器，5-光开关，6-智能显微平台，7-微流控芯片，8-废液处理设备，9-高速CCD成像系统，10-液晶屏显示，11-冲洗液配送设备，12-微流通道，13-目标细胞，14-细胞捕获阱，15-气泡，16-气泡腔，17-激光基底加热区，18-激光开关，19-扫描到的靶点，20-红色细胞，21-黄绿色细胞，7.1-缓冲液入口I，7.2-样本入口，7.3-缓冲液入口II，7.4-缓冲液入口 ，7.5-缓冲液入口 ，7.6-样本出口 ，7.7-废液出口，7.8-样本出口II，7.9-细胞捕获微型阵列阱。

具体实施方式

[0032] 如图1所示，一种激光阵列编码和光诱导的细胞分离装置，包括上位机1、中继器2、激光发生器3、激光分束器4、光开关5、高速CCD成像系统9、用于细胞操作的微流控芯片7、冲洗液配送设备11、废液处理设备8和智能显微平台6，所述的上位机1、中继器2、激光发生器3，激光分束器4、光开关5依次相连，光开关5上设有智能显微平台6，智能显微平台6上设置有微流控芯片7；微流控芯片7分别与冲洗液配送设备11和废液处理设备8连接，微流控芯片
7上侧设有高速CCD成像系统9，高速CCD成像系统9与上位机1连接。

[0033] 其中上位机：其表现形式为电脑以及相应的配套操作软件；激光发生器、光开关、激光分束器：三者是由中国电子科技集团公司第34研究所定制的“激光器4×16分光控制系统”；中继器：用于将上位机的下发的信号进行转化、放大以及再生的装置设备；高速CCD成像系统：由CCD相机DFK GV130G(Imaging，美国)、电动变焦物镜（Navitar，美国），20x物镜（Nikon，日本），Roller Block三轴位移调节台（THORLABS,美国）以及相应的上位机使用软件；冲洗液配送设备：微进样控制系统（LabSmith 美国）；废液处理设备：LSP-实验室废液处理系统（北京泓源科达科技股份有限公司）。

[0034] 如图2所示，所述的微流控芯片7包括集成在微流控芯片7上的细胞捕获微孔阵列阱7.9；其中细胞捕获微孔阵列阱7.9分别与集成在微流控芯片7上的样本入口7.2、缓冲液入口I7.1、缓冲液入口II7.3、缓冲液入口 7.4、缓冲液入口 7.5、样本出口I7.6、样本出口II7.8和废液出口7.7连接。

[0035] 如图5、6、7、8所示，所述的细胞捕获微孔阵列阱7.9包括若干细胞捕获阱14，细胞捕获阱14底部设有激光基底加热区17，激光基底加热区17下侧设有激光开关18。

[0036] 所述的高速CCD成像系统9包括显微荧光成像系统以及与其连接的液晶屏显示器10。

[0037] 所述的智能显微平台6包括三维微动载物平台和显微放大成像平台，智能显微平台6内置有PC机，PC机中设有显微平台控制模块、图像获取模块和图像分析模块，其中显微平台控制模块用于控制三维微动载物平台和显微放大成像平台，图像获取模块用于从高速CCD成像系统9种获取图像，图像分析模块用于分析细胞图像数据。

[0038] 所述的微流控芯片7由高聚物材料聚二甲基硅氧烷制成，集成在微流控芯片7上的各个部件由微流通道连接。

[0039] 具体步骤如下：1）利用目标细胞的不同特性，对部分靶细胞进行荧光标记。

[0040] 混合细胞样品中既有活细胞也有凋亡的细胞。

[0041] 凋亡细胞的特征：细胞凋亡时会在细胞、亚细胞和分子水平上发生特征性的改变，包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具有特征性。

[0042] 凋亡细胞的染色方法：荧光染料PI（碘化丙啶）是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测，英文全称是Propidium Iodide。它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。尽管PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535 nm和615 nm。

[0043] 正常细胞的染色方法：FITC异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC) ，有两种异构体，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为525～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。它的主要原理是利用FITC(异硫氰酸荧光素)上的N=C=S基团和蛋白质上游离的-NH2发生化学反应，在特定波长光源的激发下即可观测到黄绿色荧光信号。

[0044] 2）利用微流控芯片7上的细胞捕获阱将细胞捕获，混合细胞样品从微流控芯片中的样本入口7.2进入，混合细胞流经细胞捕获阱上方时陷落进入细胞捕获阱，进样结束后，将缓冲液入口I7.1、缓冲液入口II7.3、缓冲液入口 7.4和缓冲液入口 7.5同时进缓冲液，将未被捕获的细胞经样本出口II7.8收集。现在在细胞捕获微型阵列阱7.9区域，被捕获的细胞有正常细胞和凋亡细胞。混合细胞样品进样是通过微泵、微阀完成的，其中微泵、微阀是LabSmith的一款进样系统的一部分，用于控制进样速度和流速，微阀是制作在通道处的单向开口的薄膜，可以防止回流。

[0045] 3）目标图像获取，运用高速CCD成像系统9，激光发生器3选用蓝色激发光，波长488nm，正常细胞显示出黄绿色荧光，凋亡细胞显示出红色荧光。调节使用三维微动载物平台和显微放大成像平台调节至摄到细胞捕获微型阵列阱7.9区域及荧光显示的细胞图片。

[0046] 4）随后进行目标图像处理，将用于微型阵列阱中目标细胞的检测与识别。

[0047] 检测和识别的过程如下：

[0048] 1.首先对图片进行分块处理，将栅格区域图片分成4x4的16个小区域，每个图片的宽度和高度为大图的1/4，获得每幅图像的4X4阵列位置信息，如图10、11所示，并记录二进制的位置信息。如图9所示，每个栅格中有一个细胞，细胞有两种，一种为黄绿色，一种为红色。

[0049] 2. 对小区域的每个像素进行处理，RGB彩色图片的每个像素是24位（R,G,B各占8位，RGB各个值范围从0到255），若图像显示为黄绿色，则RGB值中G的值明显大于R和B的值。对小区域100x100区域的10000个像素进行挨个判断，统计出其中每个像素RGB值中G的值明显大于R和G的个数N（i i=1,2,3…… 16，Ni 为各个小区域判断为黄绿色的像素个数）。

[0050] 3.计算出每个小区域中绿色像素个数占总的像素个数的百分比M=Ni/10000*100%，若百分比M大于50%，则认为该区域中的细胞为黄绿色细胞，并记录黄绿色区域的位置信息。

[0051] 5）如图5、6、7、8所示，激光阵列编码和光诱导的细胞分离，每个细胞捕获阱的下面均连有激光基底加热区17，控制光开关5，从而控制是否在光纤对应的细胞阱中产生气泡，对应光纤的捕获阱产生气泡，细胞被顶起，然后将缓冲液入口I7.1、缓冲液入口II7.3、缓冲液入口 7.4和缓冲液入口 7.5同时进缓冲液将目标细胞通过样本出口I7.6收集，之后将光开关全部打开，将死细胞顶起，通过样本出口II7.8收集。