陈旧性动物样本种属鉴定试剂盒及制备方法

摘要

本发明提供的一种陈旧性动物样本种属鉴定试剂盒及制备方法，包括如下试剂：Master mix反应液；P-mix-1反应液；P-mix-2反应液；DNA分子量标准物；本发明解决了陈旧性生物样本的种属鉴定问题，不仅可以直接应用于刑事案件的侦破工作，维护社会安定，也可以通过对考古遗迹中动物考古学信息的挖掘，来揭示古代人们对食物的选择，狩猎和家畜饲养等重要的经济与文化背景。还可以帮助海关打击野生动物走私活动，保护野生动物资源，另外可以用于鉴定动物的中药材品质，打击假冒伪劣药材。

权利要求

1.一种陈旧性动物样本种属鉴定试剂盒，其特征在于是由以下物质组成：⑴ Master mix反应液1ml；

⑵ P-mix-1反应液0.1ml；

⑶ P-mix-2反应液0.1ml；

⑷ DNA分子量标准物；

其中，

Master mix反应液组分为：0.1M Tris-HCl缓冲液，pH为 8.2；0.1%牛血清白蛋白；5mM MgCl2；2mM dNTP；2U/µ L TaqDNA聚合酶；

P-mix-1反应液组分包括：25µ M的引物A：ACGAAACAGGATCCAACAAC，引物B：GGTGTAGTTGTCTGGGTCTCC，引物C：CCATCAACACCCAAAGCTG和引物D：CATTTAATGCACGACGTACAT；

P-mix-2反应液组分包括：25µ M的引物A：ACGAAACAGGATCCAACAAC，引物B:GGTGTAGTTGTCTGGGTCTCC，引物E：CCCATGCATATAAGCACGTAC和引物F：GAGGCATGGTGATTAAGCTC；

DNA分子量标准物用于凝胶电泳中双链线状 DNA 分子量大小的参照。

2.根据权利要求1所述陈旧性动物样本种属鉴定试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

1）对生物检材进行DNA提取：

① 取0.1-1g动物组织， 加入含有0.5M EDTA，0.5% SDS，0.4 g/L 蛋白酶K的裂解液，

56℃水浴3小时；

② 将含有DNA的裂解液7500 r/min, 离心8 min，取2mL上清液加入到离心超滤管中，

6800 r/min离心3小时，将含有DNA的裂解液浓缩到100µ L；

③ 使用硅胶法提取上一步浓缩的裂解液中DNA；4℃保存备用；

2）平行复合扩增体系

① 准备PCR反应体系1

Master mix反应液 8.5μLP-mix-1反应液 1μL样本DNA模板 2.5μL② 准备PCR反应体系2

Master mix反应液 8.5μLP-mix-2反应液 1μL样本DNA模板 2.5μL加入样本的DNA含量范围在10-20ng/µ L，根据样本量进行稀释或者浓缩；

3）将上述PCR体系加到200µ L体积的PCR管中，轻轻涡旋震荡三次；

4）将上述PCR反应体系放入PCR自动扩增仪进行DNA扩增反应：95℃初始变性5分钟，

94℃热变性30秒，54℃退火 30秒，72℃延伸45秒；7个循环，94℃热变性30秒，50℃退火

30秒，72℃延伸45秒；33个循环；72℃终延伸10分钟，最后4℃保温；

5）PCR产物电泳分析

取5μLPCR扩增产物与1μL6×加样缓冲液混合后，加入3％琼脂糖凝胶的加样孔中，电泳电压恒压在90V电泳50分钟，EB染色。

说明书

陈旧性动物样本种属鉴定试剂盒及制备方法

技术领域

[0001] 本发明提供一种陈旧性动物样本种属鉴定试剂盒，本发明同时还提供了该陈旧性动物样本种属鉴定试剂盒的制备方法，属于生物检材的种属鉴定技术领域。

背景技术

[0002] 法医物证鉴定实践中, 不明来源生物检材的种属鉴定是重要的一个鉴定环节。陈旧性生物样本的鉴定，成为现阶段法医DNA检验的难题，也制约了许多重要物证的价值。同时在考古分析、海关稽查以及中药材质量鉴定过程中也常常会遇到对陈旧性生物检材种属鉴定的需求。

[0003] 传统的种属鉴定方法的普遍存在的不足之处有以下几点：一、某些检测体系缺乏必需的内对照。单独扩增测mtDNA的编码基因，如cytb基因、12SrRNA基因、5SrRNA基因等进行种属鉴别时缺乏必需的内对照，因而若检测为阴性结，并不能判定检材为非人类，也有可能是检材已被破坏，或者是DNA提取不当等原因, 在种属鉴定过程中有可能得到假阴性的结果。二、扩增测序mtDNA的编码基因，检测过程烦琐，测序费用昂贵。三、所用的方法大多基于新鲜或是保存较好的组织样本，扩增片段普遍在300-1200bp，对大部分陈旧性生物检材和所有考古样本均不适用。四、多次实验反应会造成耗用模板量过大，使微量、高降解的陈旧性生物样本无法完成检测。五、种属关系较近的样本无法鉴定。如黄牛和水牛，山羊和绵羊。

[0004] 目前，国内已经有上百家单位开展了法医DNA检测项目，每年检验各类案件数十万起，在许多重特大、疑难案件的侦破中发挥了关键性作用，取得了巨大的成功。但是在现场检材中遗留着许多陈旧性生物样本，仍然没有得到有效的利用，其原因就是没有针对陈旧性生物样本的DNA鉴定方法。

发明内容

[0005] 本发明公开一种陈旧性动物样本种属鉴定试剂盒，针对陈旧性生物样本的DNA严重降解的特点，设计以线粒体基因组中的cytb基因和高可变I区为目标序列的小片段扩增方体系，并首次创建平行复合PCR方法，使种属鉴定结果通过简单的琼脂糖凝胶电泳，即可根据DNA片段长度来对样本进行判断。构建了一套简捷、高敏感的mtDNA种属鉴定体系，促进法医DNA检验技术的进步，为刑侦人员提供更多的信息和证据。

[0006] 本发明同时还提供了陈旧性动物样本种属鉴定试剂盒的制备方法。

[0007] 本发明的技术解决方案如下：

[0008] 选择mtDNA基因组为检测目标，建立优化的复合扩增体系。其中cytochrome b基因 (细胞色素b基因，cytb基因）作为mtDNA编码基因，其编码序列区域进化缓慢，相对保守，因而具有较稳定性，作为反应的内对照片段; 以mtDNA高可变I区的变异区为目标区，通过对Genebank中人和猪、牛、羊、马、狗等常见家养动物以及鹿、猴、熊、虎等野生动物的线粒体基因组序列进行比对分析，设计2对荧引物，针对高度降解的生物检材，以适合的片段大小（≤200bp) 对不同种属的单一或混合样本进行检测,根据不同动物种属的扩增片段长度的差异，在同一反应中鉴定一个或是多个具体动物的种属。

[0009] 通过对引物的修订和调整，建立平行复合扩增体系：在这个体系中分为两组平行进行扩增：第一组将Cytb引物和mtDNA引物放在一组形成P-mix-1进行复合扩增反应；第二组复合体系将Cytb引物和另一对mtDNA引物结合形成P-mix-2，两组平行进行用于陈旧性动物种属鉴定。

[0010] 本发明提供的一种陈旧性动物样本种属鉴定试剂盒，是由以下物质组成：

[0011] 试剂盒包括如下试剂：

[0012] ⑴ Master mix反应液

[0013] ⑵ P-mix-1反应液

[0014] ⑶ P-mix-2反应液

[0015] ⑷ DNA分子量标准物；

[0016] 2.上述陈旧性动物样本种属鉴定试剂盒的组分特征在于： 试剂盒内含有Master mix反应液1ml，其组分为：0.1M Tris-HCl缓冲液，pH为 8.2；0.1%牛血清白蛋白；5mM Mgcl2；2mM dNTP；2U/μL TaqDNA聚合酶；P-mix-1反应液0.1ml, 其组分包括：25uM引物A：ACGAAACAGGATCCAACAAC,引物B:GGTGTAGTTGTCTGGGTCTCC,引物 C: CCATCAACACCCAAAGCTG和引物D:CATTTAATGCACGACGTACAT; P-mix-2反应液0.1ml, 其组分包括：25uM引物A：ACGAAACAGGATCCAACAAC,引物B:GGTGTAGTTGTCTGGGTCTCC,引物E :CCCATGCATATAAGCACGTAC和引物F :GAGGCATGGTGATTAAGCTC.

[0017] 3. 本发明同时还提供了陈旧性动物样本种属鉴定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

[0018] ⑴ 对生物检材进行DNA提取步骤：

[0019] DNA的提取方法采用先裂解组织样本，随后使用硅胶法提取DNA的策略。具体步骤如下：

[0020] ①. 取0.1-1g动物组织， 加入含有0.5M EDTA，0.5% SDS，0.4 g/L 蛋白酶K的裂解液，56℃水浴3小时;

[0021] ②. 将含有DNA的裂解液500 r/min, 离心8 min，取2mL上清液加入到离心超滤管中，6800 r/min离心3小时，将含有DNA的裂解液浓缩到100μL。

[0022] ③. 使用硅胶法提取上一步浓缩的裂解液中DNA。4℃保存备用。

[0023] ⑵ 平行复合扩增体系

[0024] ① 准备PCR反应体系1

[0025] Master mix反应液 8.5μL

[0026] P-mix-1反应液 1μL

[0027] 样本DNA模板 2.5μL

[0028] ② 准备PCR反应体系2

[0029] Master mix反应液 8.5μL

[0030] P-mix-2反应液 1μL

[0031] 样本DNA模板 2.5μL

[0032] 建议加入样本的DNA含量范围在10-20ng/μL，根据样本量进行稀释或者浓缩。

[0033] ⑶ 将上述PCR体系加到200 μL体积的PCR管中，轻轻涡旋震荡三次；

[0034] ⑷ 将上述PCR反应体系放入PCR自动扩增仪进行DNA扩增反应，反应程序设置为：

[0035] 95℃初始变性5分钟，94℃热变性30秒，54℃退火 30秒，72℃延伸45秒；7个循环，94℃热变性30秒，50℃退火 30秒，72℃延伸45秒；33个循环；72℃终延伸10分钟，最后4℃保温。

[0036] ⑸ PCR产物电泳分析

[0037] 所得的PCR产物均要进行电泳检测，具体方法如下：取5μLPCR扩增产物与1μL6×加样缓冲液混合后，加入3％琼脂糖凝胶的加样孔中，电泳电压恒压在90V电泳50分钟，EB染色。使用凝胶成像分析仪检测。

[0038] 6. 根据电泳结果进行样本种属的鉴定

[0039] 每种动物每个PCR反应均检出两条电泳条带，其中一条为相同片段大小的Cytb基因的扩增产物片段，将此条带作为反应体系的内对照（见图1），显示DNA模板的提取质量和PCR扩增的有效性。另一条带则显示出的扩增产物的长度差异（见图2-3），比对DNA片段长度（见下表）。根据2个平行复合扩增体系的结果组合即可判断样本的种属特异性。

[0040] 表1.10种常见动物在两组复合体系中经过PCR扩增得到的片段长度

[0041] 本发明试剂盒与现有技术相比的优势表现在以下几点：

[0042] 1. 本发明设计了一个平行复合PCR方法，通过两组扩增片段长度差异的组合，通过简单的琼脂糖凝胶电泳，即可根据DNA片段长度来对样本进行种属鉴定。这种设计既解决了复合扩增的多引物干扰问题，又解决了物种相近的动物片段长度相近难以分辨的问题。该设计方法为本研究首创，实际效果简捷、高效。

[0043] 2. 本发明提供的鉴定方法针对陈旧性生物样本的DNA严重降解的特点，设计以高拷贝数的线粒体基因组中的cytb基因和高可变I区为目标序列的小片段扩增方体系，对样本的质和量要求不高，可以对包括动物的牙齿、骨骼、毛发、血液、组织等样本进行DNA提取，试验中发现10pg的DNA 即可得到明确的结果，当提取的mtDNA量保持在20pg以上，结果最为清晰。尤其对陈旧性的样本成功率明显高于同类法医物种鉴定试剂盒或方法。

[0044] 3.首次加入内标概念，使用Cytb作为阳性对照，以排除假阳性和假阴性的可能。假阳性指的是如果样本污染，扩增出条带，但如果Cytb扩增片段长度与标准不符合，则为假阳性；假阴性是指出现无扩增条带或是非试剂盒说明书给出的条带长度时，如果Cytb的结果同时为阴性则说明是样本问题无法扩增，否则如果Cytb的结果为阳性条带则说明样本为非本试剂盒所鉴定的10种动物范围内的其他种属，以排除假阴性结果。

[0045] 本发明的积极效果在于：解决陈旧性生物样本的种属鉴定问题，不仅可以直接应用于刑事案件的侦破工作，维护社会安定，也可以通过对考古遗迹中动物考古学信息的挖掘，来揭示古代人们对食物的选择，狩猎和家畜饲养等重要的经济与文化背景。还可以帮助海关打击野生动物走私活动，保护野生动物资源，另外可以用于鉴定动物的中药材品质，打击假冒伪劣药材。

附图说明

[0046] 图1为引物A和B扩增7种动物样本的mtDNA电泳图；

[0047] 图中， ~ 号为7种动物的样本编号，中间的M是DNA Marker。M：PUC 19 DNA Marker，指示DNA片段的大小由上到下依次是501bp、404bp、331bp、242bp、190bp、147bp、110bp。各电泳泳道分别为P0：空白对照（阴性对照） ：马； ：狗； :貉子； ：猪； ：
狍； ：鹿； ：貂。图1可以表明引物A和B可以稳定扩增出7种不同陈旧性动物的mtDNA的cytb基因，并产生相同片段大小为170bp左右的PCR产物。故可以将引物A和B作为陈旧性样本复合体系的内对照。

[0048] 图2为引物C和D扩增10种动物样本mtDNA的电泳图；

[0049] 图中，1~10号为10种动物的样本编号，中间的M是DNA Marker。M：PUC 19 DNA Marker（上海生工），指示DNA片段的大小,由上到下依次是501bp、404bp、331bp、242bp、190bp、147bp、110bp。1-10电泳泳道分别为1：牛；2：驴；3：猪；4：狗；5：狼；6：狍；7：熊；8：
虎；9：貉；10：貂。图1可以表明，引物C和D成功扩增出10种不同动物的mtDNA，并产生
80bp~220bp不同片段大小的PCR产物，指示了引物C和D同样具有很好的种属特异性。

[0050] 图3为引物E和F扩增10种动物样本的mtDNA电泳图；

[0051] 图中，1~10号为10种动物的样本编号，中间的M是DNA Marker。M：PUC 19 DNA Marker（上海生工），指示DNA片段的大小由上到下依次是501bp、404bp、331bp、242bp、190bp、147bp、110bp。各电泳泳道分别为P0：空白对照；1：牛；2：驴；3：猪；4：狗；5：狼；
6：狍；7：熊；8：虎；9：貉；10：貂。图2可以表明，引物E和F成功扩增出10种不同动物的mtDNA，并产生80bp~220bp不同片段大小的PCR产物，指示了引物E和F同样具有很好的种属特异性。

[0052] 图4为10种陈旧性动物在复合体系中扩增得到的电泳图。

[0053] 图中，1~10号为10种动物的样本编号，中间的M是DNA Marker。每个孔道均产生2条带，其中引物A和B作为反应内对照，各种动物扩增出同样大小的产物条带。另一引物扩增产生具有种属特异性的条带。

[0054] P0：空白对照1：牛；2：驴；3：猪；4：狗；5：狼；6：狍；7：熊；8：虎；9：貉；10：貂。

[0055] 图5为10种动物在引物C和D进行PCR扩增后，扩增产物测序结果的同源序列比对图。

[0056] 图中，由上到下依次为：bos: 家牛；Equus: 家驴；sus scrofa：家猪；Canis lupus familiaris ：家 狗；canis lupus ：狼；Panthera tigris altaica：东 北 虎；Capreolus: 狍子；Nyctereutes procyonoides：貉子；ursus thibetanus：黑熊；Mustela vison：水貂；MT-5R：引物C；MT-4F：引物D；Consensus：这10种动物扩增序列的综合比对结果，其中蓝色部分代表上下游引物与10种动物的序列同源

[0057] 图6为7种考古学动物样本在两组复合体系中PCR扩增得到的电泳图。

[0058] 图中，①~⑦号为7种考古学动物样本的样本编号，中间的M是DNA Marker。左图是考古学动物样本复合体系一，右图是考古学动物样本复合体系二。P0：空白对照；①：马；②：狗；③:貉；④：猪；⑤：狍；⑥：鹿；⑦：貂。

[0059] 图7陈旧性骨骼（疑似虎骨）鉴定的PCR扩增电泳结果。

具体实施方式

[0060] 为了便于理解本发明，特例举以下实施例。其作用被理解为是对本发明的阐释而非对本发明的任何形式的限制。

[0061] 实施例1

[0062] 陈旧性动物样本种属鉴定试剂盒的制备及其使用1

[0063] 1. 利用Genebank中的哺乳动物线粒体基因组的高可变I区序列设计两对PCR引物，所述引物的序列为：

[0064] 引物A：ACGAAACAGGATCCAACAAC

[0065] 引物B：GGTGTAGTTGTCTGGGTCTCC

[0066] 利用Genebank中的哺乳动物线粒体基因组的高可变I区序列设计两对PCR引物，所述引物的序列为：

[0067] 引物C：CCATCAACACCCAAAGCTG

[0068] 引物D：CATTTAATGCACGACGTACAT

[0069] 引物E：CCCATGCATATAAGCACGTAC

[0070] 引物F：GAGGCATGGTGATTAAGCTC

[0071] 2.制备包括下列组成成分的试剂盒 ：Master mix反应液1管(1ml/管)， P-mix-1反应液和P-mix-2反应液各1 管 (0.1ml/管 ), DNA分子量标准物1 管(0.5ml/管)。

[0072] 3.使用过程 ：

[0073] ⑴ 样本DNA：

[0074] 选取超纯水做为PCR扩增阴性标本，使用牛的静脉抗凝血液经常规裂解和消化处理后，应用传统的苯酚/氯仿法提取总DNA，并用超纯水将总DNA 浓度稀释至20ng/μL 作为模板DNA。

[0075] ⑵ PCR 反应体系配制：建立PCR反应体系，混合以下成分到总体积为12ul。

[0076] PCR反应体系1：Master mix反应液 8.5μL

[0077] P-mix-1反应液 1μL

[0078] 牛DNA模板 2.5μL

[0079] PCR反应体系2：Master mix反应液 8.5μL

[0080] P-mix-2反应液 1μL

[0081] 牛DNA模板 2.5μL

[0082] ⑶ 将上述PCR体系加到200 μL体积的PCR管中，轻轻涡旋震荡三次；

[0083] ⑷将上述PCR反应体系放入PCR自动扩增仪进行DNA扩增反应，反应程序设置为：95℃初始变性5分钟，94℃热变性30秒，54℃退火 30秒，72℃延伸45秒；7个循环，94℃热变性30秒，50℃退火 30秒，72℃延伸45秒；33个循环；72℃终延伸10分钟，最后4℃保温。

[0084] ⑸ PCR产物电泳分析

[0085] 所得的PCR产物均要进行电泳检测，具体方法如下：取 5μL PCR扩增产物与1μL6×加样缓冲液混合后，加入3％琼脂糖凝胶的加样孔中，电泳电压恒压在90V电泳50分钟，EB染色。使用凝胶成像分析仪检测。

[0086] 实施例2

[0087] 陈旧性动物样本种属鉴定试剂盒的制备及其使用2

[0088] 1. 利用Genebank中的哺乳动物线粒体基因组的高可变I区序列设计两对PCR引物，所述引物的序列为：

[0089] 引物A：ACGAAACAGGATCCAACAAC

[0090] 引物B：GGTGTAGTTGTCTGGGTCTCC

[0091] 利用Genebank中的哺乳动物线粒体基因组的高可变I区序列设计两对PCR引物，所述引物的序列为：

[0092] 引物C：CCATCAACACCCAAAGCTG

[0093] 引物D：CATTTAATGCACGACGTACAT

[0094] 引物E：CCCATGCATATAAGCACGTAC

[0095] 引物F：GAGGCATGGTGATTAAGCTC

[0096] 2.制备包括下列组成成分的试剂盒 ：Master mix反应液1管(1ml/管)， P-mix-1反应液和P-mix-2反应液各1 管 (0.1ml/管 ), DNA分子量标准物1 管(0.125ml/管)。

[0097] 3.标本采集、保存和记录 ：

[0098] (1) 标本采集 ：标本为动物的牙齿、骨骼、毛发、血液、组织样本。

[0099] (2)保存 ：可立即检测，4℃保存一周，-20℃保存期可达一年。

[0100] (3) 记录 ：标本登记采集日期、样本种类和样本量。

[0101] 4.使用过程 ：

[0102] ⑴ 样本DNA 提取：建议使用QIAquick® PCR Purification试剂盒。

[0103] 取动物样本0.2g， 加入含有0.5M EDTA，0.5% SDS，0.4 g/L 蛋白酶K的裂解液，56℃水浴3小时; 将含有 DNA的裂解液7500 r/min, 离心8 min，取2mL上清液加入到Centricon® YM-10中，6800 r/min离心3小时，将含有DNA的裂解液浓缩到100μL；使用试剂盒 QIAquick® PCR Purification Kit提取上一步浓缩裂解液中DNA。使用Nanodrop
2000 测定DNA含量，上述样本的DNA含量为1-10ng/μL。直到最后收集到DNA溶液使用Nanodrop 2000 测定DNA含量，用超纯水调节DNA溶液浓度到1ng/μl、10 ng/μl和50 ng/μl。

[0104] ⑵ PCR 反应体系配制：每一个样本设立2个PCR反应体系（PCR体系1和2），混合以下成分到总体积为12ul。每个PCR体系均设立设置三个平行反应管，分别加入三个不同浓度的样本DNA模板。

[0105] PCR反应体系1：Master mix反应液 8.5μL

[0106] P-mix-1反应液 1μL

[0107] 不同浓度的样本DNA模板 2.5μL

[0108] PCR反应体系2：Master mix反应液 8.5μL

[0109] P-mix-2反应液 1μL

[0110] 不同浓度的样本DNA模板 2.5μL

[0111] ⑶ 将上述PCR体系加到200 μL体积的PCR管中，轻轻涡旋震荡三次；

[0112] ⑷将上述PCR反应体系放入PCR自动扩增仪进行DNA扩增反应，反应程序设置为：95℃初始变性5分钟，94℃热变性30秒，54℃退火 30秒，72℃延伸45秒；7个循环，94℃热变性30秒，50℃退火 30秒，72℃延伸45秒；33个循环；72℃终延伸10分钟，最后4℃保温。

[0113] ⑸ PCR产物电泳分析

[0114] 所得的PCR产物均要进行电泳检测，具体方法如下：取 5μL PCR扩增产物与1μL6×加样缓冲液混合后，加入3％琼脂糖凝胶的加样孔中，电泳电压恒压在90V电泳50分钟，EB染色。使用凝胶成像分析仪检测。

[0115] 提供以下试验表明本发明的准确性和灵敏性。

[0116] 试验例1：

[0117] 应用本试剂盒对不同种属的动物的不同保存部位、不同保存条件和不同保存时间的陈旧性样本进行了鉴定分析，并比对样本记录或形态学鉴定结果，以判断本试剂盒的准确性和灵敏性。

[0118] 陈旧性动物样本具体信息见表2。

[0119] 表2 样本的采集信息统计表

[0120]

[0121] 1. 各取表中动物组织样本0.2g，对生物检材进行DNA提取，使用Nanodrop 2000测定上述样本DNA的含量为10-20ng/μL。然后进行PCR复合扩增,具体实验步骤见实施例1和2。 PCR产物电泳后使用凝胶成像分析仪检测。复合体系检测结果见图4。

[0122] 2. 根据电泳结果进行样本种属的鉴定

[0123] 每种动物的复合扩增体系均检出两条电泳条带，根据显示出的扩增产物的长度差异，对应表1的长度进行所检验的样本的种属判断，并比对样本记录，均得到了一致性的结果。

[0124] 3.对十种陈旧性动物使用引物C和引物D扩增得到的片段产物测序，将测序结果与NCBI数据库的同源序列进行比对（见图5），测序结果表明使用本发明得到的鉴定结果准确。

[0125] 试验例2：

[0126] 对考古学动物样本进行种属鉴定。考古学动物样本均由吉林大学边疆考古中心提供，其中只有马为骨骼样本，其余均为牙齿样本，以上所有样本均密封并于阴凉干燥的条件下保存。表3下面列出各样本的详细信息。

[0127] 表3 陈旧性动物样本的采集信息统计表

[0128]

[0129] 1. 各取表中动物组织样本0.2g，对生物检材进行DNA提取，使用Nanodrop 2000测定上述样本DNA的含量为10-20ng/μL。然后进行PCR复合扩增,具体实验步骤见实施例1和2。 PCR产物电泳后使用凝胶成像分析仪检测。复合体系检测结果见图6。

[0130] 2 根据电泳结果进行样本种属的鉴定

[0131] 每种动物的复合扩增体系均检出两条电泳条带，根据显示出的扩增产物的长度差异，对应表1的长度进行所检验的样本的种属判断，并比对样本考古学和形态学鉴定记录，均得到了一致性的结果。

[0132] 试验例3：

[0133] 鉴定送检的骨骼材料是否是虎骨

[0134] 1.对一例用酒泡过的骨骼（疑似虎骨）进行鉴定。

[0135] 使用牙钻取骨骼样本0.2g，对生物检材进行DNA提取，使用NanoDrop 2000 对提取到的DNA模板进行定量，浓度为90ng/μL，稀释5倍后，得到DNA浓度为18 ng/μL的模板溶液进行PCR复合扩增,具体实验步骤见实施例1。 PCR产物电泳后使用凝胶成像分析仪检测。复合体系检测结果见图7。

[0136] 2. 结果分析

[0137] 电泳结果得到虎的特征长度的条带：PCR体系1得到的片段长度:170,216；PCR体系2得到的片段长度:170。对照表2的各种动物的PCR扩增长度结果，鉴定该骨骼样本应该为虎骨。

[0138] 3.进一步对条带进行序列分析，以验证陈旧性动物样本种属鉴定试剂盒检验的准确性。

[0139] 取上述提取DNA适量，应用一对引物对线粒体上动物种属鉴定常用基因-细胞色素B部分基因进行PCR扩增，扩增产物长170bp, 应用AB公司的BigDye Terminator v3.1测序试剂盒进行测序反应，应用ABI-310型DNA分析仪测序，得到上述检材的细胞色素B基因的部分DNA序列。

[0140] 将获得的DNA序列在Genbank数据库中搜索共享序列，共获得37个100%的共享序列，37个共享序列均为虎的序列。共享分析结果表明，所送检的骨骼获得的细胞色素B基因的DNA序列为虎的特征序列，证明所送检的骨骼为虎骨。证明本发明的陈旧性动物样本种属鉴定试剂盒鉴定结果准确，可行。