南芥菜花叶病毒SYBRGreenI实时荧光RT-PCR检测试剂盒及方法

摘要

本发明公开了一种南芥菜花叶病毒SYBR Green I实时荧光RT-PCR检测试剂盒及方法。本发明所提供的南芥菜花叶病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒中含有由一条反转录引物和两条扩增引物组成的引物组；所述反转录引物为序列表中序列1所示的单链DNA；所述两条扩增引物为序列表中序列2和序列3所示的两条单链DNA。实验证明，利用本发明所提供的用于检测南芥菜花叶病毒的引物组及其试剂盒所建立的SYBR Green I实时荧光RT-PCR方法具有良好的重现性、灵敏性、特异性和广谱性，适用于进出境口岸及农业生产上南芥菜花叶病毒的快速检测与监测。

权利要求

1.用于检测南芥菜花叶病毒的引物组，由一条反转录引物和两条扩增引物组成；所述反转录引物为序列表中序列1所示的单链DNA；所述两条扩增引物为序列表中序列2和序列3所示的两条单链DNA。

2.用于检测南芥菜花叶病毒的引物对，为由序列表中序列2和序列3所示的两条单链DNA组成的引物对。

3.用于检测南芥菜花叶病毒的试剂，包括权利要求1所述的引物组或权利要求2所述的引物对，以及如下中的至少一种：dNTPs、Mg2+、DNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂和SYBR Green I。

4.用于检测南芥菜花叶病毒的试剂盒，含有权利要求1所述的引物组或权利要求2所述的引物对或权利要求3所述的试剂，以及作为阳性对照的南芥菜花叶病毒的病叶冻干粉末或携带有南芥菜花叶病毒基因组片段的质粒，和作为阴性对照的水。

5.权利要求1所述的引物组或权利要求2所述的引物对或权利要求3所述的试剂或权利要求4所述的试剂盒在检测待测样品中是否含有南芥菜花叶病毒中的应用。

6.一种检测或辅助检测待测样品中是否含有南芥菜花叶病毒的方法，包括如下步骤：(1)从所述待测样品中提取总RNA，采用权利要求1中所述的反转录引物进行反转录反应，得到待测cDNA；

(2)以所述待测cDNA作为模板，用权利要求1中所述的两条扩增引物进行实时荧光定量PCR反应；

(3)反应结束后，根据扩增曲线和熔解曲线按照如下方法确定所述待测样品中是否含有南芥菜花叶病毒：若所述待测样品产生S型扩增曲线，且熔解温度为81～84℃，则所述待测样品中含有或候选含有南芥菜花叶病毒；反之，则所述待测样品中不含有或候选不含有南芥菜花叶病毒。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，用所述两条扩增引物进行PCR反应时，所述两条扩增引物的摩尔比为1﹕1；步骤(2)中，所述实时荧光定量PCR反应的退火温度为50℃。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述进行反转录反应的温度为37℃。

9.权利要求1所述引物组的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括将权利要求1所述引物组中的三条单链DNA分别单独包装的步骤。

10.权利要求2所述引物对的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括将权利要求2所述引物对中的两条单链DNA分别单独包装的步骤。

11.权利要求1所述引物组或权利要求2所述的引物对在制备权利要求3所述试剂或权利要求4所述试剂盒中的应用。

说明书

南芥菜花叶病毒SYBR Green I实时荧光RT-PCR检测试剂盒及

方法

技术领域

[0001] 本发明属于植物检疫技术领域，涉及一种南芥菜花叶病毒SYBR Green I实时荧光RT-PCR检测试剂盒及方法，特别涉及用于检测南芥菜花叶病毒的SYBR Green I实时荧光RT-PCR引物组、试剂盒及其检测方法。

背景技术

[0002] 南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus,ArMV)属于类小RNA病毒目(Picornavirales)、伴生豇豆病毒科(Secoviridae)、线虫传多面体病毒属(Nepovirus)中的一个病毒成员，是农业生产上一种重要的植物病毒，已被我国列为禁止进境的检疫性有害生物。ArMV主要通过汁液摩擦传播，也可以通过种子、块茎、鳞球茎、苗木等种苗传播，还可以通过介体线虫传播。该病毒寄主范围非常广，可侵染170多个属200多种植物，主要危害黄瓜(Cucumis sativus)、西葫芦(Cucurbita pepo)、莴苣(Lactuca sativa)、芹菜(Apium graveolens)、番茄(Lycopericon esculentum)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、豇豆(Vigna unguiculata)、蚕豆(Vicia faba)、豌豆(Pisum scatwum)、甜瓜(Cucumis melo)、花椰菜(Brassica oleracea L.var.botrytis)、菠菜(Spinacia oleracea)、胡萝卜(Daucus carota)、大豆(Glycine max)、甜菜(Beta vulgaris)、马铃薯(Solanum tuberosm)、大麻(Cannabis sativa)、啤酒花(Humulus lupulus)、草莓(Fragaia ananassa)、葡萄(Vitis vinifera)、香石竹(Dianthus caryophyllus)、水仙(Narcissus tazetta)、蔷薇(Rosa multiflora)、草木樨(Melilotus suaveolens)、郁金香(Tulipa gesneriana)、薄荷
(Mentha sppiperita)、丁香(Syringa oblata)、烟草(Nicotiana tabacum)等多种作物。引起的最常见症状是叶片斑驳和脱落、植株矮化、严重畸型、耳突，但会随着寄主植物、病毒的分离物、栽培条件、季节和年份的不同而不同。有时候也可能产生隐症，并不会在寄主植物上表现症状。

[0003] 基于PCR技术的分子检测方法，已越来越多应用于植物病毒的检测中。

发明内容

[0004] 本发明的一个目的是提供一种可用于检测南芥菜花叶病毒的引物组或引物对，是SYBR Green I实时荧光定量PCR检测的引物组或引物对。

[0005] 本发明所提供的用于检测南芥菜花叶病毒的引物组，具体由一条反转录引物和两条扩增引物组成；所述反转录引物为序列表中序列1所示的单链DNA；所述两条扩增引物为序列表中序列2和序列3所示的两条单链DNA。

[0006] 本发明所提供的用于检测南芥菜花叶病毒的引物对，具体为由序列表中序列2和序列3所示的两条单链DNA组成的引物对。

[0007] 其中，序列1由18个核苷酸组成；序列2由20个核苷酸组成；序列3由20个核苷酸组成。

[0008] 在所述引物组中，既可以“各引物分别单独包装”，也可以“将所述反转录引物单独包装于包装A中，将所述两条扩增引物一同包装于包装B中”。如果是前者，可为各引物的配比可为任意比，如20:6:6。如果是后者，所述包装B中，所述两条扩增引物的摩尔比为1:1。

[0009] 在所述引物对中，既可以各引物分别单独包装，也可以混合包装。如果是前者，可为各引物的配比可为任意比，如1:1。如果是后者，所述两条扩增引物的摩尔比为1:1。

[0010] 本发明的第二个目的是提供用于检测南芥菜花叶病毒的试剂。

[0011] 本发明所提供的用于检测南芥菜花叶病毒的试剂，具体可包括所述引物组，以及2+
如下中的至少一种：dNTPs、Mg 、Taq DNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂和SYBR Green I。

[0012] 在所述试剂中，各物质可分别单独包装。

[0013] 在本发明中，所述DNA聚合酶具体为Taq DNA聚合酶；所述反转录酶具体为M-MLV反转录酶。

[0014] 本发明的第三个目的是提供一种用于检测南芥菜花叶病毒的试剂盒。

[0015] 本发明所提供的用于检测南芥菜花叶病毒的试剂盒，具体可含有所述引物组或所述引物对或所述试剂，以及作为阳性对照的南芥菜花叶病毒的病叶冻干粉末或携带有南芥菜花叶病毒基因组片段的质粒；和/或作为空白对照的水。

[0016] 在本发明中，所述携带有南芥菜花叶病毒基因组片段的质粒具体为将南芥菜花叶病毒(ArMV)的CP基因插入到pMD18-T载体中后得到的重组质粒。其中，所述南芥菜花叶病毒(ArMV)的CP基因为序列表中序列4。

[0017] 所述引物组或所述引物对或所述试剂或所述试剂盒在检测待测样品中是否含有南芥菜花叶病毒中的应用也属于本发明的保护范围。

[0018] 本发明的第四个目的是提供一种检测或辅助检测待测样品中是否含有南芥菜花叶病毒的方法。

[0019] 本发明所提供的检测或辅助检测待测样品中是否含有南芥菜花叶病毒的方法，具体可包括如下步骤：

[0020] (1)从所述待测样品中提取总RNA，采用所述反转录引物进行反转录反应，得到待测cDNA；

[0021] (2)以所述待测cDNA作为模板，用所述两条扩增引物进行实时荧光定量PCR反应；

[0022] (3)反应结束后，根据扩增曲线和熔解曲线(melting curve)按照如下方法确定所述待测样品中是否含有南芥菜花叶病毒：若所述待测样品产生S型扩增曲线，且熔解温度(melting temperature)为81～84℃(如82～84℃)，则所述待测样品中含有或候选含有南芥菜花叶病毒；反之，则所述待测样品中不含有或候选不含有南芥菜花叶病毒。

[0023] 在所述方法的步骤(2)中，用所述两条扩增引物进行PCR反应时，所述两条扩增引物的摩尔比具体可为1﹕1。

[0024] 具体的，步骤(2)的反应体系为：3μL步骤(1)获得的待测cDNA，2×实时荧光PCR反应液(宝生物工程(大连)有限公司公司产品，其产品目录号为RR820A)10.0μL，ROX Reference Dye II(50×)0.4μL，6pmol引物ArMV-2-350F(序列2)，6pmol引物ArMV-2-350R(序列3)，无RNA酶ddH2O补充至20μL。

[0025] 在所述方法的步骤(2)中，所述实时荧光定量PCR反应的退火温度可为50℃。

[0026] 更加具体的，步骤(2)的反应条件为：50℃2min；95℃预变性10min；95℃变性15s、50℃退火30s、72℃延伸35s，共40个循环。

[0027] 在所述方法的步骤(1)中，所述进行反转录反应的温度为37℃。

[0028] 更加具体的，步骤(1)中所述进行反转录反应为：在离心管中，加入4μL所述总RNA，20pmol反转录引物Oligo(dT)18(序列1)，无RNA酶ddH2O补至14μL，于95℃中孵育10min后，置于冰上5min，继续加入4μL 5×反转录缓冲液，10nmoldNTPs，100U的M-MLV反转录酶，20U的RNA酶抑制剂，于37℃水浴1h后，95℃水浴10min。

[0029] 在本发明中，以上所有的所述待测样品均可为植物样品，如感染了南芥菜花叶病毒的植物球茎，如百合、水仙或郁金香的球茎。

[0030] 所述引物组或所述引物对的制备方法也属于本发明的保护范围。

[0031] 所述引物组的制备方法包括将所述引物组中的三条单链DNA分别单独包装的步骤。

[0032] 所述引物对的制备方法包括将所述引物对中的两条单链DNA分别单独包装的步骤。

[0033] 所述引物组或所述引物对在制备所述试剂或所述试剂盒中的应用同样属于本发明的保护范围。

[0034] 实验证明，本发明重复性实验显示Ct变异系数较小，具有良好重现性；灵敏度实验显示该方法检测水平最低可达10拷贝/μL，比普通RT-PCR方法提高100倍；特异性实验显示，在同属于豇豆花叶病毒亚科的其它病毒及健康寄主植物中未见特异性扩增曲线，具有良好的特异性。利用所建立的方法，对百合、水仙、郁金香等病毒分离物检测，在阳性样品中均检测到荧光信号，具有良好的扩增曲线，扩增产物的熔解曲线仅出现单特异峰。因此，所建立的SYBR Green I实时荧光RT-PCR方法具有良好的重现性、灵敏性和特异性，可用于南芥菜花叶病毒的实验室检测。另外，本发明检测周期短，整个检测过程在2～3小时内即可完成。本发明还具有良好的广谱性：南芥菜花叶病毒不同分离物间具有比较大的差异，多数分离物间的CP基因序列同源性在82.4％～99.9％之间，其中1个分离物与其它分离物间的序列同源性甚至达到71.2％～73.1％。本发明是根据两个保守区域设计引物，不需要额外探针引物，最大保证了该检测试剂盒的广谱性。

[0035] 本发明与现有的分子检测方法相比，具有以下优点：1)比普通RT-PCR方法、免疫捕获RT-PCR和巢式RT-PCR具有更高或相当的灵敏度，并且不需要凝胶电泳步骤、操作更为简便，也减少有毒有害物质对人体、环境的危害和污染；2)与TaqMan探针、TaqMan-MGB探针的实时荧光RT-PCR方法相比，减少了1条引物探针的结合位点，从而有效提高检测广谱性，同时也减少合成探针的费用、节约检测成本。

附图说明

[0036] 图1为南芥菜花叶病毒SYBR Green I实时荧光RT-PCR检测试剂盒的重复性评价结果。

[0037] 图2为南芥菜花叶病毒SYBR Green I实时荧光RT-PCR检测试剂盒灵敏度检测的扩8 7 6 5 4 3
增曲线图。1：10拷贝/μL，2：10拷贝/μL，3：10拷贝/μL，4：10拷贝/μL，5：10拷贝/μL，6：10拷贝/μL，7：102拷贝/μL，8：101拷贝/μL，9：100拷贝/μL，10：空白对照。

[0038] 图3是南芥菜花叶病毒SYBR Green I实时荧光RT-PCR检测试剂盒灵敏度检测的熔解曲线图。1：108拷贝/μL，2：107拷贝/μL，3：106拷贝/μL，4：105拷贝/μL，5：104拷贝/μL，6：103拷贝/μL，7：102拷贝/μL，8：101拷贝/μL，9：100拷贝/μL，10：空白对照。

[0039] 图4为南芥菜花叶病毒普通RT-PCR灵敏度检测的琼脂糖凝胶电泳图。M：DNA分子量标准，各条带由大到小依次为1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp；1：1010拷贝/μL；2：109拷贝/μL；3：108拷贝/μL；4：107拷贝/μL；5：106拷贝/μL；6：105拷贝/μL；7：104拷贝/μL；8：103拷贝/μL；9：102拷贝/μL；10：101拷贝/μL；11：100拷贝/μL；12：空白对照。

[0040] 图5为南芥菜花叶病毒SYBR Green I实时荧光RT-PCR检测试剂盒特异性检测的扩增曲线图。1为108拷贝/μL的质粒标准品，2为107拷贝/μL的质粒标准品，3为BBTMV病叶样品，4为BBWV1病叶样品、5为GFLV病叶样品、6为RpRSV病叶样品、7为TRSV病叶样品、8为TBRV病叶样品、9为PRMV病叶样品、10为CPSMV病叶样品、11为SqMV病叶样品、12为BLMoV病叶样品、13为ToRSV病叶样品、14为健康百合叶片、15为健康郁金香叶片、16为健康水仙叶片。

[0041] 图6为南芥菜花叶病毒SYBR Green I实时荧光RT-PCR检测试剂盒特异性检测的熔解曲线图。1为108拷贝/μL的质粒标准品，2为107拷贝/μL的质粒标准品，3为BBTMV病叶样品，4为BBWV1病叶样品、5为GFLV病叶样品、6为RpRSV病叶样品、7为TRSV病叶样品、8为TBRV病叶样品、9为PRMV病叶样品、10为CPSMV病叶样品、11为SqMV病叶样品、12为BLMoV病叶样品、13为ToRSV病叶样品、14为健康百合叶片、15为健康郁金香叶片、16为健康水仙叶片。

[0042] 图7为南芥菜花叶病毒SYBR Green I实时荧光RT-PCR检测试剂盒在检测花卉种球样品中的扩增曲线图。1为阳性对照样品、2～15分别为水仙种球样品(Nar-6,Nar-16,Nar-19,Nar-29,Nar-5067-1,Nar-5067-2)、百合种球样品(Lil-314、Lil-47-2-1、Lil-47-3-4、Lil-47-4-2、Lil-7620-15-1、Lil-7621-25-1)和郁金香种球样品(Tul-3566-2、Tul-3566-
4)，16为空白对照样品。

[0043] 图8为南芥菜花叶病毒SYBR Green I实时荧光RT-PCR检测试剂盒在检测花卉种球样品中的熔解曲线图。1为阳性对照样品、2～15分别为水仙种球样品(Nar-6,Nar-16,Nar-19,Nar-29,Nar-5067-1,Nar-5067-2)、百合种球样品(Lil-314、Lil-47-2-1、Lil-47-3-4、Lil-47-4-2、Lil-7620-15-1、Lil-7621-25-1)和郁金香种球样品(Tul-3566-2、Tul-3566-
4)，16为空白对照样品。

具体实施方式

[0044] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0045] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0046] 南芥菜花叶病毒(ArMV)：公司名称：Agdia,Inc.，产品编号为Lot No：C1954。

[0047] ArMV阳性质粒：在ArMV的CP基因外侧设计1对引物，利用RT-PCR方法扩增其完整的CP基因，扩增引物为：ArMV-CP-F1：ATGAGBACWACNACGCG；ArMV-CP-R2：CAAACAAYACAYTGTCGCCAC。把PCR产物回收纯化后，连接至pMD18-T载体(宝生物工程(大连)有限公司产品产品)中，然后转化至大肠杆菌的感受态细胞中，挑取阳性克隆，提取质粒DNA，测序验证正确的即为含有ArMV CP基因的阳性质粒。其中，ArMV CP基因的序列为序列表中序列4。

[0048] 蚕豆真花叶病毒(BBTMV)：德国菌种保藏中心(DSMZ)，保藏编号为DSMZ No.PV-0098。

[0049] 蚕豆萎蔫病毒1号(BBWV1)：德国菌种保藏中心(DSMZ)，保藏编号为DSMZ No.PV-0067。

[0050] 葡萄扇叶病毒(GFLV)：公司名称：NEOGEN EUROPE Ltd-ADGEN Phytodiagnostics(在中国注册的公司名称：安德珍生物技术(北京)有限公司)，产品编号为Adgen No.1147-11。

[0051] 悬钩子环斑病毒(RpRSV)：德国菌种保藏中心(DSMZ)，保藏编号为DSMZ No.PV-0429。

[0052] 烟草环斑病毒病叶(TRSV)：公司名称：Agdia,Inc.，产品编号为Lot No：C1714。

[0053] 番茄黑环病毒(TBRV)：公司名称：Agdia,Inc.，产品编号为Lot No：1068-11。

[0054] 桃丛簇花叶病毒(PRMV)：公司名称：Agdia，Inc.，产品编号为Lot No：C1973。

[0055] 豇豆重花叶病毒(CPSMV)：美国国菌种保藏中心(ATCC)，保藏编号为：PV-273。

[0056] 南瓜花叶病毒(SqMV)：公司名称：Agdia,Inc.，产品编号为Lot No：C2013。

[0057] 蓝莓叶斑病毒(BLMoV)：公司名称：Agdia，Inc.，产品编号为Lot No：C1796。

[0058] 番茄环斑病毒(ToRSV)：公司名称：Agdia,Inc.，产品编号为Lot No：C1939。

[0059] 实施例1、南芥菜花叶病毒SYBR Green I实时荧光RT-PCR检测试剂盒的配置(50次检测量)

[0060] 1)反转录引物Oligo(dT)18：10μmol/L，1管(100μL)；

[0061] 2)反转录缓冲液：5×，1管(250μL)；

[0062] 3)dNTPs：浓度为10mmol/L，1管(100μL)；

[0063] 4)M-MLV反转录酶：200U/μL，1管(30μL)；

[0064] 5)RNA酶抑制剂：40U/μL，1管(30μL)；

[0065] 6)无RNA酶ddH2O，1管(1mL)；

[0066] 7)实时荧光PCR反应液：2×，1管(550μL)；

[0067] 8)ROX Reference Dye II：50×，1管(25μL)；

[0068] 9)引物ArMV-2-350F：浓度为10μmol/L，1管(35μL)；

[0069] 10)引物ArMV-2-350R：浓度为10μmol/L，1管(35μL)；

[0070] 11)阳性对照样品：含有南芥菜花叶病毒(ArMV)的叶片冻干粉末，1管(0.1g)。

[0071] 其中，反转录引物Oligo(dT)18，其序列为：

[0072] 5’-AAAAAAAAAA AAAAAAAA-3’(序列1)。

[0073] 引物ArMV-2-350F和ArMV-2-350R为两条PCR扩增引物，是针对南芥菜花叶病毒RNA2基因组上的CP基因序列设计的，其引物序列如下：

[0074] ArMV-2-350F：5’-CATTTCACRTGCCTCACTGG-3’(序列2)；

[0075] ArMV-2-350R：5’-ATGCCATAAGTRCAAGGGCT-3’(序列3)。

[0076] 其中，R＝A或G。

[0077] 5×反转录缓冲液：Promega Corporation公司产品，其产品目录号为M1705。

[0078] M-MLV反转录酶：Promega Corporation公司产品。

[0079] RNA酶抑制剂：Promega Corporation公司产品，其产品目录号为N2111。

[0080] 50×ROX Reference Dye II：宝生物工程(大连)有限公司产品，其产品目录号为RR820A。

[0081] 2×实时荧光PCR反应液：宝生物工程(大连)有限公司公司产品，其产品目录号为RR820A。2×实时荧光PCR反应液中含有TaKaRa Ex Taq HS、dNTP Mixture、Mg2+、Tli RNaseH、SYBR Green I。

[0082] 实施例2、南芥菜花叶病毒SYBR Green I实时荧光RT-PCR检测试剂盒的检测方法[0083] 实施例1中的南芥菜花叶病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

[0084] 1)反转录反应：在离心管中，加入待测样品总RNA(Trizol法提取)4μL，反转录引物Oligo d(T)18(浓度为10μmol/L)2μL，无RNA酶ddH2O 8μL，于95℃中孵育10min后，置于冰上5min，继续加入5×反转录缓冲液4μL，dNTPs 1μL，M-MLV反转录酶0.5μL，RNA酶抑制剂0.5μL，于37℃水浴1h后，95℃水浴10min(灭活反转录酶)后自然冷却至室温，合成cDNA。

[0085] 2)实时荧光PCR反应：取步骤1)合成的cDNA 3μL，2×实时荧光PCR反应液10.0μL，ROX Reference Dye II(50×)0.4μL，引物ArMV-2-350F(浓度为10μmol/L)0.6μL，引物ArMV-2-350R(浓度为10μmol/L)0.6μL，无RNA酶ddH2O 6.4μL。把混匀后的反应液按照以下条件下反应：50℃2min；95℃预变性10min；95℃变性15s、50℃退火30s、72℃延伸35s，共40个循环。

[0086] 3)结果判定：反应结束后，根据扩增曲线和熔解曲线按照如下方法确定所述待测样品中是否含有南芥菜花叶病毒：若所述待测样品产生S型扩增曲线，且熔解温度为81～84℃，则所述待测样品中含有南芥菜花叶病毒；反之，则所述待测样品中不含有南芥菜花叶病毒。

[0087] 实施例3、南芥菜花叶病毒SYBR Green I实时荧光RT-PCR检测试剂盒的重复性评价

[0088] 利用实施例1的检测试剂盒、根据实施例2中步骤2)、步骤3)的方法，分别用浓度分别为108拷贝/μL、107拷贝/μL、106拷贝/μL的ArMV阳性质粒样品进行3次重复实验，计算Ct值的平均值、标准差和变异系数。

[0089] 结果显示，随着ArMV阳性质粒标准品拷贝数的降低，Ct值增大且具有良好重现性，其变异系数分别为3.81％、0.19％、2.89％，显示出良好的重复性和准确性(表1，图1)。

[0090] 表1 检测试剂盒的重复性实验结果

[0091]

[0092] 实施例4、南芥菜花叶病毒SYBR Green I实时荧光RT-PCR检测试剂盒的灵敏度检测

[0093] 利用实施例1的检测试剂盒、根据实施例2中步骤2)、步骤3)的方法，对不同浓度的ArMV阳性质粒标准样品进行检测(浓度分别为1010拷贝/μL～100拷贝/μL)。

[0094] 实验同时设置如下普通PCR方法作为对照：

[0095] 采用的引物序列ArMV-2-350F：5’-CATTTCACRTGCCTCACTGG-3’(序列2)；ArMV-2-350R：5’-ATGCCATAAGTRCAAGGGCT-3’(序列3)。

[0096] 反应体系：2.5μL 10×PCR Buffer(Mg2+plus)，2μL dNTP Mixture(2.5mmol/L)，1μL的引物ArMV-2-350F(10μmol/L)，1μL的引物ArMV-2-350R(10μmol/L)，0.25μL Easy Taq DNA聚合酶(5U/μL)，3μL不同浓度的ArMV阳性质粒，无菌去离子补充至25μL。

[0097] 反应程序：95℃预变性3min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸7min。

[0098] 实验同时设置以水替代PCR反应模板的空白对照。

[0099] 扩增曲线如图2所示，熔解曲线如图3所示。结果表明，该检测试剂盒的检测下限为10拷贝/μL的ArMV阳性质粒标准样品，而普通PCR方法的检测下限为103拷贝/μL的质粒标准样品(图4)，比本发明方法的检测灵敏度低100倍。

[0100] 实施例5、南芥菜花叶病毒SYBR Green I实时荧光RT-PCR检测试剂盒的特异性检测

[0101] 分别提取含有BBTMV、BBWV1、GFLV、RpRSV、TRSV、TBRV、PRMV、CPSMV、SqMV、BLMoV、ToRSV的病叶样品，以及健康的百合、郁金香、水仙的叶片的总RNA，利用实施例1的检测试剂盒、根据实施例2中的方法进行检测。

[0102] 实验同时设置108拷贝/μL以及107拷贝/μL的ArMV阳性质粒标准品作为阳性对照。

[0103] 结果显示，所有样品均检测到荧光信号(图5)，但熔解曲线显示只有阳性对照ArMV阳性质粒标准品出现特异性熔解曲线(图6)，显示该检测试剂盒具有良好的特异性。

[0104] 实施例6南芥菜花叶病毒SYBR Green I实时荧光RT-PCR检测试剂盒在检测花卉种球样品中的应用

[0105] 分别提取携带有南芥菜花叶病毒(ArMV)的百合种球样品(Nar-6、Nar-16、Nar-19、Nar-29、Nar-5067-1、Nar-5067-2)、水仙种球样品(Lil-314、Lil-47-2-1、Lil-47-3-4、Lil-47-4-2、Lil-7620-15-1、Lil-7621-25-1)和郁金香种球样品(Tul-3566-2、Tul-3566-4)的总RNA，利用实施例1的检测试剂盒、根据实施例2中的方法进行检测。

[0106] 实验同时设置以水替代PCR反应模板的空白对照，以及以含有南芥菜花叶病毒(ArMV)的叶片冻干粉末替代PCR反应模板的阳性对照。

[0107] 结果显示，所有的携带南芥菜花叶病毒的花卉种球样品均产生典型的S型扩增曲线(图7)，熔解温度在82℃～84℃之间(图8)。说明本发明的检测试剂盒可以用于不同来源、不同类型的样品检测。