基于金属增强发光及纳米粒子标记放大的双增强化学发光免疫分析法

摘要

本发明公开了基于金属增强发光及纳米粒子标记放大的双增强化学发光免疫分析法。本发明基于金属增强发光及纳米粒子标记放大的双增强化学发光免疫分析法，以金属纳米粒子代替常规的聚苯乙烯纳米微球，并在距金属纳米粒子表面5～20nm的隔离层表面标记发光物质，致敏金属纳米粒子上发光物质的化学发光耦合到金属纳米粒子表面的等离子体波中，产生共振后，以更强的光强和更快的衰变速度的形式再发射出去，在传统的化学发光免疫分析技术基础上有机地整合了金属增强发光的技术以及纳米粒子的标记放大技术。使得本发明具有灵敏度高，检测速度快等优势。

权利要求

1.基于金属增强发光及纳米粒子标记放大的双增强化学发光免疫分析法，其特征在于包括

（I）夹心法：利用有机大分子或无机材料在金属纳米粒子表面形成5~20nm隔离层，将能够与待测样本中的目标分析物特异性结合的探测分子连接到金属纳米粒子或隔离层表面，再标记上发光物质，形成发光物质距离金属纳米粒子表面的距离为5~20nm具有放大标记效果的致敏金属纳米粒子；将能够与待测样本中的目标分析物特异性结合的捕获分子直接或者间接包被在固相载体上；将固相载体、致敏金属纳米粒子以及待测样本混合，形成固相载体-捕获分子-目标分析物-致敏金属纳米粒子免疫复合物；经清洗分离出固相载体复合物后，加入激发物，致敏金属纳米粒子上发光物质的化学发光耦合到金属纳米粒子表面的等离子体波中，产生共振后，以更强的光强和更快的衰变速度的形式再发射出去，最后用化学发光检测仪检测发光强度计算待测样本中的目标分析物的浓度；

或者，

（II）竞争法：利用有机大分子或无机材料在金属纳米粒子表面形成5~20nm隔离层，将能够与待测样本中的目标分析物竞争结合捕获分子的探测分子连接到金属纳米粒子或隔离层表面，再标记上发光物质，形成发光物质距离金属纳米粒子表面的距离为5~20nm具有放大标记效果的致敏金属纳米粒子；将定量的能够与待测样本中的目标分析物特异性结合的捕获分子直接或者间接包被在固相载体上，将致敏金属纳米粒子、待测样本及固相载体混合，探测分子与目标分析物将竞争结合固相载体上的捕获分子，形成固相载体-捕获分子-目标分析物和/或固相载体-捕获分子-致敏金属纳米粒子免疫复合物；经清洗分离出固相载体复合物后，加入激发物，致敏金属纳米粒子上发光物质的化学发光耦合到金属纳米粒子表面的等离子体波中，产生共振后，以更强的光强和更快的衰变速度的形式再发射出去，最后用化学发光检测仪检测发光强度，计算与致敏金属纳米粒子免疫复合物结合的捕获分子的浓度，从而进一步计算出待测样本中的目标分析物的浓度；或者是利用有机大分子或无机材料在金属纳米粒子表面形成5~20nm隔离层，将能够与待测样本中目标分析物特异性结合的定量的探测分子连接在金属纳米粒子或隔离层表面，再标记上发光物质，形成发光物质距离金属纳米粒子表面的距离为5~20nm具有放大标记效果的致敏金属纳米粒子；

将能够与待测样本中的目标分析物竞争结合探测分子的捕获分子直接或者间接包被在固相载体上，将固相载体致敏金属纳米粒子以及待测样本混合，固相载体上的捕获分子与目标分析物将竞争结合致敏金属纳米粒子上的探测分子，形成致敏金属纳米粒子-目标分析物和/或固相载体-捕获分子-致敏金属纳米粒子；经清洗分离出固相载体复合物后，加入激发物，致敏金属纳米粒子上发光物质的化学发光耦合到金属纳米粒子表面的等离子体波中，产生一定程度的共振后，以更强的光强和更快的衰变速度的形式再发射出去，最后用化学发光检测仪检测发光强度计算与固相载体上的捕获分子结合的探测分子的浓度，从而进一步计算出待测样本中的目标分析物的浓度。

2.根据权利要求1所述的基于金属增强发光及纳米粒子标记放大的双增强化学发光免疫分析法，其特征在于所述的夹心法中，探测分子通过共价偶联、结合对、物理吸附方式连接到金属纳米粒子或隔离层表面；所述的共价偶联方式选自:金属纳米粒子隔离层表面修饰的巯基、氨基或羧基共价偶联至探测分子的氨基；所述结合对方式选自:生物素一亲和素、凝集素与糖类、葡萄球菌A蛋白与IgG、抗原与抗体、阳离子与阴离子、激素维生素和脂质与受体。

3.根据权利要求1所述的基于金属增强发光及纳米粒子标记放大的双增强化学发光免疫分析法，其特征在于用于形成隔离层的有机大分子选自牛血清白蛋白、酪蛋白、超支化聚合物；用于形成隔离层的无机材料选自二氧化硅；所述的金属纳米粒子的粒径为1-100nm；

所述的固相载体选自常规的免疫分析固相载体。

4.根据权利要求1所述的基于金属增强发光及纳米粒子标记放大的双增强化学发光免疫分析法，其特征在于所述的固相载体选自磁性微粒，酶标板、微孔板、金电极或尼龙。

5.根据权利要求1所述的基于金属增强发光及纳米粒子标记放大的双增强化学发光免疫分析法，其特征在于夹心法中，所述的目标分析物选自蛋白质或多肽，所述的蛋白质包括抗原或抗体；所述的探测分子选自可与目标分析物特异性结合的蛋白质或多肽，所述的蛋白质包括抗体或抗原；所述的捕获分子选自与探测分子配对，并且能够与目标分析物特异性结合的蛋白质或多肽，所述的蛋白质包括抗原或抗体；竞争法中，所述的目标分析物选自小分子或半抗原；所述的探测分子所述的探测分子选自与目标分析物具有相同或相似结构、或相同或相似结合结构域的物质且能与捕获分子结合的物质，选自小分子、半抗原，大分子、抗原；所述的捕获分子选自能与上述分子特异性结合的物质。

6.根据权利要求5所述的基于金属增强发光及纳米粒子标记放大的双增强化学发光免疫分析法，其特征在于所述的夹心法中，探测分子选自抗体、或其活性片段、抗原或半抗原、或它们的活性片段，所述的抗体或其活性片段选自单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、Fab、（Fab’）2、抗体重链或抗体轻链。

7.根据权利要求1所述的基于金属增强发光及纳米粒子标记放大的双增强化学发光免疫分析法，其特征在于所述的发光物质选自包括N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺，吖啶酯，吖啶磺酰胺，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶在内的可以和激发液或者底物作用产生化学发光的物质；所述的激发物选自含有0.1%-1%过氧化氢的0.1mol/L-1 mol/L硝酸溶液、含有

0.1%-1%过氧化氢的0.1mol/L-1 mol/L硫酸溶液或者含有0.1%-1%过氧化氢的0.1mol/L-1 mol/L盐酸或含有0.5%-5%Tween-20的0.1-1mol/L氢氧化钠溶液、0.5%-5%Tween-80的0.1-

1mol/L氢氧化钠溶液、0.5%-5%TritonX-100的0.1-1mol/L氢氧化钠溶液。

8.一种化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于包括权利要求1中所述的致敏金纳米粒子、直接或者间接包被了捕获分子的固相载体、化学发光激发液系统。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于所述的化学发光激发液系统包括激发液1和激发液2：激发液1选自含有0.1%-1%过氧化氢的0.1mol/L-1 mol/L硝酸溶液、含有0.1%-

1%过氧化氢的0.1mol/L-1 mol/L硫酸溶液或者含有0.1%-1%过氧化氢的0.1mol/L-1 mol/L盐酸；激发液2选自含有0.5%-5%Tween-20的0.1-1mol/L氢氧化钠溶液、0.5%-5%Tween-80的

0.1-1mol/L氢氧化钠溶液、0.5%-5%TritonX-100的0.1-1mol/L氢氧化钠溶液。

10.一种制备权利要求8或9所述的试剂盒的方法，其特征在于包含如下步骤：

1) 制备致敏金纳米粒子：使用无机材料或有机分子包覆至金属纳米粒子表面形成5~

20nm隔离层，连接探测分子，离心清洗后加入发光物质进行反应使发光物质标记到金属纳米粒子表面，反应完成后再次离心清洗后得到致敏金属纳米粒子；

2) 制备直接或者间接包被了捕获分子的固相载体：通过氨基的反应将捕获分子连接于羧基或氨基修饰的磁性微球表面，或通过链霉亲和素和生物素作用将捕获分子结合到链霉亲和素化的磁微珠表面；

3) 配制激发液1和激发液2：激发液1为含有0.5%过氧化氢溶液的0.2M的硝酸溶液；激发液2为含有1%Tween-20的0.5M氢氧化钠溶液。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于包含以下方法：

1) 制备致敏金属纳米粒子：使用无机材料或有机分子包覆至金属纳米粒子表面形成5~20nm隔离层，连接探测分子NSE的一株单克隆抗体，离心清洗后加入发光物质进行反应使发光物质标记到金属纳米粒子表面，反应完成后再次离心清洗后得到致敏金属纳米粒子；

2) 制备共价偶联了链亲和素的磁性微球：表面带有化学基团的磁性微球，通过化学基团的共价偶联，活化完成后使用偶联缓冲液清洗磁性微粒，加入相当于磁性微球质量的1/

20的链亲和素，反应后使用封闭缓冲液封闭磁性微粒上空余的活化基团，得到共价偶联了链亲和素的磁性微球；

3) 磁性微球上间接包被NSE的另一株单克隆抗体：NSE的另一株单克隆抗体中加入等摩尔的NHS活化的生物素，生物素化反应完成后，将生物素化的抗体加入上述偶联了链亲和素的磁性微球中，利用链亲和素-生物素体系将NSE的另一株单克隆抗体间接包被到磁性微球上得到间接包被了捕获分子的固相载体；

4) 配制激发液1和激发液2：激发液1为含有0.5%过氧化氢溶液的0.2M的硝酸溶液；激发液2为含有1%Tween-20的0.5M氢氧化钠溶液。

说明书

基于金属增强发光及纳米粒子标记放大的双增强化学发光免

疫分析法

技术领域

[0001] 本发明属于新型纳米材料研究以及预防与诊断医学检验领域，涉及基于金属增强发光及纳米粒子标记放大的双增强化学发光免疫分析法。

背景技术

[0002] 化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA),是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。比起传统的酶免分析法，CLIA具有灵敏度更高、检测时间更短、标记方法更简单以及原料成本更低的特点。尽管如此，随着分析检验技术的逐渐普及、以及临床上对于检测待测分子灵敏度需求的进一步提高，迫切需要能在CLIA基础上系统性进一步提升灵敏度，降低检测时间的新技术。

[0003] 已有文献报道，将发光分子(吖啶衍生物，N‐(4‐氨基丁基)‐N‐乙基异鲁米诺(ABEI)，或者酶)和纳米微球共价偶联，然后用发光分子包被的微球标记检测抗体，可以大幅提高检测抗体上的发光分子的标记比例，同时减少共价偶联操作中对于检测抗体上抗原结合位点的破坏。这种方法可以大幅提高CLIA的检测灵敏度。但是，在实践中涉及到一些特别微小浓度样品检测时，该方法灵敏度不够高。

[0004] 同时，研究者发现金属纳米粒子对于其近场的光有明显的增强作用，具体表现在光子和金属纳米粒子表面等离激元的强耦合作用，而产生102‐103倍的近场荧光增强和化学发光增强等。这种效应叫做金属增强化学发光效应。另外，这种近场增强效应的产生存在临界距离，即仅当发光族和金属纳米粒子表面之间的距离在5‐20纳米以内，才能观察到近场表面增强效应；距离如果过大，所发出的光子不与金属纳米粒子的表面等离激元耦合。该技术已经被广泛的应用到对于荧光物质的增强中，包括免疫分析、核酸杂交分析等应用领域。然而根据我们的调查，目前还没有将金属增强化学发光效应应用于化学发光免疫分析中的研究报道、专利或者产品。

发明内容

[0005] 本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供基于金属增强发光及纳米粒子标记放大的双增强化学发光免疫分析法。

[0006] 本发明的另一目的是以此技术平台为基础开发不同的免疫学检测试剂盒，以解决现有基于CLIA的检测试剂盒的灵敏度不足的问题。本发明能在现有CLIA检测技术基础上系统性的将灵敏度提高1‐2个数量级。

[0007] 本发明的又一目的是提供该试剂盒的制备方法。

[0008] 为实现上述目标，本发明采用以下的技术方案予以实现：

[0009] 基于金属增强发光及纳米粒子标记放大的双增强化学发光免疫分析法，包括以下(I)或(II)所述的任意一种方法：

[0010] (I)夹心法：利用有机大分子或无机材料在金属纳米粒子表面形成5～20nm隔离层，将能够与待测样本中的目标分析物特异性结合的探测分子连接到金属纳米粒子或隔离层表面，再标记上发光物质，形成发光物质距离金属纳米粒子表面的距离为5～20nm具有放大标记效果的致敏金属纳米粒子；将能够与待测样本中的目标分析物特异性结合的捕获分子直接或者间接包被在固相载体上；将固相载体、致敏金属纳米粒子以及待测样本混合，形成固相载体‐捕获分子‐目标分析物‐致敏金属纳米粒子免疫复合物；经清洗分离出固相载体复合物(即固相载体‐捕获分子‐目标分析物‐致敏金属纳米粒子免疫复合物)后，加入激发物，致敏金属纳米粒子上发光物质的化学发光耦合到金属纳米粒子表面的等离子体波中，产生共振后，以更强的光强和更快的衰变速度的形式再发射出去，最后用化学发光检测仪检测发光强度计算待测样本中的目标分析物的浓度；

[0011] 或者，

[0012] (II)竞争法：利用有机大分子或无机材料在金属纳米粒子表面形成5～20nm隔离层，将能够与待测样本中的目标分析物竞争结合捕获分子的探测分子连接到金属纳米粒子或隔离层表面，再标记上发光物质，形成发光物质距离金属纳米粒子表面的距离为5～20nm具有放大标记效果的致敏金属纳米粒子；将定量的能够与待测样本中的目标分析物特异性结合的捕获分子直接或者间接包被在固相载体上，将致敏金属纳米粒子、待测样本及固相载体混合，探测分子与目标分析物将竞争结合固相载体上的捕获分子，形成固相载体‐捕获分子‐目标分析物和/或固相载体‐捕获分子‐致敏金属纳米粒子免疫复合物；经清洗分离出固相载体复合物后，加入激发物，致敏金属纳米粒子上发光物质的化学发光耦合到金属纳米粒子表面的等离子体波中，产生共振后，以更强的光强和更快的衰变速度的形式再发射出去，最后用化学发光检测仪检测发光强度，计算与致敏金属纳米粒子免疫复合物结合的捕获分子的浓度，从而进一步计算出待测样本中的目标分析物的浓度；或者是利用有机大分子或无机材料在金属纳米粒子表面形成5～20nm隔离层，将能够与待测样本中目标分析物特异性结合的定量的探测分子连接在金属纳米粒子或隔离层表面，再标记上发光物质，形成发光物质距离金属纳米粒子表面的距离为5～20nm具有放大标记效果的致敏金属纳米粒子；将能够与待测样本中的目标分析物竞争结合探测分子的捕获分子直接或者间接包被在固相载体上，将固相载体、致敏金属纳米粒子以及待测样本混合，固相载体上的捕获分子与目标分析物将竞争结合致敏金属纳米粒子上的探测分子，形成致敏金属纳米粒子‐目标分析物和/或固相载体‐捕获分子‐致敏金属纳米粒子；经清洗分离出固相载体复合物(即固相载体‐捕获分子‐致敏金属纳米粒子)后，加入激发物，致敏金属纳米粒子上发光物质的化学发光耦合到金属纳米粒子表面的等离子体波中，产生一定程度的共振后，以更强的光强和更快的衰变速度的形式再发射出去，最后用化学发光检测仪检测发光强度计算与固相载体上的捕获分子结合的探测分子的浓度，从而进一步计算出待测样本中的目标分析物的浓度。

[0013] 所述的基于金属增强发光及纳米粒子标记放大的双增强化学发光免疫分析法中，所述的探测分子优选通过共价偶联、结合对、物理吸附的方式连接到金属纳米粒子或隔离层表面上。

[0014] 所述的共价偶联方式选自:金属纳米粒子隔离层表面修饰的巯基、氨基或羧基共价偶联至探测分子的氨基。所述结合对方式选自:生物素一链霉亲和素、生物素一亲和素、或生物素一中性亲和素、凝集素与糖类、葡萄球菌A蛋白(SPA)与IgG、抗原与抗体、阳离子与阴离子、激素维生素和脂质与受体。

[0015] 所述的基于金属增强发光及纳米粒子标记放大的双增强化学发光免疫分析法中，用于形成隔离层的有机大分子选自牛血清白蛋白、酪蛋白、超支化聚合物；用于形成隔离层的无机材料选自二氧化硅、三氧化二铝、碱式碳酸钇；所述的金属纳米粒子的粒径为1‐100nm；所述的固相载体选自常规的免疫分析固相载体，优选磁性微球，酶标板、微孔板、金电极或尼龙，捕获探针可以通过任何现有连接蛋白质和上述固相载体物质的方法结合到固相载体上。

[0016] 所述的基于金属增强发光及纳米粒子标记放大的双增强化学发光免疫分析法，夹心法中，所述的目标分析物选自蛋白质或多肽，所述的蛋白质包括抗原或抗体；所述的探测分子、捕获分子选自与目标分析物特异性结合的抗体、抗原或适配体；所述的捕获分子是与探测分子配对的抗原或抗体。所述的探测分子或捕获分子优选抗体、或其活性片段、抗原或半抗原、或它们的活性片段，所述的抗体或其活性片段进一步选自单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、Fab、(Fab’)2、抗体重链或抗体轻链。

[0017] 竞争法中，所述的目标分析物选自小分子或半抗原；所述的探测分子选自与目标分析物具有相同或相似结构、或相同或相似结合结构域的物质且能与捕获分子结合的物质，选自小分子、半抗原、大分子、抗原；探测分子和目标分析物能够竞争与捕获分子特异性结合。捕获分子是能与探测分子和目标分析物特异结合的物质。

[0018] 所述的基于金属增强发光及纳米粒子标记放大的双增强化学发光免疫分析法中，所述的发光物质选自包括N‐(4‐氨丁基)‐N‐乙基异鲁米诺，吖啶酯，吖啶磺酰胺，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶在内的可以和激发液或者底物作用产生化学发光的物质。

[0019] 所述的化学发光激发系统包括激发液1和激发液2，激发液1选自含有0.1％‐1％过氧化氢的0.1mol/L‐1mol/L硝酸溶液、含有0.1％‐1％过氧化氢的0.1mol/L‐1mol/L硫酸溶液或者含有0.1％‐1％过氧化氢的0.1mol/L‐1mol/L盐酸。激发液2选自含有0.5％‐5％Tween‐20的0.1‐1mol/L氢氧化钠溶液、0.5％‐5％Tween‐80的0.1‐1mol/L氢氧化钠溶液、0.5％‐5％TritonX‐100的0.1‐1mol/L氢氧化钠溶液。

[0020] 所述的基于金属增强发光及纳米粒子标记放大的双增强化学发光免疫分析法中，所述的分离可采用磁场分离、色谱法、沉淀法、离心、透析等方式。

[0021] 所述的基于金属增强发光及纳米粒子标记放大的双增强化学发光免疫分析法中，在夹心法中，所述方法还包括建立发光强度与样品中目标分析物含量相关性的标准曲线。通过将检测到的固相载体复合物中的致敏金属纳米粒子的发光强度带入上述标准曲线，从而计算出固相载体‐捕获分子‐目标分析物‐致敏金属纳米粒子免疫复合物的浓度，进而得到目标分析物的量。

[0022] 一种化学发光免疫检测试剂盒，包括所述的致敏金纳米粒子、直接或者间接包被了捕获分子的固相载体、化学发光激发系统。其中致敏金纳米粒子、直接或者间接包被了捕获分子的固相载体的定义同上所述。

[0023] 一种制备本发明所述的试剂盒的方法，包含如下步骤：

[0024] 1)制备致敏金属纳米粒子：金属纳米粒子表面修饰化学基团，修饰后使用无机材料或有机分子包覆至金属纳米粒子表面，形成5～20nm隔离层，连接探测分子，离心清洗后加入发光物质进行反应使发光物质标记到金属纳米粒子表面，反应完成后再次离心清洗后得到致敏金属纳米粒子；其中所述的探测分子优选通过共价偶联的方式连接到隔离层表面；

[0025] 2)直接或者间接包被了捕获分子的固相载体：通过氨基的反应将捕获分子连接于羧基或氨基修饰的磁性微球表面，或通过链霉亲和素和生物素作用将捕获分子结合到链霉亲和素化的磁微珠表面；

[0026] 3)配制激发液1和激发液2：激发液1为含有0.5％过氧化氢溶液的0.2M的硝酸溶液；激发液2为含有1％Tween‐20的0.5M氢氧化钠溶液。

[0027] 上述检测试剂盒的制备方法(以神经元特异性烯醇化酶(NSE)磁化学发光免疫分析试剂盒为例)包括如下步骤：

[0028] 1)制备共价偶联了NSE单克隆抗体的吖啶衍生物标记金属纳米粒子(以下简称致敏金属纳米粒子)：通过正硅酸乙酯与纳米金属粒子表面的羟基反应在纳米金属粒子表面形成5‐20nm二氧化硅隔离层，采用硅烷偶联剂将官能基团(如氨基，巯基等)修饰到纳米粒子表面。再利用共价偶联的方法将相当于纳米金质量1/50的NSE单克隆抗体结合到纳米粒子隔离层表面。反应结束后，离心清洗，加入一定量的吖啶衍生物(NSP‐SA‐NHS)反应完成后再次离心清洗后得到致敏金属纳米粒子。

[0029] 2)制备共价偶联了链亲和素的磁性微球：表面带有化学基团的磁性微球，通过化学基团的共价偶联，活化完成后使用偶联缓冲液清洗磁性微球，加入相当于磁性微粒质量的1/20的链亲和素，反应后使用封闭缓冲液封闭磁性微球上空余的活化基团，得到共价偶联了链亲和素的磁性微球。

[0030] 3)磁性微球上间接包被NSE的另一株单克隆抗体(致敏磁性微球)：NSE的另一株单克隆抗体中加入等摩尔的NHS活化的生物素。生物素化反应完成后，将生物素化的抗体加入上述偶联了链亲和素的磁性微球中，利用链亲和素‐生物素体系间接包被后得到致敏磁性微球。

[0031] 4)配制激发液1和激发液2：激发液1为含有0.5％过氧化氢溶液的0.2M的硝酸溶液；激发液2为含有1％Tween‐20的0.5M氢氧化钠溶液。

[0032] 上述NSE的两株单克隆抗体为配对抗体。

[0033] 上述纳米金属粒子与NSE单克隆抗体的质量比为50:1～25。所述的纳米金属粒子优选纳米金粒子。

[0034] 有益效果：本发明基于金属增强发光及纳米粒子标记放大的双增强化学发光免疫分析法，以金纳米粒子代替常规的聚苯乙烯纳米微球，并在距金属纳米粒子表面5～20nm的隔离层表面标记发光物质，将一般的化学发光改为共振物理发光，在传统的磁化学发光免疫分析技术基础上有机地整合了金属增强发光的技术以及纳米粒子的标记放大技术。使得本发明具有灵敏度高，检测速度快等优势。

[0035] 本发明有机地整合了上述两种免疫检测增强技术，选用金纳米粒子作为发光分子标记的载体。易于合成的金纳米粒子一方面可作为增强近场化学发光的金属纳米粒子；另一方面因其高比表面积可以作为标记的放大体系。因此，在近场发光增强和标记放大的双增强作用下，激发后的固相载体复合物的化学发光显著得提高，极大地增加了检测方法的灵敏度。同时，由于金属增强化学发光的特性，发光产物的发光衰变速率得到提高，导致检测时间大幅缩短。

附图说明

[0036] 图1本发明的技术路线示意图：

[0037] 其中：1、鼠抗人NSE单克隆抗体和金纳米粒子共价偶联，2、对金纳米粒子表面进行隔离，3、用吖啶衍生物标记制备得到致敏金属纳米粒子，4、37℃温浴后磁性分离清洗得到免疫复合体。

[0038] 图2致敏金属纳米粒子上不同NSE抗体偶联比的检测标准曲线。

[0039] 图3不同致敏金属纳米粒子加样量的NSE检测标准曲线。

[0040] 图4无放大或增强体系、仅聚苯乙烯纳米球放大体系，以及基于金属增强发光及聚苯乙烯纳米球标记放大的双增强体系的NSE检测标准曲线。

[0041] 图5本发明的体系测试测定的血清标本中NSE浓度和罗氏的测定值的相关性。

具体实施方式

[0042] 以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何修改、等同变化与改型、仍属于本发明技术方案的保护范围(以下实施例方式均以纳米金为例)。

[0043] 实施例1：双抗夹心法及对比实验

[0044] 一、致敏金纳米粒子的制备

[0045] 1.1 20nm表面羧基的金纳米粒子的制备：

[0046] A.用去离子水配制1mL浓度为4％的氯金酸溶液。

[0047] B.0.5mL上述氯金酸溶液加入200mL去离子水中充分搅拌并煮沸。

[0048] C.将3ml浓度为1％的柠檬酸钠水溶液快速注入上述沸腾溶液中去。

[0049] D.冷凝回流30分钟。当金纳米粒子形成时，悬浮液的颜色将从深蓝色变为红色。

[0050] E.冷却到室温。

[0051] F.透射电子显微镜下测量所制备金纳米粒子的粒径为13nm。根据粒径和密度计算单个球形金纳米粒子的质量，根据总体系中金元素的质量推算出纳米金溶液中的粒子浓度为17nmol/L。

[0052] 1.2用二氧化硅在纳米金表面形成隔离层并将NSE单抗偶联至隔离层表面：

[0053] A.将40mL上述制备的纳米金溶液分散在80mL乙醇中，加入20mL纯化水，再逐滴加入1mL24％‐28％的浓氨水，加完之后立即迅速加入20μL正硅酸乙酯，期间保持300rpm搅拌1小时，测得反应后粒径为33nm。

[0054] B.将制备得到的上述纳米金溶液清洗3次后，重新分散在80mL纯化水中，加入0.3g十六烷基三甲基溴化铵、60mL乙醇，最后逐滴缓慢加入1.5mL 24％‐28％的浓氨水，300rpm搅拌30分钟。向上述体系中加入400μL硅酸四乙酯(TEOS)，再加入200μL3‐氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，继续搅拌反应6小时。反应结束后，对纳米金溶液进行清洗，得到含5‐20nm隔离层的纳米金颗粒。取上述制备的氨基修饰的含隔离层的纳米金溶液，加入4mL 50％戊二醛活化氨基，37℃搅拌12小时，采用50mM pH8.0的磷酸缓冲液清洗三次。

[0055] C.根据纳米金与NSE单克隆抗体所需偶联比例，计算出所需偶联的NSE单抗的量，将NSE单抗(购自fitzgerald，货号：10‐7938)用50mM pH8.0的磷酸缓冲液稀释成所需浓度，缓慢向NSE单抗溶液中滴加入活化后的金纳米粒子。室温下充分搅拌反应两个小时，高速离心洗涤去游离的NSE单抗。

[0056] 1.3用吖啶磺酰胺标记上述偶联了NSE单抗的金纳米粒子：

[0057] 按照吖啶磺酰胺：NSE单克隆抗体为1：20的摩尔比标记上述偶联了NSE单抗的金纳米粒子。将吖啶衍生物用DMSO充分溶解后缓慢滴加入偶联了NSE单抗的金纳米粒子溶液中，4℃下避光反应过夜，透析除去溶液中未结合上的吖啶衍生物。

[0058] 二、以磁珠为固相载体的化学发光分析方法

[0059] 本发明的化学发光分析方法可以用磁性微球为固相载体，本实施例中使用的磁性微球为聚苯乙烯包裹的四氧化三铁的磁纳米颗粒。可以通过氨基的反应将NSE另一株单抗(购自fitzgerald，货号：10‐7937)即捕获分子连接于羧基或氨基修饰的磁性微球表面，也可以通过链霉亲和素和生物素作用将捕获探针结合到链霉亲和素化的磁微珠表面。结合有捕获探针的磁性微球可与目标分析物和致敏金属纳米粒子结合形成“夹心式”免疫复合物，用化学发光进行检测。

[0060] 2.1 固相载体‐捕获分子的制备：

[0061] A.取100mg/mL羧基磁性微球(购自JSR Life Sciences)200ul于圆底烧瓶中，采用50mM pH为5.0的MES缓冲液为反应缓冲液，清洗磁珠3次后，加入5ml反应缓冲液将磁珠重悬，将称取好的EDC用反应缓冲液溶解至20mg/ml,取500ul迅速加入磁珠中(磁珠与EDC的质量比为2：1)，混匀，35℃在搅拌装置上搅拌30分钟。搅拌结束后，磁性分离，吸去上清液，使用反应缓冲液清洗一次。取5ml MES缓冲液，重悬磁珠。取抗体200ul链亲和素(10mg/ml)加入磁珠中，35℃在搅拌装置上搅拌2‐3小时。摇床结束，超声1min,使用洗液清洗，重复此步骤，循环3次。加入8ml磁珠储存液重悬(磁珠终浓度为2.5mg/ml)。

[0062] B.取0.5mL离心管，用生物素进行标记NSE捕获抗体(购自fitzgerald，货号：10‐7937)，标记比例为NSE单抗：生物素＝1mol：20mol。

[0063] 2.2金纳米粒子上包被的NSE单克隆抗体浓度的确定：

[0064] A.分别向4份1mL戊二醛活化的含隔离层的金纳米粒子溶液中加入0.3mg/mL,0.6mg/mL,1.2mg/mL,以及2.4mg/mL的NSE单抗10μL，NSE单抗采用50mM pH8.0的磷酸缓冲液稀释，按照实施例1中所述的条件偶联，得到4中不同比例的NSE单抗包被纳米金。用吖啶磺酰胺进行标记，标记比例为NSE单抗：吖啶磺酰胺＝1mol：20mol，得到四种致敏金纳米粒子。

[0065] B.用NSE稀释液配制浓度梯度为0.025，0.05，0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.125，6.25，12.5，25，50，100，200以及400ng/mL的NSE标准品。在反应杯中，加入链亲和素包被的磁性微球10μL，生物素化的NSE一株单克隆抗体50μL，NSE标准品100μL，以及上述致敏金纳米粒子
10μL(四种致敏金属纳米粒子平行对比)。37℃温浴20min后，用PBS‐T清洗液磁性分离清洗三次。先后加入激发液1和2，激发液1为含有0.5％过氧化氢溶液的0.2M的硝酸溶液；激发液
2为含有1％Tween‐20的0.5M氢氧化钠溶液，用化学发光检测仪测定不同浓度NSE标准品产生的发光值。

[0066] 测试了金纳米粒子上包被不同比例的NSE单克隆抗体对于最终检测结果的影响，由图2可以看出，随着致敏金属纳米粒子制备时NSE抗体和纳米金的比例的从3μg单抗/mL纳米金(1ml纳米金溶液约为17nmol，约为50ug纳米金颗粒)逐渐提升至12μg单抗/mL纳米金时，所测试浓度梯度下的发光值整体呈逐渐上升趋势，而且背景发光值并未显著增加。然而，当比例提高至24μg单抗/mL纳米金时，发光值并未表现出显著增加趋势。根据拟合曲线回算出每个点的回收率，结果见表1，当所选比例为12μg单抗/mL纳米金(50μg)时(即纳米金与单抗的质量比为50：12)，所建立方法的检测范围最宽，具体是在80％‐120％的规定回收率范围内能达到0.1‐400ng/mL。因此，在后续的研究中固定选择该浓度配比。

[0067] 表1 致敏金属纳米粒子上抗体/金纳米粒子的偶联比例对NSE检测回收率的影响[0068]

[0069] 2.3 免疫分析中加入的致敏金属纳米粒子浓度的确定：

[0070] 用PBS缓冲液稀释配制浓度梯度为0.025，0.05，0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.125，6.25，12.5，25，50，100，200以及400ng/mL的NSE标准品。在反应杯中，加入链亲和素包被的磁性微球10μL，生物素化的NSE一株单克隆抗体50μL，NSE标准品100μL，以及不同体积的(10μL，20μL，50μL以及100μL)上述确定包被比例的致敏金属纳米粒子。37℃温浴20min后，用PBS‐T清洗液磁性分离清洗三次。先后加入激发液1和2，用化学发光检测仪测定不同浓度NSE标准品产生的发光值。

[0071] 实验结果如图3所示，随着致敏金属纳米粒子的加样量的逐渐提升，整体的发光值以及本底均呈逐步上升趋势。通过计算回收率来分析不同加样量的检测范围，结果如表2所示，当致敏金属纳米粒子加样量为50μL时，NSE各个浓度点检测的回收率最佳，NSE的检测范围可以进一步优化到0.025‐400ng/mL。

[0072] 表2 致敏金属纳米粒子加样量对NSE检测回收率的影响

[0073]

[0074] 三、双抗夹心法对比实验

[0075] 传统化学发光(CLIA)双抗夹心法，用20nm聚苯乙烯纳米球标记放大体系，以及基于金属增强发光及纳米粒子标记放大的双增强体系的检测结果对比：

[0076] A.传统CLIA双抗夹心法:

[0077] 用PBS缓冲液稀释配制浓度梯度为0.025，0.05，0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.125，6.25，12.5，25，50，100，200以及400ng/mL的NSE标准品。在反应杯中，加入链亲和素包被的磁性微球10μL，生物素化的NSE一株单克隆抗体50μL，NSE标准品100μL，以及直接标记了吖啶衍生物的NSE另一种单克隆抗体。37℃温浴20min后，用PBS‐T清洗液磁性分离清洗三次。
先后加入激发液1和2，用化学发光检测仪测定不同浓度NSE标准品产生的发光值。

[0078] B.聚苯乙烯—SiO2(PS—SiO2)纳米球标记放大体系：

[0079] 硅(PS/SiO2)纳米复合微球的制备:

[0080] 将0.8g十二烷基苯磺酸钠，0.084g碳酸氢钠，2mL苯乙烯单体共同溶于100mL水中,于油浴70℃,通氮气的气氛下搅拌数分钟。待溶液均匀后加入0.3g过硫酸钾,反应2h后加入2mL 3‐甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷,让其继续反应12h,。用1倍甲醇将羟基化聚苯乙烯水胶乳稀释。羟基化聚苯乙烯颗粒凝集析出,离心分离,用甲醇和蒸馏水反复洗涤,烘干待用。采用溶胶‐凝胶法,称取0.2g羟基化聚苯乙烯纳米粒子,将其溶解于2mL的甲苯中,加入2mL四乙氧基硅烷(TEOS),370uL TritonX‐100，反应5h。于另一100mL的锥形瓶中,加入
50mL的无水乙醇,10mL 25％氨水,搅拌数分钟后,两锥形瓶液体混合,继续搅拌24h,离心分离,烘干待用。采用溶胶‐凝胶法制备纳米复合材料,首先将共聚前驱物(PS‐OH)溶解于甲苯中,再加入TEOS,表面活性剂及非水溶性染料苯基卟啉,使之构成了一个稳定的乳液体系。
利用TEOS水解与缩合作用形成PS/sio2纳米复合粒子。最终制得聚苯乙烯纳米球表面具有
20nm二氧化硅隔离层。

[0081] 参照实施例1中氨基化修饰纳米复合粒子二氧化硅隔离层的方法，并采用戊二醛活化氨基。

[0082] 分别向4份1mL戊二醛活化的金纳米粒子中加入0.3mg/mL,0.6mg/mL,1.2mg/mL,以及2.4mg/mL的NSE单抗10μL，NSE单抗采用50mM pH8.0的磷酸缓冲液稀释，按照实施例1中所述的条件偶联，得到4种不同比例的NSE单抗包被纳米复合粒子。用吖啶磺酰胺进行标记，标记比例为NSE单抗：吖啶磺酰胺＝1mol：20mol，即可得到吖啶酯标记的包被了NSE单抗的聚苯乙烯/二氧化硅纳米球，简称致敏聚苯乙烯纳米球。

[0083] 用PBS缓冲液稀释配制浓度梯度为0.025，0.05，0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.125，6.25，12.5，25，50，100，200以及400ng/mL的NSE标准品。在反应杯中，加入链亲和素包被的磁性微球10μL，生物素化的NSE一株单克隆抗体50μL，NSE标准品100μL，以及和前述纳米金双抗夹心实验所用等量检测抗体的致敏聚苯乙烯纳米球。37℃温浴20min后，用PBS‐T清洗液磁性分离清洗三次。先后加入激发液1和2，用化学发光检测仪测定不同浓度NSE标准品产生的发光值，用五参数曲线拟合后计算回收率。

[0084] C.基于金属增强发光及纳米粒子标记放大的双增强体系：

[0085] 用PBS缓冲液稀释配制浓度梯度为0.025，0.05，0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.125，6.25，12.5，25，50，100，200以及400ng/mL的NSE标准品。在反应杯中，加入链亲和素包被的磁性微球10μL，生物素化的NSE另一株单克隆抗体(购自fitzgerald，货号：10‐7937)50μL，NSE标准品100μL，以及含和和前述纳米金双抗夹心实验所用等量检测抗体的致敏金属纳米粒子。37℃温浴20min后，用PBS‐T清洗液磁性分离清洗三次。先后加入激发液1和2，用化学发光检测仪测定不同浓度NSE标准品产生的发光值。

[0086] 以上三个体系中所用的NSE检测抗体的浓度相等。结果如图4所示，在80％‐120％的回收率范围内，传统的双抗夹心法的检测范围下限仅为0.78ng/mL，20nm聚苯乙烯纳米球的标记放大体系的检测范围下限为0.097ng/mL，大约有8倍的提高。聚苯乙烯纳米球的高比表面积使得更多的抗体可以偶联在纳米球上，因此可以形成更多的免疫复合体。另外，抗体以及蛋白包被的纳米球可以提供更多的吖啶衍生物标记位点，增加了发光物质的标记量，从而提高了发光值和灵敏度。利用本发明所述的双增强体系后，检测范围下限为0.024ng/mL，相比较起传统的模式，有了30倍以上的提高。比起聚苯乙烯纳米球的放大体系，也有4倍的提高。这一结果证实了本发明体系的双增强性质，不仅仅实现了纳米球的标记放大增强性能，同时利用金纳米粒子的表面增强发光的特性，进一步大幅提高了灵敏度和发光值。

[0087] 表3 无放大或增强体系、仅聚苯乙烯纳米球放大体系，以及基于金属增强发光及聚苯乙烯纳米球标记放大的双增强体系对NSE检测回收率的影响

[0088]

[0089] 本发明的体系测试测定的血清标本中NSE浓度和罗氏的测定值的相关性对比实验多份血清标本用罗氏相关产品测试NSE含量后，挑选出其中梯度合适的17份。用本发明的体系分别测定NSE含量，作图比较相关性。由图5可见，两种体系表现出良好地相关性，R2值高达0.988。证实了本发明体系以及依据该体系的试剂盒除了具有超高灵敏度，更宽的检测范围外，还有极佳的准确性。

[0090] 实施例2：竞争法及对比实验

[0091] 一、用二氧化硅在纳米金表面形成隔离层并将E2(雌二醇)单抗偶联至隔离层表面：(此处方法与NES夹心法全部相同)

[0092] 1.120nm表面羟基的金纳米粒子的制备：

[0093] A.用去离子水配制1mL浓度为4％的氯金酸溶液。

[0094] B.0.5mL上述氯金酸溶液加入200mL去离子水中充分搅拌并煮沸。

[0095] C.将3ml浓度为1％的柠檬酸钠水溶液快速注入上述沸腾溶液中去。

[0096] D.冷凝回流30分钟。当金纳米粒子形成时，悬浮液的颜色将从深蓝色变为红色。

[0097] E.冷却到室温。

[0098] F.透射电子显微镜下测量所制备金纳米粒子的粒径为13nm。根据粒径和密度计算单个球形金纳米粒子的质量，根据总体系中金元素的质量推算出纳米金溶液中的粒子浓度为17nmol/L。

[0099] 1.2 用二氧化硅在纳米金表面形成隔离层并将E2单抗偶联至隔离层表面：

[0100] A.将40mL上述制备的纳米金溶液分散在80mL乙醇中，加入20mL纯化水，再逐滴加入1mL24％‐28％的浓氨水，加完之后立即迅速加入20μL正硅酸乙酯，期间保持300rpm搅拌1小时，测得反应后粒径为33nm。

[0101] B.将制备得到的上述纳米金溶液清洗3次后，重新分散在80mL纯化水中，加入0.3g十六烷基三甲基溴化铵、60mL乙醇，最后逐滴缓慢加入1.5mL 24％‐28％的浓氨水，300rpm搅拌30分钟。向上述体系中加入400μL硅酸四乙酯(TEOS)，再加入200μL3‐氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，继续搅拌反应6小时。反应结束后，对纳米金溶液进行清洗，得到有5‐20nm隔离层的纳米金颗粒。取上述制备的氨基修饰的纳米金溶液，加入4mL 50％戊二醛活化氨基，37℃搅拌12小时，采用50mM pH8.0的磷酸缓冲液清洗三次。

[0102] C.根据纳米金与E2单克隆抗体所需偶联比例，计算出所需偶联的E2单抗的量，将E2单抗(购自Meridian Life Science，货号：MAS04‐267)用50mM pH8.0的磷酸缓冲液稀释成所需浓度，缓慢向E2单抗溶液中滴加入活化后的金纳米粒子。室温下充分搅拌反应两个小时，高速离心洗涤去游离的E2单抗。

[0103] 1.3 用吖啶磺酰胺标记上述偶联了E2单抗的金纳米粒子：

[0104] 按照吖啶磺酰胺：E2单克隆抗体为1：20的摩尔比标记上述偶联了E2单抗的金纳米粒子。将吖啶衍生物用DMSO充分溶解后缓慢滴加入偶联了E2单抗的金纳米粒子溶液中，4℃下避光反应过夜，透析除去溶液中未结合上的吖啶衍生物。

[0105] 二、以磁珠为固相载体的化学发光分析方法

[0106] 本发明的化学发光分析方法可以用磁性微球磁微珠为固相载体，本实施例中使用的磁性微球为聚苯乙烯包裹的四氧化三铁的磁纳米颗粒。可以通过共价偶联的反应将目标分子或其结构类似物即竞争性捕获分子连接于羧基或氨基修饰的磁性微球表面，或通过链霉亲和素和生物素作用将捕获探针结合到链霉亲和素化的磁微珠表面。结合有竞争性捕获探针的磁微珠和目标分析物与致敏金属纳米粒子竞争结合形成“固相载体‐捕获分子‐目标分析物”和/或“固相载体‐捕获分子‐致敏金纳米粒子免疫复合物”，用化学发光进行检测。

[0107] 2.1 固相载体‐竞争性捕获分子的制备：

[0108] 取100mg/mL羧基磁性微球(购自JSR Life Sciences，货号：MS160/Carboxyl)200ul于圆底烧瓶中，采用50mM pH为5.0的MES缓冲液为反应缓冲液，清洗磁珠3次后，加入
5ml反应缓冲液将磁珠重悬，将称取好的EDC用反应缓冲液溶解至20mg/ml,取500ul迅速加入磁珠中(磁珠与EDC的质量比为2：1)，混匀，35℃在搅拌装置上搅拌30分钟。搅拌结束后，磁性分离，吸去上清液，使用反应缓冲液清洗一次。取5ml MES缓冲液，重悬磁珠。取E2‐BSA(购自sigma，货号：E‐5630，10mg/ml)20μL加入磁珠中，35℃在搅拌装置上搅拌2‐3小时。摇床结束，使用洗液清洗。加入8ml磁珠储存液重悬(磁珠终浓度为2.5mg/ml)。

[0109] 取0.5mL离心管，用生物素进行标记E2捕获抗体(购自fitzgerald，货号：10‐7937)，标记比例为E2单抗：生物素＝1mol：20mol。

[0110] 2.2 金纳米粒子上包被的E2单克隆抗体浓度的确定：

[0111] A.分别向4份1mL戊二醛活化的含隔离层的金纳米粒子中加入0.1mg/mL,0.2mg/mL,0.4mg/mL,以及1mg/mL的E2单抗10μL，E2单抗采用50mM pH8.0的磷酸缓冲液稀释，按照实施例1中所述的条件偶联，得到4中不同比例的E2单抗包被纳米金。用吖啶磺酰胺进行标记，标记比例为E2单抗：吖啶磺酰胺＝1mol：20mol，得到四种致敏金属纳米粒子。

[0112] B.用E2稀释液配制浓度梯度为10，20，37.5，75，150，300，600，1200，1800，2400，3000，3600，4200以及4800pg/mL的E2标准品。在反应杯中，加入E2‐BSA(购自sigma，货号：E‐
5630)包被的磁性微球10μL，E2标准品100μL，以及上述致敏金属纳米粒子10μL(四种致敏金属纳米粒子平行对比)。37℃温浴20min后，用PBS‐T清洗液磁性分离清洗三次。先后加入激发液1和2，用化学发光检测仪测定不同浓度E2标准品产生的发光值。激发液1为含有0.5％过氧化氢溶液的0.2M的硝酸溶液；激发液2为含有1％Tween‐20的0.5M氢氧化钠溶液。

[0113] 测试了金纳米粒子上包被不同比例的E2单克隆抗体对于最终检测结果的影响，随着致敏金属纳米粒子制备时E2抗体和纳米金的比例的从0.1μg抗体/mL纳米金(1ml纳米金溶液约为17nmol，约为50μg纳米金颗粒)逐渐提升至0.2μg抗体/mL纳米金时，所测试浓度梯度出现的灵敏度过高，而上限不够的情况得以改善。然而，当比例提高至0.4μg抗体/mL纳米金时，检测又出现灵敏度不够的现象。根据拟合曲线回算出每个点的回收率，结果见表4，当所选比例为0.2μg抗体/mL纳米金时(即纳米金与单抗的质量比为250:1)，所建立方法的检测范围最宽，具体是在80％‐120％的规定回收率范围内能达到0.1‐400pg/mL。因此，在后续的研究中固定选择该浓度配比。

[0114] 表4 致敏金属纳米粒子上抗体/金纳米粒子的偶联比例对E2检测回收率的影响[0115]

[0116] 2.3 免疫分析中加入的致敏金属纳米粒子浓度的确定：

[0117] 用PBS缓冲液稀释配制浓度梯度为10，20，37.5，75，150，300，600，1200，1800，2400，3000，3600，4200以及4800pg/mL的E2标准品。在反应杯中，加入E2‐BSA包被的磁性微球10μL，E2标准品100μL，以及不同体积的(10μL，20μL，50μL以及100μL)上述确定包被比例的致敏金属纳米粒子。37℃温浴20min后，用PBS‐T清洗液磁性分离清洗三次。先后加入激发液1和2，用化学发光检测仪测定不同浓度E2标准品产生的发光值。

[0118] 实验结果显示，随着致敏金属纳米粒子的加样量的逐渐提升，整体的发光值以及本底均呈逐步上升趋势。通过计算回收率来分析不同加样量的检测范围，结果如表5所示，当致敏金属纳米粒子加样量为20μL时，E2各个浓度点检测的回收率最佳，E2的检测范围可以进一步优化到20‐4800pg/mL。

[0119] 表5 致敏金属纳米粒子加样量对E2检测回收率的影响

[0120]

[0121] 三、竞争法对比实验

[0122] 传统化学发光(CLIA)竞争法，用20nm聚苯乙烯纳米球标记放大体系，以及基于金属增强发光及纳米粒子标记放大的双增强体系的检测结果对比：

[0123] A.传统化学发光竞争法:

[0124] 用PBS缓冲液稀释配制浓度梯度,10，20，37.5，75，150，300，600，1200，1800，2400，3000，3600，4200以及4800pg/mL的E2标准品。在反应杯中，加入E2‐BSA包被的磁性微球10μL，E2标准品100μL，以及直接标记了吖啶磺酰胺的E2单克隆抗体。37℃温浴20min后，用PBS‐T清洗液磁性分离清洗三次。先后加入激发液1和2，用化学发光检测仪测定不同浓度E2标准品产生的发光值。

[0125] B.聚苯乙烯‐二氧化硅(PS/SiO2)纳米球标记放大体系：

[0126] 硅(PS/SiO2)纳米复合微球的制备:

[0127] 将0.8g十二烷基苯磺酸钠，0.084g碳酸氢钠，2mL苯乙烯单体共同溶于100mL水中,于油浴70℃,通氮气的气氛下搅拌数分钟。待溶液均匀后加入0.3g过硫酸钾,反应2h后加入2mL 3‐甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷,让其继续反应12h。用1倍甲醇将羟基化聚苯乙烯水胶乳稀释。羟基化聚苯乙烯颗粒凝集析出，离心分离，用甲醇和蒸馏水反复洗涤,烘干待用。采用溶胶‐凝胶法,称取0.2g羟基化聚苯乙烯纳米粒子，将其溶解于2mL的甲苯中,加入2mL四乙氧基硅烷(TEOS),370uL TritonX‐100，反应5h。于另一100mL的锥形瓶中,加入
50mL的无水乙醇,10mL 25％氨水,搅拌数分钟后,两锥形瓶液体混合,继续搅拌24h，离心分离,烘干待用。利用TEOS水解与缩合作用形成PS/SiO2纳米复合粒子。最终使得聚苯乙烯纳米球表面具有20nm二氧化硅隔离层。

[0128] 参照实施例1中氨基化修饰纳米复合粒子二氧化硅隔离层的方法，并采用戊二醛活化氨基。

[0129] 分别向1mL戊二醛活化的金纳米粒子中加入0.2mg/mL的E2单抗10μL，E2单抗采用50mMpH8.0的磷酸缓冲液稀释，按照实施例1中所述的条件偶联，得到E2单抗包被纳米复合粒子。用吖啶磺酰胺进行标记，标记比例为E2单抗：吖啶磺酰胺＝1mol：20mol，即可得到吖啶酯标记的包被了E2单抗的聚苯乙烯/二氧化硅纳米球，简称致敏聚苯乙烯纳米球。

[0130] 用PBS缓冲液稀释配制浓度梯度,10，20，37.5，75，150，300，600，1200，1800，2400，3000，3600，4200以及4800pg/mL的E2标准品。在反应杯中，加入E2‐BSA包被的磁性微球10μL，E2标准品100μL，以及20μL致敏聚苯乙烯纳米球。37℃温浴20min后，用PBS‐T清洗液磁性分离清洗三次。先后加入激发液1和2，用化学发光检测仪测定不同浓度E2标准品产生的发光值，用五参数曲线拟合后计算回收率。

[0131] C.基于金属增强发光及纳米粒子标记放大的双增强体系：

[0132] 用PBS缓冲液稀释配制浓度梯度为10，20，37.5，75，150，300，600，1200，1800，2400，3000，3600，4200以及4800pg/mL的E2标准品。在反应杯中，加入E2‐BSA的磁性微球10μL，E2标准品100μL，以及含和20μL致敏金属纳米粒子。37℃温浴20min后，用PBS‐T清洗液磁性分离清洗三次。先后加入激发液1和2，用化学发光检测仪测定不同浓度E2标准品产生的发光值。

[0133] 以上三个体系中所用的E2检测抗体的浓度相等。结果显示，在80％‐120％的回收率范围内，传统的竞争法的检测范围下限仅为150pg/mL，20nm聚苯乙烯纳米球的标记放大体系的检测范围下限为37.5pg/mL，大约有4倍的提高。聚苯乙烯纳米球的高比表面积使得更多的抗体可以偶联在纳米球上，因此可以形成更多的免疫复合体。另外，抗体以及隔离层包被的纳米球可以提供更多的吖啶衍生物标记位点，增加了发光物质的标记量，从而提高了发光值和灵敏度。利用本发明所述的双增强体系后，检测范围下限为10pg/mL，相比较起传统的模式，有了15倍以上的提高。比起聚苯乙烯纳米球的放大体系，也有4倍的提高。这一结果证实了本发明体系的双增强性质，不仅仅实现了纳米球的标记放大增强性能，同时利用金纳米粒子的表面增强发光的特性，进一步大幅提高了灵敏度和发光值。

[0134] 表6 无放大或增强体系、仅聚苯乙烯纳米球放大体系，以及基于金属增强发光及聚苯乙烯纳米球标记放大的双增强体系对E2检测回收率的影响

[0135]

[0136] 本发明的体系测试测定的血清标本中E2浓度和贝克曼的测定值的相关性对比实验多份血清标本用贝克曼相关产品测试E2含量后，挑选出其中梯度合适的17份。用本发明的体系分别测定E2含量，作图比较相关性。结果显示，两种体系表现出良好地相关性，R2值高达0.988。证实了本发明体系以及依据该体系的试剂盒除了具有超高灵敏度，更宽的检测范围外，还有极佳的准确性。