一种免清洗的长时间细胞膜荧光成像试剂及其制备方法

摘要

本发明提供的一种免清洗的长时间细胞膜荧光成像试剂，所述试剂为侧链含有疏水单元和低效率荧光单元的乙二醇壳聚糖高分子。该试剂基于多位点锚定，其生物相容性好、合成简单、成本低廉、染色方便，无须清洗且不易被细胞内吞，可以用做长时间的细胞膜特异性示踪标记探针。

权利要求

1.一种免清洗的长时间细胞膜荧光成像试剂，其特征在于：所述试剂为侧链含有膜锚定单元和低效率荧光单元的乙二醇壳聚糖，其中，膜锚定单元由疏水单元和聚乙二醇高分子组成，疏水单元通过聚乙二醇高分子链接到乙二醇壳聚糖的氨基上；低效率荧光单元是在水溶液中发光效率低，而在疏水性环境中发光强度大的荧光分子。

2.根据权利要求1所述的一种免清洗的长时间细胞膜荧光成像试剂，其特征在于：所述膜锚定单元占乙二醇壳聚糖重复单元数的百分比在5％到30％；所述低效率荧光单元占乙二醇壳聚糖重复单元数的百分比在1％到5％。

3.根据权利要求1所述的一种免清洗的长时间细胞膜荧光成像试剂，其特征在于：所述乙二醇壳聚糖的分子量为10000-100000。

4.根据权利要求1所述的一种免清洗的长时间细胞膜荧光成像试剂，其特征在于：所述膜锚定单元包括胆固醇、磷脂分子、烷烃和维生素E；所述疏水单元通过聚乙二醇高分子链接到乙二醇壳聚糖的氨基上，所述聚乙二醇高分子分子量在500以上。

5.根据权利要求1所述的一种免清洗的长时间细胞膜荧光成像试剂，其特征在于：所述低效率荧光单元为羧基化的尼罗红染料或羧基化的四苯基乙烯，其通过与氨基反应直接链接到乙二醇壳聚糖上，或通过短链PEG链接到乙二醇壳聚糖的氨基上。

6.一种免清洗的长时间细胞膜荧光成像试剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)取膜锚定单元和乙二醇壳聚糖分别溶于PBS缓冲液中，混匀，室温反应；产物透析、冻干；

(2)在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺存在下，产物和低效率荧光单元分子室温反应，纯化即得；其中，所述低效率荧光单元是在水溶液中发光效率低，而在疏水性环境中发光强度大的荧光分子。

说明书

一种免清洗的长时间细胞膜荧光成像试剂及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种基于多位点锚定、免清洗的长时间细胞膜荧光成像试剂，还涉及该试剂的制备方法。

背景技术

[0002] 细胞膜不仅在结构上将细胞个体包裹形成稳定的内部环境，而且在功能上参与了物质运输、能量传递、信号转导、囊泡运输、细胞生长、分化、粘附、转移、应激、胞吞、胞吐、凋亡、坏死、自噬等很多重要生物学过程，因此关于细胞膜的研究越来越受到重视。对细胞膜进行荧光染色可以对细胞膜进行标记和示踪，已经成为研究细胞膜结构和功能的有力手段。

[0003] 目前市售的亲脂性荧光染料如DiD家族(DiO、DiI、DiA、DiR等)和FM家族(FM4-64、FM 2-10等)存在很多的不足。这些荧光分子在水介质中也有较强的荧光，导致过量的荧光染料存在于细胞培养液中，进而造成了荧光显微成像时背景信号干扰极大，需要用缓冲液或者细胞培养液进行多次清洗，才能实现比较满意的成像效果。另一方面，DiD家族因为是小分子，很容易被内吞而使细胞器的膜结构等染色，因此失去了细胞膜成像的特异性。FM染料家族虽然通过增加极性头部的方式一定程度上提高了染料分子在细胞膜上的稳定性，但染色10分钟以上仍然会造成内吞，难以长时间标记细胞膜。为了解决长时间成像的问题，目前也有很多的科研人员开发了一些新型染料，它们都是利用一条或两条疏水尾巴作为锚定区域，通过改善亲水性头部的方式进行设计，因为仍然都是小分子荧光染料所以很容易被内吞(尤其染色时间长时，内吞更甚)，因此这种单一位点锚定的方式很难有技术突破。因此，开发一种的无须清洗的长时间细胞膜特异性成像试剂非常有必要。

[0004] 此外，由于细胞膜相关的生物学过程大多需要长时间尺度的示踪研究，因此需要借助长时间细胞膜成像染料；然而，由于很多生物学过程需要原位捕捉最原始的状态(比如在活体组织和器官中)，无法进行体外细胞实验中常用的荧光染料清洗的操作，因此目前迫切需要研制一类能够免清洗的细胞膜成像染料。

发明内容

[0005] 发明目的：本发明的目的是提供一种免清洗的长时间细胞膜荧光成像试剂。

[0006] 技术方案：本发明提供的一种免清洗的长时间细胞膜荧光成像试剂，所述试剂为侧链含有疏水单元和低效率荧光单元的乙二醇壳聚糖。乙二醇壳聚糖在任何pH值的水溶液中均有很好的溶解性，并且具有低免疫原性、生物相容性、生物可降解性、生物活性等特点。疏水单元可通过疏水相互作用多位点地插入细胞膜，并把乙二醇壳聚糖高分子及其上负载的尼罗红分子锚定到细胞膜上；乙二醇壳聚糖把各个胆固醇疏水单元和尼罗红染料单元交联起来，防止其长时间染色被细胞内吞；尼罗红染料由于在水溶液中发光效率低，而在疏水的细胞膜上发出红色的荧光，可以实现免清洗的长时间细胞膜荧光成像。

[0007] 作为优选，所述疏水单元占乙二醇壳聚糖重复单元数的百分比在5％到30％；所述尼罗红染料单元占乙二醇壳聚糖重复单元数的百分比在1％到5％。

[0008] 作为另一种优选，所述乙二醇壳聚糖(glycol chitosan)的分子量在10000以上，优选10000-100000。

[0009] 作为另一种优选，所述疏水单元包括胆固醇、磷脂分子、烷烃和维生素E；所述疏水单元通过聚乙二醇高分子链接到乙二醇壳聚糖的氨基上；所述其中聚乙二醇高分子分子量在500以上。

[0010] 作为另一种优选，所述低效率荧光单元为羧基化的尼罗红染料或羧基化的四苯基乙烯，其通过与氨基反应直接链接到乙二醇壳聚糖上，或通过短链PEG链接到乙二醇壳聚糖的氨基上。所述低效率荧光单元在水溶液中发光效率低，而在疏水性环境中发光强度大的荧光分子，以实现免清洗成像。

[0011] 所述羧基化的尼罗红染料的结构式为：

[0012]

[0013] 所述羧基化的四苯基乙烯的结构式为：

[0014]

[0015] 本发明还提供了上述一种免清洗的长时间细胞膜荧光成像试剂的制备方法，包括以下步骤：

[0016] (1)取疏水单元分子和乙二醇壳聚糖分别溶于PBS缓冲液中，混匀，室温反应；产物透析、冻干；

[0017] (2)在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)存在下，产物和低效率荧光单元分子室温反应，纯化即得。

[0018] 有益效果：本发明提供的细胞膜荧光成像试剂基于多位点锚定，其生物相容性好、合成简单、成本低廉、染色方便，无须清洗且不易被细胞内吞，可以用做长时间的细胞膜特异性示踪标记探针。

[0019] 具体而言，本发明相对于现有技术，具有以下突出的优势：

[0020] (1)本发明采用采用了多位点锚定技术，高分子上只要有一个胆固醇分子插入细胞膜后，就会促进同一高分子骨架上其他锚定单元的胆固醇陆续插膜(即存在插膜过程的协同效应)，荧光染色所需时间短。

[0021] (2)本发明试剂的疏水单元和低效率荧光单元都以共价结合的方式链接在乙二醇壳聚糖高分子的骨架上，所得到的成像试剂能够与细胞膜进行多位点插入，形成高分子包被结构，使其不易被细胞内吞，因此增加了在细胞膜上的保持时间。

[0022] (3)本发明试剂的低效率荧光单元在水中发光效率低，而插入细胞膜后的会在疏水的磷脂层里发出荧光，因此没有插入细胞膜的游离染料即使不清洗掉也不会有背景干扰，从而实现了免清洗成像；同时，由于染料不易内吞，所以游离的染料又不断的补给到膜上，就实现了长时间的荧光成像。

[0023] (4)该试剂的组成成分包括乙二醇壳聚糖和PEG的选用都具备生物相容性，而且锚定侧链的胆固醇更是动物细胞所固有成分，因此该试剂毒性低，生物体细胞膜标记不会产生影响。

[0024] (5)该试剂的乙二醇壳聚糖和PEG使该成像试剂具有很好的水溶性，可以方便地进行 体外细胞实验以及活体成像实验。

[0025] (6)该试剂乙二醇壳聚糖上剩余的氨基带有的正电荷，会与带负电荷的细胞膜发生静电相互作用，增加与细胞膜的亲和力，因而进一步促进了染料在细胞膜上的保持时间。(7)本发明所提出的多位点锚定方案可以作为一个应用平台，通过改变不同的锚定单元，如利用四苯基乙烯(TPE)等疏水环境下荧光更强的荧光单元，从而可以开发出各种功能和各种颜色的探针，应用于更加复杂和特异的细胞膜结构和功能研究。

附图说明

[0026] 图1为基于多位点锚定、免清洗的长时间细胞膜荧光成像试剂构成图(荧光分子以尼罗红分子为例)。

[0027] 图2为采用荧光成像试剂对A549细胞的共聚焦显微镜成像结果。荧光成像试剂为chitosan-30％cholesterol-2％Nile red，其制备过程见实施例1。

具体实施方式

[0028] 实施例1

[0029] 多位点锚定、免清洗的长时间细胞膜荧光成像试剂chitosan-30％cholesterol-2％Nile red的设计、合成和细胞膜荧光染色方法如下：

[0030] 试剂的设计：所述试剂构成见图1，该试剂以乙二醇壳聚糖高分子(glycol chitosan)为骨架，侧链含有30％的聚乙二醇2000-胆固醇(PEG2000-cholesterol)疏水单元和2％的尼罗红染料荧光单元。所述的乙二醇壳聚糖高分子，具有良好的生物相容性和水溶性，分子量在10000以上。所述的胆固醇疏水侧链，通过NHS-PEG2000-cholesterol的形式链接到乙二醇壳聚糖的氨基上，增加水溶性。所述的尼罗红染料为羧基化的尼罗红，经过与氨基反应直接链接到乙二醇壳聚糖上。所述试剂溶于水后，保持自由舒展状态，不会自组装成纳米颗粒，不易被细胞内吞，实现长时间成像。胆固醇疏水单元可通过疏水相互作用多位点的插入细胞膜，并把高分子和尼罗红分子锚定到细胞膜上；高分子把各个胆固醇疏水单元和尼罗红染料单元交联起来，防止其长时间染色被细胞内吞；尼罗红染料由于在水溶液中发光效率低，而在疏水的细胞膜上发出红色的荧光，实现免清洗的长时间细胞膜荧光成像。

[0031] 试剂的合成：首先以乙二醇壳聚糖高分子(glycol chitosan)、N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇2000-胆固醇(NHS-PEG2000-cholesterol)和尼罗红染料为原料，合成锚定单元占乙二醇壳聚糖单元数的百分比为30％，荧光分子单元占乙二醇壳聚糖单元数的百分比 为2％的成像试剂，即chitosan-30％cholesterol-2％Nile red染料，具体为：分别称取5mg N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇2000-胆固醇和1.34mg乙二醇壳聚糖高分子(聚合度：大于400；分子量约80000)并分别溶于PBS缓冲液(pH 7.4,50mM)，再将两者混合后，磁子搅拌室温反应4h；反应结束后于截留分子量为10k的透析袋中，透析3天进行纯化并冻干制成中间产品“乙二醇壳聚糖-胆固醇”复合物；然后，称取1mg“乙二醇壳聚糖-胆固醇”和2nmol羧基化的尼罗红染料(结构式见图2；合成方法见参考文献：Benzophenoxazine-based fluorescent dyes for labeling biomolecules.Tetrahedron 2006,62,11021–11037)于DMSO中，再加入6nmol的EDC和6nmol的NHS(均为3倍过量)于室温反应过夜；反应结束后用HPLC法进行提纯，最后于冻干机中冷冻干燥最终制得的成像试剂chitosan-30％cholesterol-2％Nile red染料于-20℃中冷冻保存。

[0032] 细胞膜染色成像实验：所述成像试剂chitosan-30％cholesterol-2％Nile red染料溶于细胞培养用PBS制成4mg/mL的储存液，再将储存液用DMEM完全培养基(DMEM不完全培养基+10％胎牛血清+1％青霉素-链霉素双抗)稀释成终浓度为100μg/mL的工作液。细胞在共聚焦培养板上培养12小时后，先吸去培养基，PBS洗两次，加入100μg/mL工作液放回细胞培养箱染色5min。染色结束后无须清洗，直接于激光扫描共聚焦显微镜下尼罗红染料荧光通道在63倍油镜下观察即可，其成像结果见图2。

[0033] 实施例2

[0034] 本实施例的实施方法与实施例1中的方法一致，只是将尼罗红荧光分子换成四苯基乙烯(tetraphenylethylene，TPE)荧光分子，选用的乙二醇壳聚糖高分子分子量约100000。该荧光分子是聚集诱导发光(AIE)的一种，其可通过分子内旋转受限(restriction of intra-molecular rotation，RIR)的方式发光。该荧光分子在水溶液中时自由度大，能量容易分散，所以发光效率低；而在插入疏水细胞膜后，由于被束缚在疏水磷脂的紧缩的空间里，使分子旋转受限，能量分散受阻，产生高荧光量子产率的绿色荧光。所以该荧光分子发光条件与尼罗红相似，可以用于制成多位点锚定、免清洗的长时间细胞膜荧光成像试剂。
制备方案中，通过羧基化的四苯基乙烯分子TPE-COOH(合成方法参考文献：Cell Membrane Tracker  Based on  Restriction  of  Intramolecular Rotation.ACS 
Appl.Mater.Interfaces,2014,6,8971–8975)在EDC和NHS的催化下通过酰胺键链接到乙二醇壳聚糖的高分子骨架上。

[0035] 实施例3

[0036] 本实施例的实施方法与实施例1中的方法类似，只是选用的乙二醇壳聚糖高分子分子量约10000，合成锚定单元占乙二醇壳聚糖重复单元数的百分比改为5％，荧光分子单元占乙二醇壳聚糖重复单元数的百分比改为1％，所制得的成像试剂组成为chitosan-5％cholesterol-1％Nile red。

[0037] 实施例4

[0038] 本实施例的实施方法与实施例1中的方法类似，只是合成锚定单元占乙二醇壳聚糖重复单元数的百分比改为20％，荧光分子单元占乙二醇壳聚糖重复单元数的百分比改为5％，所制得的成像试剂组成为chitosan-20％cholesterol-5％Nile red。

[0039] 实施例5

[0040] 本实施例的实施方法与实施例1中的方法一致，只是NHS-PEG2000-cholesterol分子中的胆固醇疏水单元依次改成磷脂分子(1,2-肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺,DMPE)、烷烃(十八个碳原子，C18)或者维生素E等疏水侧链制得细胞膜荧光成像试剂。