负载吉西他滨的PEG化肽类树状大分子靶向给药系统及其制备方法

摘要

本发明为了解决树状大分子给药系统抗癌特异性的问题，提供了一种负载吉西他滨的PEG化肽类树状大分子靶向给药系统及其制备方法。其特征在于：给药系统为抗肿瘤药物吉西他滨、靶向功能性因子GFLG和PEG化多肽类树状大分子的偶联物，通过GFLG将吉西他滨和PEG化肽类树状大分子相连接后形成功能化树状大分子，在获得良好生物相容性的同时，使同等剂量的药物达到明显的抗肿瘤疗效。

权利要求

1.负载吉西他滨的PEG化肽类树状大分子靶向给药系统的制备方法，其特征在于：给药系统为抗肿瘤药物吉西他滨、靶向功能性因子GFLG和PEG化肽类树状大分子的偶联物，其结构如下：其中，A的结构为：

B为PEG化的3~5代肽类树状大分子，树状大分子的末端氨基与基团A连接；

先在吉西他滨与GFLG的偶联物上引入甲基乙烯基，得到偶联物MA-GFLG-GEM，备用；再将作为载体的肽类树状大分子炔基化，在树状大分子上引入三苯甲硫基，得到炔基三苯甲硫基树状大分子，脱去三苯甲基后，与偶联物MA-GFLG-GEM发生偶联反应，得到炔基化树状大分子与吉西他滨的偶联物，最后经PEG化得成品。

2.根据权利要求1所述的负载吉西他滨的PEG化肽类树状大分子靶向给药系统的制备方法，其特征在于：所述肽类树状大分子的末端总共连接有1个或者多个所述的A基团。

3.根据权利要求1所述的负载吉西他滨的PEG化肽类树状大分子靶向给药系统的制备方法，其特征在于：所述的肽类树状大分子为赖氨酸或者谷氨酸的肽类树状大分子。

4.根据权利要求1所述的负载吉西他滨的PEG化肽类树状大分子靶向给药系统的制备方法，其特征在于：所述PEG化肽类树状大分子靶向给药系统的颗粒粒径为80~130 nm。

5.根据权利要求1所述的负载吉西他滨的PEG化肽类树状大分子靶向给药系统的制备方法，其特征在于：具体操作步骤如下： A MA-GFLG-GEM偶联物的制备

以Boc-GFLG-OMe为原料，与甲基乙烯酰氯反应制得MA-GFLG-OH，后MA-GFLG-OH与N，N-二异丙基乙胺、四氢噻唑-2-硫酮反应，反应结束后，将反应产物、吉西他滨盐酸盐、吡啶溶解在无水二甲亚砜中，避光反应，反应所得产物为MA-GFLG-GEM偶联物；

B炔基化树状大分子的合成

以Boc与Cbz基团保护的树状大分子为原料，在氢气氛围下与Pb/C反应，反应结束后，将反应产物溶解在DMF当中，体系中加入N，N-二异丙基乙胺、己炔酸、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三唑，在氮气保护下反应，反应所得产物为炔基化树状大分子；

C 炔基三苯甲硫基树状大分子的合成

炔基化树状大分子溶解在无水二氯甲烷与三氟乙酸的混合溶剂中，体系在氮气保护下反应，将反应产物溶解在无水DMF中，体系中加入N，N-二异丙基乙胺、3-三苯甲硫基丙酸、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三唑，在氮气保护下反应，反应所得产物为炔基三苯甲硫基树状大分子；

D 炔基化树状大分子-吉西他滨偶联物的合成

炔基三苯甲硫基树状大分子溶解在无水二氯甲烷与三氟乙酸的混合溶剂中，体系在氮气保护下反应；当溶液转为黄绿色后，体系加入三乙基硅烷，反应结束后，将反应产物溶解在无水DMF当中，溶液中加入偶联物MA-GFLG-GEM、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯，在氮气保护下避光反应，反应所得产物为炔基化树状大分子-吉西他滨偶联物；

E PEG化树状大分子

在氮气气氛下，将炔基化树状大分子-吉西他滨偶联物、CuSO4·5H2O、N3-mPEG、抗坏血酸钠加入到DMF 和H2O的混合溶剂当中，反应体系避光反应，反应结束后，产物经提纯、透析、冻干得到PEG化树状大分子-吉西他滨偶联物。

6.根据权利要求5所述的负载吉西他滨的PEG化肽类树状大分子靶向给药系统的制备方法，其特征在于：所述的B和C步骤，体系在氮气保护下反应结束后，溶液用乙酸乙酯稀释，并依次用NaHCO3、HCl、NaHCO3、NaCl洗涤，有机相用无水MgSO4干燥，并用减压蒸馏除去溶剂，残留物经重结晶，得到产物。

7.根据权利要求5所述的负载吉西他滨的PEG化肽类树状大分子靶向给药系统的制备方法，其特征在于：所述的D步骤，溶液中加入偶联物MA-GFLG-GEM、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯后，在氮气保护及室温下避光反应0.1~90小时。

8.根据权利要求5所述的负载吉西他滨的PEG化肽类树状大分子靶向给药系统的制备方法，其特征在于：所述的D步骤，反应结束后，反应液逐滴加入到乙酸乙酯当中，析出物通过离心、提纯、干燥，得到炔基化树状大分子-吉西他滨偶联物。

说明书

负载吉西他滨的PEG化肽类树状大分子靶向给药系统及其制

备方法

技术领域

[0001] 本发明属于高分子靶向纳米载体的制备领域，具体涉及负载吉西他滨的PEG化肽类树状大分子靶向给药系统及其制备方法。

背景技术

[0002] 由于可精确控制的尺寸，低分散度以及可多功能化改性的表面，使得树状大分子（dendrimer）与传统的胶体或者大分子运载体系相比，有望改善抗癌药物的相关性质，如药物动力学，因此其非常适用于作为载体以传递抗癌药物。由于肽类树状大分子融合了树状大分子以及肽类分子两者的特点，而获得了水溶性，生物可降解性，生物相容性以及免疫相容性等优势，所以在最近一段时间里，肽类树状大分子作为一种药物载体获得了很大的关注。尽管有着极大的优势，但是因为这种类型的药物控释体系很容易在体内循环的时候被快速的代谢掉，其体内应用依然面临着极大的挑战和局限性。虽然这种被快速代谢的情况可以通过提高树状大分子的代数来避免，但是合成上的难度以及相应产生的毒性却是不可避免的。

[0003] 为了避免上述问题，将聚乙二醇（PEG）链段引入树状大分子的球状表面，从而制备出了基于树状大分子的纳米颗粒体系。这种体系由于其分子量和尺寸相较于单纯的树状大分子有一定程度的增加，从而在降低系统毒性的同时获得更长的血液循环时间和更好的肿瘤组织富集程度。同时，PEG化还可以防止网状内皮组织对于树状大分子的早期清除。因此，PEG化的肽类树状大分子是一种很具有吸引力的药物控释体系，如“Development of efficient acid cleavable multifunctional prodrugs derived from dendritic polyglycerol with a poly(ethylene glycol) shell”（Journal of Controlled Release. 2011;151:295-301），“Dendrimers of citric acid and poly(ethylene glycol) as the new drug-delivery agents”（Biomaterials. 2005;26:1175-83），“Pharmacokinetics and tumor disposition of PEGylated, methotrexate conjugated poly-L-lysine dendrimers”（Molecular Pharmaceutics. 2009;6:1190-204）。然而，目前PEG化数树大分子给药系统的环境敏感键为pH响应，即利用肿瘤组织以及肿瘤细胞内部的酸性进行控制释放，由于在肿瘤组织当中的pH值也会对使敏感键断裂，自由药物不可避免的会在肿瘤组织当中扩散，增加其溢出肿瘤组织，重新回到血管当中的机率，从而降低其抗癌特异性。

[0004] 作为药物载体，用于癌症治疗的基于树状大分子的纳米颗粒必须有选择的将自由药物释放进入到肿瘤组织或者肿瘤细胞当中，这样才能够集大程度地提升抗肿瘤效果以及降低药物的副作用。酶敏感体系是一种高效的，具有选择性的药物传输体系，其通过只能被肿瘤细胞特异性分泌的酶所裂解的连接点与药物相连接。Cathepsin B 是一种在大多数肿瘤细胞和肿瘤上皮细胞里面过度表达的溶酶体半胱氨酸蛋白酶。GFLG (Gly-Phe-Leu-Gly) 是一种对应于cathepsin B的基质，其作为一种特异性断裂短肽已经被应用于多种聚合物药物当中。这种四肽序列在血浆和血清当中都有着很好的稳定性，并且可以在内吞作用之后在溶酶体当中释放药物。

发明内容

[0005] 本发明为了解决数树大分子给药系统抗癌特异性的问题，本发明提供了一种负载吉西他滨的PEG化肽类树状大分子靶向给药系统及其制备方法。通过GFLG将吉西他滨和PEG化肽类树状大分子相连接后形成功能化树状大分子，在获得良好生物相容性的同时，使同等剂量的药物达到明显的抗肿瘤疗效。

[0006] 基于GFLG体系的释药体系是针对肿瘤细胞特有的酶进行断裂，即释药体系必须进入肿瘤细胞之后才发生特异性反应，因此其抗癌特异性得到有效保证。

[0007] 为实现上述发明目的，本发明采用如下的技术方案：

[0008] 负载吉西他滨的PEG化肽类树状大分子靶向给药系统，其特征在于：给药系统为抗肿瘤药物吉西他滨、靶向功能性因子GFLG和PEG化肽类树状大分子的偶联物，其结构如下：

[0009]

[0010] 其中，A的结构为：

[0011]

[0012] B为PEG化的3~5代肽类树状大分子，树状大分子的末端氨基与基团A连接。

[0013] 树状大分子必须依靠较大的尺寸才能体现出EPR效应（肿瘤细胞的增强渗透滞留效应）以及避免被过早的代谢。尽管高代数的树状大分子拥有较大的尺寸，但随之而来的却是更高的系统毒性。

[0014] 本发明所述肽类树状大分子的末端总共连接有1个或者多个所述的A基团。

[0015] 本发明所述的肽类树状大分子为赖氨酸或者谷氨酸的肽类树状大分子。

[0016] 本发明所述PEG化肽类树状大分子靶向给药系统的颗粒粒径为80~130 nm。该粒径可有效利用肿瘤组织血管壁疏松的特点，通过EPR效应，达到给药系统在肿瘤组织的高富集; 同时又可以有效延长其在体内的循环时间，从而有望展现出良好的抗肿瘤效果。

[0017] 本发明给药系统的载体为肽类树状大分子，具有单分散性，外围可修饰官能团较多，类蛋白的结构，其在体内的分解产物为天然氨基酸，生物安全性高；PEG链段的引入可以提高整个体系的水溶性，同时可以帮助较低代数的树状大分子在不提高代数的前提下获得较大的纳米尺寸，提高整个体系的生物安全性，并且由于PEG的外部修饰，使得释药体系不易被网状内皮细胞所捕捉，在此基础上，由于PEG的引入，使体系拥有了亲水区域，可以利用亲疏水作用自组装形成纳米颗粒；GFLG的引入使材料拥有了针对肿瘤细胞的特异性酶敏感特性，使其可以在进入肿瘤细胞之前较为稳定，而在进入细胞之后发生特异性的酶水解反应，起到特异性的抗癌作用。

[0018] 吉西他滨的毒性较小，是目前很多癌症化疗的一线药物，其分子结构中带有胺基，可以和GFLG末端的羧基形成酰胺键，使其在断裂时释放原药。另外，吉西他滨的分子体积较小，受空间位阻的影响小，其体外特异性断裂效率明显提高。

[0019] 本发明负载吉西他滨的肽类树状大分子靶向给药系统的制备方法，其特征在于：先在吉西他滨（GEM）与GFLG的偶联物上引入甲基乙烯基（MA），得到偶联物MA-GFLG-GEM，备用；再将作为载体的肽类树状大分子炔基化，在树状大分子上引入三苯甲硫基，得到炔基三苯甲硫基树状大分子，脱去三苯甲基后，与偶联物MA-GFLG-GEM发生偶联反应，得到炔基化树状大分子与吉西他滨的偶联物，最后经PEG化得成品。

[0020] 本发明在吉西他滨与GFLG的偶联物上引入MA（甲基乙烯基），并在树状大分子上引入三苯甲硫基，三苯甲基（Trt）作为巯基的保护基，脱去Trt后，MA的双键与巯基发生偶联反应，得到炔基化树状大分子与吉西他滨的偶联物。

[0021] 同时，采用炔基化树状大分子，通过氨基与羧基的缩合反应形成酰胺键，从而使树状大分子的外围带上炔基，为后面的PEG化提供点击反应的反应位点，为铜催化的炔-叠氮点击环加成（CuAAC）反应，有效的降低不必要的副反应以及保持树状大分子的低分散度。

[0022] 本发明的PEG化肽类大分子的制备方法具体操作步骤如下：

[0023]  A MA-GFLG-GEM偶联物的制备

[0024] 以Boc-GFLG-OMe为原料，与甲基乙烯酰氯反应制得MA-GFLG-OH，后MA-GFLG-OH与N，N-二异丙基乙胺、四氢噻唑-2-硫酮反应，反应结束后，将反应产物、吉西他滨盐酸盐、吡啶溶解在无水二甲亚砜中，避光反应，反应所得产物为MA-GFLG-GEM偶联物；

[0025] B炔基化树状大分子的合成

[0026] 以Boc与Cbz基团保护的树状大分子为原料，在氢气氛围下与Pb/C反应，反应结束后，将反应产物溶解在DMF当中，体系中加入N，N-二异丙基乙胺、己炔酸、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三唑，在氮气保护下反应，反应所得产物为炔基化树状大分子；

[0027] 这一步通过氨基与羧基的缩合反应形成酰胺键，脱去Cbz，从而使树状大分子的外围带上炔基，为后面的PEG化提供点击反应的反应位点。

[0028] C 炔基三苯甲硫基树状大分子的合成

[0029] 炔基化树状大分子溶解在无水二氯甲烷与三氟乙酸的混合溶剂中，体系在氮气保护下反应，将反应产物溶解在无水DMF中，体系中加入N，N-二异丙基乙胺、3-三苯甲硫基丙酸、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三唑，在氮气保护下反应，反应所得产物为炔基三苯甲硫基树状大分子；

[0030] 引入三苯甲硫基的目的在于在树状大分子外围引入巯基，三苯甲基（Trt）是作为巯基的保护基而存在。引入巯基的目的是可以和吉西他滨偶联物上MA（甲基乙烯基）的双键发生巯-烯反应。

[0031] D 炔基化树状大分子-吉西他滨偶联物的合成

[0032] 炔基三苯甲硫基树状大分子溶解在无水二氯甲烷与三氟乙酸的混合溶剂中，体系在氮气保护下反应；当溶液转为黄绿色后，体系加入三乙基硅烷，反应结束后，将反应产物溶解在无水DMF当中，溶液中加入偶联物MA-GFLG-GEM、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯，在氮气保护下避光反应，反应所得产物为炔基化树状大分子-吉西他滨偶联物；

[0033] 因为巯基-乙烯基偶联反应本身就是一个类似于点击反应的高效反应，在某些结构中甚至是定量反应。依靠这一反应类型，可以通过简单的反应投料比的改变来改变阿霉素对于炔基化树状大分子的修饰程度，从而改变最终材料的载药量。

[0034] 用TFA（三氟乙酸）的目的在于去除巯基保护剂：三苯甲基，使巯基暴露出来。在DBU的作用下，MA-GFLG-GEM中MA的双键与巯基发生偶联反应。

[0035] 加入三乙基硅烷的目的在于捕捉反应过程当中产生的正离子，促进反应的进行，必须等到变成黄绿色之后才能加入，否则不能起到脱除保护剂的作用。

[0036] E PEG化树状大分子

[0037] 在氮气气氛下，将炔基化树状大分子-吉西他滨偶联物、CuSO4·5H2O、N3-mPEG、抗坏血酸钠加入到DMF 和H2O的混合溶剂当中，反应体系避光反应，反应结束后，产物经提纯、透析、冻干得到PEG化树状大分子-吉西他滨偶联物。

[0038] 优选地，所述的B和C步骤，体系在氮气保护下反应结束后，溶液用乙酸乙酯稀释，并依次用NaHCO3、HCl、NaHCO3、NaCl洗涤，有机相用无水MgSO4干燥，并用减压蒸馏除去溶剂，残留物经重结晶，得到产物。

[0039] 利用反复洗涤和萃取的方法可以有效去除杂质并且减少纯化步骤，利于合成量的放大。

[0040] 优选地，所述的D步骤，溶液中加入偶联物MA-GFLG-GEM、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯后，在氮气保护及室温下避光反应0.1~90小时。有效提高巯基-乙烯基偶联反应的反应机率。

[0041] 优选地，所述的D步骤，反应结束后，反应液逐滴加入到乙酸乙酯当中，析出物通过离心、提纯、干燥，得到炔基化树状大分子-吉西他滨偶联物。

[0042] 通过逐滴加入到乙酸乙酯可有效去除未反应的树状大分子和DBU，去除杂质，有效提高产品纯度。

[0043] 本发明的有益效果在于：

[0044] 1、本发明的肽类树状大分子靶向给药系统，PEG链段和GFLG短肽结合在一起，可发挥其各自的优势，同时是首次将GFLG引入肽类树状大分子体系，可以避免以往还原性敏感和pH敏感键不仅仅在肿瘤细胞内发生断裂，同时还会在肿瘤组织内发生断裂释放出药物的问题，从而减低药物溢出肿瘤部位的风险。

[0045] 2、本发明的PEG化肽类树状大分子靶向给药系统的颗粒粒径可达到80~130nm。该粒径可有效利用肿瘤组织血管壁疏松的特点，通过EPR效应，达到给药系统在肿瘤组织的高富集; 同时又可以有效延长其在体内的循环时间，从而有望展现出良好的抗肿瘤效果。

[0046] 3、本发明靶向给药系统的制备方法采用吉西他滨与GFLG的偶联物上引入甲基乙烯基，再与树状大分子偶联的方案，反应高效、制备方法温和简单，且可以尽量避免铜离子的引入。

[0047] 4、本发明的制备方法中采用炔基化树状大分子，通过氨基与羧基的缩合反应形成酰胺键，从而使树状大分子的外围带上炔基，为后面的PEG化提供点击反应的反应位点，为铜催化的炔-叠氮点击环加成（CuAAC）反应，有效的降低不必要的副反应以及保持树状大分子的低分散度。

[0048] 5、本发明的制备方法引入三苯甲硫基，其目的在于在树状大分子外围引入巯基，三苯甲基是作为巯基的保护基而存在。引入巯基的目的是可以和吉西他滨偶联物上MA（甲基乙烯基）的双键发生巯-烯反应。

[0049] 6、本发明在树状大分子与吉西他滨的偶联反应中加入三乙基硅烷，其目的在于捕捉反应过程当中产生的正离子，促进反应的进行，并且必须等到溶液变成黄绿色之后才能加入，否则不能起到脱除三苯甲基保护剂的作用。

[0050] 7、本发明在炔基化树状大分子和炔基化三苯甲硫基树状大分子的合成反应结束后，溶液用乙酸乙酯稀释，并依次用NaHCO3、HCl、NaHCO3、NaCl洗涤，利用反复洗涤和萃取的方法可以有效去除杂质并且减少纯化步骤，利于合成量的放大。

[0051] 8、本发明在树状大分子与吉西他滨的偶联反应结束后，通过将反应液逐滴加入到乙酸乙酯可有效去除未反应的树状大分子和DBU，去除杂质，有效提高产品纯度。

附图说明

[0052] 图1为HPLC测量的偶联体Ⅰ的吉西他滨含量标准曲线。

[0053] 图2 为PEG化树状大分子-吉西他滨偶联物的 DLS图。

[0054] 图3 为PEG化树状大分子-吉西他滨偶联物的TEM图。

[0055] 图4为PEG化树状大分子-吉西他滨偶联体与吉西他滨体外抗肿瘤效果图。

[0056] 图5为PEG化树状大分子-吉西他滨偶联体与吉西他滨体外细胞毒性试验的肿瘤细胞生存率曲线 图。

[0057] 图6为PEG化树状大分子的未载药载体对于COS-7正常细胞的细胞毒性图。

[0058] 图7为荷瘤小鼠的肿瘤生长曲线图。

[0059] 图8为荷瘤小鼠的肿瘤重量示意图。

[0060] 图9为荷瘤小鼠的肿瘤抑制率的示意图。

[0061] 图10为本发明实施例1中的树状大分子偶联物的结构示意图。

具体实施方式

[0062] 下面结合具体实施方式对本发明的实质性内容作进一步详细的描述。

[0063] 实施例1

[0064] 负载吉西他滨的PEG化肽类树状大分子靶向给药系统，给药系统为抗肿瘤药物吉西他滨、靶向功能性因子GFLG和PEG化多肽类树状大分子的偶联物，其结构如图10所示：

[0065] 偶联体Ⅰ：n=10, m=3的PEG化3代赖氨酸树状大分子-吉西他滨偶联物[0066] 偶联体Ⅱ：n=1, m=1的PEG化3代赖氨酸树状大分子-吉西他滨偶联物

[0067] 偶联体Ⅲ：n=10, m=1的PEG化3代赖氨酸树状大分子-吉西他滨偶联物[0068] 偶联体Ⅳ：n=1, m=1的PEG化4代赖氨酸树状大分子-吉西他滨偶联物

[0069] 偶联体Ⅴ：n=2, m=1的PEG化5代赖氨酸树状大分子-吉西他滨偶联物

[0070] 偶联体Ⅵ：n=5, m=6的PEG化3代赖氨酸树状大分子-吉西他滨偶联物

[0071] 偶联体Ⅶ：a=10, b=1的PEG化4代谷氨酸树状大分子-吉西他滨偶联物[0072] 实施例2

[0073] 基于GFLG的PEG化多肽类树状大分子给药系统的制备方法，先在吉西他滨与GFLG的偶联物上引入甲基乙烯基，得到偶联物MA-GFLG-GEM，备用；再将作为载体的肽类树状大分子炔基化，在树状大分子上引入三苯甲硫基，得到炔基三苯甲硫基树状大分子，脱去三苯甲基后，与偶联物MA-GFLG-GEM发生偶联反应，得到炔基化树状大分子与吉西他滨的偶联物，最后经PEG化得成品。

[0074] 实施例3

[0075] 本发明的制备方法具体操作步骤如下：

[0076]  A MA-GFLG-GEM偶联物的制备；

[0077] 以Boc-GFLG-OMe为原料，与甲基乙烯酰氯反应制得MA-GFLG-OH，后MA-GFLG-OH与N，N-二异丙基乙胺、四氢噻唑-2-硫酮反应，反应结束后，将反应产物、吉西他滨盐酸盐、吡啶溶解在无水二甲亚砜中，避光反应，反应所得产物为MA-GFLG-GEM偶联物；

[0078] B炔基化树状大分子的合成

[0079] 以Boc与Cbz基团保护的树状大分子为原料，在氢气氛围下与Pb/C反应，反应结束后，将反应产物溶解在DMF当中，体系中加入N，N-二异丙基乙胺、己炔酸、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三唑，在氮气保护下反应，反应所得产物为炔基化树状大分子；

[0080] 这一步通过氨基与羧基的缩合反应形成酰胺键，脱去Cbz，从而使树状大分子的外围带上炔基，为后面的PEG化提供点击反应的反应位点。

[0081] C 炔基三苯甲硫基树状大分子的合成

[0082] 炔基化树状大分子溶解在无水二氯甲烷与三氟乙酸的混合溶剂中，体系在氮气保护下反应，将反应产物溶解在无水DMF中，体系中加入N，N-二异丙基乙胺、3-三苯甲硫基丙酸、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三唑，在氮气保护下反应，反应所得产物为炔基三苯甲硫基树状大分子；

[0083] D 炔基化树状大分子-吉西他滨偶联物的合成

[0084] 炔基三苯甲硫基树状大分子溶解在无水二氯甲烷与三氟乙酸的混合溶剂中，体系在氮气保护下反应；当溶液转为黄绿色后，体系加入三乙基硅烷，反应结束后，将反应产物溶解在无水DMF当中，溶液中加入偶联物MA-GFLG-GEM、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯，在氮气保护下避光反应，反应所得产物为炔基化树状大分子-吉西他滨偶联物；

[0085] E PEG化树状大分子

[0086] 在氮气气氛下，将炔基化树状大分子-吉西他滨、CuSO4·5H2O、N3-mPEG、抗坏血酸钠加入到DMF 和H2O的混合溶剂当中，反应体系避光反应，反应结束后，产物经提纯、透析、冻干得到PEG化树状大分子-吉西他滨偶联物。

[0087] 实施例4

[0088] 本实施例与实施例3基本相同，在此基础上：

[0089] 所述的B步骤，溶液在氮气保护以及冰浴下搅拌1h，并在室温下搅拌7天，得炔基化树状大分子。

[0090] 通过控制反应温度与时间，可有效降低初始反应速率，减少副反应，并且可以获得完全修饰的产品即末端胺基均被修饰的产品。

[0091] 实施例5

[0092] 本实施例与实施例3基本相同，在此基础上：

[0093] 所述的C步骤，在氮气保护下反应，溶液在氮气保护以及冰浴下搅拌1h，并在室温下搅拌7天，得炔基三苯甲硫基树状大分子。

[0094] 实施例6

[0095] 本实施例与实施例3基本相同，在此基础上：

[0096] 所述的B步骤，在氮气保护下反应，溶液在氮气保护以及冰浴下搅拌60h，并在室温下搅拌0.5天，得炔基化树状大分子。

[0097] 所述的C步骤，在氮气保护下反应，溶液在氮气保护以及冰浴下搅拌60h，并在室温下搅拌0.5天，得炔基三苯甲硫基树状大分子。

[0098] 所述的B和C步骤，体系在氮气保护下反应结束后，溶液用乙酸乙酯稀释，并依次用NaHCO3、HCl、NaHCO3、NaCl洗涤，有机相用无水MgSO4干燥，并用减压蒸馏除去溶剂，残留物经重结晶，得到产物。

[0099] 实施例7

[0100] 本实施例与实施例3基本相同，在此基础上：

[0101] 所述的D步骤，溶液中加入偶联物MA-GFLG-GEM、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯后，在氮气保护及室温下避光反应0.1小时。

[0102] 实施例8

[0103] 本实施例与实施例3基本相同，在此基础上：

[0104] 所述的D步骤， 溶液中加入偶联物MA-GFLG-GEM、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯，在氮气保护及室温下避光反应90小时，反应所得产物为炔基化树状大分子-吉西他滨偶联物；

[0105] 实施例9

[0106] 本实施例与实施例3基本相同，在此基础上：

[0107] 所述的D步骤，反应结束后，反应液逐滴加入到乙酸乙酯当中，析出物通过离心、提纯、干燥，得到炔基化树状大分子-吉西他滨偶联物。

[0108] 实施例10

[0109] 偶联物Ⅰ的制备方法，具体步骤如下：

[0110] A MA-GFLG-GEM偶联物的制备

[0111] 在氮气保护下，将Boc-GFLG-OMe（1）溶于10 mL 无水二氯甲烷与三氟乙酸的混合溶剂中（1:1，v/v）并在0oC下搅拌24 h。利用旋转蒸发仪除去溶剂后，加入适量无水乙醚洗涤三次，有白色沉淀析出。通过离心收集白色沉淀，并在真空干燥箱当中干燥0.5 h。所得样品溶解在20 mL水与乙腈（水/乙腈=4/1，v/v）的混合溶剂当中,并在冰水浴下用1 M氢氧化钠水溶液将pH值调节到9，随后再加入13 mL 1 M氢氧化钠水溶液并继续搅拌2 h。在冰盐浴下，逐滴加入0.85 mL 甲基乙烯酰氯，同时利用1 M氢氧化钠水溶液使体系pH值保持在10左右。搅拌4 h后加入大量乙酸乙酯，并用1 M盐酸水溶液将pH调整到2-3。最后用饱和氯化钠水溶液洗涤三次，收集有机相并用无水硫酸镁干燥。除去溶剂后，在乙酸乙酯与正己烷的混合溶剂中重结晶，得到MA-GFLG-OH。在氮气保护下，将MA-GFLG-OH，N，N-二异丙基乙胺，四氢噻唑-2-硫酮溶解在20 mL 无水二氯甲烷中，在冰盐浴下逐滴加入EDCI的无水二氯甲烷溶液。24 h后，向体系中加入500 mL 乙酸乙酯，并依次用1 M碳酸氢钠水溶液，1 M 盐酸水溶液，饱和氯化钠水溶液洗涤。除去溶剂，在乙酸乙酯与正己烷的混合溶剂中重结晶得到亮黄色固体MA-GFLG-TT（2）。将MA-GFLG-TT，吉西他滨盐酸盐，吡啶溶解在30 mL 无水二甲亚砜中，避光室温搅拌24 h。除去大部分溶剂后，在冰冻的乙酸乙酯中沉淀得白色固体为MA-GFLG- GEM偶联物（3）ESI-MS m/z 744 [(M+K)+，C32H41F2N7O9]

[0112]

[0113] B 炔基化树状大分子（5）的合成

[0114] Boc与Cbz基团保护的树状大分子（4）(3.0 g, 0.5 mmol) 溶解在 20 mL甲醇中，Pb/C (2.54 g, 10%) 加入溶液当中。反应体系在氢气氛围下搅拌3天。反应结束后，溶剂通过减压蒸馏除去。残留物溶解在50 mL DMF当中，DIPEA (16.8 mL, 96 mmol)，己炔酸 (18 mmol), HBTU (6.83 g, 18 mmol), HOBt (2.34 g, 18 mmol) 加入体系，溶液在氮气保护下以及冰浴下搅拌1小时，并在室温下搅拌4天。反应结束后，溶液用500 mL EtOAc 稀释，并依次用NaHCO3 aq. (satd.), 1 M HCl aq., NaHCO3 aq. (satd.)，NaCl aq. (satd.)洗涤.有机相用无水MgSO4干燥，并用减压蒸馏出去溶剂。残留物在乙酸乙酯/乙醚的混合溶剂中重结晶得到白色固体为炔基化树状大分子（5），产率：53% (1.37g, 0.27 mmol). 1H NMR (400 MHz, DMSO): δ = 1.18-1.65 (m, CH2-Lys and CHCCH2CH2), 2.12-2.16 (m, CHCCH2 and NCH2CH2), 2.741 (s, CHC(R)), 2.95 (s, CONHCH2), 4.14 (s, COCH(R)NH), +6.70-7.98(m, (R)CONH); MALDI-TOF MS: m/z 5192 [(M+Na), C264H438N46O57Na].[0115]

[0116] C 炔基三苯甲硫基树状大分子（6）的合成

[0117] 炔基化树状大分子（5）(1.0 g, 0.19 mmol) 溶解在无水二氯甲烷/三氟乙酸 (1:1, 6 mL)当中，溶液在氮气保护及0 oC 下搅拌24小时。通过减压蒸馏将溶剂除去，加入无水乙醚，析出白色沉淀。析出物真空干燥0.5小时并溶解在30 mL 无水DMF当中。DIPEA (12.6 mL, 72 mmol), 3-三苯甲硫基丙酸(12 mmol), HBTU (4.55 g, 12 mmol), HOBt (1.62 g, 12 mmol) 加入体系中，该溶液在氮气保护及冰浴下搅拌1小时并在室温下搅拌
48小时。反应结束后，溶液用500 mL EtOAc 稀释，并依次用NaHCO3 aq. (satd.), 1 M HCl aq., NaHCO3 aq. (satd.)，NaCl aq. (satd.)洗涤.有机相用无水MgSO4干燥，并用减压蒸馏出去溶剂。残留物在乙酸乙酯/乙醚的混合溶剂中重结晶得到白色固体为炔基三苯甲硫基树状大分子（7），产率：75% (1.13 g, 0.14 mmol). 1H NMR (400 MHz, DMSO): δ = 
1.234-1.644 (m, CH2-Lys and CHCCH2CH2), 2.11-2.22 (m, TrtSCH2CH2CO, CHCCH2 and NCH2CH2), 2.74 (s, CHC(R)), 2.95 (s, CONHCH2), 4.14 (s, COCH(R)NH), 7.20-7.29 (d, ArH), 7.77-7.95 (m, (R)CONH); MALDI-TOF MS: m/z 7954 [(M+Na)+, C468H562N46O43S12Na].

[0118]

[0119] D 炔基化树状大分子-吉西他滨偶联物（7）的合成

[0120] 炔基三苯甲硫基树状大分子（6）(1.19 g, 0.15 mmol) 溶解在无水二氯甲烷/三氟乙酸 (1:1, 8 mL) 当中，该溶液在氮气保护及冰浴下搅拌0.5小时。当溶液转为黄绿色后， 三乙基硅烷 (145.6 mg, 1.25 mmol)加入体系。反应体系在室温和氮气保护下继续搅拌24小时。通过减压蒸馏将溶剂除去，加入无水乙醚，析出白色沉淀。析出物真空干燥0.5小时并溶解在20 mL 无水DMF当中。MA-GFLG-GEM (3，324.43 mg, 0.46 mmol), DBU (2.74 g, 18 mmol)加入体系中.溶液在氮气保护及室温下避光反应72小时。反应结束后，反应液逐滴加入300 mL乙酸乙酯当中，析出红色沉淀析出物通过离心收集并利用柱色谱提纯。所得产物在真空下干燥，最终的到白色固体炔基化树状大分子-吉西他滨（7），产率：43%. MALDI-TOF MS: m/z 7159 [(M+Na)+, C336H1521F6N67O72S12Na].每个目标分子上平均带有三个GEM

[0121]

[0122] E 基于PEG化树状大分子-吉西他滨偶联物纳米颗粒的合成

[0123] 在氮气气氛下，炔基化树状大分子-吉西他滨（7）(150 mg, 21.0 µmol), CuSO4·5H2O (90 mg, 0.36 mmol), N3-mPEG (760 mg, 0.38 mmol)以及抗坏血酸钠 (142 mg, 
0.72 mmol)加入20 mL DMF 和H2O (3:1, V/V)的混合溶剂当中。反应体系避光反应3天。反应结束后，溶液避光透析48小时。通过冻干去除溶剂，并通过尺寸排阻色谱柱（Superose 12 HR/16/30 column on an ÄKTA FPLC system (GE Healthcare) column）进一步提纯。通过再次透析和冻干获得最终产物PEG化树状大分子-吉西他滨偶联物（8），产率：73 % (419.6 +
mg) MALDI-TOF MS: m/z 27372[(M+Na)]

[0124]

[0125] 通过在EDTA溶液当中透析，可以除去点击反应后所残留于体系当中微量的铜离子，而小分子杂质，过量的PEG链段以及副产物都可以通过ÄKTA FPLC 简单除去。

[0126] 因为PEG链段的分子量虽然是一个正态分布，但最主要的分子量是已知的，因此可以通过质谱所得出分子量的增加来判断PEG链段的个数。

[0127] 根据PEG化树状大分子-吉西他滨偶联物（8）的3MALDI-TOF质谱结果（27372[(M+Na)+），平均每个树状大分子上连有10个PEG链段。

[0128] 图1为利用HPLC所测定的GEM的标准曲线，从中可以得出PEG化树状大分子-吉西他滨偶联物当中吉西他滨的载药量为2.5%，即平均每个目标分子带有三个GEM，这与上述炔基化树状大分子-吉西他滨的质谱数据是吻合的。

[0129] 实施例11

[0130] 偶联体Ⅱ的合成方案与实施例11基本相同，在此基础上：

[0131] 炔基三苯甲硫基3代赖氨酸树状大分子溶解在无水二氯甲烷/三氟乙酸中，体系在氮气保护下反应；当溶液转为黄绿色后，体系加入三乙基硅烷，反应结束后，除去溶剂，加入无水乙醚，析出物经真空干燥，并溶解在无水DMF当中，溶液中加入1.05倍的MA-GFLG-治疗因子，DBU（1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯），在氮气保护下避光反应，反应所得产物为炔基化3代赖氨酸树状大分子-治疗因子偶联物。在氮气气氛下，将炔基化树状大分子-治疗因子偶联物、CuSO4•5H2O、1.05倍摩尔数的N3-mPEG（叠氮甲氧基PEG）、抗坏血酸钠加入到DMF 和H2O的混合溶剂当中，反应体系避光反应，反应结束后，溶液经避光透析，通过冻干去除溶剂，并通过提纯、透析、冻干得到PEG化树状大分子-吉西他滨偶联物。MALDI-TOF MS：m/+z 7774 ([M+Na])

[0132] 实施例12

[0133] 偶联体Ⅲ的合成方案与实施例11基本相同，在此基础上：

[0134] 炔基三苯甲硫基3代赖氨酸树状大分子溶解在无水二氯甲烷/三氟乙酸中，体系在氮气保护下反应；当溶液转为黄绿色后，体系加入三乙基硅烷，反应结束后，除去溶剂，加入无水乙醚，析出物经真空干燥，并溶解在无水DMF当中，溶液中加入1.05倍的MA-GFLG-治疗因子，DBU（1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯），在氮气保护下避光反应，反应所得产物为炔基化3代赖氨酸树状大分子-治疗因子偶联物。在氮气气氛下，将炔基化树状大分子-吉西他滨偶联物、CuSO4•5H2O、10.1倍摩尔数的N3-mPEG（叠氮甲氧基PEG）、抗坏血酸钠加入到DMF 和H2O的混合溶剂当中，反应体系避光反应，反应结束后，溶液经避光透析，通过冻干去除溶剂，并通过提纯、透析、冻干得到PEG化树状大分子-治疗因子偶联物。MALDI-TOF MS：m/z 25999 ([M+Na]+)

[0135] 实施例13

[0136] 偶联体Ⅳ的合成方案与实施例11基本相同，在此基础上：

[0137] 炔基三苯甲硫基4代赖氨酸树状大分子溶解在无水二氯甲烷/三氟乙酸中，体系在氮气保护下反应；当溶液转为黄绿色后，体系加入三乙基硅烷，反应结束后，除去溶剂，加入无水乙醚，析出物经真空干燥，并溶解在无水DMF当中，溶液中加入1.05倍的MA-GFLG-治疗因子，DBU（1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯），在氮气保护下避光反应，反应所得产物为炔基化4代赖氨酸树状大分子-治疗因子偶联物。在氮气气氛下，将炔基化树状大分子-治疗因子偶联物、CuSO4•5H2O、1.05倍摩尔数的N3-mPEG（叠氮甲氧基PEG）、抗坏血酸钠加入到DMF 和H2O的混合溶剂当中，反应体系避光反应，反应结束后，溶液经避光透析，通过冻干去除溶剂，并通过提纯、透析、冻干得到PEG化树状大分子-治疗因子偶联物。MALDI-TOF MS：m/z 13057([M+K]+)

[0138] 实施例14

[0139] 偶联体Ⅴ的合成方案与实施例11基本相同，在此基础上：

[0140] 炔基三苯甲硫基5代赖氨酸树状大分子溶解在无水二氯甲烷/三氟乙酸中，体系在氮气保护下反应；当溶液转为黄绿色后，体系加入三乙基硅烷，反应结束后，除去溶剂，加入无水乙醚，析出物经真空干燥，并溶解在无水DMF当中，溶液中加入1.05倍的MA-GFLG-治疗因子，DBU（1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯），在氮气保护下避光反应，反应所得产物为炔基化5代赖氨酸树状大分子-治疗因子偶联物。在氮气气氛下，将炔基化树状大分子-治疗因子偶联物、CuSO4•5H2O、2.1倍摩尔数的N3-mPEG（叠氮甲氧基PEG）、抗坏血酸钠加入到DMF 和H2O的混合溶剂当中，反应体系避光反应，反应结束后，溶液经避光透析，通过冻干去除溶剂，并通过提纯、透析、冻干得到PEG化树状大分子-治疗因子偶联物。MALDI-TOF MS：m/z 25571([M+H]+)

[0141] 实施例15

[0142] 偶联体Ⅵ的合成方案与实施例11基本相同，在此基础上：

[0143] 炔基三苯甲硫基3代赖氨酸树状大分子溶解在无水二氯甲烷/三氟乙酸中，体系在氮气保护下反应；当溶液转为黄绿色后，体系加入三乙基硅烷，反应结束后，除去溶剂，加入无水乙醚，析出物经真空干燥，并溶解在无水DMF当中，溶液中加入6.1倍的MA-GFLG-治疗因子，DBU（1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯），在氮气保护下避光反应，反应所得产物为炔基化3代赖氨酸树状大分子-治疗因子偶联物。在氮气气氛下，将炔基化树状大分子-治疗因子偶联物、CuSO4•5H2O、5.03倍摩尔数的N3-mPEG（叠氮甲氧基PEG）、抗坏血酸钠加入到DMF 和H2O的混合溶剂当中，反应体系避光反应，反应结束后，溶液经避光透析，通过冻干去除溶剂，并通过提纯、透析、冻干得到PEG化树状大分子-治疗因子偶联物。MALDI-TOF MS：m/z 19416([M+K]+)

[0144] 实施例16

[0145] 谷氨酸树状大分子-吉西他滨偶联的合成方案与赖氨酸树状大分子-吉西他滨偶联的合成方案（实施例10—15）基本相同。

[0146] 实施例17

[0147] Boc-GFLG-OMe的合成方法

[0148] 1．在氮气保护下，Boc-Gly-OH (11，10.5 g)，H-Phe-OMe盐酸盐 (12，8.6 g)，HOBT (10.808 g)，HBTU (30 g)，DIPEA (48 mL) 溶解在50 mL 无水DMF当中，溶液在0oC下搅拌2 h，而后在室温下搅拌24 h。反应结束后将反应体系加入500 mL乙酸乙酯当中，并依次用NaHCO3 aq. (satd.)，1 M HCl aq., NaHCO3 aq. (satd.)，NaCl aq. (satd.)洗涤.有机相用无水MgSO4干燥，并用减压蒸馏出去溶剂。残留物在乙酸乙酯/乙醚的混合溶剂中重结晶得到白色固体Boc-GF-OMe。ESI-MS m/z 359[(M+Na)+]产率： 85% yield.

[0149]

[0150] 2．在氮气保护下，Boc-Leu-OH (14.0 g)，H-Gly-OMe盐酸盐 (5.0 g)，HOBT (10.8 g)，EDC (16.0 g)，DIPEA (48.8 mL) 溶解在50 mL 无水DMF。溶液在0oC下搅拌2 h，而后在室温下搅拌24 h。反应结束后将反应体系加入500 mL乙酸乙酯当中，并依次用NaHCO3 aq. (satd.), 1 M HCl aq.，NaHCO3 aq. (satd.)，NaCl aq. (satd.)洗涤。有机相用无水MgSO4干燥，并用减压蒸馏出去溶剂。残留物在乙酸乙酯/乙醚的混合溶剂中重结晶得到白色固体 Boc-LG-OMe。ESI-MS m/z 341[(M+K)+]产率：87% yield.

[0151]

[0152] 3．Boc-GF-OMe (9.0 g, 27.0 mmol) 首先溶解在适量甲醇中，然后 在0 ℃下加入1 M NaOH aq. (80.0 mL) 溶液在室温下搅拌3 h，然后用1 M HCl aq.将pH调节到2-3。反应结束后将反应体系加入500 mL乙酸乙酯当中，并用NaCl aq. (satd.) 洗涤三次。减压蒸馏出去溶剂。所得白色固体为Boc-GF-OH，备用。

[0153]

[0154] 4．在氮气保护下，Boc-LG-OMe (8.607 g, 28.5 mmol) 首先溶解在20 mL 无水二氯甲烷与三氟乙酸的混合溶剂当中（1:1， V/V），该混合体系在0oC下搅拌24 h。通过减压蒸馏将溶剂除去，加入无水乙醚，析出白色沉淀。析出物真空干燥0.5小时并溶解在50 mL无水DMF当中。DIPEA (19.5 mL)、Boc-GF-OH(6.0 g)、HBTU (10.6 g)、HOBT (3.8 g) 依次加入体系并在氮气保护下以及0oC下搅拌1 h，而后在室温下搅拌24 h。反应结束后将反应体系加入500 mL乙酸乙酯当中，并依次用NaHCO3 aq. (satd.)，1 M HCl aq.，NaHCO3 aq. (satd.)，NaCl aq. (satd.)洗涤.有机相用无水MgSO4干燥，并用减压蒸馏出去溶剂。残留物在乙酸乙酯/乙醚的混合溶剂中重结晶得到白色固体Boc-GFLG-OMe。ESI-MS m/z 529 [(M+Na)+]产率：70.3% yield.

[0155]

[0156] 实施例18

[0157] 本发明实施例10中，Boc(12)-G3-Cbz(12)的合成方法

[0158] 1．在氮气保护下，Boc-Lys(Boc)-OH (3.523 g, 10.17 mmol)，HOBT ( 3.865 g, 10.17 mmol)，HBTU(3.856 g, 10.17 mmol)，DIPEA(7.1 mL, 40.68 mmol) 溶解在50 mL 无水DMF当中，并在0 oC搅拌30 min。2.42 g三（2-胺乙基）胺逐滴加入后该体系在室温下搅拌24 h。反应结束后将反应体系加入500 mL乙酸乙酯当中，并依次用NaHCO3 aq. (satd.)，
1 M HCl aq.，NaHCO3 aq. (satd.)，NaCl aq. (satd.)洗涤.有机相用无水MgSO4干燥，并用减压蒸馏出去溶剂。残留物在乙酸乙酯/乙醚的混合溶剂中重结晶得到白色固体为1代赖氨酸树状大分子（G1）。1H NMR (400 MHz, DMSO):δ=1.15–1.75 (m, CH2-Lys and CH3-Boc), .40 (m, NCH2CH2NHCO), 2.80 (m, CH2NH-Lys), 3.08 (m, NCH2CH2NHCO),177 3.78–4.0 (m, COCH(R)NH), 6.70 (s, NHCO), 7.61 (s, NHCO); MALDI-TOF MS:178 m/z 1153.75 [(M+Na)+, C54H102N10O15Na] 产率：87.5%

[0159]

[0160] 2．在氮气保护下，1代赖氨酸树状大分子(2.26 g, 2mmol) 首先溶解在20 mL 无水二氯甲烷与三氟乙酸的混合溶剂当中（1:1， V/V），该混合体系在0oC下搅拌24 h。通过减压蒸馏将溶剂除去，加入无水乙醚，析出白色沉淀。析出物真空干燥0.5小时并溶解在50 mL 无水DMF当中。DIPEA (4.89 mL, 28 mmol)，Boc-Lys (Boc)-OH (2.42, 7 mmol)，HBTU (2.65 g, 7 mmol)，HOBT (0.945 g, 7 mmol)依次加入体系并在氮气保护下以及0oC下搅拌1 h，而后在室温下搅拌24 h。反应结束后将反应体系加入500 mL乙酸乙酯当中，并依次用NaHCO3 aq. (satd.)，1 M HCl aq.、NaHCO3 aq. (satd.)，NaCl aq. (satd.)洗涤。有机相用无水MgSO4干燥，并用减压蒸馏出去溶剂。残留物在乙酸乙酯/乙醚的混合溶剂中重结晶得到白色固体为2代赖氨酸树状大分子（G2）。1H NMR (400 MHz, DMSO):δ=1.15–1.80 (m, CH2-Lys and CH3-Boc), 2.42 (m, NCH2CH2NHCO), 2.80–3.15 (m, CH2NH-Lys and NCH2CH2NHCO), 3.80–4.22 (m, COCH(R)NH), 6.40 (s, NHCO), 6.78 (s, NHCO), 6.90 +(s, NHCO), 7.78 (s, NHCO); MALDI-TOF MS: 2522.64 [(M+Na) ,C120H222N22O33Na].产率：
73%

[0161]  

[0162] 3．在氮气保护下，2代赖氨酸树状大分子(2.0 g, 0.8 mmol) 首先溶解在20 mL 无水二氯甲烷与三氟乙酸的混合溶剂当中（1:1， V/V），该混合体系在0oC下搅拌24 h。通过减压蒸馏将溶剂除去，加入无水乙醚，析出白色沉淀。析出物真空干燥0.5小时并溶解在50 mL 无水DMF当中。DIPEA (7.9 mL, 60 mmol)，Cbz-Lys (Boc)-OH (4.256, 11.2 mmol)，HBTU (4.244 g, 11.2 mmol)，HOBT (1.512 g, 11.2 mmol) 依次加入体系并在氮气保护下以及0oC下搅拌1 h，而后在室温下搅拌24 h。反应结束后将反应体系加入500 mL乙酸乙酯当中，并依次用NaHCO3 aq. (satd.)，1 M HCl aq.、NaHCO3 aq. (satd.)、NaCl aq. (satd.)洗涤。有机相用无水MgSO4干燥，并用减压蒸馏出去溶剂。残留物在乙酸乙酯/乙醚的混合溶剂中重结晶得到白色固体为3代赖氨酸树状大分子（G3）。MALDI-TOF MS: m/z 5668[(M+Na)+, C288H438N46O69]产率：68%

[0163]

[0164] 本发明合成方法的原料来源：Boc-Gly-OH，H-Phe-OMe盐酸盐，Boc-Leu-OH，H-Gly-OMe盐酸盐，Boc-Lys(Boc)-OH，Cbz-Lys (Boc)-OH均从上海吉尔生化有限公司购进；三（2-胺乙基）从TCI化学品公司购进。

[0165] 实施例19

[0166] 本发明对树状大分子-吉西他滨偶联体Ⅰ进行了以下实验检测：

[0167] 一、尺寸，形貌及Zeta电位

[0168] 本发明利用Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Worcestershire, UK)对纳米颗粒的流体动力学尺寸和Zeta电位进行了表征。PEG化树状大分子-吉西他滨偶联物溶解在10 mL重蒸水中以得到100 μg/mL 的水溶液。将该水溶液滴在铜网上，分散几分钟后，多余的溶剂用滤纸拭去并在室温下自然晾干以制得TEM样品。将基于PEG化树状大分子-吉西他滨偶联体的纳米颗粒水溶液（100 μg/mL）直接滴在硅片上并在室温下自然晾干，并通过FE-SEM进一步对其尺寸进行表征。

[0169] 动态光散射（DLS）结果(图2)表明PEG化树状大分子-吉西他滨偶联物可以在水中聚集成109.2 nm的纳米颗粒。这种自组装行为的驱动力来自于PEG链段的亲水性与树状大分子疏水性之间的平衡。另外，体系当中所含有的吉西他滨也为整个体系的自组装行为提供了π-π堆叠，偶极作用和氢键作用等驱动力纳米颗粒表面的负电荷，可以降低纳米颗粒与血清蛋白之间强烈作用，从而减少巨噬细胞对于纳米颗粒吞噬，延长其在体内的循环时间。因此，这一体系在肿瘤组织当中能够获得更好地聚集，从而显示出较好的抗肿瘤效果。

[0170] 利用TEM对纳米颗粒的形貌进行了进一步的表征，结果表明纳米颗粒的尺寸在100 nm左右(图3)。综合DLS的结果，基于PEG化树状大分子-吉西他滨偶联体的纳米颗粒拥有90~110 nm的尺寸，这一特征使其能够充分利用EPR效应而在肿瘤组织聚集，同时又可以有效延长其在体内的循环时间，从而有望展现出良好的抗肿瘤效果。

[0171] 利用DLS 和TEM对偶联体Ⅴ的纳米颗粒的形貌进行表征，DLS结果表明纳米颗粒的尺寸为129.5nm，TEM结果表明纳米颗粒的尺寸在110 nm左右。综合DLS的结果，基于PEG化树状大分子-吉西他滨偶联体Ⅴ的纳米颗粒拥有100~130 nm的尺寸。

[0172] 利用DLS 和TEM对偶联体Ⅵ的纳米颗粒的形貌进行表征，DLS结果表明纳米颗粒的尺寸为82.5nm，TEM结果表明纳米颗粒的尺寸在90 nm左右。综合DLS的结果，基于PEG化树状大分子-吉西他滨偶联体Ⅵ的纳米颗粒拥有80~100 nm的尺寸。

[0173] 二、肿瘤细胞系种类，细胞培养以及动物实验

[0174] 1、TC-1细胞系从中国科学院上海细胞库购入，并以RPMI 1640为培养基，以10%（v/v）的热失活胎牛血清及1% 青霉素和链霉素混合物为补充剂，在5% 二氧化碳/95%空气的气氛和37 oC的条件下进行培养。

[0175] 取对数生长期以上的TC-1细胞, 用0.05%胰蛋白酶消化后细胞记数, 用新鲜培养液配制成1×105/ml，96,孔板各孔加100uL , 置于37 ℃, 5 % CO2培养箱内培养。纯化的PEG化3代树状大分子-吉西他滨偶联物以及吉西他滨样品用 PBS 溶解, 过滤除菌。24 h 后加等倍稀释的不同浓度的PEG化3代树状大分子-吉西他滨偶联物或者吉西他滨样品 ( 20uL/孔 ) , 同一浓度设5个复孔, 阴性对照孔加 20uL培养基。继续培养48 h 后, 每孔加100uL CCK-8溶液, 置室温2 h后,用Well scan MK全自动酶标仪测450 nm处吸光度值, 按以下公式计算杀伤率: 杀伤率 (%) = [对照孔D(450) -实验孔 D (570) ] /对照孔 D (570)×100 % , 通过 计算细胞生长的抑制百分率, 用Orig n 6.0软件计算出PEG化3代树状大分子-吉西他滨偶联物和吉西他滨的IC50(半数抑制浓度)分别为1.52 ug/mL, 0.04 ug/mL，结果见图4。

[0176] 2、BALB/c 小鼠乳腺癌4T1细胞株与非洲绿猴肾细胞株COS-7从中科院上海细胞库购得。37℃，5% CO2的气氛下，细胞在RPMI 1640培养基（10%（V/V）热灭活胎牛血清，1%盘尼西林/链霉素）中单层培养。雌性BALB/c小鼠（20 ± 2 g，6-8周龄）从成都达硕生物公司购得，并在恒温、昼夜交替环境中饲养。

[0177] 体外细胞毒性试验

[0178] 未载药载体、PEG-G3(Lys)-GFLG-gem（PEG化3代树状大分子-吉西他滨偶联物）以及吉西他滨盐酸盐游离药物（GEM•HCl）的细胞毒性利用CCK-8法进行测定。在96孔板中，每孔加入5.0 × 103个4T1或COS-7细胞。24小时后，将未载药载体、PEG-G3(Lys)-GFLG-gem以及GEM•HCl 的灭菌水溶液分别加入预留小孔中。继续培养48小时，移去培养基并每孔加入100 µL 10% CCK-8/ RPMI 1640（V/V）混合溶液。孔板在37℃下继续培养2小时，利用酶标仪（ThermoFisher SCIENTIFIC）对每个样品的细胞存活率进行测定。

[0179] 结果如图5所示，PEG-G3(Lys)-GFLG-gem的IC5（0 细胞半致死浓度）为31.2 ng/mL，略高于吉西他滨盐酸盐游离药物的11.3 ng/mL。作为具有纳米尺寸的药物递送载体，PEG-G3(Lys)-GFLG-gem 需要通过内吞作用进入溶酶体当中，而后释放出药物，这就使得其起作用速度慢于通过自由扩散进入细胞的游离药物。这可能是其细胞毒性低于游离药物。同时，未载药载体在高浓度情况下（4.0-107.8 μg/mL, 图6）并未显示出对于4T1细胞的明显毒性；另外，在323.2 μg/mL 浓度条件下，未载药载体对于COS-7正常细胞依然没有明显的细胞毒性。以上结果表明未载药载体在细胞层面具有较好的生物相容性，同时载药体系的细胞毒性由释放的药物所提供。

[0180] 体内动物试验

[0181] 在每只BALB/c小鼠皮下注射50 μL 4T1细胞PBS悬液（5× 105）以建立4T1体内肿瘤模型。约两周后，当肿瘤体积增长到100-150 mm3时，将荷瘤小鼠按照注射药物种类的不同随机分为三组：生理盐水组（Saline，对照组），GEM•HCl (1 mg GEM/kg) 以及PEG-G3(Lys)-GFLG-gem（1 mg GEM/kg ）。每四天通过尾静脉注射200 μL测试溶液，并每两天测定肿瘤体积与小鼠体重。肿瘤体积依照以下公式进行计算：V (mm3) = 1/2 × length (mm) × width (mm2). 21天后，断颈处死所有小鼠，剥离肿瘤并称重、计算抑瘤率（TGI）。TGI=（1-（治疗组平均瘤重）/（对照组平均瘤重））×100%

[0182] 结果如图7所示，吉西他滨盐酸盐游离药物的治疗效果不甚理想，其21天相对肿瘤生长率为483.21 ± 104.64 %，与之相反的是PEG-G3(Lys)-GFLG-GEM 治疗组在21天得相对肿瘤生长率为86.17 ± 38.27 %。21天后，断颈处死所有荷瘤小鼠并剥离肿瘤，对肿瘤进行称重。如图8、9所示，吉西他滨盐酸盐游离药物组的瘤重为1924 ± 504 mg （TGI=44.59 %），而PEG-G3(Lys)-GFLG-GEM 治疗组的瘤重为350 ± 139 mg，其抑瘤率TGI为89.92%。这表明载药递送系统的体内抗肿瘤效果要远远优于游离药物。纳米载药递送系统优越的体内抗肿瘤效果与生物相容性可能是其表面所带负电荷、体内长循环时间、较高的肿瘤部位聚集程度以及其酶敏感药物释放行为所共同导致的。