扩张型心肌病斑马鱼疾病模型的建立与应用

摘要

本发明涉及扩张型心肌病斑马鱼疾病模型的建立与应用。首次构建了一种模拟人类扩张型先天性心肌病(Congenital Dilated CardioMyopathy，CDCM)的疾病模型，所述的疾病模型可作为筛药模型，应用于筛选可改善CDCM所致心力衰竭症状药物。本发明的方法是一种经济快捷的高内涵筛选方法，得到的化合物具较高的特异性和成药性。

权利要求

1. 一种筛选治疗扩张型心肌病或心力衰竭的潜在药物的方法，其特征在于，所述方法 包括： (1) 提供斑马鱼titin-/-突变型胚胎； (2) 按照受精后时间计算，从受精后20±2小时开始用候选药物处理（1)的胚胎； (3) 至胚胎受精后32±2小时，48±2小时，分别观测斑马鱼胚胎的表型； 其中，若胚胎受精后48±2小时心脏博动频率显著增加，则所述的候选药物是治疗扩张 型心肌病或心力衰竭的潜在药物;或 若胚胎受精后32±2小时，心包肿大程度显著缓解，心脏早期舒张、收缩能力显著加强 或心脏缩小程度降低或血液循环显著改善，则所述的候选药物是治疗扩张型心肌病或心力 衰竭的潜在药物。

2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤⑵包括:在测试组中，从受精后20±2小 时开始用候选药物处理(1)的胚胎;和/或 步骤(3)包括:观测斑马鱼胚胎的表型，并与对照组比较，其中所述的对照组是不用所 述候选药物处理的、同步发育的斑马鱼titin-/-突变型胚胎； 若与对照组相比，测试组胚胎受精后48±2小时心脏博动频率显著增加，则所述的候选 药物是治疗扩张型心肌病或心力衰竭的潜在药物;或 若与对照组相比，测试组胚胎受精后32 ±2小时，心包肿大程度显著缓解，心脏早期舒 张、收缩能力显著加强或心脏缩小程度降低或血液循环显著改善，则所述的候选药物是治 疗扩张型心肌病或心力衰竭的潜在药物。

3. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的心脏博动频率显著增加是:与对照 组相比，测试组胚胎心脏的博动次数显著增加;或 所述的心包肿大程度显著缓解是：与对照组相比，测试组胚胎心外膜扩大程度显著降 低;或 所述的血液循环显著改善是:与对照组相比，测试组胚胎有血液循环。

4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述测试组胚胎心脏的博动次数显著增加是 增加至每分钟高于140次。

5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述测试组胚胎心脏的博动次数显著增加是 增加至每分钟高于150次。

6. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的候选药物包括:小分子化合物、肽。

7. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述对照组仅包括候选药物的溶剂。

8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的溶剂是DMSO。

9. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，还设置阳性药对照组，所述的阳性药对照为 地高辛。

10. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括:对获得的潜在药物 进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选药物中进一步选择和确定对于治疗扩张 型心肌病或心力衰竭有用的物质。

11. 筛选模型的用途，用于筛选治疗扩张型心肌病或心力衰竭的潜在药物；其中，所述 的筛选模型是斑马鱼titin-/-突变型胚胎，其是由斑马鱼titin+/_突变型杂合子交配产生 的后代。

说明书

扩张型心肌病斑马鱼疾病模型的建立与应用

技术领域

[0001] 本发明属于医药技术领域，更具体地，本发明涉及一种肌小节缺陷致扩张型心肌 病的斑马鱼模型的建立及其应用。

背景技术

[0002] 扩张型先天性心肌病（Congenital Dilated CardioMyopathy，CDCM)是一类主要 的先天心肌病，临床表现为左心室或者双侧心室扩张，伴随正性肌力下降。儿童预后五年内 致死率达80%，幸存者也会患有后遗疾病或需心脏移植。成人中先天性基因变异所致DCM外 显率在40岁后达95%，死亡率仍然很高（发病后平均存活时间男性1.7年，女性3.2年），其致 残致畸率在各种疾病及综合征内也居于首位。

[0003] 心肌细胞肌小节缺陷是⑶CM主要的发病原因之一。Titin(TTN)是组装肌小节和纹 状肌的必要蛋白，提供正性肌力，调节收缩压。TTN蛋白是人类蛋白组中最大的一个，它含有 大约33，000个氨基酸，是含量第三大的纹状肌蛋白。生理状态下，两个TTN分子结合形成大 约2μπι宽的肌小节，锚定于Z-Iine和M-lin e<32012年发表于新英格兰医学杂志的研究报道了 在312例扩张型心肌病(Dilated CardioMyopathy，DCM)中发现72例发生TTN突变，并显示 TTN截短型突变是遗传性DCM极其重要的病因，其在家族性扩张型心肌病家族发病率约占 25%，散发病例约为18%。TTN基因在转录过程中可以进行可变剪切，产生不同的转录本，其中 含有N2B结构域的转录本是在心肌细胞中特异表达的，可见N2B结构域在心肌的正常发育和 病理发生发挥一定的作用。明确TTN功能变异有助于提高对DCM病理生理认识，从而帮助DCM 患者能够得到早期诊断、干预和治疗。

[0004] 目前，对于DCM的病理和治疗研究由于缺乏合适的动物模型而进展缓慢。尽管国际 上有部分用于心衰研究的小鼠模型，但主要集中于beta-肾上腺素受体活性调控方面，无法 模拟先天性心肌肌力缺陷这一主要心肌病的表征。

[0005] 因此，本领域亟待开发一种用于DCM研究的动物模型，以便深入探讨新的治疗方 案，在一定程度上替代心脏移植或提高预后生存率。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供扩张型心肌病斑马鱼疾病模型的建立与应用。

[0007] 在本发明的第一方面，提供一种筛选治疗扩张型心肌病或心力衰竭的潜在药物的 方法，所述方法包括：

[0008] (1)提供斑马鱼titin-/-突变型胚胎；

[0009] (2)按照受精后时间计算，从受精后20±2小时开始用候选药物处理（1)的胚胎； [0010] ⑶至胚胎受精后32±2小时，48±2小时，分别观测斑马鱼胚胎的表型；

[0011]其中，若胚胎受精后48±2小时心脏博动频率显著增加，则所述的候选药物是治疗 扩张型心肌病或心力衰竭的潜在药物;或

[0012]若胚胎受精后32±2小时，心包肿大程度显著缓解，心脏早期舒张、收缩能力显著 加强或心脏缩小程度降低或血液循环显著改善，则所述的候选药物是治疗扩张型心肌病或 心力衰竭的潜在药物。

[0013]在一个优选例中，所述的方法中，步骤⑵包括:在测试组中，从受精后20±2小时 开始用候选药物处理（1)的胚胎;和/或

[0014] 步骤(3)包括:观测斑马鱼胚胎的表型，并与对照组比较，其中所述的对照组是不 用所述候选药物处理的、同步发育的斑马鱼titin-/-突变型胚胎；

[0015] 若与对照组相比，测试组胚胎受精后48±2小时心脏博动频率显著增加，则所述的 候选药物是治疗扩张型心肌病或心力衰竭的潜在药物;或

[0016] 若与对照组相比，测试组胚胎受精后32±2小时，心包肿大程度显著缓解，心脏早 期舒张、收缩能力显著加强或心脏缩小程度降低或血液循环显著改善，则所述的候选药物 是治疗扩张型心肌病或心力衰竭的潜在药物。

[0017] 在另一优选例中，所述的心脏博动频率显著增加是:与对照组相比，测试组胚胎心 脏的博动次数显著增加，如增加至每分钟高于140次;较佳地高于150次;或

[0018] 所述的心包肿大程度显著缓解是：与对照组相比，测试组胚胎心外膜扩大程度显 著降低;或

[0019] 所述的血液循环显著改善是:与对照组相比，测试组胚胎有血液循环。

[0020] 在另一优选例中，所述的候选药物包括(但不限于）：小分子化合物、肽。

[0021] 在另一优选例中，所述对照组仅包括候选药物的溶剂；较佳地，所述的溶剂是 DMS0;和/或还设置阳性药对照组;较佳地，所述的阳性药对照为药物Digitoxin。

[0022] 在另一优选例中，所述的方法还包括:对获得的潜在药物进行进一步的细胞实验 和/或动物试验，以从候选药物中进一步选择和确定对于治疗扩张型心肌病或心力衰竭有 用的物质。

[0023] 在另一优选例中，所述的扩张型心肌病是扩张型先天性心肌病。

[0024] 在本发明的另一方面，提供一种用于筛选治疗扩张型心肌病或心力衰竭的潜在药 物的筛选模型，所述的筛选模型是斑马鱼titin-/-突变型胚胎，其是由斑马鱼titin+/-突 变型杂合子交配产生的后代。

[0025] 在本发明的另一方面，提供所述的筛选模型的用途，用于筛选治疗扩张型心肌病 或心力衰竭的潜在药物。

[0026] 在本发明的另一方面，提供化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗扩张型心肌 病或心力衰竭的药物组合物中的用途，所述化合物选自：

[0027]

[0028] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。

附图说明

[0029] 图l、titin-/_斑马鱼缺陷模型。

[0030] A、模型斑马鱼的遗传学特征。位于9号染色体的titina基因 NB2结构域为终止密码 子(T-〉A)截短型titin-/-基因突变。

[0031] B、野生型(Wild-type)和基因突变鱼的表型(A:心房，V:心室）。

[0032] 图2、心脏搏动节律检测。对心脏每分钟内的搏动次数计数，titin-/-突变模型自 48hpf后心跳次数明显降低。MU表示纯合突变型;WT表示野生型。

[0033] 图3、药物筛选策略。96孔板内加入相应的胚胎及含有药物的E3胚胎培养液进行药 物处理，从斑马鱼胚胎受精后10小时开始处理，一直到胚胎受精后32小时，然后光镜下观察 斑马鱼胚胎的表型。

[0034]图4、以心脏搏动频率为检测指标的化合物效应判定。DMSO C为正常对照，DMSO M 为阴性对照，Digitoxin(地高辛)为阳性对照。心跳频率恢复至150次以上的化合物Al、6、7 为候选化合物。

具体实施方式

[0035]本发明人经过深入的研究，基于TTN基因截短型的突变斑马鱼系，首次构建了一种 模拟人类扩张型先天性心肌病(Congenital Dilated CardioMyopathy，Q)CM)的疾病模型， 所述的疾病模型可作为筛药模型，应用于筛选可改善CDCM所致心力衰竭症状药物。本发明 的方法是一种经济快捷的高内涵筛选方法，得到的化合物具较高的特异性和成药性。

[0036]如本文所用，所述的"显著"是指在发生统计学上的变化。如"显著增加"，是指增加 20%或更多；"显著缓解"是指疾病严重程度显著降低20%或以上，以此类推。

[0037] 本发明提供一种肌小节缺陷致扩张型心肌病的斑马鱼模型。使用titin基因突变 株，确认缺陷为ttn蛋白截短型功能缺失。杂合型突变体已可通过Sanger Institute购买。 一对titin突变杂合子雌雄成鱼在一周内将产生100个DCM后代(一对鱼一周内产400个胚胎 计，25%后代发病）。这些胚胎将被用于疾病表型分析。

[0038] 本发明人经过反复实验，针对斑马鱼胚胎发育的特点，总结了疾病模型的各项检 测指标：

[0039] (1)心脏搏动节律检测指标:对心脏在每分钟内的搏动次数进行计数（图3 )，通过 时间延续性研究，48受精后小时(hpf)时为最优检测时相。正常搏动次数约为170次/分，模 型搏动次数约为140次/分。

[0040] (2)心脏形态学检测指标:32hpf时较易观察心脏表型，包括心外膜扩大，心脏早期 舒张，收缩无力。72hpf时心脏较正常小，可能凋亡引起心肌细胞丢失所致。

[0041] (3)血循环检测指标:成功的模型胚胎于32hpf起无血液循环，可见红细胞堆积。

[0042] 在获得了本发明的筛药模型后，可以应用该模型来筛选治疗扩张型心肌病或心力 衰竭的潜在治疗药物。

[0043] 因此，本发明提供一种筛选治疗扩张型心肌病或心力衰竭的潜在物质的方法，所 述的方法包括：（1)提供斑马鱼titin-/-突变型胚胎；（2)按照受精后时间计算，从受精后20 ±2小时开始用候选药物处理（1)的胚胎；（3)至胚胎受精后32±2小时，48±2小时，分别观 测斑马鱼胚胎的表型；

[0044]其中，若胚胎受精后48±2小时心脏博动频率显著增加，则所述的候选药物是治疗 扩张型心肌病或心力衰竭的潜在药物；

[0045] 若胚胎受精后32±2小时，心包肿大程度显著缓解，心脏早期舒张、收缩能力显著 加强或心脏缩小程度降低或血液循环显著改善，则所述的候选药物是治疗扩张型心肌病或 心力衰竭的潜在药物。

[0046] 在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到疾病状况的变化，还可 设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选药物的疾病模型。

[0047] 作为本发明的优选方式，所述的方法还包括:对获得的潜在物质进行进一步的细 胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于治疗扩张型心肌病或心力衰竭真正有用 的物质。

[0048] 另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的治疗扩张型心肌病或心力衰 竭的潜在药物。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选 出能够对于治疗扩张型心肌病或心力衰竭有用的物质。

[0049] 作为本发明的优选实施例，使用本发明的筛选模型的筛选方法如下：

[0050] 1)选择药物库中各类结构的小分子化合物，用DMSO作为溶剂，配成0.5mM的储存 液;在表型筛选时，将每种化合物用胚胎培养液稀释成5μΜ;其中对照使用DMSO为空白对照， Digitoxin为阳性对照药。

[0051] 2)ttn突变的杂合子(ttn+/_)交配产生的后代，其中有1/4的后代有突变表型，将 已发育至23-somite纯合突变产生的后代胚胎，10个/孔加入到96孔板中。然后在每个96孔 板中加入相应的含有药物的E3胚胎培养液进行药物处理。

[0052] 3)至胚胎受精后32hpf，在光镜下观测模型检测指标的改善情况，48hpf计数心脏 节律，判断小分子化学物是否可作为药物先导化合物。

[0053] 4)化合物毒性判断:检查胚胎的整体形态及对应时相的体节数目，观察分析化合 物的发育毒性，记录以备分析效应毒理学指标。

[0054] 本发明提供了一些化合物或其药学上可接受的盐的用途，用于制备治疗扩张型心 肌病或心力衰竭的药物组合物;所述化合物选自：

[0055]

[0056] 所述化合物或其药学上可接受的盐及其组合物可通过口服以及静脉内、肌内或皮 下等途径给药;优选的是口服给药，只要适合活性成分的特性和所需的特定给药方式均可 应用。在制备药物组合物中通常使用的佐剂也可有利地被包括，例如调味剂、色素、防腐剂 和抗氧化剂如维生素 E、维生素 C、BHT和BHA。

[0057] 本发明的化合物的有效剂量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化。 然而，通常当本发明的化合物每天以约l-300mg/kg动物体重的剂量给予时，能得到令人满 意的效果，较佳地每天以1-3次分开的剂量给予，或以缓释形式给药。对大部分大型哺乳动 物而言，每天的总剂量约为5-1000mg，较佳地约为10-500mg。适用于内服的剂量形式，包含 与固态或液态药学上可接受的载体密切混合的约l_200mg的活性化合物。可调节此剂量方 案以提供最佳治疗应答。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或 将剂量按比例地减少。

[0058] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或 按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

[0059] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述 的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

[0060] 实施例1、用于筛选的检测指标确定

[0061] 本发明制备了一个类似人类扩张型心肌病的斑马鱼突变株，即titin基因突变株， 确认缺陷为ttn蛋白截短型功能缺失（图IA-Bhtitin突变杂合子可购自Sanger Institute。一对titin突变杂合子雌雄成鱼在一周内将产生100个DCM后代(一对鱼一周内 产400个胚胎计，25%后代发病）。

[0062] 通过测序技术鉴定，确认titina基因的N2B结构域上有一个TAT-TAA的碱基改变， 产生了终止密码子，使titina蛋白的翻译提前终止，这个突变株的突变类型为截短型titin 突变。突变株形态学表型为心包肿大，心脏收缩力下降，没有血液循环。

[0063]将上述titin突变杂合子鱼和Tg(flkl: :EGFP)的血管内皮细胞被绿色荧光标记的 转基因鱼（购自国际斑马鱼资源中心）交配，观察后代血管发育。发现突变后的血管形态发 生完全正常，证明血管发育并非为检测指标。心脏先扩张性舒张(32hpf)，随着时间推移，伴 随各种心脏发育的缺陷凋亡，在60hpf时心脏已经开始萎缩。而心脏搏动频率自48hpf后显 著放缓，搏动次数低于每分针140次。

[0064] 对各表型进行观察记录、总结比较后，结合人类扩张型心肌病的临床表征，本发明 人选择了 3类表型作为检测指标，包括：

[0065] 1)心脏搏动节律检测指标:对心脏在每分钟内的搏动次数进行计数（图3 )，通过时 间延续性研究，48hpf时为最优检测时相（图2)。心脏搏动频率自48hpf后显著放缓，搏动次 数低于每分钟140次。

[0066] 2)心脏形态学检测指标：32hpf时较易观察心脏表型，包括心外膜扩大（心包肿 大），心脏早期舒张，收缩无力。3天后，可观察到纯合突变胚胎的心脏较正常小。

[0067] 3)血循环检测指标:模型胚胎于32hpf起无血液循环，可见红细胞堆积于卵黄囊 上。

[0068]实施例2、药物筛选方法

[0069] 本发明提供的筛选治疗DCM的小分子化合物的方法，采用模式生物肌小节缺陷斑 马鱼，具体步骤如下：

[0070] 1.药物筛选库的选择及配制

[0071] 应用于筛选的化合物，包括640种已被FDA批准过可用于临床的小分子药物，1，057 种Tocris公司的小分子抑制剂库，1,200种Prestwick公司的具有结构和活性多样性的化合 物库。每种小分子化合物均配制成〇. 5mM的储存液，溶剂为DMS0。本实施例化合物库中所选 择的浓度是5μΜ作为初筛浓度，复筛使用2-25μΜ浓度梯度。

[0072] 2.胚胎的准备

[0073] TTN突变的杂合子(titin+/-)交配产生的后代，其中有1/4的后代有突变表型，即 在32hpf时心包肿大，心脏收缩压力下降，没有血液循环。首先，本发明人饲养大于1000个 titin+/-杂合和野生型的鱼交配产生的后代，通过随机配对观察子代形态学表型。挑出大 于100对杂合子配对(titin+/-)，将杂合子产生的后代胚胎于23-somite时选出纯合突变， 10个/孔加入到96孔板中。

[0074] 3.化合物筛选

[0075] 以实施例1中制定的检测指标作为筛选的依据。在相应的时间点进行观察和检测， 筛选策略如图3。

[0076] 在每个96孔板中加入相应的含有候选药物的E3胚胎培养液进行药物处理，从斑马 鱼胚胎受精后20小时（约25-somite)开始处理，一直到胚胎受精后48小时，然后在可见光显 微镜下观察斑马鱼胚胎的表型。

[0077] 如果胚胎依然表型为心包肿大，无血液循环，那么这个药物对扩张型心肌病无治 疗效果。

[0078] 32hpf时，若相对于未给予候选药物的胚胎(DMS0对照组），给予候选药物处理后的 胚胎表现为正常胚胎表型或有明显改善(如心脏形态萎缩不显著或萎缩进程减缓），有血液 循环，无心包肿大，心脏早期舒张、收缩能力改善，则此化合物即为候选先导药物进入复筛。 72hpf时，若相对于未给予候选药物的胚胎(对照组），给予候选药物处理后的胚胎表现为心 脏不缩小或缩小程度缓解，则此化合物即为候选先导药物进入复筛。

[0079] 同时设置DMSO C为正常胚胎(非突变)仅给予DMSO处理的对照，DMSOM为突变体仅 给予DMSO处理的阴性对照，D i g i t ο X i η (地高辛)为阳性对照。

[0080] 若相对于未给予候选药物的胚胎(对照组），给予候选药物处理后的胚胎心脏搏动 频率自48hpf后搏动不放缓，或放缓进程慢于对照组，或搏动次数高于每分针140次，则此化 合物即为候选先导药物进入复筛。

[0081] 确定真实的最高有效化合物进行深入的研究，评价与表型相关的总体胚胎健康， 通过心脏搏动计数试验分析在复筛中的有效性重现，排除假阳性，得到有效先导化合物深 入研究。

[0082]以心脏博动频率为指标，部分筛选结果如图4,筛选获得部分有效化合物结构如 下：

[0083]

[0084] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。