一种褐藻多糖硫酸酯的质量分析方法

摘要

本发明涉及一种褐藻多糖硫酸酯的质量分析方法，所述质量分析方法利用HPLC-柱后衍生-荧光检测法对褐藻多糖硫酸酯进行含量分析，其色谱条件为：色谱柱采用至少一根以上适合多糖的分离范围为2000–1000000道尔顿的色谱柱组成；流动相采用50mmol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH6.7）-乙腈（87:17，V/V）；HPLC柱温为室温；流速为0.1mL/min–1.0mL/min。本发明具有灵敏度高、重现性好、稳定性好等优点，适用于褐藻多糖硫酸酯的含量测定和药代动力学研究。

权利要求

1.一种褐藻多糖硫酸酯的质量分析方法，其特征在于，所述褐藻多糖硫酸酯的质量分析方法利用HPLC-柱后衍生-荧光检测法对褐藻多糖硫酸酯进行含量分析，其色谱条件为：色谱柱采用至少一根适合多糖的分离范围为2,000～1,000,000道尔顿的色谱柱组成；流动相采用pH 6.7、50mmol/L磷酸二氢钾缓冲液－乙腈＝87:17，V/V；流速为0.1mL/min–1.0mL/min；柱温为：20-40℃；

柱后衍生条件：衍生试剂：50-500mmol/L盐酸胍；反应液：0.1-2.0mol/L氢氧化钠；衍生液流速：0.2-0.5mL/min；冷却液：0.5mol/L氢氧化钠；冷却液流速：0.1-0.5mL/min；柱后反应器温度：70-130℃；

荧光检测条件：激发波长Ex＝255nm；检测器发射波长Em＝430nm；光电增益系数PMT＝14或17；

检测方法采用外标法，以高纯度褐藻多糖硫酸酯作为标准。

2.如权利要求1所述的褐藻多糖硫酸酯的的质量分析方法，其特征在于，应用于药代动力学分析时，生物样品前处理步骤为：将血清或组织匀浆液中加入0.1～1.0mol/L氯化钠；根据褐藻多糖硫酸酯分子量大小，采用截留分子量大于褐藻多糖硫酸酯分子量范围的膜进行超滤离心。

3.如权利要求1所述的褐藻多糖硫酸酯的的质量分析方法，其特征在于，色谱条件为：色谱柱：Shodex Asahipak GS-320HQ，300mm×7.6mm；柱温箱温度：室温；流动相：pH 6.7、

50mmol/L磷酸二氢钾缓冲液—乙腈＝87:17，V/V；高效液相系统的流速：0.5mL/min；进样体积：20μL；

柱后衍生条件：

反应系统条件：衍生反应液浓度：0.5mol/L氢氧化钠和200mmol/L盐酸胍，衍生液流速：0.3mL/min；冷却液：0.5mol/L氢氧化钠，冷却液流速：0.3mL/min；柱后反应器温度：

125℃；

荧光检测条件：检测器激发波长Ex＝255nm；检测器发射波长Em＝430nm；PMT＝14或17。

4.如权利要求1所述的褐藻多糖硫酸酯的的质量分析方法，其特征在于，所述质量分析方法的色谱条件为：色谱柱：Shodex Asahipak GS-320HQ，300mm×7.6mm，加保护柱：Shodex Asahipak GS-2G 7B，50mm×7.6mm；柱温箱温度：室温；流动相：pH 6.7、50mmol/L磷酸二氢钾缓冲液—乙腈＝87:17，V/V；高效液相系统的流速：0.5mL/min；进样体积：

20μL；检测器激发波长Ex＝255nm；检测器发射波长Em＝430nm；PMT＝14或17；

衍生反应系统条件：

衍生反应液浓度：0.5mol/L氢氧化钠和200mmol/L盐酸胍，衍生液流速：0.3mL/min；

冷却液：0.5mol/L氢氧化钠，冷却液流速：0.3mL/min；柱后反应器温度：125℃。

说明书

一种褐藻多糖硫酸酯的质量分析方法

技术领域

[0001] 本发明涉及医药生物检测领域，具体涉及一种褐藻多糖硫酸酯的的质量分析方法。

背景技术

[0002] 褐藻多糖硫酸酯是一类硫酸化多糖，存在于部分海洋褐藻和海洋无脊椎动物中，首先由Kylin在1913年用稀酸从掌状海带中提取出来。Kylin将提取物水解后分离出L-岩藻糖，他将这种多糖命名为fucoidin，现根据多糖的命名原则一般定名为fucoidan，中文名称为褐藻多糖硫酸酯，也被称为岩藻多糖、岩藻聚糖、岩藻聚糖硫酸酯或褐藻糖胶。现在人们对褐藻多糖硫酸酯的组成有较为清晰的了解，它是一类化学组成和结构非常复杂的多糖，以岩藻糖和硫酸基为主，随着褐藻的种类不同还含有少量半乳糖、木糖、糖醛酸等其他成分。

[0003] 褐藻多糖硫酸酯是具有多种生物活性的一类类肝素多糖，现已报道褐藻多糖硫酸酯具有抗凝血、提高免疫力、抗肿瘤、抗病毒、降血糖、降血脂、抗辐射、以及用于治疗慢性肾衰、糖尿病肾病、心肌缺血和帕金森病等多种疾病。

[0004] 含量测定是药物可靠性的重要依据。目前测定褐藻多糖硫酸酯含量的主要方法有半胱氨酸硫酸法、Cameron 法、气相色谱法和液相色谱法。这些方法都需要将待分析的褐藻多糖硫酸酯样品先水解, 再分离或衍生化, 间接测定褐藻多糖硫酸酯中岩藻糖的含量, 因操作繁琐, 对定量分析不方便。而且由于不同褐藻多糖硫酸酯中岩藻糖含量有所不同，依据岩藻糖来确定褐藻多糖硫酸酯的含量难免会有所偏差。

[0005] 同时，药物开发必须对药物的体内代谢产物和代谢机理进行研究，确保药物在体内的活性和安全性，也能够指导新药设计、优选给药方案、改善药物剂型等。褐藻多糖硫酸酯经体内代谢后，血清、器官等生物组织中药物浓度低，在分析前还要去除蛋白质、类脂等其他影响结果测定的杂质，这必然造成褐藻多糖硫酸酯药物一定程度的损失，使分析样品中药物浓度更低。所以要进行这些样品的微量检测，难度很大，致使褐藻多糖硫酸酯的药代动力学研究一直进展缓慢。之前采用的半胱氨酸硫酸法、Cameron法由于检测限度高，不能用于微量分析。

[0006] 气相色谱法和液相色谱法需将褐藻多糖硫酸酯水解为岩藻糖，再进行色谱分析。由于岩藻糖在强酸条件下不稳定，导致水解后的岩藻糖测定结果重现性差、误差较大，难以对生物样品中微量褐藻多糖硫酸酯进行准确分析。这就要求建立一种高灵敏度、重现性好的微量分析方法，检测体内样品的褐藻多糖，为药代动力学研究提供条件。

发明内容

[0007] 本发明的目的是提供一种高灵敏度、重现性好、稳定性佳的褐藻多糖硫酸酯质量分析方法。

[0008] 为实现上述目的，本发明提供的技术方案是，一种褐藻多糖硫酸酯的质量分析方法，所述质量分析方法利用HPLC-柱后衍生-荧光检测法对褐藻多糖硫酸酯进行含量分析，其色谱条件为：色谱柱采用至少一根以上适合多糖的分离范围为2,000 – 1,000,000 道尔顿的色谱柱组成；流动相采用50 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH 6.7）-乙腈（87:17，V/V）；HPLC柱温为室温；流速为 0.1 mL/min – 1.0 mL/min；

[0009] 柱后衍生条件：衍生试剂：50 - 500 mmol/L盐酸胍；反应液：0.1 - 2.0 mol/L氢氧化钠；衍生液流速：0.2-0.5 mL/min；冷却液：0.5 mol/L氢氧化钠；冷却液流速：0.1 -0.5 mL/min；柱后反应器温度：70-130 ℃；

[0010] 荧光检测条件：激发波长Ex=255 nm；检测器发射波长Em=430 nm；

[0011] 检测方法采用外标法，以高纯度褐藻多糖硫酸酯作为标准。

[0012] 其中，所述质量分析方法还有生物样品前处理步骤：将血清或组织匀浆液中加入0.1-1.0 mol/L 氯化钠；根据褐藻多糖硫酸酯分子量大小，采用截留分子量大于褐藻多糖硫酸酯分子量范围的膜进行超滤离心。

[0013] 优选的，色谱条件为：色谱柱：Shodex Asahipak GS-320 HQ（300 mm×7.6 mm）；柱温箱温度：室温；流动相：50 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH 6.7）—乙腈（87:17，V/V）；高效液相系统的流速：0.5 mL/min；进样体积：20 μL。

[0014] 柱后衍生条件：

[0015] 反应系统条件：衍生反应液浓度：0.5 mol/L氢氧化钠和200 mmol/L盐酸胍，衍生液流速：0.3 mL/min；冷却液：0.5 mol/L氢氧化钠，冷却液流速：0.3 mL/min；柱后反应器温度：125℃。

[0016] 荧光检测条件：检测器激发波长Ex=255 nm；检测器发射波长Em=430 nm；PMT=14或17。

[0017] 优选的，所述质量分析方法的色谱条件为：色谱柱：Shodex Asahipak GS-320 HQ（300 mm×7.6 mm），加保护住：Shodex Asahipak GS-2G 7B（50mm×7.6mm）；柱温箱温度：室温；流动相：50 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH 6.7）—乙腈（87:17，V/V）；高效液相系统的流速：0.5 mL/min；进样体积：20 μL；

[0018] 检测器激发波长Ex=255 nm；检测器发射波长Em=430 nm；PMT=14或17；

[0019] 衍生反应系统条件：

[0020] 衍生反应液浓度：0.5 mol/L氢氧化钠和200 mmol/L盐酸胍，衍生液流速：0.3 mL/min；冷却液：0.5 mol/L氢氧化钠，冷却液流速：0.3 mL/min；柱后反应器温度：125℃。

[0021] 与现有技术相比，本发明首次建立了一种利用HPLC-柱后衍生-荧光检测法对褐藻多糖硫酸酯进行含量测定的方法。该方法具有灵敏度高、重现性好、稳定性好等优点，适合用于褐藻多糖硫酸酯的含量测定和药代动力学研究。

附图说明

[0022] 图1是褐藻多糖硫酸酯盐酸胍衍生物的最佳激发光谱和最佳发射光谱。

[0023] 图2是褐藻多糖硫酸酯盐酸胍衍生物的三维荧光谱图。

[0024] 图3是不同盐酸胍浓度对衍生褐藻多糖硫酸酯荧光强度的影响。

[0025] 图4是不同氢氧化钠浓度对褐藻多糖硫酸酯衍生效率的影响。

[0026] 图5是不同温度对衍生后荧光效率的影响。

[0027] 图6是血清中不同浓度褐藻多糖硫酸酯色谱图（PMT=14）。

[0028] 图7是柱后衍生法测定血清中褐藻多糖硫酸酯浓度标准曲线。

[0029] 图8是兔单次静脉注射褐藻多糖硫酸酯的药时曲线。

[0030] 图9是单次静脉注射50mg/Kg 褐藻多糖硫酸酯拟合曲线。

[0031] 图10是兔血清单次静脉注射褐藻多糖硫酸酯的药时色谱图。

具体实施方式

[0032] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。

[0033] 实施例1，褐藻多糖硫酸酯的制备

[0034] 将500 g海带除去泥沙，用20倍水在高压锅中提取3小时，控制温度100~105℃，提取2次。除去藻体，合并2次提取液，用硅藻土抽滤，滤液浓缩，向浓缩液中加入2 mol/L MgCl2使MgCl2终质量浓度为0.05 mol/L，同时加入无水乙醇，使乙醇终重量浓度为20%，搅拌生成沉淀，离心除去沉淀，取上清液，用3500Da透析袋透析2天，浓缩透析袋内溶液，冻干得褐藻多糖，得率为1.85%。

[0035] 取上述冻干得到的褐藻多糖溶于水，配成浓度为2.5%的水溶液，上样到以DEAE-Sepharose-CL-6B为载体柱层析，依次用0.1 mol/L NaCl、0.5 mol/L NaCl、1.0mol/L NaCl、1.5 mol/L NaCl和2.0mol/L NaCl溶液线性梯度洗脱，收集各洗脱液，分别透析、冻干。其中由1.0mol/L NaCl洗脱所得的白色絮状沉淀即为纯化的褐藻多糖硫酸酯。

[0036] 实施例2，羊栖菜褐藻多糖硫酸酯的制备

[0037] 将500 g羊栖菜，用20倍水在高压锅中提取3小时，控制温度100-105℃，提取2次。除去藻体，合并2次提取液，用硅藻土抽滤，滤液浓缩，加入2 mol/L MgCl2使MgCl2终质量浓度为0.05 mol/L，同时加入无水乙醇，使乙醇终重量浓度为20%，搅拌生成沉淀，离心除去沉淀，上清液，用3500Da透析袋透析2天，浓缩透析袋内溶液，冻干得羊栖菜粗褐藻多糖硫酸酯，得率为3.29%。

[0038] 实施例3，高效液相-柱后荧光衍生法测定褐藻多糖硫酸酯含量的条件优化与测定

[0039] 本实施例中所用褐藻多糖硫酸酯样品为实施例1中所制备的纯化的褐藻多糖硫酸酯。

[0040] （1）最佳激发波长和发射波长的确定。

[0041] 以盐酸胍为衍生试剂的反应液配制：在试管中分别加入褐藻多糖硫酸酯样品，盐酸胍，氢氧化钠及硼砂，使得终浓度分别为褐藻多糖硫酸酯5 μg/mL，盐酸胍浓度50 mmol/L，氢氧化钠浓度为0.5 mol/L，硼砂2 %。同时以空白作为对照。在110℃反应30 min，冷却至室温。使用二维和三维扫描确定最佳激发和发射波长。实验结果如附图1和图2。图1是褐藻多糖硫酸酯盐酸胍衍生物的最佳激发光谱和最佳发射光谱，图2是褐藻多糖硫酸酯盐酸胍衍生物的三维荧光谱图。通过实验确定最佳激发波长和最佳发射波长分别为激发波长Ex=249nm；发射波长Em=435nm。

[0042] （2）最佳反应体系条件的优化

[0043] 色谱条件：

[0044] 色谱柱：以倍压管代替；进样体积：20 μL；流动相：水；流动相流速：0.5 mL/min；衍生液流速：0.3 mL/min；冷却液：0.3mL/min；检测器激发波长Ex=249nm；检测器发射波长Em=435nm； PMT=14或17。

[0045] 衍生反应液配制：

[0046] 褐藻多糖硫酸酯样品的配制：采用实施例1中所制备纯化的褐藻多糖硫酸酯，配制浓度为1 mg/mL的母液，分别稀释到5 μg/mL和10 μg/mL。不同浓度盐酸胍、氢氧化钠，以及反应温度如表1，采用单一变量进行选择最佳反应条件。实验结果如附图3、图4和图5所示。图3是不同盐酸胍浓度对衍生褐藻多糖硫酸酯荧光强度的影响，图4是不同氢氧化钠浓度对褐藻多糖硫酸酯衍生效率的影响，图5是不同温度对衍生后荧光效率的影响。通过条件优化确定盐酸胍浓度为50-50 m mol/L；氢氧化钠浓度为0.1 - 2.0 mol/L；反应温度为70-130 °C。

[0047] 表1 高效液相-柱后荧光衍生法优化衍生反应条件选择

[0048]

[0049] （3）方法学验证

[0050] 用如下所述实验方法进行方法学验证。

[0051] 色谱系统条件：

[0052] 色谱柱：Shodex Asahipak GS-320 HQ（300 mm×7.6 mm），加保护柱：Shodex Asahipak GS-2G 7B（50mm×7.6mm）；柱温箱温度：室温；流动相：50 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH 6.7）—乙腈（87:17，V/V）；高效液相系统的流速：0.5 mL/min；进样体积：20 μL。

[0053] 检测器激发波长Ex=255 nm；检测器发射波长Em=430 nm；PMT=14或17。

[0054] 反应系统条件：

[0055] 衍生反应液浓度：0.5 mol/L氢氧化钠和200 mmol/L盐酸胍，衍生液流速：0.3 mL/min；冷却液：0.5 mol/L氢氧化钠，冷却液流速：0.3 mL/min；柱后反应器温度：125℃。

[0056] 样品配制：

[0057] 外标法的选用及标准曲线绘制：将褐藻多糖硫酸酯溶于去离子水，使褐藻多糖硫酸酯终浓度分别为0.5、1、2.5、5、10、25、50、100 μg/mL，0.22μm滤膜过滤，分别上样分析，在分析所用浓度范围内，呈线性关系。

[0058] 检测限和定量限：分别上样不同浓度的褐藻多糖硫酸酯，浓度分别为0.025、0.05、0. 25、0.5、0. 75、1、1.25、2.5 μg/mL，上样分析。检测限位0.05μg/mL，定量限为
0. 25μg/mL。

[0059] 日间精密度和日内精密度：分别取浓度为10、25、50 μg/mL的褐藻多糖硫酸酯样品，进行精密度分析。日内精密度是在同一日相同时间间隔连续测定6次，日间精密度是每天测定，连续测定6天，日内精密度和日间精密度（RSD）均小于3%。

[0060] 稳定性：分别取浓度为10、25、50 μg/mL的褐藻多糖硫酸酯样品，分别放置于4℃冷藏保存和-20℃冷冻保存。连续5天进行取样分析，测定结果没有明显变化。

[0061] 加样回收率：标准褐藻多糖硫酸酯溶液的配制：取纯化的褐藻多糖硫酸酯10.1mg，加水溶解稀释使终浓度为0.4 mg/mL。

[0062] 取浓度分别为10、25、50μg/mL的三份褐藻多糖硫酸酯溶液，三种浓度下标准褐藻多糖硫酸酯的加入量分别为80%、100%、120%，进行加样回收率测定，加样回收率在98.1-102.4%之间，符合质量分析要求。

[0063] 实施例4，羊栖菜褐藻多糖硫酸酯含量测定

[0064] 测试样品：实施例2中制备的羊栖菜粗褐藻多糖硫酸酯。

[0065] 色谱系统条件：

[0066] 色谱柱：Shodex Asahipak GS-320 HQ（300 mm×7.6 mm），加保护柱：Shodex Asahipak GS-2G 7B（50mm×7.6mm）；柱温箱温度：室温；流动相：50 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH 6.7）—乙腈（87:17，V/V）；高效液相系统的流速：0.5 mL/min；进样体积：20 μL。

[0067] 检测器激发波长Ex=255 nm；检测器发射波长Em=430 nm；PMT=14或17

[0068] 衍生反应系统条件：

[0069] 衍生反应液浓度：0.5 mol/L氢氧化钠和200 mmol/L盐酸胍，衍生液流速：0.3 mL/min；冷却液：0.5 mol/L氢氧化钠，冷却液流速：0.3 mL/min；柱后反应器温度：125℃[0070] 检测方法采用外标法，以高纯度褐藻多糖硫酸酯作为标准。

[0071] 检测结果：羊栖菜粗褐藻多糖硫酸酯中褐藻多糖硫酸酯的含量为62.5%。

[0072] 实施例5，兔血清褐藻多糖硫酸酯中的含量测定

[0073] 测试样品为实施例1中制备的褐藻多糖硫酸酯。

[0074] （1）血清样品的前处理

[0075] 对空白或含有褐藻多糖硫酸酯的血清或生物组织匀浆液中加入0.1-1mol/L氯化钠，选用截留分子量为5万道尔顿的超滤膜进行超滤离心，上清液留样用于色谱分析。

[0076] （2）色谱系统条件

[0077] 色谱柱：Shodex Asahipak GS-320 HQ（保护柱Shodex Asahipak GS-2G 7B）；进样体积：20 μL；流动相：50 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH 6.7）—乙腈（87:17，V/V）；柱温箱温度：室温；流动相流速：0.5 mL/min；检测器激发波长Ex=255nm；检测器发射波长Em=430nm；PMT=14或17。

[0078] 柱后系统条件：衍生反应液浓度：0.5 mol/L氢氧化钠和200 mmol/L盐酸胍，衍生液流速：0.3 mL/min；冷却液：0.5 mol/L氢氧化钠，冷却液流速：0.3 mL/min；柱后反应器温度：125°C。

[0079] （3）方法学验证

[0080] 用如下所述实验方法进行方法学验证。

[0081] 血清样品前处理：超滤离心管（MWCO 50KDa），10000rpm×10min， 0.5 mol/L氯化钠。

[0082] 色谱系统条件：

[0083] 色谱柱：Shodex Asahipak GS-320 HQ（300 mm×7.6 mm），加保护住：Shodex Asahipak GS-2G 7B（50mm×7.6mm）；柱温箱温度：室温；流动相：50 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH 6.7）—乙腈（87:17，V/V）；高效液相系统的流速：0.5 mL/min；进样体积：20 μL。

[0084] 检测器激发波长Ex=255 nm；检测器发射波长Em=430 nm；PMT=14或17。

[0085] 反应系统条件：

[0086] 衍生反应液浓度：0.5 mol/L氢氧化钠和200 mmol/L盐酸胍，衍生液流速：0.3 mL/min；冷却液：0.5 mol/L氢氧化钠，冷却液流速：0.3 mL/min；柱后反应器温度：125℃。

[0087] 样品配制：

[0088] 外标法的选用及标准曲线绘制：取100 μL空白血清，加入50 μL不同浓度的褐藻多糖硫酸酯和50 μL 2 mol/L氯化钠中，使褐藻多糖硫酸酯的终浓度为0.5、1、2.5、5、10、25、50、100 μg/mL涡旋混合1 min，静置1 h，转移至超滤离心管中，离心（10000 rpm ×
10 min）；取离心液进行分析，实验结果表明符合线性曲线。色谱分析结果见附图6和图7。
图6为血清中不同浓度的褐藻多糖硫酸酯色谱图（PMT=14），图6中曲线从上至下是褐藻多糖硫酸酯的终浓度为100、50、25、10、5、2.5、1、0.5 μg/mL。图7为柱后衍生法测定血清中褐藻多糖硫酸酯浓度标准曲线。

[0089] 检测限和定量限：取100 μL空白血清，加入50 μL不同浓度的褐藻多糖硫酸酯和50 μL 2 mol/L氯化钠中，使褐藻多糖硫酸酯的终浓度为0.025、0.05、0. 25、0.5、0.75、1、1.25、2.5 μg/mL涡旋混合1 min，静置1 h，转移至超滤离心管中，离心（10000 rpm × 10 min）；取离心液进行分析，结果血清褐藻多糖硫酸酯检测限为0.05μg/mL。

[0090] 日间精密度和日内精密度：取100 μL空白血清，加入50 μL不同浓度的褐藻多糖硫酸酯和50 μL 2 mol/L氯化钠中，使褐藻多糖硫酸酯的终浓度为10、25、50 μg/mL涡旋混合1 min，静置1 h，转移至超滤离心管中，离心（10000 rpm × 10 min）；取离心液进行分析。日内精密度是在同一日相同时间间隔连续测定6次，日间精密度是每天测定，连续测定6天，结果见表2，精密度（RSD）小于3%。

[0091] 稳定性：取100 μL空白血清，加入50 μL不同浓度的褐藻多糖硫酸酯和50 μL2 mol/L氯化钠中，使褐藻多糖硫酸酯的终浓度为10、25、50 μg/mL涡旋混合1 min，静置1 h，转移至超滤离心管中，离心（10000 rpm × 10 min），取离心液。一份放置于4℃冷藏保存，一份放置于-20℃冷冻保存。连续5天进行取样分析，结果见表3，稳定性RSD小于3%。

[0092] 回收率：标准褐藻多糖硫酸酯溶液的配制：取褐藻多糖硫酸酯 10.1mg，加水溶解稀释使终浓度为0.4 mg/mL。

[0093] 取100 μL空白血清，加入50 μL不同浓度待检测的褐藻多糖硫酸酯（分别用2 mol/L氯化钠配制）和50 μL 不同量标准褐藻多糖硫酸酯中，使待检测褐藻多糖硫酸酯的终浓度为10、25、50μg/mL，三种浓度下标准褐藻多糖硫酸酯的加入量分别为80%、100%、120%。涡旋混合1 min，静置1h，转移至超滤离心管中，离心（10000 rpm × 10 min）；取离心液进行进样分析，实验结果如表4。

[0094] 表2 兔血清中褐藻多糖硫酸酯测定的日内及日间精密度（n=6）

[0095]

[0096] 表3 兔血清中不同温度下的稳定性(n=5)

[0097]

[0098] 表4 兔血清中褐藻多糖硫酸酯加样回收率

[0099]

[0100] （4）新西兰兔静脉注射褐藻多糖硫酸酯的血清样品分析：

[0101] 新西兰兔以50 mg/Kg的剂量静脉注射褐藻多糖硫酸酯样品，并在给药前后0 min、5 min、15 min、30 min、60 min、120 min、180 min、240 min、300 min、360 min、480 min、600 min、720 min分别取血清样品，血清样品加入0.5 mol/L氯化钠，选用截留分子量为5万道尔顿的超滤膜进行超滤离心，上清液留样用于色谱分析。

[0102] 色谱系统条件：

[0103] 色谱柱：Shodex Asahipak GS-320 HQ（300 mm×7.6 mm），加保护住：Shodex Asahipak GS-2G 7B（50mm×7.6mm）；柱温箱温度：室温；流动相：50 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH 6.7）—乙腈（87:17，V/V）；高效液相系统的流速：0.5 mL/min；进样体积：20 μL。

[0104] 检测器激发波长Ex=255 nm；检测器发射波长Em=430 nm；PMT=14或17。

[0105] 反应系统条件：

[0106] 衍生反应液浓度：0.5 mol/L氢氧化钠和200 mmol/L盐酸胍，衍生液流速：0.3 mL/min；冷却液：0.5 mol/L氢氧化钠，冷却液流速：0.3 mL/min；柱后反应器温度：125℃。

[0107] 检测方法采用外标法，以高纯度褐藻多糖硫酸酯作为标准。

[0108] 分析结果见图8、图9和图10。图8为兔单次静脉注射褐藻多糖硫酸酯的药时曲线，图9为单次静脉注射50mg/Kg 褐藻多糖硫酸酯拟合曲线，图中的曲线为预测值，圆圈为观察值。图10为兔血清单次静脉注射褐藻多糖硫酸酯的药时色谱图，图10中曲线从上往下依次为：5 min，15 min，30 min，60 min，120 min，180 min，240 min，300 min，360 min。药代动力学参数分析结果见表5。

[0109] 表5 单次静脉注射褐藻多糖硫酸酯兔代谢的药代动力学参数（n=3）

[0110]参数 单位 参数值（Mean±S.D）
A μg/ml 104.84±5.38
Alpha 1/min 0.062±0.020
B μg/ml 35.13±12.89
Beta 1/min 0.007±0.002
k10 1/min 0.021±0.002
k12 1/min 0.027±0.010
k21 1/min 0.021±0.010
t1/2Alpha min 11.24±2.93
t1/2Beta min 98.20±25.78
C0 μg/ml 139.98±18.06
V (mg/kg)/(μg/ml) 0.357±0.043
CL (mg/kg)/(μg/ml)/min 0.008±0.000
V2 (mg/kg)/(μg/ml) 0.464±0.130
CL2 (mg/kg)/(μg/ml)/min 0.010±0.002
AUC 0-t μg/ml*min 6285.18±383.25
AUC 0-inf μg/ml*min 6677.26±310.70
AUMC μg/ml*min^2 732671.68±168408.08
MRT min 109.73±23.57
Vss mg/kg/(μg/ml) 0.825±0.172

[0111] （6）新西兰兔灌胃注射褐藻多糖硫酸酯的血清样品分析

[0112] 褐藻多糖硫酸酯以200mg/Kg的剂量灌胃给药，并在给药前后0 min、20 min、40 min、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h、5 h、6 h、8 h、12 h、18 h、24 h分别取血清样品，样品处理和分析方法同实施例5（5）兔静脉注射分析。结果表明新西兰兔灌服褐藻多糖硫酸酯后2小时，出现药峰浓度。灌胃给药褐藻多糖硫酸酯的生物利用度为9.5%。

[0113] 褐藻多糖硫酸酯经静脉注射后，经拟合后发现褐藻多糖硫酸酯在体内代谢符合二房室模型，药峰浓度Cmax=110.53μg/mL，达峰时间Tmax=5min，随后浓度降低，并在6h后检测不到；分布半衰期t1/2α=11.24 ± 2.93 min；消除半衰期t1/2β=98.20 ± 25.78 min。褐藻多糖硫酸酯经灌胃给药药峰浓度在2h左右出现。

[0114] 本发明首次建立了一种利用HPLC-柱后衍生-荧光检测法对褐藻多糖硫酸酯进行含量测定的方法。本发明具有灵敏度高、重现性好、稳定性好等优点，适合用于褐藻多糖硫酸酯的含量测定和药代动力学研究。

[0115] 以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。