口腔鳞状细胞癌的生物标志物及其应用

摘要

本发明提供了一种与口腔口咽鳞状细胞癌颈部淋巴结转移相关的标志物及其应用。所述标志物为GPD1L和/或HIF1α，特别是二者的组合。本发明中，通过检测GPD1L和/或HIF1α的表达水平，可进行口腔口咽鳞状细胞癌辅助诊断、口腔口咽鳞状细胞癌患者预后判断、和/或口腔口咽鳞状细胞癌颈部淋巴结转移预测。

权利要求

1.检测GPD1L的表达水平的试剂或检测GPD1L和HIF1α的表达水平的试剂在制备用于口腔鳞状细胞癌辅助诊断、口腔鳞状细胞癌患者预后判断、和/或口腔鳞状细胞癌颈部淋巴结转移预测的组合物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其中，检测GPD1L的表达水平包括检测GPD1L的基因表达水平，或者检测GPD1L的蛋白表达水平；检测GPD1L和HIF1α的表达水平包括检测GPD1L和HIF1α的基因表达水平，或者检测GPD1L和HIF1α的蛋白表达水平。

3.根据权利要求1所述的应用，其中，检测GPD1L的表达水平包括采用免疫组化方法检测来自待测个体的石蜡组织切片中GPD1L蛋白表达水平；检测GPD1L和HIF1α的表达水平包括采用免疫组化方法检测来自待测个体的石蜡组织切片中GPD1L蛋白表达水平和HIF1α蛋白表达水平。

4.根据权利要求3所述的应用，其中，

GPD1L蛋白表达水平按以下公式计算评分，并以GPD1L蛋白表达评分100作为阈值，评分<100为低表达，评分≥100为高表达：GPD1L蛋白表达评分=P×I×100，

其中：P为检测样本切片的阳性表达面积百分比，

I为染色强度评分，阴性或弱阳性为1，阳性为2，强阳性为3；

HIF1α蛋白表达水平是以10%细胞核阳性作为阈值，阳性细胞核<10%为低表达，阳性细胞核≥10%为高表达。

5.根据权利要求4所述的应用，其中：

GPD1L低表达个体的口腔鳞状细胞癌颈部淋巴结转移风险高于GPD1L高表达个体；

GPD1L低表达且HIF1α高表达个体的口腔鳞状细胞癌颈部淋巴结转移风险高于GPD1L高表达且HIF1α低表达个体；

GPD1L高表达的口腔鳞状细胞癌患者无病生存及癌相关生存好于GPD1L低表达个体；

GPD1L高表达且HIF1α低表达的口腔鳞状细胞癌患者无病生存及癌相关生存好于GPD1L低表达且HIF1α高表达个体。

6.根据权利要求1所述的应用，其中，口腔鳞状细胞癌颈部淋巴结转移为早期口腔鳞状细胞癌延迟性颈部淋巴结转移。

7.检测GPD1L的表达水平的试剂或检测GPD1L和HIF1α的表达水平的试剂在制备用于口腔鳞状细胞癌辅助诊断、预后判断、和/或颈部淋巴结转移预测的试剂盒中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其中，所述检测GPD1L的表达水平的试剂为采用免疫组织化学技术检测来自待测个体的石蜡组织标本中GPD1L表达水平的试剂；所述检测GPD1L和HIF1α的表达水平的试剂为采用免疫组织化学技术检测来自待测个体的石蜡组织标本中GPD1L和HIF1α表达水平的试剂。

9.根据权利要求8所述的应用，其中，所述检测GPD1L的表达水平的试剂包括GPD1L的抗体；所述检测GPD1L和HIF1α的表达水平的试剂包括GPD1L的抗体和HIF1α的抗体。

说明书

口腔鳞状细胞癌的生物标志物及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与口腔鳞状细胞癌和/或口咽鳞状细胞癌颈部淋巴结转移预测相关的蛋白标志物及其应用。

背景技术

[0002] 在我国，口腔口咽癌90％以上为鳞状细胞癌，流行病学统计近年来有逐渐上升的趋势。因位于呼吸道与消化道的重要位置，在人体语言、进食、呼吸方面都起到重要作用，病变严重者可造成毁容、吞咽、咀嚼、发音等功能障碍，影响患者的生活质量，甚至危及生命。口腔口咽鳞癌患者的诊断和治疗现状如下：①手术为主的治疗是唯一治愈手段，该肿瘤对放化疗仅中度敏感；②尽管诊断和治疗手段不断进步，长期生存率始终徘徊在50％-60％，很难继续改善；③颈部淋巴结转移是口腔口咽鳞癌患者最重要的预后因子；④约30％-40％的患者在初次就诊时已伴有颈部淋巴结转移；⑤目前尚无高效的临床及分子标志物能够准确预测口腔口咽鳞癌颈部淋巴结转移。

[0003] 近年来，随着对肿瘤发病机制和生物学行为认识的提高，已经证实口腔鳞癌颈部转移的内因是分子水平异常的结果，诊断和治疗新策略的产生有赖于对颈部转移生物学行为相关的功能基因和蛋白进行全面、系统的研究。在后基因组时代，认识到蛋白是身体的役马(work horse)。不同代谢途径都是通过蛋白来表现。因此，可以使用在口腔口咽鳞癌早期表达的独特且特异的蛋白作为生物标志物，通过引入分子分型诊断方法辅助临床筛选颈部淋巴结转移高危患者，从而为开发新的颈部转移诊断技术，为患者个体化外科治疗提供坚实的基础。随着人类基因组计划的完成和微阵列技术的出现，国内外学者利用基因芯片技术对多种恶性肿瘤(如前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、肺癌、鼻咽癌、食道癌、甲状腺癌等)进行基因表达谱分析，分别筛选出了多个可能与恶性肿瘤发生、发展密切相关的候选基因；对这些肿瘤相关基因功能的深入研究和最终确定，能在一定程度上揭示肿瘤发生、发展的分子机制，为癌症新型诊断方法、药物治疗靶点设计和预后预测提供研究基础。2007年以来，国际上已经有多个实体肿瘤(包括前列腺癌、乳腺癌等)的分子诊断/分子分型商品化试剂盒上市，大多已 经通过FDA认证；然而到目前为止，口腔口咽鳞癌转化医学领域尚无有效的商品化分子诊断产品问世，口腔口咽鳞癌的个体化诊断和治疗迫切需要对新的关键基因进行深入的研究。

[0004] 缺氧诱导因子1α(HIF-1α)作为肿瘤乏氧调控的核心成员，一些证据表明HIF-1α与肿瘤的生长、侵袭、转移密切相关，其过表达可明显促进肿瘤的转移(Tsai Y P,Wu K J.Hypoxia-regulated target genes implicated in tumor metastasis,J Biomed Sci,2012,19:102；Vered M,Dayan D,Yahalom R,et al.Cancer-associated fibroblasts and epithelial-mesenchymal transition in metastatic oral tongue squamous cell carcinoma,Int J Cancer,2010,127(6):1356-1362；Yang M H,Wu M Z,Chiou S H,et al.Direct regulation of TWIST by HIF-1alpha promotes metastasis,Nat Cell Biol,2008,10(3):295-305)；然而，也有许多研究表明，HIF-1α在许多肿瘤中表达与转移无明显相关性，甚至有报道该分子可以启动凋亡，某些条件下和特定肿瘤中具有抑癌作用(Cabanillas R,Rodrigo JP,Secades P,et al.The relation between hypoxia-inducible factor(HIF)-1alpha expression with p53expression and outcome in surgically treated supraglottic laryngeal cancer.J Surg Oncol.2009,99(6):373-8；Fillies T,Werkmeister R,van Diest PJ,et al.HIF1-alpha overexpression indicates a good prognosis in early stage squamous cell carcinomas of the oral floor BMC Cancer.2005,21；5:84；Munipalle PC,Viswanath YK,Davis PA,et al.Prognostic value of hypoxia inducible factor 1αin esophageal squamous cell carcinoma.Dis Esophagus.2011,24(3):177-81)。这与HIF-1α在肿瘤特定时空条件下发挥作用的特定信号通路和其上下游调控分子密切相关。

[0005] 现有技术中未发现能用于预测口腔口咽鳞癌颈部淋巴结转移且具有高敏感度和特异度的生物标志物。

发明内容

[0006] 本发明的主要目的在于提供一种能用于预测口腔口咽鳞癌颈部淋巴结转移的生物标志物，并提供所述的生物标志物及其相关检测试剂的应用，特别是用于口腔口咽鳞状细胞癌辅助诊断、口腔口咽鳞状细胞癌患者预后判断、和/或口腔口咽鳞状细胞癌颈部淋巴结转移预测，具有高敏感度和特异度。

[0007] 为了寻找一种能用于预测口腔口咽鳞癌颈部淋巴结转移的生物标志物，本案发明人在前期课题研究中基因表达谱芯片筛选基础之上，运用生物信息学方法，经统计学 分析初步筛选出78个口腔鳞癌相关基因，并经进一步的摸索实验及分析研究，发现了GPD1L基因是一个新的口腔鳞癌下调基因，其在口腔口咽鳞癌组织中表达明显下调。此后在对120例口腔鳞癌和120例正常口腔黏膜组织标本中78个口腔鳞癌相关基因的real-time PCR检测中，发现GPD1L基因在97.6％的口腔鳞癌组织中表达下调，且经研究发现GPD1L与HIF-1α调控密切相关，GPD1L与HIF1α基因表达水平呈现明显负相关。最终确定了GPD1L与HIF-1α可以作为口腔口咽鳞状细胞癌辅助诊断、口腔口咽鳞状细胞癌患者预后判断、和/或口腔口咽鳞状细胞癌颈部淋巴结转移预测的生物标志物。

[0008] 本发明中，除明确说明外，所述GPD1L包括GPD1L基因和/或GPD1L蛋白；所述HIF-1α包括HIF-1α基因和/或HIF-1α蛋白。所述口腔口咽鳞状细胞癌包括口腔鳞状细胞癌和/或口咽鳞状细胞癌。通常情况下，所述的“高表达”、“低表达”是相对于正常人相应组织中的表达水平而言。

[0009] GPD1L基因定位于人染色体3p22.3区段，与甘油-3-磷酸脱氢酶基因具有84％的同源序列，包含8个外显子。该基因最初于2002年哺乳动物基因组计划时被发现，但当时并不了解GPD1L有何生理功能。2007年，London等发现该基因突变与一种严重的心源性猝死性疾病(Brugada综合症)的发生有关，该疾病的主要致病机理是钠离子通道基因异常。GPD1L可以直接或间接与心脏钠离子通道的穿孔素α亚单位偶联(Pore-formingα-subunit of the cardiac sodium channel，SCN5A)，并对其发挥调控作用，GPD1L突变可通过自身失活或中断与SCN5A的偶联从而对心脏钠离子通道起到拮抗作用，具体机制仍有待于进一步证实。因此，目前以GPD1L为主题的研究主要集中在心律失常领域，除了心脏组织外，GPD1L在其他组织中的分布及其生理功能目前尚不清楚，有学者甚至认为GPD1L的生理功能是心脏特异性的(London B,Michalec M,Mehdi H,et al.Mutation in glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1like gene (GPD1-L)decreases cardiac Na+current and causes inherited arrhythmias,Circulation,2007,116:2260-2268；Valdivia CR,Ueda K,Ackerman MJ,et al.GPD1L links redox state to cardiac excitability by PKC-dependent phosphorylation of the sodium channel SCN5A,Am J Physiol Heart Circ Physiol,2009,297:H1446-1452)。近来，一项体外研究发现，GPD1L还是逆向调节HIF-1α降解和稳定的重要调控因子(Fong GH,Takeda K.Role and regulation of prolyl hydroxylase domain proteins,Cell Death Differ,2008,15:635–641)，该蛋白可以通过增强脯氨酰羟化酶(prolyl hydroxylase，PHD)活性使HIF-1α 的两个重要的脯氨酸残基(脯氨酸402和564)发生羟基化，从而降低了HIF-1α的稳定性，致使羟基化后的HIF-1α迅速与E3泛素连接酶相结合，并被蛋白酶体降解，但目前为止，GPD1L对HIF-1α羟基化调节的具体机制并不清楚(Min JH,Yang H,Ivan M,et al.Structure of an HIF-1alpha-pVHL complex:hydroxyproline recognition in signaling,Science,2002,296:1886–1889；Kelly TJ,Souza AL,Clish CB,et al.A hypoxia-induced positive feedback loop promotes hypoxia-inducible factor 1alpha stability through miR-210suppression of glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1-like,Mol Cell Biol,2011,31:2696-2706)。

[0010] 本案发明人在研究中，通过制备口腔口咽鳞癌患者术后病理石蜡组织连续切片(4μm)，利用免疫组织化学技术检测每例组织标本中GPD1L和HIF-1α蛋白表达水平，将口腔口咽鳞癌患者颈部淋巴结转移与石蜡组织标本中的GPD1L和HIF-1α蛋白表达水平关联，通过进一步的研究分析，证实了GPD1L和/或HIF-1α可以作为口腔口咽鳞状细胞癌辅助诊断、口腔口咽鳞状细胞癌患者预后判断、和/或口腔口咽鳞状细胞癌颈部淋巴结转移预测的生物标志物，通过检测GPD1L和/或HIF-1α的表达水平，可以为口腔口咽鳞状细胞癌辅助诊断、口腔口咽鳞状细胞癌患者预后判断、和/或口腔口咽鳞状细胞癌颈部淋巴结转移预测提供依据。特别是，这两种生物标志物联合在口腔口咽鳞状细胞癌患者预后判断、以及预测口腔口咽鳞癌颈部淋巴结转移效率上具有协同作用。具体而言，GPD1L与HIF1α表达呈现负相关的趋势，GPD1L低表达同时HIF-1α高表达患者是口腔口咽鳞癌颈部淋巴结转移的高危人群，而GPD1L高表达同时HIF-1α低表达患者是口腔口咽鳞癌颈部淋巴结转移的低危人群。当GPD1L与HIF1α用于判断口腔口咽鳞状细胞癌患者预后，Kaplan-Meier生存分析发现，GPD1L高表达/HIF1α低表达患者明显较GPD1L低表达/HIF1α高表达者获得更好的无病生存及癌相关生存，GPD1L和HIF1α表达联合预测效率明显高于两种蛋白单独预测，具有最强的预后价值。

[0011] 从而，一方面，本发明提供了检测GPD1L和/或HIF1α的表达水平的试剂在制备用于口腔口咽鳞状细胞癌辅助诊断、口腔口咽鳞状细胞癌患者预后判断、和/或口腔口咽鳞状细胞癌颈部淋巴结转移预测的组合物中的应用。

[0012] 根据本发明的具体实施方案，检测GPD1L和/或HIF1α的表达水平包括检测GPD1L和/或HIF1α的基因表达水平，或者检测GPD1L和/或HIF1α的蛋白表达水平。可以采用所属领域中已知的任何可行方法，例如限制性片段长度多态性分析(RFLP)、 反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、荧光原位杂交法(FISH)、放射性免疫分析、竞争性结合法、Western印迹分析法、酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫组化等，检测来自待测个体的样品中GPD1L和/或HIF1α的表达水平。所述的检测试剂即为这些检测方法中用到的试剂，包括但不限于蛋白、核酸、碳水化合物等。

[0013] 根据本发明的一具体实施方案，检测GPD1L和/或HIF1α的表达水平包括采用免疫组化方法检测来自待测个体的石蜡组织切片中GPD1L蛋白表达水平和/或HIF1α蛋白表达水平。该具体实施方案中所述的检测GPD1L和/或HIF1α的表达水平的试剂即免疫组化方法所用到的检测试剂。具体而言，检测GPD1L蛋白表达水平的试剂包括GPD1L蛋白的抗体，检测HIF1α蛋白表达水平的试剂包括HIF1α蛋白的抗体，所述的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，这些抗体可以商购或是按照现有技术的方法自行制备得到。

[0014] 在本发明的一优选具体实施方案中，GPD1L蛋白表达水平按以下公式计算评分，并以GPD1L蛋白表达评分100作为阈值，评分<100为低表达，评分≥100为高表达：

[0015] GPD1L蛋白表达评分＝P×I×100，

[0016] 其中：P为检测样本切片的阳性表达面积百分比(％)，

[0017] I为染色强度评分，阴性或弱阳性为1，阳性为2，强阳性为3。

[0018] 在本发明的一优选具体实施方案中，HIF1α蛋白表达水平是以10％细胞核阳性作为阈值，阳性细胞核<10％为低表达，阳性细胞核≥10％为高表达。

[0019] 根据本发明的具体实施方案，本发明的技术用于预测待测个体的口腔口咽鳞状细胞癌颈部淋巴结转移时，HIF1α高表达个体的口腔口咽鳞状细胞癌颈部淋巴结转移风险高于HIF1α低表达个体；GPD1L低表达个体的口腔口咽鳞状细胞癌颈部淋巴结转移风险高于GPD1L高表达个体。当采用GPD1L联合HIF1α表达预测颈部淋巴结转移时，GPD1L与HIF1α蛋白表达有呈现负相关的趋势，GPD1L低表达且HIF1α高表达个体的口腔口咽鳞状细胞癌颈部淋巴结转移风险高于GPD1L高表达且HIF1α低表达个体。

[0020] 根据本发明的具体实施方案，本发明的技术用于口腔口咽鳞状细胞癌患者预后判断时，HIF1α低表达的口腔口咽鳞状细胞癌患者无病生存及癌相关生存好于HIF1α高表达个体；GPD1L高表达的口腔口咽鳞状细胞癌患者无病生存及癌相关生存好于GPD1L低表达个体。GPD1L高表达且HIF1α低表达的口腔口咽鳞状细胞癌患者无病 生存及癌相关生存好于GPD1L低表达且HIF1α高表达个体。GPD1L与HIF1α两种标志物表达水平协同分析具有最强的预后价值。

[0021] 另一方面，本发明还提供了一种用于口腔口咽鳞状细胞癌辅助诊断、预后判断、和/或颈部淋巴结转移预测的组合物，该组合物包括：检测GPD1L以及HIF1α表达水平的试剂。所述的检测GPD1L以及HIF1α表达水平的试剂可以是所属领域中已知的任何可检测来自个体的待测样品中GPD1L表达水平以及HIF1α表达水平的试剂，例如前述的用于采用限制性片段长度多态性分析、反转录-聚合酶链式反应、荧光原位杂交法、放射性免疫分析、竞争性结合法、Western印迹分析法、酶联免疫吸附法或免疫组化等方法检测GPD1L表达水平以及HIF1α表达水平的试剂。

[0022] 另一方面，本发明还提供了一种用于口腔口咽鳞状细胞癌辅助诊断、预后判断、和/或颈部淋巴结转移预测的试剂盒，该试剂盒包括：检测GPD1L和/或HIF1α表达水平的试剂。所述的检测GPD1L和/或HIF1α表达水平的试剂可以是所属领域中已知的任何可检测来自个体的待测样品中GPD1L表达水平和/或HIF1α表达水平的试剂，例如前述的用于采用限制性片段长度多态性分析、反转录-聚合酶链式反应、荧光原位杂交法、放射性免疫分析、竞争性结合法、Western印迹分析法、酶联免疫吸附法或免疫组化等方法检测GPD1L表达水平和/或HIF1α表达水平的试剂。在本发明的一优选具体实施方案中，所述检测GPD1L和/或HIF1α表达水平的试剂为采用免疫组织化学技术检测来自待测个体的石蜡组织标本中GPD1L和/或HIF1α表达水平的试剂，这样的检测GPD1L表达水平的试剂通常包括GPD1L的抗体，检测HIF1α表达水平的试剂通常包括HIF1α的抗体。

[0023] 另一方面，本发明还提供了一种用于治疗口腔口咽鳞状细胞癌、和/或抑制口腔口咽鳞状细胞癌颈部淋巴结转移的组合物，该组合物含有：提高口腔口咽鳞状细胞癌患者GPD1L表达水平的试剂，和/或降低口腔口咽鳞状细胞癌患者HIF1α表达水平的试剂。本发明中，由于GPD1L表达下降和HIF-1α表达上升指示口腔口咽鳞癌颈部淋巴结转移的存在，因此它们可能是癌瘤转移的必需组分。在适当的时相，有计划地调控上述蛋白的表达很可能抑制口腔口咽鳞癌颈淋巴转移，从而提高患者预后。

[0024] 综上所述，本发明提供了两种呈负相关表达并具有协同预测作用的生物标志物GPD1L和HIF-1α，通过检测其表达水平情况可以用于口腔口咽鳞状细胞癌辅助诊断、口腔口咽鳞状细胞癌患者预后判断、和/或口腔口咽鳞状细胞癌颈部淋巴结转移预测， 也可作为抗癌药物的标靶用于治疗目的，本发明的标志物具有高敏感度和特异度，对于口腔口咽鳞癌颈部淋巴转移高危患者进行大规模筛查具有重要意义。

附图说明

[0025] 图1A：颈清组GPD1L表达与无病生存的Kaplan-Meier曲线。

[0026] 图1B：颈清组GPD1L表达与癌相关生存的Kaplan-Meier曲线。

[0027] 图2A：颈清组HIF1α表达与无病生存的Kaplan-Meier曲线。

[0028] 图2B：颈清组HIF1α表达与癌相关生存的Kaplan-Meier曲线。

[0029] 图3A：颈清组GPD1L与HIF1α表达协同作用与无病生存的Kaplan-Meier曲线。

[0030] 图3B：颈清组GPD1L与HIF1α表达协同作用与癌相关生存的Kaplan-Meier曲线。

[0031] 图4：GPD1L与HIF1α蛋白表达典型图片。两者表达呈现明显负相关性Correlation coefficient:－0.341，P<0.001，且GPD1L低表达同时HIF1α高表达患者是早期口腔鳞癌颈部淋巴结转移的高危人群。

[0032] 图5A：验证组GPD1L表达与无病生存的Kaplan-Meier曲线。

[0033] 图5B：验证组GPD1L表达与癌相关生存的Kaplan-Meier曲线。

[0034] 图6A：验证组HIF1α表达与无病生存的Kaplan-Meier曲线。

[0035] 图6B：验证组HIF1α表达与癌相关生存的Kaplan-Meier曲线。

[0036] 图7A：验证组GPD1L与HIF1α表达协同作用与无病生存的Kaplan-Meier曲线。

[0037] 图7B：验证组GPD1L与HIF1α表达协同作用与癌相关生存的Kaplan-Meier曲线。

具体实施方式

[0038] 下面结合具体实施例及附图进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照所属领域的常规操作、或按照制造厂商所建议的操作条件进行。

[0039] 实施例1、GPD1L及HIF1α蛋白表达及其与颈部淋巴结转移的相关性分析验证[0040] (1)临床病例选取

[0041] 随机选取北京大学口腔医院口腔颌面外科1993年6月-2010年5月住院治疗并接 受同期颈清扫术的原发口腔鳞癌患者125例，临床分期为Ⅰ-Ⅳ期(UICC/AJCC.7ed.,2010)，作为颈清组，进行颈部淋巴结转移相关的潜在生物标志物分析。

[0042] 另随机选取颈部“坐观”的原发早期口腔鳞癌病例106例，临床分期(Ⅰ-Ⅱ期)，作为验证组，观察该组患者延迟性颈部淋巴结转移率，重点检验“颈清组”中已经鉴定的分子标志物在指导早期口腔鳞癌颈部治疗上的价值。

[0043] 随访截止日期为2013年6月1日，颈清组中生存患者的中位随访时间为73个月(四分位数：68.3-103个月)，观察组中生存患者的中位随访时间为62个月(四分位数：52-91个月)。所有患者均签署知情同意书并匿名编号，临床病理学资料经查询既往临床病历获得，所有患者术前未经任何治疗，且全身检查排除远处转移。

[0044] (2)治疗方案

[0045] 颈清组：原发肿瘤扩大切除+颈淋巴清扫术±修复重建术±术后放疗。

[0046] 验证组：原发肿瘤扩大切除±修复重建术。

[0047] 放疗：pN+的颈清组患者在术后2-6周内接受放射治疗，采用常规(或调强)五分割放疗方式，每周一至周五，每次剂量为200 cGy。总剂量为：原发灶及淋巴结阳性颈部>6000 cGy；淋巴结阴性颈部>5000 cGy；如果原发灶切缘阳性>6500 cGy。观察组患者颈部未行预防性放疗。

[0048] 颈部复发或延迟性转移治疗：全颈清扫术±术后放疗。

[0049] (3)检测试剂材料

[0050] 所有切片为4微米厚连续切片，共231例，行GPD1L及HIF1α蛋白免疫组化检测。GPD1L蛋白的免疫组化一抗采用瑞典Atlas公司的兔多克隆抗体(HPA035284，1:50稀释)；
HIF1α蛋白免疫组化一抗采用美国Novus Biologicals公司的鼠单克隆抗体(NB100-105，
1:200稀释)。其他除非另有说明，否则免疫组织化学实验所有使用的试剂均来自北京中杉金桥生物技术有限公司。

[0051] (4)实验方法

[0052] 石蜡组织标本烤片50-60℃，2-3小时以上；常规脱蜡至水化，二甲苯I、II、III各10分钟，无水乙醇，95％，85％，75％乙醇，各2分钟，水洗2分钟；PBS洗3分钟×3次，3％H2O2作用20分钟以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS洗3分钟×3次；将切片置于pH6.0的柠檬酸缓冲液中，100℃水浴煮沸20分钟，自然冷却至室温；PBS洗3分钟×3次；1％正常马血清封闭，室温孵育1小时；按预定浓度加 一抗，4℃孵育过夜；次日PBS洗3分钟×3次；加入二抗，室温下孵育1小时；PBS洗3分钟×3次；0.04％DAB显色1-5分钟，镜下控制显色；自来水洗，复染(苏木素衬染2分钟，水洗，盐酸酒精分化2秒，水洗分化30分钟)；
脱水，常规树脂封片。

[0053] (5)评分标准

[0054] 所有切片的阳性表达面积(P)采用IPP 6.0软件的手动计数方法评分；染色强度(I)评分为：1(阴性或弱阳性)，2(阳性)及3(强阳性)三级。每张切片评分均采用10个随机高倍视野下至少1000个细胞进行评分，最终评分结果再由2名独立的病理专家进行评估，如对高低表达评判有争议，要经过讨论得出最后结论。最终评分结果取10个视野的评分平均值作为最终结果。GPD1L蛋白表达评分＝P×I×100，并以评分的中位数100作为阈值，将所有患者表达分为低表达(评分<100)和高表达(评分≥100)两组。HIF1α蛋白表达评分参照以往同类研究方法仅计算阳性细胞百分比，以10％细胞核阳性作为阈值将所有患者分为低表达(阳性细胞核<10％)和高表达(阳性细胞核≥10％)。

[0055] (6)统计学分析

[0056] 本发明中，采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。“颈清组”与“验证组”各项临床病理学参数(除发病年龄外)转化为计数资料采用非参数检验分析；两组发病年龄比较采用独立样本t检验。GPD1L与HIF1α蛋白表达与各项临床病理学参数比较及其与淋巴结转移及术后延迟性转移相关性分析均采用卡方检验。对于生存分析，计算无病生存和癌相关生存，单因素分析应用Kaplan-Meier检验进行分析，进而应用多因素生存分析对无病生存和癌相关生存的独立预测因子进行统计分析。

[0057] (7)颈清组检测结果

[0058] 125例入选的颈清组患者的相关原始资料参见表1，各项基线资料与颈部淋巴结转移的相关性分析见表2。

[0059] 表1.用于本发明的125例颈清组患者原始资料

[0060]

[0061]

[0062]

[0063]

[0064]

[0065]

[0066]

[0067] 表2.125例颈清组患者基线资料、GPD1L和HIF1α蛋白表达与颈淋巴结转移[0068]

[0069]

[0070] 颈清组患者颈部治疗结果：

[0071] 125例患者中择区性颈清扫术55例，改良/全颈清扫术46例，双侧择区性颈清扫术13例，单侧全颈/对侧择区性颈清扫术9例，双侧全颈清扫术2例。所有术后病理报告淋巴结阳性患者建议行术后放疗。

[0072] 颈清组患者颈部淋巴结转移相关临床病理学因素分析：

[0073] 125例颈清组患者术后病理证实63例(50.4％)出现颈部淋巴转移，其中pN1：33例，pN2b：25例，pN2c：5例。各项临床病理学参数中T分期与颈部淋巴结转移明显相关，随着T分期的增加，口腔鳞癌患者的颈部淋巴结转移风险明显增加(P＝0.013)。此外，病理分级也与颈部淋巴结转移有一定相关性，随着病理分级的升高，颈部淋巴结转移风险逐渐升高，但差异无统计学意义(P＝0.091)。其他各项因子如年龄、性别、发病部位、生长方式、吸烟及饮酒史等均与颈部淋巴结转移无明显统计学相关性。

[0074] GPD1L及HIF1α蛋白表达与颈部淋巴结转移的相关性分析：

[0075] 125例颈清组患者的石蜡组织切片均进行GPD1L及HIF1α蛋白免疫组化检测，排除其中2例肿瘤组织过少或无肿瘤的切片，最终123例患者完成蛋白表达检测并评分。其中，GPD1L蛋白低表达患者44例，高表达者79例；HIF1α蛋白低表达患者 48例，高表达者75例。HIF1α蛋白表达与颈部淋巴结转移密切相关，HIF1α高表达口腔鳞癌患者颈部淋巴结转移率明显高于低表达患者(58.7％vs.37.5％，P＝0.027)；GPD1L蛋白表达与颈部淋巴结转移有一定相关性，GPD1L低表达患者颈部淋巴结转移率高于高表达者(61.4％vs.44.3％，P＝0.091)。且口腔鳞癌组织标本中GPD1L与HIF1α蛋白表达有呈现负相关的趋势(P＝0.110，见表3)。当采用GPD1L联合HIF1α表达预测颈部淋巴结转移，即对GPD1L与HIF1α呈负相关表达的亚组患者分析后发现，GPD1L低表达/HIF1α高表达患者明显比GPD1L高表达/HIF1α低表达者颈部淋巴结转移率高(71.0％vs.37.1％，P＝0.007)，敏感度为62.9％，特异度为71.0％，具有最强的诊断效率。

[0076] 表3.颈清组中GPD1L与HIF1α蛋白表达的spearman相关性分析

[0077]

[0078] GPD1L及HIF1α蛋白表达与颈清组患者的预后密切相关：

[0079] 截止至随访终点，颈清组125例患者中共有57例(45.6％)死亡，3例患者死于癌不相关因素(其中1例死于心力衰竭，1例死于肺内感染，1例死于不明原因)。通过Kaplan-Meier生存分析发现，GPD1L蛋白表达与颈清组中口腔鳞癌患者无病生存(低表达vs.高表达：25.0％vs.57.0％，P<0.001)和癌相关生存(低表达vs.高表达：45.5％vs.62.5％，P＝0.013)密切相关(图1A，图1B)；同样地，HIF1α蛋白表达与该组患者无病生存(低表达vs.高表达：60.4％vs.36.0％，P＝0.009)及癌相关生存(低表达vs.高表达：70.8％vs.46.7％，P＝0.005)密切相关(图2A，图2B)。当采用GPD1L联合HIF1α表达预测颈清组患者预后，Kaplan-Meier生存分析发现，GPD1L高表达/HIF1α低表达患者明显较GPD1L低表达/HIF1α高表达者获得更好的无病生存(71.4％vs.22.6％，P<0.001)及癌相关生存(80.0％vs.45.2％，P<0.001)，GPD1L和HIF1α表达联合预测效率明显高于两种蛋白单独预测，具有最强的预后价值(图3A，图3B)。

[0080] (8)验证组检测结果

[0081] 106例入选的验证者的相关原始资料参见表4，各项基线资料与颈部淋巴结转移的相关性分析见表5，所有患者均为早期鳞癌(T1-2N0M0)。

[0082] 表4.用于本发明的106例验证组患者原始资料

[0083]

[0084]

[0085]

[0086]

[0087]

[0088] 表5.106例验证组患者基线资料、GPD1L和HIF1α蛋白表达与延迟性颈淋巴结转移

[0089]

[0090]

[0091] 验证组患者颈部治疗结果：

[0092] 原发肿瘤患者颈部采取坐观策略，如出现术后延迟性颈部淋巴结转移，行治疗性颈清扫术，并推荐术后放疗。

[0093] 验证组患者术后延迟性颈部淋巴结转移相关临床病理学因素分析：

[0094] 106例验证组患者中术后发生单纯延迟性颈部淋巴结转移(不包括肿瘤复发伴淋巴结转移)17例(16.0％)。各项临床病理学参数中组织学高危因素(包括神经侵袭、血管内瘤栓、弥漫性浸润)与术后延迟性颈部淋巴结转移密切相关，随着组织学高危因素的出现，早期口腔鳞癌患者的延迟性颈部淋巴结转移风险明显增加(P＝0.043)。此外，病理分级(P＝0.087)和肿瘤生长方式(P＝0.067)也与延迟性颈部淋巴结转移有一定相关性，随着病理分级的升高或肿瘤生长方式趋向浸润性，延迟性颈部淋巴结转移风险逐渐上升，但差异无统计学意义。其他因素如年龄、性别、发病部位、吸烟及饮酒史等均与颈部淋巴结转移无明显相关性。

[0095] GPD1L及HIF1α蛋白表达与延迟性颈部淋巴结转移的相关性分析：

[0096] 106例验证组患者的石蜡组织切片均进行GPD1L及HIF1α蛋白免疫组化检测，排除4例肿瘤组织过少或无肿瘤的切片，最终102例患者完成两种蛋白表达检测并评分。其中，GPD1L蛋白低表达患者53例，高表达49例；HIF1α蛋白低表达患者57例，高表达45例。HIF1α蛋白表达与早期口腔鳞癌延迟性颈部淋巴结转移密切相关，HIF1α高表达患者术后延迟性颈部淋巴结转移率显著高于低表达者(26.7％vs.8.8％，P＝0.030)；GPD1L蛋白表达与早期口腔鳞癌术后延迟性颈部淋巴结转移有一定相关性，GPD1L低表达患者颈部淋巴结转移率高于高表达者(24.5％vs.8.2％，P＝0.051)。 且早期口腔鳞癌组织标本中GPD1L与HIF1α蛋白表达水平呈现明显负相关(correlation coefficient:-0.341，P<0.001，见表6)。当GPD1L联合HIF1α表达预测延迟性颈部淋巴结转移分析发现，GPD1L低表达/HIF1α高表达患者较GPD1L高表达/HIF1α低表达者颈部淋巴结转移率显著升高(31.3％vs.5.6％,P＝0.014)，敏感度为83.3％，特异度为60.7％，具有较高的阳性诊断率。且GPD1L与HIF1α表达联合预测颈部淋巴结转移准确率显著高于两种蛋白单独预测。

[0097] 表6.验证组中GPD1L与HIF1α蛋白表达的spearman相关性分析

[0098]

[0099] 图4为GPD1L与HIF1α蛋白表达典型图片。GPD1L与HIF1α两者表达呈现明显负相关性Correlation coefficient:－0.341，P<0.001，且GPD1L低表达同时HIF1α高表达患者是早期口腔鳞癌颈部淋巴结转移的高危人群。

[0100] GPD1L及HIF1α蛋白表达与早期口腔鳞癌患者预后密切相关：

[0101] 截止至随访终点，验证组106例早期口腔鳞癌患者中共有50例(47.2％)死亡，6例患者死于癌不相关因素(其中4例死于心脑血管疾病，1例死于肺内感染，1例死于自杀)。Kaplan-Meier生存分析发现，GPD1L蛋白表达与早期口腔鳞癌患者无病生存(低表达vs.高表达：32.1％vs.44.9％，P＝0.039)密切相关，进一步的癌相关生存结果表明，尽管GPD1L低表达患者较高表达者有明显的生存下降趋势(52.8％vs.67.2％，P＝0.122)但差异无统计学意义(图5A，图5B)；而HIF1α蛋白表达与该组患者无病生存(低表达vs.高表达：49.1％vs.24.4％，P＝0.001)和总癌相关生存(低表达vs.高表达：70.2％vs.46.7％，P＝0.045)均密切相关(图6A，图6B)。当采用GPD1L联合HIF1α表达预测早期口腔鳞癌患者预后，Kaplan-Meier生存分析发现，GPD1L高表达/HIF1α低表达患者明显较GPD1L低表达/HIF1α高表达者获得更好的无病生存(47.2％vs.18.8％，P＝0.001)及癌相关生存(75.0％vs.46.9％，P＝0.034)，两种蛋白表达协同作用具有最强的预后价值(生存曲线见图7A，图7B)。

[0102] 实施例2、GPD1L和HIF1α蛋白表达的协同作用是预测口腔鳞癌颈部转移的独立预测因子

[0103] 本实施例中，首先将实施例1中两组231例患者资料进行了汇总，应用单因素生存分析筛选与口腔鳞癌患者颈部转移(颈清组同期颈部转移+验证组延迟性颈部转移)相关的因子，备选因子包括年龄、性别、发病部位、T分期、病理分级、烟酒史、淋巴结状态、组织学高危因素、GPD1L与HIF1α表达协同作用。结果表明包括术前T分期(P<0.001)、病理分级(P＝0.001)、饮酒史(P＝0.015)、组织学高危因素(P＝0.009)、生长方式(P＝0.005)和GPD1L与HIF1α蛋白表达的协同作用(P<0.001)在内的6个因素是与颈部淋巴转移相关的因子。

[0104] 进一步，对筛选出的6个因子进行多因素生存分析，分析结果参见表7。

[0105] 表7.Cox比例风险回归模型评价口腔癌患者颈部转移独立预测因子

[0106]

[0107] 表7结果可以表明，上述所筛选出的6个因子中，仅GPD1L与HIF1α蛋白表达协同作用(P＝0.019)能够作为判断口腔鳞癌患者颈部转移的独立预测因子。