3,5-二异戊烯基,2,4,4′-三羟基查尔酮及其衍生物的用途和制备

摘要

本发明属于新化合物制备方法及其抗肿瘤活性测定领域，尤其是一种3,5-二异戊烯基，2,4,4’-三羟基查尔酮及其衍生物的用途和制备，结构式中R1为氢或异戊烯基，R2为氢或异戊烯基，R3为氢或甲基，R4为氢或甲基，R5为氢或甲基，其中R1-R5不同时为氢。其抗肿瘤活性测定所用的三种肿瘤细胞分别为人白血病细胞(K562)、人结肠癌细胞(HT-29)、人肝癌细胞(HepG2)。本申请合成出此类双取代查尔酮类衍生物，部分为首次合成，并进行了体外细胞抗肿瘤活性的测定，结果显示此类部分衍生物对三种肿瘤细胞有一定的抑制活性(IC50

权利要求

1.3,5-二异戊烯基,2,4,4'-三羟基查尔酮在制备治疗肿瘤的药物中的应用，所述

3,5-二异戊烯基，2,4,4’三羟基查尔酮的结构式如下：

2.一种3,5-二异戊烯基,2,4,4'-三羟基查尔酮的衍生物，其特征在于，结构如下：取代基的种类如下：

3.一种制备权利要求2所述的3,5-二异戊烯基,2,4,4'-三羟基查尔酮的衍生物的方法，其特征在于：合成路线如下：

说明书

3,5-二异戊烯基,2,4,4′-三羟基查尔酮及其衍生物的用

途和制备

技术领域

[0001] 本发明属于化合物制备方法及抗肿瘤活性测定领域，尤其3,5-二异戊烯基,2,4,4'-三羟基查尔酮及其衍生物的用途和制备。技术背景

[0002] 查尔酮类化合物广泛存在于自然界中,是一类存在于甘草、红花等多种药用植物的天然有机化合物,其基本骨架结构为1,3-二苯基丙烯酮。由于查尔酮类化合物分子具有较大的柔性，能与不同的受体结合,表现出多方面的生物学活性。近年来科学工作者对其进行了广泛而深入的研究,特别是在抗肿瘤、抗寄生虫、抗HIV、抗炎等多种生物学活性研究与开发上,取得了较快的研究进展。

[0003] 在文献报道的大量查尔酮衍生物中，多数是在A苯环上进行一个单取代基衍生合成，其他是在B环上进行反应衍生取代，A苯环上双取代查尔酮的合成及生物活性的测定及其构效关系的研究报道较少，因此本发明的此类查尔酮衍生物及抗肿瘤活性测定的结果会对查尔酮抗肿瘤机制的及构效关系的研究提供一定的帮助。

[0004] 3,5-二异戊烯基，2,4,4’三羟基查尔酮现有的作用是抗疟疾，申请人通过证实，发现其新功能。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种3,5-二异戊烯基,2,4,4'-三羟基查尔酮及其衍生物的用途和制备，并进行了3,5-二异戊烯基,2,4,4'-三羟基查尔酮体外细胞抗肿瘤活性的测定，所测定的3种肿瘤细胞分别为人白血病细胞(K562)、人结肠癌细胞(HT-29)和人肝癌细胞(HepG2)，结果显示这类衍生物部分具有较好的抗肿瘤生物活性(IC50<10)。

[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

[0007] 本发明的优点和积极效果：

[0008] 1、本发明具有合成路线短、操作简单、反应条件温和、合成工艺和纯化方法简单、收率高等优点。

[0009] 2、本发明合成出大量不同位置、不同取代基的双取代查尔酮类衍生物，并进行了体外细胞抗肿瘤活性的测定，结果显示这类衍生物部分具有较好的抗肿瘤生物活性(IC50<10)。

[0010] 3、抗肿瘤活性测定结果会对查尔酮衍生物构效关系和抗肿瘤机制研究提供帮助。

[0011] 4、本发明具有操作简单、反应条件温和、合成工艺和纯化方法简单、收率高等优点，并且抗肿瘤活性测定结果会对构效关系和抗肿瘤机制研究提供帮助。

附图说明

[0012] 图1为3，5-二异戊烯基,2,4,4'-三羟基查尔酮的核磁共振氢谱。

[0013] 图2为3，5-二异戊烯基,2,4,4'-三甲氧基查尔酮的核磁共振氢谱。

[0014] 图3为3-香叶基，5异戊烯,2,4,4'-三羟基查尔酮的核磁共振氢谱。

[0015] 图4为3-香叶基，5异戊烯,2,4,4'-三甲氧基查尔酮的核磁共振氢谱。

[0016] 图5为3-异戊烯，5-香叶基,2,4,4'-三羟基查尔酮的核磁共振氢谱。

[0017] 图6为3-异戊烯，5-香叶基,2,4,4'-三甲氧基查尔酮的磁共振氢谱。

[0018] 图7为3，5-二香叶基,2,4,4'-三羟基查尔酮的核磁共振氢谱。

[0019] 图8为3，5-二香叶基,2,4,4'-三甲氧基查尔酮的核磁共振氢谱。

[0020] 具体的实施方式

[0021] 为了理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步说明：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

[0022] 本发明所述3,5-二异戊烯基,2,4,4'-三羟基查尔酮在制备质量肿瘤的药物中的应用，所述3,5-二异戊烯基,2,4,4'-三羟基查尔酮的结构式如下：

[0023]

[0024] 一种3,5-二异戊烯基,2,4,4'-三羟基查尔酮的衍生物，及该衍生物在制备质量肿瘤的药物中的应用，结构如下：

[0025]

[0026] 其中R1为氢或异戊烯基，R2为氢或异戊烯基，R3为氢或甲基，R4为氢或甲基，R5为氢或甲基，且R1-R5不同时为氢。

[0027] 3,5-二异戊烯基,2,4,4'-三羟基查尔酮的衍生物的方法，合成路线如下：

[0028]

[0029] 下面通过实施例具体说明制备方法。

[0030] 实施例1

[0031] 具体步骤如下：

[0032] (1)合成中间体2,4-二甲氧基甲醚苯乙酮的合成

[0033] 取2,4-二羟基苯乙酮1.0g(6.57mmol)放入100mL圆底烧瓶中，加入10ml无水DCM，0℃搅拌情况下加入NaH630mg(15.78mmol)后加入氯甲基甲醚1.16g(14.5mmol)，室温下搅拌2h，TLC检测反应完全，后反应倒入冰水中，搅拌15min，然后用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压旋去溶剂，石油醚：乙酸乙酯＝10:1,200目硅胶柱层析纯化，得浅黄色油状物1.45g，产率为90％.

[0034] (2)合成中间体2,4-二甲基甲醚,5-碘苯乙酮的合成

[0035] 10ml 无 水 DMF 溶 解 2,4- 二 甲 氧 基 甲 醚 苯 乙 酮 1g(4.16mmol)，NIS1.03g(4.58mmol)，后升温至50℃，反应2h后，TLC检测反应完全，后反应倒入冰水中，搅拌15min，然后用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压旋去溶剂，石油醚：乙酸乙酯＝10:1,200目硅胶柱层析纯化，得浅黄色油状物1.1g，产率为70％.[0036] (3)合成中间体2,4,4'-三甲氧基甲醚,5-碘查尔酮的合成

[0037] 向在乙醇中的2,4-二甲基甲醚,5-碘苯乙酮(366mg，1mmol)和4-甲氧基甲氧基苯甲醛(174.41mg，1.05mmol)的搅拌的溶液(5mL)溶液中缓慢加入60％KOH(2ml)在0℃，然后将反应混合物温热至室温并搅拌12小时。反应完成后，将反应混合物用乙酸乙酯(3×20mL)萃取。将有机层合并，用饱和氯化钠溶液洗涤，用硫酸钠干燥,过滤,并在真空下浓缩，石油醚：乙酸乙酯＝10:1,200目硅胶柱层析纯化，得到黄色油状物2,4,4'-三甲氧基甲醚,5-碘查尔475mg,产率为92％。

[0038] (4)合成中间体2,4,4'-三甲氧基甲醚,5-异戊烯基查尔酮的合成

[0039] 向在无水DMF(3mL)中的溶液中加入PdCl2(dppf)(36.6mg，0.05mmol)，2,4,4'-三甲氧基甲醚,5-碘查尔酮(514mg，1.0mmol)和异戊烯基硼酸酯(235mg，1.2mmol)的搅拌溶液中，加入碳酸铯(456mg，1.4mmol)。将混合物在70℃下加热通过微波进行2小时。将反应混合物冷却，并通过TLC监测。反应完成后，将反应混合物过滤并在真空下蒸发。石油醚：乙酸乙酯＝10:1,200目硅胶柱层析纯化，得到黄色油状物2,4,4'-三甲氧基甲醚,5-异戊烯基查尔酮384mg，产率为84％。

[0040] (5)合成中间体2-羟基,4,4'-二甲氧基甲醚,5-异戊烯基查尔酮的合成[0041] 2,4,4'-三甲氧基甲醚,5-异戊烯基查尔酮(100mg，0.22mmol)在MeOH(2mL)中的溶液中，在0℃下加入1N盐酸水溶液(1ml)中搅拌15min后，通过TLC监测，将MeOH在真空下除去。乙酸乙酯(10mL)中，然后加入并分离各层。水层用乙酸乙酯(2×10ml)萃取，合并有机层，用MgSO4干燥，真空浓缩，石油醚：乙酸乙酯＝10:1,200目硅胶柱层析纯化，得到黄色固体53mg，产率为75％。

[0042] (6)合成中间体2-O-异戊烯基,4,4'-二甲氧基甲醚,5-异戊烯基查尔酮的合成[0043] 2-羟基,4,4'-二甲氧基甲醚,5-异戊烯基查尔酮(480mg，1mmol)和NaH(52mg，1.3mmol)在无水DMF中的搅拌的溶液(5mL)溶液中缓慢加入异戊烯基溴(282mg，1.3mmol)在0℃搅拌2小时。将反应混合物通过TLC监测。反应完成后，将反应混合物用水稀释，用CH2Cl2(20ml)中。将有机层用H2O(3×10ml)洗涤，经Mg2SO4并减压浓缩。石油醚：乙酸乙酯＝10:1,200目硅胶柱层析纯化，得到无色油状物550mg，产率为：89％。

[0044] (7)合成中间体2-羟基-3,5-二异戊烯基,4,4'-二甲氧基甲醚查尔酮的合成[0045] 向在无水甲苯15mL加入2-异戊烯基,4,4'-二甲氧基甲醚,5-异戊烯基查尔酮(617mg，1mmol)的搅拌溶液中的溶液中缓慢加入100-200目 室温，然后将反应混合物在140℃进行4小时，反应完成后后，将反应混合物在真空下浓缩，石油醚：乙酸乙酯＝10:1,200目硅胶柱层析纯化，得到黄色油状物60mg，产率为9％。

[0046] (8)合成2,4,4'-三羟基-3,5-二异戊烯基查尔酮的合成

[0047] 0℃下加入2-羟基-3-异戊烯基,4,4'-二甲氧基甲醚,5-异戊烯基查尔酮(60mg，0.1mmol)在THF(6mL)中的溶液中，加入98％H2SO4(0.5ml)，异丙醇(1ml)中，于室温下搅拌2小时后，通过TLC监测，反应完成后，将反应混合物在真空下浓缩，石油醚：乙酸乙酯＝
10:1,200目硅胶柱层析纯化，得到黄色固体45mg，产率为79％。

[0048] 1H NMR(DMSO400MHz):δ/ppm1.33(t,3H,J ＝ 7.2,CH3),4.39(m,2H,J ＝7.2),7.92(s,1H,ArH),8.08(s,1H,ArH),10.95(s,1H,NH).

[0049] (9)合成2,4,4'-三甲氧基-3,5-二异戊烯基查尔酮的合成

[0050] 2,4,4'-三羟基-3,5-二异戊烯基查尔酮(480mg，1mmol)和NaH(52mg，1.3mmol)在无水DMF中的搅拌的溶液(5mL)溶液中缓慢加入碘甲烷(282mg，1.3mmol)在0℃搅拌2小时。将反应混合物通过TLC监测。反应完成后，将反应混合物用水稀释，用CH2Cl2(20ml)中。将有机层用H2O(3×10ml)洗涤，经Mg2SO4并减压浓缩。石油醚：乙酸乙酯＝10:1,200目硅胶柱层析纯化，得到黄色油状物550mg，产率为：89％。

[0051] (10)合成中间体2,4,4'-三甲氧基甲醚,5-香叶基查尔酮的合成

[0052] 向在无水DMF(3mL)中的溶液中加入PdCl2(dppf)(36.6mg，0.05mmol)，2,4,4'-三甲氧基甲醚,5-碘查尔酮(514mg，1.0mmol)和香叶基硼酸酯(335mg，1.2mmol)的搅拌溶液中，加入碳酸铯(456mg，1.4mmol)。将混合物在70℃下加热通过微波进行2小时。将反应混合物冷却，并通过TLC监测。反应完成后，将反应混合物过滤并在真空下蒸发。石油醚：乙酸乙酯＝10:1,200目硅胶柱层析纯化，得到黄色油状物2,4,4'-三甲氧基甲醚,5-香叶基查尔酮384mg，产率为84％。

[0053] (11)合成中间体2-羟基,4,4'-二甲氧基甲醚,5-香叶基查尔酮的合成[0054] 2,4,4'-三甲氧基甲醚,5-香叶基查尔酮(100mg，0.22mmol)在MeOH(2mL)中的溶液中，在0℃下加入1N盐酸水溶液(1ml)中搅拌15min后，通过TLC监测，将MeOH在真空下除去。乙酸乙酯(10mL)中，然后加入并分离各层。水层用乙酸乙酯(2×10ml)萃取，合并有机层，用MgSO4干燥，真空浓缩，石油醚：乙酸乙酯＝10:1,200目硅胶柱层析纯化，得到黄色固体53mg，产率为75％。

[0055] (12)合成中间体2-O-异戊烯基,4,4'-二甲氧基甲醚,5-香叶基查尔酮的合成[0056] 2-羟基,4,4'-二甲氧基甲醚,5-香叶基查尔酮(480mg，1mmol)和NaH(52mg，1.3mmol)在无水DMF中的搅拌的溶液(5mL)溶液中缓慢加入异戊烯基溴(282mg，1.3mmol)在0℃搅拌2小时。将反应混合物通过TLC监测。反应完成后，将反应混合物用水稀释，用CH2Cl2(20ml)中。将有机层用H2O(3×10ml)洗涤，经Mg2SO4并减压浓缩。石油醚：乙酸乙酯＝10:1,200目硅胶柱层析纯化，得到无色油状物550mg，产率为：89％。

[0057] (13)合成中间体2-羟基-3-异戊烯基,4,4'-二甲氧基甲醚,5-香叶基查尔酮的合成

[0058] 向在无水甲苯15mL加入2-O-异戊烯基,4,4'-二甲氧基甲醚,5-香叶基查尔酮(617mg，1mmol)的搅拌溶液中的溶液中缓慢加入100-200目 室温，然后将反应混合物在140℃进行4小时，反应完成后后，将反应混合物在真空下浓缩，石油醚：乙酸乙酯＝10:1,200目硅胶柱层析纯化，得到黄色油状物60mg，产率为9％。

[0059] (14)合成2,4,4'-三羟基-3-异戊烯基,5-香叶基查尔酮的合成

[0060] 0℃下加入2-羟基-3-异戊烯基,4,4'-二甲氧基甲醚,5-香叶基查尔酮(60mg，0.1mmol)在THF(6mL)中的溶液中，加入98％H2SO4(0.5ml)，异丙醇(1ml)中，于室温下搅拌2小时后，通过TLC监测，反应完成后，将反应混合物在真空下浓缩，石油醚：乙酸乙酯＝
10:1,200目硅胶柱层析纯化，得到黄色固体45mg，产率为79％。

[0061] (15)合成2,4,4'-三甲氧基-3-异戊烯基5-香叶基查尔酮的合成

[0062] 2,4,4'-三羟基-3-异戊烯基5-香叶基查尔酮(480mg，1mmol)和NaH(52mg，1.3mmol)在无水DMF中的搅拌的溶液(5mL)溶液中缓慢加入碘甲烷(282mg，1.3mmol)在
0℃搅拌2小时。将反应混合物通过TLC监测。反应完成后，将反应混合物用水稀释，用CH2Cl2(20ml)中。将有机层用H2O(3×10ml)洗涤，经Mg2SO4并减压浓缩。石油醚：乙酸乙酯＝10:1,200目硅胶柱层析纯化，得到黄色油状物550mg，产率为：89％。

[0063] (16)合成中间体2-O-香叶基,4,4'-二甲氧基甲醚,5-异戊烯基查尔酮的合成[0064] 2-羟基,4,4'-二甲氧基甲醚,5-异戊烯基查尔酮(480mg，1mmol)和NaH(52mg，1.3mmol)在无水DMF中的搅拌的溶液(5mL)溶液中缓慢加入香叶基溴(282mg，1.3mmol)在0℃搅拌2小时。将反应混合物通过TLC监测。反应完成后，将反应混合物用水稀释，用CH2Cl2(20ml)中。将有机层用H2O(3×10ml)洗涤，经Mg2SO4并减压浓缩。石油醚：乙酸乙酯＝10:1,200目硅胶柱层析纯化，得到无色油状物550mg，产率为：89％。

[0065] (17)合成中间体2-羟基,3-香叶基,4,4'-二甲氧基甲醚,5-异戊烯基查尔酮的合成

[0066] 向在无水甲苯15mL加入2-O-香叶基,4,4'-二甲氧基甲醚,5-异戊烯基查尔酮(617mg，1mmol)的搅拌溶液中的溶液中缓慢加入100-200目 室温，然后将反应混合物在140℃进行4小时，反应完成后后，将反应混合物在真空下浓缩，石油醚：乙酸乙酯＝10:1,200目硅胶柱层析纯化，得到黄色油状物60mg，产率为9％。

[0067] (18)合成2,4,4'-三羟基-3-香叶基,5-异戊烯基查尔酮的合成

[0068] 0℃下加入2-羟基,3-香叶基,4,4'-二甲氧基甲醚,5-异戊烯基查尔酮(60mg，0.1mmol)在THF(6mL)中的溶液中，加入98％H2SO4(0.5ml)，异丙醇(1ml)中，于室温下搅拌2小时后，通过TLC监测，反应完成后，将反应混合物在真空下浓缩，石油醚：乙酸乙酯＝
10:1,200目硅胶柱层析纯化，得到黄色固体45mg，产率为79％。

[0069] (19)合成2,4,4'-甲氧基-3-香叶基,5-异戊烯基查尔酮的合成

[0070] 2,4,4'-三羟基-3,5-二异戊烯基查尔酮(480mg，1mmol)和NaH(52mg，1.3mmol)在无水DMF中的搅拌的溶液(5mL)溶液中缓慢加入碘甲烷(282mg，1.3mmol)在0℃搅拌2小时。将反应混合物通过TLC监测。反应完成后，将反应混合物用水稀释，用CH2Cl2(20ml)中。将有机层用H2O(3×10ml)洗涤，经Mg2SO4并减压浓缩。石油醚：乙酸乙酯＝10:1,200目硅胶柱层析纯化，得到黄色油状物550mg，产率为：89％。

[0071] (20)合成中间体2-O-香叶基,4,4'-二甲氧基甲醚,5-香叶基查尔酮的合成[0072] 2-羟基,4,4'-二甲氧基甲醚,5-香叶基查尔酮(480mg，1mmol)和NaH(52mg，1.3mmol)在无水DMF中的搅拌的溶液(5mL)溶液中缓慢加入香叶基(282mg，1.3mmol)在
0℃搅拌2小时。将反应混合物通过TLC监测。反应完成后，将反应混合物用水稀释，用CH2Cl2(20ml)中。将有机层用H2O(3×10ml)洗涤，经Mg2SO4并减压浓缩。石油醚：乙酸乙酯＝10:1,200目硅胶柱层析纯化，得到无色油状物550mg，产率为：89％。

[0073] (21)合成中间体2-羟基-3,5-二香叶基,4,4'-二甲氧基甲醚查尔酮的合成[0074] 向在无水甲苯15mL加入2-O-香叶基,4,4'-二甲氧基甲醚,5-香叶基查尔酮(617mg，1mmol)的搅拌溶液中的溶液中缓慢加入100-200目 室温，然后将反应混合物在140℃进行4小时，反应完成后后，将反应混合物在真空下浓缩，石油醚：乙酸乙酯＝10:1,200目硅胶柱层析纯化，得到黄色油状物60mg，产率为9％。

[0075] (22)合成2,4,4'-三羟基-3,5-二香叶基查尔酮的合成

[0076] 0℃下加入2-羟基-3-香叶基,4,4'-二甲氧基甲醚,5-香叶基查尔酮(60mg，0.1mmol)在THF(6mL)中的溶液中，加入98％H2SO4(0.5ml)，异丙醇(1ml)中，于室温下搅拌2小时后，通过TLC监测，反应完成后，将反应混合物在真空下浓缩，石油醚：乙酸乙酯＝
10:1,200目硅胶柱层析纯化，得到黄色固体45mg，产率为79％。

[0077] (23)合成2,4,4'-三甲氧基-3,5-二香叶基查尔酮的合成

[0078] 2,4,4'-三羟基-3-异戊烯基5-香叶基查尔酮(480mg，1mmol)和NaH(52mg，1.3mmol)在无水DMF中的搅拌的溶液(5mL)溶液中缓慢加入碘甲烷(282mg，1.3mmol)在
0℃搅拌2小时。将反应混合物通过TLC监测。反应完成后，将反应混合物用水稀释，用CH2Cl2(20ml)中。将有机层用H2O(3×10ml)洗涤，经Mg2SO4并减压浓缩。石油醚：乙酸乙酯＝10:1,200目硅胶柱层析纯化，得到黄色油状物550mg，产率为：89％。

[0079] 实施例7

[0080] 溶液的配制：

[0081] DMEM low glucose培养液的配制：购买HyClone MEM low glucose培养基，每瓶500mL，加入10％的胎牛血清和1％的青链霉素溶液，即每瓶培养基加入50mL的胎牛血清和
5mL的青链霉素，培养基的配置在超净工作台中进行，后放置冰箱4℃保存。

[0082] DMEM/F-12培养液的配制：购买HyClone MEM/F-12培养基，每瓶500mL，加入10％的胎牛血清和1％的青链霉素溶液，即每瓶培养基加入50mL的胎牛血清和5mL的青链霉素，培养基的配置在超净工作台中进行，后放置冰箱4℃保存。

[0083] PBS缓冲液的配制：在1000mL锥形瓶中，称取氯化钠8g，氯化钾0.2g，十二水合磷酸氢二钠2.9g，磷酸二氢钾0.2g，加入800mL纯净水充分搅拌溶解后定容至1000mL，高压灭菌后放置冰箱4℃保存。

[0084] MTT溶液的配制：称取MTT干粉0.5g，溶于100mL PBS缓冲液中，用0.22μM滤膜过滤除菌后，放置冰箱-12℃保存。

[0085] 抗肿瘤活性测定的具体步骤：

[0086] 本发明抗肿瘤活性测定所用3肿瘤细胞：人肝癌细胞(HepG2)、白血病细胞(K562)和人结肠癌细胞(HT-29)。

[0087] 利用人肝癌细胞HepG2活性测试

[0088] HepG2细胞使用的培养液为含1％的青霉素-链霉素溶液，10％的胎牛血清的DMEM细胞培养液，培养条件为37℃、含5％CO2的恒温培养箱。具体步骤：

[0089] (1)用血球计数板对细胞进行计数后，用用DMEM low glucose培养液将其稀释至4
5x10个/mL；

[0090] (2)在96孔板的每个孔里加入100μL细胞悬液吹打混匀，培养箱37℃温育24h；

[0091] (3)将所要测试化合物稀释至5种浓度：2mM,0.2mM,20μM,2μM,0.2μM，按照浓度依次加药0.5μL/孔，培养箱37℃温育48h；

[0092] (4)加入浓度为5mg/mL的MTT，培养箱37℃温育4h；

[0093] (5)加DMSO将细胞溶解，酶标仪测490nm和630nm下的OD值；

[0094] (6)处理数据，根据OD值计算IC50值。

[0095] 利用利用人白血病细胞K562活性测试

[0096] K562细胞使用的培养液为含1％的青霉素-链霉素溶液，10％的胎牛血清的PRMI1640细胞培养液，培养条件为37℃、含5％CO2的恒温培养箱。具体步骤：

[0097] (1)用血球计数板对细胞进行计数后，用RPMI培养液将其稀释至5x104个/mL；

[0098] (2)在96孔板的每个孔里加入100μL细胞悬液，培养箱37℃温育2h；

[0099] (3)将所要测试化合物稀释至5种浓度：2mM,0.2mM,20μM,2μM,0.2μM，按照浓度依次加药0.5μL/孔，培养箱37℃温育48h；

[0100] (4)加入浓度为5mg/mL的MTT，培养箱37℃温育4小时；

[0101] (5)加异丙醇与盐酸裂解液，酶标仪测570nm和630nm下的OD值；

[0102] (6)处理数据，根据OD值计算IC50值。

[0103] 利用利用人白血病细胞HT-29活性测试

[0104] HT-29细胞使用的培养液为含1％的青霉素-链霉素溶液，10％的胎牛血清的DMEM/F-12细胞培养液，培养条件为37℃、含5％CO2的恒温培养箱。具体步骤：

[0105] (1)用血球计数板对细胞进行计数后，用用DMEM/F-12培养液将其稀释至5x104个/mL；

[0106] (2)在96孔板的每个孔里加入100μL细胞悬液吹打混匀，培养箱37℃温育24h；

[0107] (3)将所要测试化合物稀释至5种浓度：2mM,0.2mM,20μM,2μM,0.2μM，按照浓度依次加药0.5μL/孔，培养箱37℃温育48h；

[0108] (4)加入浓度为5mg/mL的MTT，培养箱37℃温育4h；

[0109] (5)加DMSO将细胞溶解，酶标仪测490nm和630nm下的OD值；

[0110] (6)处理数据，根据OD值计算IC50值。

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[0112] 表1为合成的进行抗肿瘤活性测定的化合物

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[0114] 表2为化合物抗肿瘤活性测定的结果

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