体外制备人工牙齿原基的方法和由其获得的人工牙齿原基

摘要

本发明是针对一种体外制备一种人工牙齿原基的方法，包括以下步骤：a)提供多个分离的间充质牙髓细胞；以及b)在多种非贴壁条件下培养这些间充质牙髓细胞以形成代表一种人工牙齿原基的一个细胞聚集体；连同培养至由其衍生的一种人工牙齿原基。

权利要求

1.体外制备一种人工牙齿原基的方法，包括以下步骤：a)提供多个分离的间充质牙髓细胞；以及

b)在多种非贴壁条件下培养这些间充质牙髓细胞以形成代表一种人工牙齿原基的一个细胞聚集体。

2.如权利要求1所述的方法，其中这些间充质牙髓细胞包含或组成为原代成体间充质牙髓细胞。

3.如权利要求1或2中一项所述的方法，其中这些间充质牙髓细胞源自一颗牙齿的牙髓组织。

4.如权利要求1或2中一项所述的方法，其中这些间充质牙髓细胞源自一颗第三磨牙的髓组织。

5.如权利要求1或2中一项所述的方法，其中这些间充质牙髓细胞在每ml5×104到5×7

10个的一种浓度下经受多种非贴壁培养条件。

6.如权利要求1或2中一项所述的方法，其中这些间充质牙髓细胞在多种非贴壁条件下培养至少48小时。

7.如权利要求1或2中一项所述的方法，其中这些间充质牙髓细胞是在多种非贴壁条件下培养，至少直到形成具有0.3mm到2mm的一种平均直径的一个细胞聚集体。

8.如权利要求1或2中一项所述的方法，其中这些间充质牙髓细胞是在多种非贴壁条件下培养，至少直到所形成的该细胞聚集体展现与即将经受多种非贴壁培养条件之前的分离的间充质牙髓细胞相比，BMP4、HGF、PAX9、MSX1、I型胶原蛋白、DSPP和/或原牙质的上调的表达。

9.如权利要求1或2中一项所述的方法，其中在该细胞聚集体的形成中未使用人工生物或非生物支架。

10.如权利要求1或2中一项所述的方法，其中在这些间充质牙髓细胞在多种非贴壁条件下培养至少2天之后，添加多个上皮细胞且在多种非贴壁条件下共培养。

11.如权利要求10所述的方法，其中这些上皮细胞是多个角化细胞。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述多个角化细胞源自皮肤或齿龈。

13.通过如权利要求1到12中一项所述的方法生产的人工牙齿原基。

14.包含如权利要求13所述的人工牙齿原基的移植物。

15.包含如权利要求13所述的人工牙齿原基或如权利要求14所述的移植物以及至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。

16.一种用于体外筛选多种物质的方法，这些物质调节牙齿组织的特性，该方法包括以下步骤：-提供如权利要求13所述的人工牙齿原基或由其衍生的一个细胞聚集体或组织的一个样品；

-将该对应的样品分成多个部分；

-将至少一个部分与待筛选的一种物质一起孵育；以及-将针对这一被处理的部分所测量的多个参数与未与这一待筛选的物质一起孵育的另一部分相比较。

17.如权利要求16所述的方法，其中在将该部分与待筛选的一种物质一起孵育之前，该部分经受一种自含式循环系统。

说明书

体外制备人工牙齿原基的方法和由其获得的人工牙齿原基

背景技术

[0001] 牙科护理是维持健康义齿的最佳方式。然而，即使在最佳牙科护理下，也可发生牙齿的损害、破坏或缺失。所述牙齿的损害、破坏或缺失可能为例如疾病相关的、激素相关的、疗法相关的或意外事件的后果。现今，在此类情况下使用牙科植入体，这些牙科植入体通常由包含金属(例如钛)、陶瓷和/或复合物的材料形成。这些植入技术是高度复杂的且由医学和化妆品观点，已经达到高水平。然而，这些牙齿替换疗法需要一个重要的外科手术，且最终，需要辛苦的随访护理。另外，这些合成植入体无法满足对于牙齿的所有需求，如例如由将牙齿固定于颔骨内的天然牙周韧带“吸收”。

[0002] 因此，在再生医学领域内的一个目的是提供允许生产或诱导在功能和形态方面等于对应的天然存在组织和器官的组织或器官的手段。一种方法是提供可体外和/或体内用于牙齿再生的人工组织或器官。所述人工组织包含已经通过生物技术手段生产的组织。

[0003] 除了提供能够体内形成在功能和形态方面充分等于天然存在牙齿的牙齿的组织的问题以外，另一目标是提供无需胚胎干细胞即可制造且利用源于待治疗的患者的细胞的组织。

[0004] 在众多方法中，已经针对用于这种目的的组织进行首次尝试且取得进展。此类方法的实例描述于EP 1 905 459 A1、EP 2 130 909 A1、US 2007/0231275A1、US 2011/0212414以及WO 2005/051436A2中。然而，在大多数的这些方法中，使用胚胎细胞，这些细胞在非生理学贴壁培养(adherent culture)条件下进行培养且需要合成支架或载体的存在。

[0005] 因此，本发明的一种选择是提供克服现有技术的一种或多种问题的手段。具体来说，本发明的一种选择是提供体外制备人工牙齿原基的改良的方法，该方法可用非胚胎原代细胞来执行。

发明内容

[0006] 本发明涉及一种体外制备人工牙齿原基的方法，包括以下步骤：

[0007] a)提供分离的间充质牙髓细胞；和

[0008] b)在非贴壁条件下培养这些间充质牙髓细胞以形成代表人工牙齿原基的细胞聚集体。

[0009] 已惊讶地发现，分离的间充质牙髓细胞能够形成代表人工牙齿原基的三维细胞聚集体，而不影响胚胎上皮细胞。这种效应是通过在非贴壁条件下培养间充质牙髓细胞来达成的。可能展示，在所述非贴壁培养条件下，这些间充质牙髓细胞自由地彼此安排且凝结成细胞聚集体，该聚集体展现牙胚结构的特异性标志物的表达且因此表示牙齿原基。

[0010] 在下文中，更详细地提供本发明的不同方面。除非清楚地作相反陈述，否则如此定义的各方面可以与任何一个或多个其他方面组合。具体来说，被指示为优选或有利的任何特征均可以与被指示为本发明的一部分或被指示为优选或有利的任何一个或多个其他特征组合。

[0011] 本发明的方法是针对体外人工牙齿原基的制备。人工牙齿原基为已经重新且体外制备且组装的牙齿原基。

[0012] 出于本发明的目的，术语“牙齿原基”是指展现牙齿组织或功能性牙胚所特有的至少一种功能的一种或超过一种细胞类型的功能性细胞聚集体。优选地，本发明的牙齿原基展现牙齿组织或功能性牙胚或牙齿的大多数或基本上所有的器官或组织功能。具体来说，本发明的牙齿原基可以表现得像功能性诱导性牙胚一样且能够体外和/或体内诱导牙齿器官发育或完整牙齿的发育。本发明的牙齿原基的特征可以在于与牙齿组织的发育或分化有关的标志基因或蛋白质的增强的表达。优选地，本发明的牙齿原基的特征可以在于与即将经受非贴壁培养条件之前的分离的间充质牙髓细胞相比，BMP4、HGF、PAX9、MSX1、I型胶原蛋白、DSPP和/或原牙质(predentin)的增强的表达。此外，在聚集体中可能出现基底膜(basement membrane)形成，特征主要在于IV型胶原蛋白表达。聚集体形成和培养条件可能导致所得组织的矿化(mineralization)。

[0013] 本发明的人工牙齿原基是通过本发明的一种方法形成的。该人工牙齿原基可以展现具有实质上球形形状且具有0.3mm到2mm的平均直径，优选地具有0.5mm到1.5mm的平均直径的细胞聚集体。该人工牙齿原基可以包含一个包含由间充质牙髓细胞形成的一个内核和由上皮细胞形成的一个外层的细胞聚集体，而这些上皮细胞可以在稍后时刻在共培养时凹入该内核中。上皮来源的细胞的凹入可能导致这些细胞的成釉细胞分化。这种分化的特征可以在于外观形态(柱状安排)以及在于成釉细胞标志基因或蛋白质(例如BMP7、SHH和/或釉基质(amelogenin))的增强的表达。本发明的人工牙齿原基不含任何人工生物或非生物支架或载体，该支架或载体不是源于所述人工牙齿原基的生产中所用的细胞。本发明的人工牙齿原基优选地由通过本发明的一种方法形成的细胞聚集体组成，其中该方法已经被执行而无需使用任何人工生物或非生物支架或载体，该支架或载体不是源于所述方法中所用的细胞。

[0014] 在本发明的该方法中，使用分离的间充质牙髓细胞。术语“分离的”意思指这些间充质牙髓细胞是已经从一个天然来源或其后代分离的细胞，该后代例如已经通过细胞增殖而得到。所用的这些间充质牙髓细胞优选地从一个供体牙齿或组织的牙髓组织得到。优选地，这些间充质牙髓细胞是尚未转化或永生化的原代细胞。这些细胞的特征可以在于对于CD90、CD73、CD44、CD29和HLAI呈阳性以及对于CD34和CD45呈阴性。它们在2维培养中展现纺锤形状的形态且粘附到塑料。具体来说，这些间充质牙髓细胞可以包含或组成为成体间充质牙髓细胞。所述成体间充质牙髓细胞是从一个供体牙齿或组织的非胚胎牙髓组织得到。这些间充质牙髓细胞可从已经分化成包含牙髓组织的任何供体牙齿或组织的牙髓组织得到。优选地，这些间充质牙髓细胞是从一颗牙齿的牙髓组织，更优选地从一个供体的第三磨牙得到。用于本发明的该方法中的这些间充质牙髓细胞优选地是人类牙髓细胞。人类间充质牙髓细胞是从人类来源的牙髓组织得到。

[0015] 在本发明的该方法中，这些间充质牙髓细胞可在分离后的任何阶段在非贴壁条件下经受培养。然而，如果这些间充质牙髓细胞在贴壁2维单层条件下已经经历至少一些培养，那么细胞聚集体的形成进一步得到增强。优选地，这些间充质牙髓细胞在非贴壁条件下经受培养之前已经在2维单层培养中培养了至少1个传代。细胞聚集体形成的高效率在广谱的传代中得以维持。然而，已经发现如果这些间充质牙髓细胞已经在2维单层培养中培养了至少1个传代且不超过15个传代，那么获得最佳结果。优选地，这些间充质牙髓细胞在分离后在2维单层中培养了至少2个传代且不超过8个传代之后经受非贴壁培养。

[0016] 在本发明的该方法中，在提供分离的间充质牙髓细胞之后，这些间充质牙髓细胞经受非贴壁培养条件以形成细胞聚集体。

[0017] 如果这些间充质牙髓细胞在某一浓度下经受非贴壁培养条件，那么细胞聚集体的形成为尤其有效的。如果该浓度过低，那么细胞仅很少地彼此接触且凝结为细胞聚集体不太有效。另一方面，如果间充质牙髓细胞的该浓度过高，那么细胞不太灵活或可动且因此，细胞聚集体的形成不太有效。优选地，这些间充质牙髓细胞在每ml5×104到5×107个的浓度5 7
下经受非贴壁培养条件。如果这些间充质牙髓细胞在每ml1×10到1×10个，优选地每ml5×105到5×106个且最优选地每ml9×105到1.1×106个的浓度下经受非贴壁培养条件，那么获得甚至更佳结果。

[0018] 在本发明的该方法中，这些分离的间充质牙髓细胞在非贴壁培养条件下进行培养。这意思指间充质牙髓细胞在其中这些细胞不会采用一种扁平、展开形状的条件下进行培养，指示对于培养表面的强烈附着和贴壁。优选地，这些间充质牙髓细胞在播种后立即保持圆形且即使有的话，也仅与培养表面微弱地缔合。用于非贴壁细胞培养的适当手段为本领域中众所周知的。非贴壁培养条件可以包含在具有不支撑这些间充质牙髓细胞的贴壁的一个培养表面的培养容器中培养这些间充质牙髓细胞。例如，可使用具有展现超低细胞附着的培养表面的培养容器。出于这个目的，可以使用具有一个中性或带正电荷的培养表面的培养容器。优选地，该培养表面可以由一层进一步降低这些间充质牙髓细胞和该培养表面的相互作用的一种材料涂布。该培养表面可以由一种亲水性水凝胶覆盖。

[0019] 看起来，在非贴壁培养条件下，这些间充质牙髓细胞相当快速地缔合且凝结成细胞聚集体。在已经24小时的非贴壁细胞培养之后，这些间充质牙髓细胞聚集成一个大的复合物。然而，为了制备代表着具有改进的发育、分化和/或功能的人工牙齿原基的细胞聚集体，有利的是进行非贴壁培养，持续超过24小时的一段时间。在本发明的该方法中，这些间充质牙髓细胞可以在非贴壁条件下培养至少48小时，优选地至少72小时，更优选地至少2周，甚至更优选地至少4周，最优选地至少8周。因此，这些间充质牙髓细胞可以在非贴壁条件下培养48小时到10周，优选地1周到9周，更优选地4周到8周。

[0020] 在本发明的该方法中，这些间充质牙髓细胞优选地在非贴壁条件下培养，至少直到形成展现具有0.3mm到2mm的平均直径，更优选地具有0.5mm到1.5mm的平均直径的一种圆形形状的细胞聚集体。

[0021] 通过本发明的该方法产生的人工牙齿原基的适用性取决于它诱导或提供分化的牙齿组织的能力。因此，优选的是在非贴壁条件下培养这些分离的间充质牙髓细胞，直到所得的细胞聚集体开始展现部分地或完全地分化的牙齿组织的特性和/或功能。分化的进展可通过对应的标志基因、蛋白质或结构的相对表达来监测。优选地，这些分离的间充质牙髓细胞是在非贴壁条件下培养，至少直到所形成的细胞聚集体展现与即将经受非贴壁培养条件之前的分离的间充质牙髓细胞相比，BMP4、HGF、PAX9、MSX1、I型胶原蛋白、DSPP和/或原牙质的上调的表达。优选地，所形成的聚集体展现牙齿发育的所谓的帽状期(cap stage)的关于形态和基因表达的特征。基因的相对表达可容易地通过众所周知的方法，如例如定量或半定量RT-PCR、转录体定序(RNA-seq)或RNA印迹法(Northern blotting)来测定。蛋白质的相对表达也可通过众所周知的方法，如例如蛋白质印迹法(Western blotting)、悬浮点阵技术(Suspension Array Technology)和ELISA技术来测定。蛋白质的差异表达的定位可通过原位杂交和/或免疫组织化学来测定。

[0022] 大多数的现有技术的方法所遇到的缺点之一是在这些方法中，需要人工生物或非生物支架或载体的存在，细胞在其上或其内进行培养以形成牙齿原基或牙胚。如果一个生物或非生物支架或载体是从外部添加或提供且不是通过在细胞聚集体形成期间本发明的该方法中所用的细胞形成，那么所述支架或载体被视为人工的。在本发明的该方法中，此类人工生物或非生物支架或载体的使用或存在是不需要的。本发明的该方法生成根据本发明的人工牙齿原基，而不使用任何所述人工生物或非生物支架或载体，该支架或载体不是源于所述人工牙齿原基的生产中所用的细胞。在一个优选的实施例中，执行本发明的该方法，使得在细胞聚集体的形成中不使用人工生物或非生物支架。

[0023] 本发明的该方法是尤其有利的，因为本发明的人工牙齿原基可从单一细胞类型开始，也就是说从分离的间充质牙髓细胞开始来生产。然而，如果该方法进一步包括共培养预凝结的间充质牙髓细胞与上皮细胞的步骤，那么即使更复杂的人工牙齿原基的产生也可实现。该共培养优选地在非贴壁培养条件下执行。看起来尤其有利的是在非贴壁条件下培养这些分离的间充质牙髓细胞持续至少48小时以形成预聚集的间充质牙髓细胞，接着添加上皮细胞，以及在非贴壁条件下共培养预聚集的间充质牙髓细胞和上皮细胞的混合物。可以执行共培养，持续以上关于分离的间充质牙髓细胞的非贴壁培养所定义和提出的时间段。

[0024] 优选地，本发明的该方法中所用的上皮细胞是原代上皮细胞，尤其优选的人类原代上皮细胞。这些原代上皮细胞可以从成体或非胚胎组织，如例如皮肤组织或齿龈组织获得。在一个优选的实施例中，这些上皮细胞是角化细胞，例如人类角化细胞，更优选地是从非胚胎组织，如例如皮肤或齿龈获得的原代角化细胞。尤其优选的是从齿龈，例如从非胚胎齿龈获得的人类角化细胞。

[0025] 在具有该共培养步骤的本发明的该方法中，添加这些上皮细胞用于共培养，使得最初用于形成预聚集的间充质牙髓细胞的间充质牙髓细胞的数目等于或高于上皮细胞的数目。优选地，上皮细胞以关于间充质牙髓细胞的初始细胞数目为1:1到1:10的相对量，优选地以1:2到1:8的相对量，更优选地以1:3到1:5的相对量添加用于共培养。

[0026] 具有该共培养步骤的本发明的该方法生成本发明的人工牙齿原基，其中形成该牙齿原基的早期细胞聚集体包含由聚集的间充质牙髓细胞形成的一个核和由这些上皮细胞形成的一个外层。该长期培养的聚集体可以展现这些上皮细胞凹入间充质细胞的内核中。

[0027] 在本发明的该方法中，这些间充质牙髓细胞在贴壁或非贴壁条件下与标准培养基一起培养。在非贴壁条件下诱导适当细胞聚集并不必需专门的培养基。熟练人员充分了解适合的培养基。典型地，标准DMEM是与某一含量的胎牛血清(FCS)一起使用，优选地FCS以5％到15％的浓度，更优选地以10％FCS的浓度存在。如果在非贴壁条件下共培养预聚集的间充质牙髓细胞和上皮细胞，那么培养基可以包含某一量的通常用于在贴壁条件下培养这些上皮细胞的培养基。

[0028] 本发明还针对一种移植物，其包含或组成为本发明的人工牙齿原基或由其获得的组织或结构。

[0029] 在本发明的另一方面中，提供一种药物组合物，其包含本发明的人工牙齿原基、由其获得的组织或结构或本发明的移植物以及至少一种药学上可接受的赋形剂。

[0030] 本发明的人工牙齿原基、本发明的移植物或本发明的药物组合物可以用于治疗牙齿损害和/或破坏或牙齿缺失。

[0031] 由于本发明的该方法与从非胚胎来源获得的分离的间充质牙髓细胞合作，该方法允许由从一个特定供体或患者获得的细胞开始来生产人工牙齿原基。因此，有可能提供已经从待用本发明的该人工牙齿原基、药物组合物或移植物治疗的人的细胞获得的人工牙齿原基。因此，看来有可能提供主要地、实质上或完全地从一个移植物的接受者本身的细胞获得的移植物，使得排斥反应将降低到最低或将完全不存在。

[0032] 本发明的该人工牙齿原基可以用于牙齿组织或整个牙齿的体外产生。

[0033] 本发明的人工牙齿原基、本发明的移植物或本发明的药物组合物可以用作可体外和体内使用的一种研究工具。

[0034] 本发明的人工牙齿原基、本发明的移植物或本发明的药物组合物可以用于体外或体内筛选多种物质的一种方法中，这些物质调节牙齿组织的特性。

[0035] 本发明另外提出一种体外筛选多种物质的方法，这些物质调节牙齿组织的特性，该方法包括以下步骤：

[0036] -提供本发明的人工牙齿原基或通过本发明的一种方法制备的细胞聚集体或由其得到的组织的一个样品；

[0037] -将对应的样品分成多个部分；

[0038] -将至少一个部分与待筛选的一种物质一起孵育；以及

[0039] -将关于该被处理的部分所测量的参数与未与该待筛选的物质一起孵育的另一部分相比较。

[0040] 在一个优选的实施例中，在将该部分与待筛选的一种物质一起孵育之前，该部分经受一种自含式循环系统。

[0041] 简单地说，本发明方法使得有可能鉴别和分析多种物质，这些物质经由本发明的人工牙齿原基对牙齿或牙齿组织施加影响。该样品应理解为包含某一数目的根据本发明的产品受试者，将其分成多个部分。提供至少两个子集；一个用于筛选，而另一个用作阴性对照。优选地，筛选部分的数目超过对照部分的数目。通常，多个部分经受高通过量筛选。在本发明方法中待筛选的物质不受任何限制。在本发明的一个实施例中，这些物质选自下组，即核酸(包括RNAi)、核糖酶、适体、抗体、肽、碳水化合物、聚合物、具有在50与1.000Da之间的分子量的小分子、以及蛋白质，优选地抗体、细胞因子以及脂质运载蛋白(lipocalin)。这些物质经常可在库中获得。优选的是孵育在该样品的一个不同部分内的一种单一化合物。然而，也有可能通过孵育在一个部分内的至少两种物质来研究多种物质的协同效应。受试者的另一子集在这些物质不存在下同时地进行孵育。该孵育过程取决于不同参数，例如细胞类型和检测敏感性，它们的优化遵循本领域的普通技术人员已知的常规程序。在本发明的含义中有效物质的鉴别优选地间接地执行，例如通过测定发生改变的表达模式和/或细胞活力。该测定可以在一个规定的时刻执行且与在实验开始时的信号强度和阴性对照有关。适合的测试为本领域的普通技术人员已知或可容易地按常规来设计。

[0042] 由于本发明的人工牙齿原基可被视为一个器官或者一个器官或其部分的一个前体，可能尤其有利的是使用一种测试系统，其中该人工牙齿原基可在模拟天然灌注的条件下被制备和/或培养一段延长的时间。看来尤其适合在基于具有申请号EP 10 008 244的欧洲专利申请中或具有公开号WO 2009/146911A2的PCT申请中所述的自含式芯片上的器官(organ-on-a-chip)装置的一种检验系统中组合本发明的该方法和/或本发明的人工牙齿原基。

[0043] 本发明首次提供一种人工牙齿原基和一种生产它的方法，其特征在于缺乏对于任何人工生物或非生物支架或载体的需求，该人工牙齿原基是从成体细胞生产的，使得不需要胚胎细胞或组织且该人工牙齿原基仅需要一种细胞类型的细胞，也就是说分离的间充质牙髓细胞，或两种细胞类型的细胞，也就是说分离的间充质牙髓细胞和角化细胞。

[0044] 本发明的人工牙齿原基代表能够用于体外和体内牙齿器官发育的一种功能性诱导性牙胚。所得的牙齿器官的特征在于通常形成发育的牙齿的一部分的多个结构的可证实的存在，这些结构按一颗牙齿的生理学顺序被安排：

[0045] -釉质，即成釉细胞；

[0046] -牙质；

[0047] -牙髓，包括成牙质细胞和未分化的牙髓细胞；

[0048] -牙骨质，即成牙骨质细胞；

[0049] -牙周；以及

[0050] -牙槽骨。

附图说明

[0051] 图1展示人类间充质牙髓细胞的三维低附着培养；比例尺：500μm。

[0052] 图2展示与角化细胞共培养的人类牙髓细胞；比例尺：500μm。给定的时间点指示添加角化细胞后的小时数。

[0053] 图3展示由本发明方法描述的原基的自组装细胞类型区室化；比例尺：A：100μm，B、C：500μm，D:300μm。给定的时间点指示添加角化细胞后的时间。

[0054] 图4展示细胞内和细胞外分子的表达以表征所构建的牙齿原基。

具体实施方式

[0055] 一般方法

[0056] 间充质牙髓细胞分离

[0057] 牙髓细胞分离是根据来自格罗恩索斯(Gronthos)等人(一种分离且培养扩增人类牙髓干细胞的方法(A method to isolate and culture expand human dental pulp stem cells).分子生物学方法(Methods Mol Biol).2011；698:107-21)的一种经过修改的方案来执行。

[0058] 1将在知情同意后从患者拔出的多颗第三磨牙收集到含有10％FCS和青霉素以及链霉素(各为100μg/ml)的DMEM中且储存在4℃下持续不超过24小时。

[0059] 2在细胞提取的整个程序中在无菌条件下处置这些活检。齿冠和根部(如果存在的话)用100％乙醇擦拭。为了打开髓腔，通过机械裂化用一个锤子使牙齿裂开。

[0060] 3用镊子移除髓组织且放置在一个含有PBS的皮氏培养皿中。

[0061] 4接着将该组织切割成小片段，这些片段接着用PBS洗涤两次以移除碎片和血液。

[0062] 5然后，在37℃下用胶原酶(3mg/ml)/分散酶II(4mg/ml)的酶混合物执行消化步骤，持续2小时。

[0063] 6该经过消化的溶液通过一个70μm细胞过滤器来过滤且通过离心(400xg，持续5分钟)用PBS洗涤两次。将剩余的细胞球粒再悬浮于DMEM w/10％FCS和青霉素以及链霉素(各为100μg/ml)中。

[0064] 细胞培养

[0065] 间充质牙髓细胞的培养和扩增是通过在标准培养条件(5％CO2，37℃)下将单层培养中的细胞维持在培养烧瓶表面上用于DMEM w/10％FCS和青霉素以及链霉素(各为100μg/ml)中的贴壁细胞来达成。使贴壁的成纤维细胞样间充质细胞生长到90％汇合并且然后传代。

[0066] 用于形成人工牙齿原基的聚集/凝结过程

[0067] 对于在非贴壁条件下的培养，约第2代到第8代的间充质牙髓细胞在使用之前两天进行传代，收获且再悬浮于DMEM+10％FCS中以在单一细胞悬浮液中生成每ml106个细胞。将该细胞悬浮液(每个孔1ml)给予24孔低附着板(超低丛集板(Ultra Low Cluster Plate)，康宁(Corning)，德国(Germany))。与标准组织培养皿的带负电荷的亲水性表面形成对比，超低附着板具有一个中性、亲水性水凝胶涂布的表面，该表面极大地最小化附着蛋白质的结合。通过使用这种专门的培养皿，这些间充质牙髓细胞不会像在微团培养(micromass culture)中通过细胞粘附沉降。2维单层培养物的形成被阻止且这些细胞在维持非贴壁条件的这种悬浮培养中保持一种圆形形状。此外，与依赖于一种外部支架或载体的多种方法形成对比，该低附着培养系统提供了在一个初始凝结过程期间自由细胞移动和细胞细胞相互作用的机会。凝结过程在播种后不久开始且用肉眼观察形成聚集体的细胞。为了确保恒定培养条件，每3天定期地更换培养基。

[0068] 共培养

[0069] 如果打算共培养间充质牙髓细胞和上皮来源的细胞(皮肤来源的或齿龈角化细胞)，那么由以上方法描述的所生产的凝结物在第2到5天被转移到适合用于两种细胞类型(例如标准DMEM(w/FCS)和角化细胞培养基；1:1)的一种复合培养基中。添加关于用于间充质凝结的初始细胞数目呈1:4比率的上皮细胞的单一细胞悬浮液且在非贴壁条件下培养所得混合物。为了确保恒定培养条件，每3天定期地更换培养基。

[0070] 结果

[0071] 为了扩增用于体外制备人工牙齿原基的人类牙髓细胞(hDPC)，在单层中培养这些分离的细胞，持续至少2个传代。如所述，细胞采用一种成纤维细胞形态且表达MSC表面标志物(CD90、CD73、CD44、CD29以及HLA I(数据未示出)。为了实现细胞安排和分化的诱导，以一种三维方式培养hDPC。上述低附着培养技术的想法是避免细胞附着到培养皿表面且允许由细胞运动性介导的自组织。因此，将人类间充质牙髓细胞(hDPC)在具有10％FCS的正常DMEM中以1×106个细胞/ml的密度播种于低附着培养板中且在标准细胞培养条件下进行培养。牙髓细胞彼此自由地安排且凝结成三维细胞聚集体。凝结在播种后快速地开始。在已经4小时之后，大多数的细胞缔合形成细胞聚集体。在播种后的24小时内，细胞进一步聚集成凝结物(图1)。这个细胞聚集体在一段延长的时期内保持活力且进一步发育且分化成具有0.3mm的平均直径的本发明的人工牙齿原基。

[0072] 为了分析这些凝结的间充质是否能够与人类齿龈角化细胞相互作用且分析是否可通过这些凝结物诱导成釉细胞分化，将hDPC凝结物和角化细胞在该三维低附着系统中共培养。此处，从齿龈分离的原代人类角化细胞以关于用于间充质凝结成48小时大的间充质hDPC聚集体的初始细胞数目呈1:4比率的上皮细胞的单一细胞悬浮液形式添加。所得混合物接着在非贴壁条件下进行培养。角化细胞安排在三维间充质聚集体周围。这些齿龈角化细胞被吸引且快速地组装在凝结物周围(图2)。

[0073] 在牙齿发育期间，观察到间充质与上皮组织之间的强烈相互作用，导致增殖和凹入。为了追踪由本发明所述的培养方法诱导的这两种细胞类型之间的相互影响，用荧光标6
记所用的细胞。组成性表达eGFP的hDPC以1×10个细胞/ml的密度播种于低附着培养板中且如上文所述培养24小时。然后，用CellTrackerTMRed CMTPX(分子探针 (Molecular))追踪的原代人类角化细胞以关于用于间充质凝结的初始细胞数目呈1:4比率的上皮细胞的单一细胞悬浮液形式添加且在非贴壁条件下培养所得混合物。三天后，角化细胞被附着到间充质聚集体的表面(图3A)。四周的共培养导致该自组装凝结物内的完全“交织”结构。在这一时间点，通过荧光显微法可在所构建的类器官内的一层hDPC的下面检测到角化细胞(图3B)。这一观察结果进一步由冷冻切片(8μm厚度)的荧光显微分析证实(图3C)。
组合的苏木精/曙红染色进一步说明了该人工牙齿原基的结构区室化(图3D)。归因于酸性蛋白质(例如细胞角蛋白15和18)的表达而清楚地呈现粉红色的角化细胞凹入该三维凝结物的一个位点处。连接这些凹入的细胞与周围上皮的上皮组织的条带类似于牙齿发育期间的牙板。该间充质由一个结缔组织样的层清楚地从外部上皮分离且完全地围绕该凹入的结构。

[0074] 由本发明的该方法制备的人工牙齿原基在8周培养后经受全面免疫组织分析。所构建的类器官关于细胞内和细胞外分子的表达进行表征。对于对应的蛋白质的检测，针对波形蛋白(Vimentin)、细胞角蛋白15、I型胶原蛋白、IV型胶原蛋白以及Ki67使用一次抗体。将二次抗体与Alexa 594(红色)偶合，用于在荧光显微镜下检测(图4)。所有切片均用Hoechst33258(蓝色)复染。波形蛋白(图4A/A’)和细胞角蛋白15(图4B)清楚地分别标志间充质和上皮的区域。I型胶原蛋白(图4C)仅在该聚集体的间充质部分中作为细胞外基质的一部分表达。注意I型胶原蛋白是牙质的一种主要组分。IV型胶原蛋白(图4D)在模拟一个基底层的这两种细胞类型的界面处高度表达。增殖活性仅在上皮细胞层中检测到，如由Ki67的存在所指示(图4E)。注意凹入的上皮的柱状安排(图4A’；参见箭头)。体内的内部釉质上皮也在帽状期过程中安排在一个柱状层中且接着引起前成釉细胞和成釉细胞。